專利名稱：用于測(cè)定cd8+t細(xì)胞的健康的測(cè)試法的制作方法
用于測(cè)定CD8+T細(xì)胞的健康的測(cè)試法本申請(qǐng)要求2010年3月18日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/340，492，2009年9月15日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/276，733以及2009年8月24日提交的美國(guó)序號(hào)12/583，723的優(yōu)先權(quán)，這些申請(qǐng)均通過(guò)弓I入并入本文。
本發(fā)明在美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院授予的資助號(hào)為ROl AI065609和U19AI46132的政府資助下完成的。因此，美國(guó)政府也對(duì)該發(fā)明享有一定的權(quán)利。該申請(qǐng)中所引用的各種出版物用數(shù)字在括號(hào)內(nèi)注明。這些參考文獻(xiàn)的出處可在說(shuō)明書末尾、權(quán)利要求書之前找到。這些出版物公開的內(nèi)容通過(guò)引用整體并入本文，以便能夠更全面地說(shuō)明本發(fā)明所涉及的現(xiàn)有技術(shù)水平。
背景技術(shù)：
如何特異且有效地防止并治療人自身免疫性疾病一直是醫(yī)藥領(lǐng)域的核心難題。原因部分是由于我們還不完全了解免疫系統(tǒng)在胸腺陰性選擇后如何區(qū)分自我和非我以維持外周自身耐受。通常認(rèn)為表達(dá)對(duì)MHC/自身肽復(fù)合物具有高親和カ的TCR的胸腺細(xì)胞被去除的胸腺陰性選擇(1-3)消除了外周中病理性自身免疫的“緊急危險(xiǎn)”并且是自身耐受的主要機(jī)制。然而，通過(guò)胸腺陰性選擇向外周中釋放大部分中等親和カ的自反應(yīng)性T細(xì)胞代表了各個(gè)體內(nèi)遺傳的病理性自身免疫性的潛在危險(xiǎn)(4-6)，原因是潛在病理性自身反應(yīng)性T細(xì)胞包含在中等親和カT細(xì)胞庫(kù)中并常常能夠被功能性活化以引發(fā)自身免疫性疾病(6-9)。因此，在胸腺陰性選擇后自我/非我的區(qū)分必須在外周中繼續(xù)，且外周調(diào)節(jié)機(jī)制的主要功能之一是選擇性地下調(diào)對(duì)自身抗原的免疫應(yīng)答而不損害正在進(jìn)行的對(duì)外來(lái)病原的應(yīng)答(10-12)。因此，在鼠研究中已經(jīng)證明了通過(guò)胸腺陰性選擇和隨后的外周T細(xì)胞調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)自我和非我區(qū)分，其中在外周T細(xì)胞調(diào)節(jié)中Qa-I限制性CD8+T細(xì)胞選擇性地下調(diào)由其自身和外來(lái)抗原活化的中等親和カT細(xì)胞(11-15)。與Foxp3+⑶25+Treg和當(dāng)前已知的控制免疫應(yīng)答的量級(jí)和類型的任何其它調(diào)節(jié)細(xì)胞(16，17)不同，Qa-I限制性CD8+T細(xì)胞代表僅當(dāng)前證實(shí)的在外周中發(fā)揮區(qū)分自我和非我功能的調(diào)節(jié)機(jī)制(11，12)。由于外周自反應(yīng)性T細(xì)胞庫(kù)因胸腺陰性選擇而不具有高親和カ部分，中等親和カT細(xì)胞的選擇性下調(diào)同時(shí)能夠抑制自身免疫并保持由高親和カT細(xì)胞支配的功能性抗感染免疫(11-15)。與MHC Ib類分子Qa-I偶聯(lián)的熱休克肽(Hsp60sp)也被證明是常見的替代靶結(jié)構(gòu)，其優(yōu)先以較高水平在中等親和カT細(xì)胞上表達(dá)并特異性地被Qa-I限制性⑶8+T細(xì)胞識(shí)別(14)。該發(fā)現(xiàn)掲示了 Qa-I限制性CD8+T細(xì)胞和其靶T細(xì)胞之間的分子相互作用并解釋了 Qa-I限制性CD8+T細(xì)胞為何能夠選擇性地下調(diào)中等親和カ的T細(xì)胞。該發(fā)現(xiàn)提供了解釋T細(xì)胞活化的親和カ能夠被翻譯成外周T細(xì)胞調(diào)節(jié)以區(qū)分外周中的自我和非我的分子和細(xì)胞機(jī)制(15)。本文描述了基于這些發(fā)現(xiàn)用于測(cè)定受試者HLA-E+限制性⑶8+T細(xì)胞的健康的新測(cè)試法。

發(fā)明內(nèi)容
測(cè)定受試者的⑶8+T細(xì)胞是否能夠功能性地識(shí)別HLA-E/Hsp60sp靶結(jié)構(gòu)的方法，所述方法包括a)使所述受試者的⑶8+T細(xì)胞樣品與荷載有Hsp60sp的HLA-E+細(xì)胞接觸；b)量化步驟a)中的荷載有Hsp60sp且與所述受試者的⑶8+T細(xì)胞接觸的HLA-E+細(xì)胞的增殖；c)使所述受試者的CD8+T細(xì)胞樣品與荷載有不與HLA-E結(jié)合的肽的HLA-E+細(xì)胞接觸；d)量化步驟c)中的荷載有不與HLA-E結(jié)合的肽且與所述受試者的CD8+T細(xì)胞接觸的HLA-E+細(xì)胞的增殖；和e)比較步驟d)中量化的増殖和步驟b)中量化的増殖，其中步驟d)中量化的増殖的量大于步驟b)中量化的増殖的量表明所述受試者 的CD8+T細(xì)胞能夠功能性地識(shí)別HLA-E/Hsp60sp靶結(jié)構(gòu)，而其中在步驟d)中量化的增殖的量小于或等于步驟b)中量化的増殖的量表明所述受試者的CD8+T細(xì)胞不能功能性地識(shí)別HLA_E/Hsp60sp 革巴結(jié)構(gòu)。測(cè)定受試者的⑶8+T細(xì)胞是否能夠功能性地識(shí)別HLA-E/Hsp60sp靶結(jié)構(gòu)的方法，所述方法包括a)使所述受試者的⑶8+T細(xì)胞樣品與荷載有Hsp60sp的HLA-E+細(xì)胞接觸；b)量化步驟a)中的荷載有Hsp60sp且與所述受試者的⑶8+T細(xì)胞接觸的HLA-E+細(xì)胞的增殖；c)使所述受試者的⑶8+T細(xì)胞樣品與荷載有B7sp肽的HLA-E+細(xì)胞接觸；d)量化步驟c)中的荷載有B7sp肽且與所述受試者的⑶8+T細(xì)胞接觸的HLA-E+細(xì)胞的增殖；和e)比較步驟d)中量化的増殖和步驟b)中量化的増殖，其中步驟d)中量化的増殖的量大于步驟b)中量化的増殖的量表明所述受試者的CD8+T細(xì)胞能夠功能性地識(shí)別HLA-E/Hsp60sp靶結(jié)構(gòu)，而其中在步驟d)中量化的增殖的量小于或等于步驟b)中量化的増殖的量表明所述受試者的CD8+T細(xì)胞不能功能性地識(shí)別HLA_E/Hsp60sp 革巴結(jié)構(gòu)。測(cè)定不知道患有自身免疫性疾病的受試者是否具有發(fā)展為所述自身免疫性疾病的傾向的方法，所述方法包括測(cè)定所述受試者的CD8+T細(xì)胞是否能夠功能性地識(shí)別細(xì)胞表面上的HLA-E/Hsp60sp靶結(jié)構(gòu)并抑制所述細(xì)胞的増殖，其中如果所述受試者的CD8+T細(xì)胞不能功能性地識(shí)別所述細(xì)胞表面上的HLA-E/Hsp60sp靶結(jié)構(gòu)并抑制所述細(xì)胞的増殖，則所述受試者具有發(fā)展為所述自身免疫性疾病的傾向。測(cè)定不知道患有自身免疫性疾病的受試者是否具有發(fā)展為所述自身免疫性疾病的傾向的方法，所述方法包括測(cè)定所述受試者的HLA-E限制性CD8+T細(xì)胞是否能夠區(qū)分自我和非我，其中如果所述受試者的HLA-E限制性CD8+T細(xì)胞不能區(qū)分自我和非我，則所述受試者具有發(fā)展為所述自身免疫性疾病的傾向。測(cè)定受試者的CD8+T細(xì)胞是否能夠區(qū)分自我和非我的方法，所述方法包括A)i)使純化的⑶4+細(xì)胞群與(a) —定量的自身抗原和(b)抗原提呈細(xì)胞群接觸，從而由此活化所述CD4+細(xì)胞群；
ii)洗滌所述活化的CD4+細(xì)胞群從而除去所述自身抗原；iii)在所述受試者的CD8+T細(xì)胞群存在下共同培養(yǎng)部分所述活化的CD4+細(xì)胞群和部分所述抗原提呈細(xì)胞群；iv)量化所述活化的CD4+細(xì)胞的增埴；和V)利用不同量的自身抗原重復(fù)步驟A)i)至步驟A) iv)，從而測(cè)定引發(fā)所述活化的CD4+細(xì)胞的最大増殖所需的自身抗原的量并由此測(cè)定所述純化的CD4+細(xì)胞群的自身抗原的 ED5tl ；B)
i)使從所述受試者獲得的外周血單核細(xì)胞樣品與(a)自身抗原和(b)抗原提呈細(xì)胞群接觸，從而由此活化所述CD4+細(xì)胞群；ii)洗滌所述活化的CD4+細(xì)胞群從而除去所述自身抗原；iii)在所述受試者的CD8+T細(xì)胞群存在下共同培養(yǎng)部分所述活化的CD4+細(xì)胞群和部分所述抗原提呈細(xì)胞群；iv)量化所述活化的⑶4+細(xì)胞的增埴；v)利用不同量的自身抗原重復(fù)步驟B) i)至步驟B)iv)，從而測(cè)定引發(fā)所述活化的CD4+細(xì)胞的最大増殖所需的自身抗原的量并由此測(cè)定所述外周血單核細(xì)胞樣品的自身抗原的ED50 ；其中步驟A)和B)能夠以任意順序進(jìn)行；和C)比較所述自身抗原的ED5tl和所述外來(lái)抗原的ED5tl,其中，所述外來(lái)抗原的ED5tl高于所述自身抗原的ED5tl表明所述受試者的CD8+T細(xì)胞不能區(qū)分自我和非我，而其中所述外來(lái)抗原的ED5tl等于或小于所述自身抗原的ED5tl表明所述受試者的CD8+T細(xì)胞能夠區(qū)分自我和非我。測(cè)定受試者的⑶8+T細(xì)胞是否能夠功能性地識(shí)別HLA-E/Hsp60sp靶結(jié)構(gòu)的方法，所述方法包括a)使所述受試者的⑶8+T細(xì)胞樣品與荷載有Hsp60sp的HLA-E+細(xì)胞接觸；b)量化步驟a)中的荷載有Hsp60sp且與所述受試者的⑶8+T細(xì)胞接觸的HLA-E+細(xì)胞的增殖；c)使所述受試者的CD8+T細(xì)胞樣品與荷載有不與HLA-E結(jié)合的肽的HLA-E+細(xì)胞接觸；d)量化步驟c)中的荷載有不與HLA-E結(jié)合的肽且與所述受試者的CD8+T細(xì)胞接觸的HLA-E+細(xì)胞的增殖；和e)比較步驟d)中量化的増殖和步驟b)中量化的増殖，其中其中，步驟d)中量化的増殖的量大于步驟b)中量化的増殖的量表明所述受試者的CD8+T細(xì)胞能夠功能性地識(shí)別HLA-E/Hsp60sp靶結(jié)構(gòu)，而其中在步驟d)中量化的增殖的量小于或等于步驟b)中量化的増殖的量表明所述受試者的CD8+T細(xì)胞不能功能性地識(shí)別HLA-E/Hsp60sp 革E結(jié)構(gòu)。測(cè)定受試者的HLA-E限制性⑶8+T細(xì)胞是否被HLA-E/Hsp60sp活化的方法，所述方法包括
a)使從所述受試者獲得的包含HLA-E限制性⑶8+T細(xì)胞的樣品與包含HLA-E/Hsp60sp的組合物接觸；和b)檢測(cè)步驟(a)是否引起所述樣品的HLA-E限制性CD8+T細(xì)胞分泌細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞溶解酶，其中，所述樣品的HLA-E限制性CD8+T細(xì)胞分泌細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞溶解酶表明所述受試者的HLA-E限制性⑶8+T細(xì)胞被HLA-E/Hsp60sp活化，而其中在步驟b)中沒(méi)有可檢測(cè)的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞溶解酶的分泌表明所述受試者的HLA-E限制性CD8+T細(xì)胞沒(méi)有被HLA-E/Hsp60sp活化。鑒定樣品中的功能性HLA-E限制性CD8+T細(xì)胞的方法，所述方法包括a)使所述樣品與包含HLA_E/Hsp60sp的組合物接觸；和
b)檢測(cè)步驟(a)是否引起所述樣品的細(xì)胞分泌細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞溶解酶，其中，所述樣品的細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞溶解酶的分泌表明所述樣品包含功能性HLA-E限制性⑶8+T細(xì)胞。預(yù)防性地治療受試者而免于發(fā)展為自身免疫性疾病的方法，所述方法包括向所述受試者施用荷載有Hsp60sp肽的樹突細(xì)胞從而活化所述受試者中的HLA-E限制性CD8+T細(xì)胞并由此預(yù)防性地治療受試者而免于發(fā)展為所述自身免疫性疾病。用于治療患有自身免疫性疾病的受試者的方法，所述方法包括向所述受試者施用荷載有Hsp60sp肽的樹突細(xì)胞從而活化所述受試者中的HLA-E限制性CD8+T細(xì)胞并由此治療所述自身免疫性疾病。治療患有自身免疫性疾病的受試者的方法,所述方法包括a)測(cè)定從所述受試者獲得的HLA-E限制性CD8+T細(xì)胞是否能夠區(qū)分自我和非我；和b)如果在步驟a)中測(cè)定所述受試者的HLA-E限制性CD8+T細(xì)胞不能夠區(qū)分自我和非我，則向所述受試者施用荷載有Hsp60sp肽的外來(lái)體或樹突細(xì)胞從而活化所述受試者中的HLA-E限制性CD8+T細(xì)胞，并由此治療所述自身免疫性疾病。


圖IA :荷載肽后HLA-E在HLA-E轉(zhuǎn)染子B721/E表面上的表達(dá)。按照方法中所述，用肽荷載HLA-E轉(zhuǎn)染子，然后用抗-HLA-E mAb對(duì)表面進(jìn)行染色。圖IB =HLA-E限制性⑶8+T細(xì)胞[⑶8 (H)]特異性地抑制表達(dá)HLA-E且荷載有Hsp60sp的細(xì)胞。按照方法中的描述，產(chǎn)生CD8 (H)和對(duì)照細(xì)胞系并在CD8+T細(xì)胞抑制測(cè)試中測(cè)驗(yàn)。數(shù)據(jù)來(lái)自三個(gè)健康的正常個(gè)體。圖IC =HLA-E限制性⑶8+T細(xì)胞抑制了對(duì)自身抗原MBP和GAD的整體免疫應(yīng)答，但增強(qiáng)了對(duì)外來(lái)抗原TT和PPD的免疫應(yīng)答。按照方法中的描述，產(chǎn)生CD8 (H)和對(duì)照細(xì)胞系并在自我/非我區(qū)分測(cè)試中測(cè)驗(yàn)。數(shù)據(jù)來(lái)自三個(gè)健康的正常個(gè)體。圖2A :與正常個(gè)體相比，從I型糖尿病(TlD)患者新鮮分離的PBMC中的⑶8+T細(xì)胞喪失了區(qū)分自我和非我的能力。按照方法中的描述，從TlD患者的PBMC中純化CD8+T細(xì)胞，并在CD8+T細(xì)胞抑制測(cè)試中測(cè)驗(yàn)。所顯示的數(shù)據(jù)表示與健康的正常對(duì)照配對(duì)測(cè)驗(yàn)的10位TlD患者中的9位患者的數(shù)據(jù)。
圖2B :與正常個(gè)體相比，從TlD患者新鮮分離的PBMC中的⑶8+T細(xì)胞喪失了特異性地識(shí)別HLA-E/Hsp60sp靶結(jié)構(gòu)的能力。按照方法中的描述，在標(biāo)準(zhǔn)的自我/非我區(qū)分測(cè)試中從來(lái)自TlD患者的PBMC純化⑶4+T細(xì)胞、測(cè)驗(yàn)并與PBMC比較。所顯示的數(shù)據(jù)表示與健康的正常對(duì)照配對(duì)測(cè)驗(yàn)的10位TlD患者中的9位患者的數(shù)據(jù)。圖3A :與正常個(gè)體相比，在體外用荷載有Hsp60sp肽的自體樹突細(xì)胞(DC)加強(qiáng)后，CD8+T細(xì)胞恢 復(fù)了區(qū)分自我和非我的能力。按照描述從各TlD患者和相應(yīng)的正常對(duì)照產(chǎn)生CDS(H)和對(duì)照CD8+細(xì)胞系，并在自我/非我區(qū)分測(cè)試中測(cè)驗(yàn)和比較。所顯示的數(shù)據(jù)表示與健康的正常對(duì)照配對(duì)的最初測(cè)試具有HLA-E限制性⑶8+T細(xì)胞缺陷的9位TlD患者中的8位患者的數(shù)據(jù)。圖3B :與正常個(gè)體相比，在體外用荷載有Hsp60sp肽的自體DC加強(qiáng)后，⑶8+T細(xì)胞恢復(fù)了特異性地識(shí)別靶結(jié)構(gòu)HLA-E/Hsp60sp的能力。按照描述從各TlD患者和相應(yīng)的正常對(duì)照產(chǎn)生CD8 (H)和對(duì)照CD8+細(xì)胞系，并在CD8+T細(xì)胞抑制測(cè)試中測(cè)驗(yàn)和比較。所顯示的數(shù)據(jù)表示與健康的正常對(duì)照配對(duì)的最初測(cè)試具有HLA-E限制性CD8+T細(xì)胞缺陷的9位TlD患者中的8位患者的數(shù)據(jù)。圖3C :與正常對(duì)照個(gè)體相比，從所測(cè)驗(yàn)的大多數(shù)I型糖尿病(TlD)患者新鮮分離的PBMC中的CD8+T細(xì)胞都喪失了區(qū)分外周中的自我和非我的能力。與正常對(duì)照配對(duì)，比較了所純化的⑶4+T細(xì)胞和各TlD患者中的PBMC對(duì)自身抗原GAD比外來(lái)抗原TT的免疫應(yīng)答。在存在和不存在CD8+T細(xì)胞下在各個(gè)個(gè)體中使用SND指標(biāo)作為評(píng)價(jià)對(duì)自身比外來(lái)抗原的應(yīng)答之間的區(qū)別的參數(shù)。數(shù)據(jù)表示用于各患者的兩個(gè)測(cè)驗(yàn)。圖3D:來(lái)自所測(cè)試的多數(shù)糖尿病患者的CD8±T細(xì)胞在體外加強(qiáng)后再次獲得了區(qū)分自我和非我的能力。與正常對(duì)照配對(duì)，比較了所建立的CD8(H)細(xì)胞系和各TlD患者的CD8⑶和CD8 (N)細(xì)胞系對(duì)自身抗原GAD比外來(lái)抗原TT的免疫應(yīng)答。SDN指標(biāo)用作評(píng)價(jià)各個(gè)體對(duì)自身抗原比外來(lái)抗原的應(yīng)答的差異的參數(shù)。數(shù)據(jù)表示用于各患者的兩個(gè)測(cè)驗(yàn)。圖4 :所測(cè)試的從多數(shù)TlD患者新鮮分離的⑶8+T細(xì)胞都喪失了區(qū)分外周中的自我和非我的能力。與正常對(duì)照配對(duì)，比較了所純化的⑶4+T細(xì)胞以及各TlD患者的⑶4+T細(xì)胞加CD8+T細(xì)胞對(duì)自身抗原MBP比外來(lái)抗原TT的免疫應(yīng)答。數(shù)據(jù)概括了 10位TlD患者和相應(yīng)的對(duì)照。圖5 由特異性靶結(jié)構(gòu)HLA-E/Hsp60sp觸發(fā)的HLA-E限制性⑶8+T細(xì)胞的提高的細(xì)胞溶解酶(CE)表達(dá)。將來(lái)自健康個(gè)體的CD8 (H)和CD (B)細(xì)胞系與荷載有Hsp60sp肽或B7sp對(duì)照肽的B721/E細(xì)胞共培養(yǎng)。按照方法中的描述，通過(guò)利用穿孔素(Perf)、顆粒酶A(GA)和顆粒酶B (GB)的細(xì)胞內(nèi)三色染色和隨后的FACS分析測(cè)定⑶8+T的CE表達(dá)。數(shù)據(jù)表示來(lái)自三個(gè)健康的正常個(gè)體之一的數(shù)據(jù)。上圖表示CE表達(dá)的三個(gè)不同組合的CE表達(dá)指標(biāo)，下圖表示CD8(H)細(xì)胞系上CE的細(xì)胞內(nèi)染色圖譜。發(fā)明詳述本發(fā)明使用的“HLA-E”具有本領(lǐng)域的通常含義，即人白細(xì)胞抗原系統(tǒng)E。HLA-E 蛋白序列描述于 NCBI 登錄號(hào) CAA05527、CAA40172、BAB63328 和 BAF31260，其通過(guò)引用并入本文。在實(shí)施方式中，所述試劑是HLA-E/IgG融合蛋白，所述試劑是HLA-E四聚體或HLA_E/Hsp60sp四聚體。四聚體描述在，例如Salcedo et al. , Eur.J. Immunol. 2000 Apr ；30 (4) :1094-101中，其通過(guò)引用并入本文。所述親和力模型和中等親和カT細(xì)胞描述在2008年8月28日公開的W0/2008/103471中，其通過(guò)引用并入本文。本文使用的“HLA-E限制性⑶8+T細(xì)胞”是識(shí)別免疫系統(tǒng)抗原提呈細(xì)胞(APC)上或HLA-E+樹突細(xì)胞上由HLA-E分子提呈的肽的調(diào)節(jié)性CD8+T細(xì)胞。如本文所涵蓋的，用于HLA-E限制性⑶8+T細(xì)胞的抗原提呈細(xì)胞包括中等親和カT細(xì)胞，其也是這些⑶8+T細(xì)胞的特異性靶標(biāo)。本文使用的“荷載”有肽的細(xì)胞或膜結(jié)合組合物應(yīng)表示在允許進(jìn)入所述細(xì)胞或所述肽的膜結(jié)合組合物和/或結(jié)合于所述細(xì)胞或所述肽的膜結(jié)合組合物的條件下所述細(xì)胞或膜結(jié)合組合物與所述肽一起溫育。例如，可以通過(guò)在37°C下分別用濃度為50uM的Hsp60sp或B7sp溫育細(xì)胞2小時(shí)使樹突細(xì)胞荷載Hsp60sp或B7sp。在實(shí)施方式中，所述HLA-E+細(xì)胞是CD4+/HLA-E+T細(xì)胞、CD8+/HLA-E+T細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述Hsp60sp是人的。人Hsp60sp是QMRPVSRVL(SEQ IDNO 1) ο 鼠 Hsp60sp 具有序列 QMRPVSRAL (SEQ ID NO 2)。B7sp 具有序列 VMAPRTVLL (SEQ IDNO 3)。·“自身抗原”根據(jù)其存在的生物體定義，其是生物體自身組織的生理組分和能夠刺激自身免疫的機(jī)體成分?！巴鈦?lái)抗原”或非我抗原根據(jù)其存在的生物體定義，其是這樣的分子該分子不是生物體自身組織的生理組分和機(jī)體成分但能夠在生物體內(nèi)刺激免疫應(yīng)答。本文使用的細(xì)胞增殖可以以本領(lǐng)域已知的方式量化。本文使用的“ED5tl”應(yīng)表示引發(fā)相關(guān)細(xì)胞(例如抗原活化的CD4+T細(xì)胞)的半數(shù)最大增殖的抗原或自身抗原的劑量。測(cè)定受試者的⑶8+T細(xì)胞是否能夠功能性地識(shí)別HLA-E/Hsp60sp靶結(jié)構(gòu)的方法，所述方法包括a)使所述受試者的⑶8+T細(xì)胞樣品與荷載有Hsp60sp的HLA-E+細(xì)胞接觸；b)量化步驟a)中的荷載有Hsp60sp且與所述受試者的⑶8+T細(xì)胞接觸的HLA-E+細(xì)胞的增殖；c)使所述受試者的CD8+T細(xì)胞樣品與荷載有不與HLA-E結(jié)合的肽的HLA-E+細(xì)胞接觸；d)量化步驟c)中的荷載有不與HLA-E結(jié)合的肽且與所述受試者的CD8+T細(xì)胞接觸的HLA-E+細(xì)胞的增殖；和e)比較步驟d)中量化的増殖和步驟b)中量化的増殖，其中步驟d)中量化的増殖的量大于步驟b)中量化的増殖的量表明所述受試者的CD8+T細(xì)胞能夠功能性地識(shí)別HLA-E/Hsp60sp靶結(jié)構(gòu)，而其中在步驟d)中量化的增殖的量小于或等于步驟b)中量化的増殖的量表明所述受試者的CD8+T細(xì)胞不能功能性地識(shí)別HLA_E/Hsp60sp 革巴結(jié)構(gòu)。測(cè)定受試者的⑶8+T細(xì)胞是否能夠功能性地識(shí)別HLA-E/Hsp60sp靶結(jié)構(gòu)的方法，所述方法包括a)使所述受試者的⑶8+T細(xì)胞樣品與荷載有Hsp60sp的HLA-E+細(xì)胞接觸；b)量化步驟a)中的荷載有Hsp60sp且與所述受試者的⑶8+T細(xì)胞接觸的HLA-E+細(xì)胞的增殖；
c)使所述受試者的⑶8+T細(xì)胞樣品與荷載有B7sp肽的HLA-E+細(xì)胞接觸；d)量化步驟c)中的荷載有B7sp肽且與所述受試者的⑶8+T細(xì)胞接觸的HLA-E+細(xì)胞的增殖；和e)比較步驟d)中量化的増殖和步驟b)中量化的増殖，其中步驟d)中量化的増殖的量大于步驟b)中量化的増殖的量表明所述受試者的CD8+T細(xì)胞能夠功能性地識(shí)別HLA-E/Hsp60sp靶結(jié)構(gòu)，而其中在步驟d)中量化的增殖的量小于或等于步驟b)中量化的増殖的量表明所述受試者的CD8+T細(xì)胞不能功能性地識(shí)別HLA-E/Hsp60sp 革E結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明方法的實(shí)施方式中，步驟a)和/或步驟c)中的所述受試者的CD8+T細(xì)胞樣品是從所述受試者獲得的外周血單核細(xì)胞樣品。在本發(fā)明方法的實(shí)施方式中，所述受試者具有自身免疫性疾病。在本發(fā)明方法的實(shí)施方式中，所述自身免疫性疾病是I型糖尿 病。測(cè)定不知道患有自身免疫性疾病的受試者是否具有發(fā)展為所述自身免疫性疾病的傾向的方法，所述方法包括測(cè)定所述受試者的CD8+T細(xì)胞是否能夠功能性地識(shí)別細(xì)胞表面上的HLA-E/Hsp60sp靶結(jié)構(gòu)并抑制所述細(xì)胞的増殖，其中如果所述受試者的CD8+T細(xì)胞不能功能性地識(shí)別所述細(xì)胞表面上的HLA-E/Hsp60sp靶結(jié)構(gòu)并抑制所述細(xì)胞的増殖，則所述受試者具有發(fā)展為所述自身免疫性疾病的傾向。在本發(fā)明所述方法的實(shí)施方式中，通過(guò)以下步驟測(cè)定所述受試者的CD8+T細(xì)胞是否能夠功能性地識(shí)別所述細(xì)胞表面上的HLA-E/Hsp60sp靶結(jié)構(gòu)并抑制所述細(xì)胞的増殖a)使所述受試者的⑶8+T細(xì)胞樣品與荷載有Hsp60sp的HLA-E+細(xì)胞接觸；b)量化步驟a)中的荷載有Hsp60sp且與所述受試者的⑶8+T細(xì)胞接觸的HLA-E+細(xì)胞的增殖；c)使所述受試者的CD8+T細(xì)胞樣品與荷載有不與HLA-E結(jié)合的肽的HLA-E+細(xì)胞接觸；d)量化步驟c)中的荷載有不與HLA-E結(jié)合的肽且與所述受試者的CD8+T細(xì)胞接觸的HLA-E+細(xì)胞的增殖；和e)比較步驟d)中量化的増殖和步驟b)中量化的増殖，其中，步驟d)中量化的増殖的量大于步驟b)中量化的増殖的量表明所述受試者的CD8+T細(xì)胞能夠功能性地識(shí)別HLA-E/Hsp60sp靶結(jié)構(gòu)，而其中在步驟d)中量化的增殖的量小于步驟b)中量化的増殖的量表明所述受試者的CD8+T細(xì)胞不能功能性地識(shí)別HLA-E/Hsp60sp祀結(jié)構(gòu)。測(cè)定不知道患有自身免疫性疾病的受試者是否具有發(fā)展為所述自身免疫性疾病的傾向的方法，所述方法包括測(cè)定所述受試者的HLA-E限制性CD8+T細(xì)胞是否能夠區(qū)分自我和非我，其中如果所述受試者的HLA-E限制性CD8+T細(xì)胞不能區(qū)分自我和非我，則所述受試者具有發(fā)展為所述自身免疫性疾病的傾向。在本發(fā)明方法的實(shí)施方式中，受試者的CD8+T細(xì)胞是否能夠區(qū)分自我和非我的測(cè)定包括A)i)使⑶4+細(xì)胞群與(a) —定量的自身抗原和(b)抗原提呈細(xì)胞群接觸，從而由此活化所述CD4+細(xì)胞群；ii)洗滌所述活化的CD4+細(xì)胞群從而除去所述自身抗原；iii)在所述受試者的CD8+T細(xì)胞群存在下共同培養(yǎng)部分所述活化的CD4+細(xì)胞群和部分所述抗原提呈細(xì)胞群；iv)量化所述活化的⑶4+細(xì)胞的増殖；和V)利用不同量的自身抗原重復(fù)步驟A)i)至步驟A) iv)，從而測(cè)定引發(fā)所述活化的CD4+細(xì)胞的最大増殖所需的自身抗原的量并由此測(cè)定自身抗原的ED5tl ；B)i)使CD4+細(xì)胞群與(a)外來(lái)抗原和(b)抗原提呈細(xì)胞群接觸，從而由此活化所述⑶4+細(xì)胞群； ii)洗滌所述活化的CD4+細(xì)胞群從而除去所述外來(lái)抗原；iii)在所述受試者的CD8+T細(xì)胞群存在下共同培養(yǎng)部分所述活化的CD4+細(xì)胞群和部分所述抗原提呈細(xì)胞群；iv)量化所述活化的⑶4+細(xì)胞的増殖；和V)利用不同量的外來(lái)抗原重復(fù)步驟B) i)至步驟B)iv)，從而測(cè)定引發(fā)所述活化的CD4+細(xì)胞的最大増殖所需的外來(lái)抗原的量并由此測(cè)定外來(lái)抗原的ED5tl ；其中步驟A)和B)能夠以任意順序進(jìn)行；和C)比較所述自身抗原的ED5tl和所述外來(lái)抗原的ED5tl,其中，外來(lái)抗原的ED5tl高于所述自身抗原的ED5tl表明所述受試者的⑶8+T細(xì)胞不能區(qū)分自我和非我，而其中所述外來(lái)抗原的ED5tl等于或小于所述自身抗原的ED5tl表明所述受試者的CD8+T細(xì)胞能夠區(qū)分自我和非我。本發(fā)明方法的實(shí)施方式中，所述CD8+T細(xì)胞包含在從所述受試者獲得的外周血單核細(xì)胞的樣品中。在本發(fā)明方法的實(shí)施方式中，所述CD8+T細(xì)胞是HLA-E限制性的。測(cè)定受試者的CD8+T細(xì)胞是否能夠區(qū)分自我和非我的方法，所述方法包括A)i)使純化的⑶4+細(xì)胞群與(a) —定量的自身抗原和(b)抗原提呈細(xì)胞群接觸，從而由此活化所述CD4+細(xì)胞群；ii)洗滌所述活化的CD4+細(xì)胞群從而除去所述自身抗原；iii)在所述受試者的CD8+T細(xì)胞群存在下共同培養(yǎng)部分所述活化的CD4+細(xì)胞群和部分所述抗原提呈細(xì)胞群；iv)量化所述活化的CD4+細(xì)胞的増殖；和V)利用不同量的自身抗原重復(fù)步驟A)i)至步驟A) iv)，從而測(cè)定引發(fā)所述活化的CD4+細(xì)胞的最大増殖所需的自身抗原的量并由此測(cè)定所述純化的CD4+細(xì)胞群的自身抗原的 ED5tl ；B)i)使從所述受試者獲得的外周血單核細(xì)胞樣品與(a)自身抗原和(b)抗原提呈細(xì)胞群接觸，從而由此活化所述CD4+細(xì)胞群；ii)洗滌所述活化的CD4+細(xì)胞群從而除去所述自身抗原；
iii)在所述受試者的CD8+T細(xì)胞群存在下共同培養(yǎng)部分所述活化的CD4+細(xì)胞群和部分所述抗原提呈細(xì)胞群；iv)量化所述活化的CD4+細(xì)胞的増殖；和V)利用不同量的自身抗原重復(fù)步驟B) i)至步驟B)iv)，從而測(cè)定引發(fā)所述活化的CD4+細(xì)胞的最大増殖所需的自身抗原的量并由此測(cè)定所述外周血單核細(xì)胞樣品的自身抗原的ED50 ；其中步驟A)和B)能夠以任意順序進(jìn)行；和C)比較所述自身抗原的ED5tl和所述外來(lái)抗原的ED5tl, 其中，所述外來(lái)抗原的ED5tl高于所述自身抗原的ED5tl表明所述受試者的CD8+T細(xì)胞不能區(qū)分自我和非我，而其中所述外來(lái)抗原的ED5tl等于或小于所述自身抗原的ED5tl表明所述受試者的CD8+T細(xì)胞能夠區(qū)分自我和非我。測(cè)定受試者的⑶8+T細(xì)胞是否能夠功能性地識(shí)別HLA-E/Hsp60sp靶結(jié)構(gòu)的方法，所述方法包括a)使所述受試者的⑶8+T細(xì)胞樣品與荷載有Hsp60sp的HLA-E+細(xì)胞接觸；b)量化步驟a)中的荷載有Hsp60sp且與所述受試者的⑶8+T細(xì)胞接觸的HLA-E+細(xì)胞的增殖；c)使所述受試者的CD8+T細(xì)胞樣品與荷載有不與HLA-E結(jié)合的肽的HLA-E+細(xì)胞接觸；d)量化步驟c)中的荷載有不與HLA-E結(jié)合的肽且與所述受試者的CD8+T細(xì)胞接觸的HLA-E+細(xì)胞的增殖；和e)比較步驟d)中量化的増殖和步驟b)中量化的増殖，其中，步驟d)中量化的増殖的量大于步驟b)中量化的増殖的量表明所述受試者的CD8+T細(xì)胞能夠功能性地識(shí)別HLA-E/Hsp60sp靶結(jié)構(gòu)，而其中在步驟d)中量化的增殖的量小于步驟b)中量化的増殖的量表明所述受試者的CD8+T細(xì)胞不能功能性地識(shí)別HLA-E/Hsp60sp祀結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明方法的實(shí)施方式中，步驟a)和/或步驟c)中的所述受試者的CD8+T細(xì)胞樣品是從所述受試者獲得的外周血單核細(xì)胞樣品。在本發(fā)明方法的實(shí)施方式中，所述受試者具有自身免疫性疾病。在本發(fā)明方法的實(shí)施方式中，所述自身免疫性疾病是I型糖尿病。測(cè)定受試者是否可能發(fā)展為自身免疫性病癥的方法，所述方法包括測(cè)定受試者的CD8+T細(xì)胞是否能夠區(qū)分自我和非我，其中CD8+T細(xì)胞不能區(qū)分自我和非我的受試者被確定為可能發(fā)展為自身免疫性疾病。在一個(gè)實(shí)施方式中，測(cè)定所述受試者的CD8+T細(xì)胞能夠通過(guò)上文描述的方法區(qū)分自我和非我。測(cè)定患有自身免疫性疾病的受試者是否能夠通過(guò)施用荷載有HSP60sp的細(xì)胞治療所述自身免疫性疾病的方法，所述方法包括測(cè)定所述受試者的CD8+T細(xì)胞是否功能性地識(shí)別HLA-E/Hsp60sp靶結(jié)構(gòu)，其中CD8+T細(xì)胞不能功能性地識(shí)別HLA-E/Hsp60sp靶結(jié)構(gòu)的患有自身免疫性疾病的受試者被確定為能夠通過(guò)施用荷載Hsp60sp的細(xì)胞來(lái)治療。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)上文描述的方法測(cè)定所述受試者的CD8+T細(xì)胞自身能夠功能性地識(shí)別HLA-E/Hsp60 靶結(jié)構(gòu)。測(cè)定受試者的HLA-E限制性⑶8+T細(xì)胞是否被HLA-E/Hsp60sp活化的方法，所述方法包括a)使從所述受試者獲得的包含HLA-E限制性⑶8+T細(xì)胞的樣品與包含HLA-E/Hsp60sp的組合物接觸；和b)檢測(cè)步驟(a)是否引起所述樣品的HLA-E限制性CD8+T細(xì)胞對(duì)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞溶解酶的分泌，其中，所述樣品的HLA-E限制性CD8+T細(xì)胞分泌細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞溶解酶表明所述受試者的HLA-E限制性⑶8+T細(xì)胞被HLA-E/Hsp60sp活化，而其中在步驟b)中沒(méi)有可檢測(cè)的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞溶解酶的分泌表明所述受試者的HLA-E限制性CD8+T細(xì)胞沒(méi)有被HLA-E/Hsp60sp
活化。 在實(shí)施方式中，所述包含HLA-E/Hsp60sp的組合物是經(jīng)轉(zhuǎn)染表達(dá)HLA-E且荷載有Hsp60sp的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，經(jīng)轉(zhuǎn)染表達(dá)HLA-E的細(xì)胞是B721細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞溶解酶是穿孔素、顆粒酶A或顆粒酶B。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述樣品是血液樣品或源自血液。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)使所述樣品與結(jié)合有可檢測(cè)標(biāo)記物的抗細(xì)胞溶解酶抗體接觸來(lái)檢測(cè)所述細(xì)胞溶解酶。鑒定樣品中的功能性HLA-E限制性CD8+T細(xì)胞的方法，所述方法包括a)使所述樣品與包含HLA_E/Hsp60sp的組合物接觸；和b)檢測(cè)步驟(a)是否引起所述樣品的細(xì)胞分泌細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞溶解酶，其中，所述樣品的細(xì)胞分泌細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞溶解酶表明所述樣品包含功能性HLA-E限制性CD8+T細(xì)胞。預(yù)防性地治療受試者而免于發(fā)展為自身免疫性疾病的方法，所述方法包括向所述受試者施用荷載有Hsp60sp肽的樹突細(xì)胞從而在所述受試者中活化HLA-E限制性CD8+T細(xì)胞并由此預(yù)防性地治療所述受試者而免于發(fā)展為所述自身免疫性疾病。用于治療患有自身免疫性疾病的受試者的方法，所述方法包括向所述受試者施用荷載有Hsp60sp肽的樹突細(xì)胞從而在所述受試者中活化HLA-E限制性CD8+T細(xì)胞并由此治療所述自身免疫性疾病。治療患有自身免疫性疾病的受試者的方法，所述方法包括a)測(cè)定從所述受試者獲得的HLA-E限制性CD8+T細(xì)胞是否能夠區(qū)分自我和非我；和b)如果在步驟a)中測(cè)定所述受試者的HLA-E限制性CD8+T細(xì)胞不能夠區(qū)分自我和非我，則向所述受試者施用荷載有Hsp60sp肽的外來(lái)體或樹突細(xì)胞從而在所述受試者中活化HLA-E限制性CD8+T細(xì)胞，并由此治療所述自身免疫性疾病。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述自身免疫性疾病是I型糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、銀屑病、硬皮病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述自身免疫性疾病是斑禿、強(qiáng)直性脊柱炎、抗磷脂綜合征、自身免疫性阿狄森氏病、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性肝炎、自身免疫性內(nèi)耳病、自身免疫性淋巴細(xì)胞增生綜合征(ALPS)、自身免疫性血小板減少性紫癜(ATP)、白塞氏病、大皰性類天皰瘡、心肌病、乳糜瀉-皮膚炎、慢性疲勞免疫功能障礙綜合征(CFIDS)、慢性炎癥性脫髓鞘多發(fā)性神經(jīng)病、瘢痕性類天皰瘡、冷凝集素病、肢端硬皮綜合征(crest syndrome)、克隆氏病、德戈斯病(Dego’ s disease)、皮肌炎、幼年型皮肌炎(dermatomyositis-juvenile)、盤狀狼瘡、原發(fā)性混合型冷球蛋白血癥、纖維肌痛_纖維肌炎、格雷夫斯病、格-巴ニ氏綜合征、橋本氏甲狀腺炎、特發(fā)性肺纖維化、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、IgA腎病、胰島素依賴型糖尿病(I型)、幼年型關(guān)節(jié)炎、狼瘡、美尼爾氏病、混合結(jié)締組織病、多發(fā)性硬化、重癥肌無(wú)カ、尋常性天皰瘡、惡性貧血、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、多軟骨炎、多腺性綜合征、風(fēng)濕性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原發(fā)性無(wú)丙種球蛋白血癥、原發(fā)性膽汁性肝硬化、銀屑病、雷諾氏現(xiàn)象、賴特氏綜合征、風(fēng)濕熱、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病、硬皮病、干燥綜合征、全身肌強(qiáng)直綜合征、大動(dòng)脈炎、顳動(dòng)脈炎/巨細(xì)胞動(dòng)脈炎、潰瘍性結(jié)腸炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜風(fēng)或韋格納肉芽腫。在所述方法的實(shí)施方式中，Hsp60sp肽具有SEQ ID NO :1所示的序列。在所述方法的實(shí)施方式中，所述樹突細(xì)胞是不成熟的樹突細(xì)胞。
在本發(fā)明方法的實(shí)施方式中，所述受試者是人。本文所述方法、組合物和過(guò)程的各個(gè)要素的所有組合都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。通過(guò)參考以下實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)可更好地理解本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易理解具體的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)僅例示本發(fā)明，在下文的權(quán)利要求書中將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更全面完整的描述。實(shí)駘細(xì)節(jié)在本文中提供了實(shí)驗(yàn)性證據(jù)證明能夠從健康個(gè)體分離出參與人自身免疫性疾病I型糖尿病(TlD)的發(fā)生和控制的、能夠差異性地調(diào)節(jié)針對(duì)自身抗原和外來(lái)抗原的免疫應(yīng)答的HLA-E限制性⑶8+T細(xì)胞。此外，還提供了測(cè)定HLA-E限制性⑶8+T細(xì)胞的健康的試驗(yàn)并進(jìn)行了測(cè)試。特異件識(shí)別靶細(xì)胞上表汰的HLA-E/Hsd60sd的人HLA-E限制件⑶8+T細(xì)胞系的津、-之前在小鼠中的研究中證明了與MHC Ib類分子Qa-I偶聯(lián)的熱休克肽(Hsp60sp)是常見的替代靶結(jié)構(gòu)，其優(yōu)先在被任何抗原活化的中等親和カT細(xì)胞上表達(dá)并特異性地被Qa-I限制性⑶8+T細(xì)胞識(shí)別。因此，通過(guò)中等親和カT細(xì)胞上該常見靶結(jié)構(gòu)的特異性識(shí)別，Qa-I限制性CD8+T細(xì)胞能夠選擇性地下調(diào)中等親和カ而非高親和カT細(xì)胞從而在外周中實(shí)現(xiàn)自我/非我的區(qū)分(14，15)。為了研究HLA-E限制性人⑶8+T細(xì)胞，證實(shí)了可能從健康人的PBMC產(chǎn)生特異性識(shí)別與HLA-E結(jié)合的Hsp60sp的HLA-E限制性⑶8+T細(xì)胞系。因此，之前的研究表明荷載有Qa-I結(jié)合肽Hsp60sp而非Qdm的鼠樹突細(xì)胞可以用作疫苗以誘導(dǎo)來(lái)自EAE的⑶8+T細(xì)胞依賴性保護(hù)(14)。該結(jié)果強(qiáng)烈提示在體內(nèi)可能通過(guò)荷載有Hsp60sp的樹突細(xì)胞誘導(dǎo)功能性Qa-1/HLA-E限制性⑶8+T細(xì)胞。采用這種方法，已經(jīng)通過(guò)用荷載有Hsp60sp的自體樹突細(xì)胞(稱為“CD8 (H) ”)或荷載有作為對(duì)照的B7sp的自體樹突細(xì)胞(稱為“CD8 (B) ” )刺激純化的外周CD8+T細(xì)胞成功地從數(shù)種DR4+健康個(gè)體產(chǎn)生了兩種類型的人CD8+T細(xì)胞系。首先對(duì)從健康供體產(chǎn)生的⑶8+T細(xì)胞系進(jìn)行測(cè)試以驗(yàn)證其識(shí)別靶T細(xì)胞上表達(dá)的HLA-E/Hsp60sp。因此，為了鑒定能夠被調(diào)節(jié)性⑶8+T細(xì)胞識(shí)別的HLA-E結(jié)合肽，建立了在其表面上表達(dá)HLA-E的人細(xì)胞系。為此，建立了 HLA-E表達(dá)構(gòu)建體并轉(zhuǎn)染到人HLA-A、B、C缺陷型B細(xì)胞系中(18，19)。通過(guò)有限稀釋產(chǎn)生HLA-E表達(dá)克隆并用作HLA-E提呈細(xì)胞，以鑒定靶HLA-E結(jié)合肽并測(cè)驗(yàn)所述HLA-E限制性⑶8+T細(xì)胞的功能。按照描述(14，20)首先通過(guò)用HLA-E特異性mAb 3D-12 (21)對(duì)荷載有所述肽的B721/E細(xì)胞染色而測(cè)定HLA-E在所克隆的B721/HLA-E轉(zhuǎn)染子(B721/E)表面上的表達(dá)。圖IA顯示了亞克隆B721/E的代表性結(jié)果，在B721/E中B7sp和Hsp60sp都能夠與HLA-E結(jié)合以穩(wěn)定所述細(xì)胞表面HLA-E的表達(dá)。Hsp60sp特異件CD8+T細(xì)朐抑制荷載有Hsd60sd的HLA-E表汰細(xì)朐，伯不抑制荷載有對(duì)照肽B7sp的HLA-E表達(dá)細(xì)胞通過(guò)測(cè)驗(yàn)CD8 (H)細(xì)胞系對(duì)表達(dá)HLA-E且荷載有Hsp60sp、B7sp或?qū)φ誋LA-E非結(jié)合肽的轉(zhuǎn)染子B721/HLA-E的抑制作用，對(duì)從健康個(gè)體產(chǎn)生的CD8 (H)細(xì)胞系的特異性進(jìn)行了研究(CD8+T細(xì)胞抑制測(cè)試)。圖IB顯示的結(jié)果證明與由荷載有B7sp的DC觸發(fā)的⑶8+T細(xì)胞(⑶8 (B))相比，在所測(cè)驗(yàn)的所有個(gè)體中由荷載Hsp60sp的DC觸發(fā)的⑶8+T細(xì)胞(⑶8(H))均顯示對(duì)荷載有Hsp60sp而非B7sp或?qū)φ针牡腍LA-E轉(zhuǎn)染子的抑制。對(duì)照⑶8 (B)不抑制任何轉(zhuǎn)染子。通過(guò)檢測(cè)由HLA-E限制性⑶8+T細(xì)胞分泌的細(xì)胞溶解酶(CE)進(jìn)一步證實(shí)了 HLA-E限制性⑶8+T細(xì)胞對(duì)在靶細(xì)胞上表達(dá)的HLA-E/Hsp60sp的特異性認(rèn)知 識(shí)別(specific cognitive recognition)。因此,如圖5中的代表性結(jié)果所示，當(dāng)將⑶8 (H)細(xì)胞系與荷載有Hsp60sp的B721/E細(xì)胞而非荷載有對(duì)照肽B7sp的B721/E細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，或者當(dāng)將CD8 (B)細(xì)胞系與荷載有Hsp60sp或B7sp的B721/E共培養(yǎng)時(shí)，觀察到CD8+T細(xì)胞分泌的CE (例如穿孔素、顆粒酶A和顆粒酶B)增加。這些觀察結(jié)果與在上述⑶8+T細(xì)胞抑制測(cè)試中檢測(cè)的荷載有Hsp60sp而非B7sp的CD8 (H)細(xì)胞系對(duì)靶標(biāo)的特異性殺傷準(zhǔn)確關(guān)聯(lián)。這些結(jié)果表明，能夠從健康人的血液產(chǎn)生HLA-E限制性、Hsp60sp特異性⑶8+T細(xì)胞(在小鼠中鑒定的Qa-I限制性調(diào)節(jié)性⑶8+T細(xì)胞的人對(duì)應(yīng)物)。HLA-E限制件⑶8+T細(xì)胞在外周中發(fā)揮區(qū)分自我和非我的功能在成功建立且之前在小鼠研究中使用的標(biāo)準(zhǔn)T細(xì)胞增殖測(cè)試中測(cè)定CD8+T細(xì)胞系對(duì)CD4+T細(xì)胞對(duì)自身抗原MBP (或GAD)比外來(lái)抗原TT (或PPD)的免疫應(yīng)答的整體親和力的影響。因此，通過(guò)系列劑量的MBP (和GAD)或TT (和PPD)活化所純化的自體⑶4+T細(xì)胞，并將CD8(H)細(xì)胞加入到CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)物中。使用CD8(B)和“CD8(N) ”細(xì)胞(即用沒(méi)有荷載肽的DC致敏(prime))作為對(duì)照。在使用GAD作為自身抗原的研究中，所選擇的供體是DR4+的。如圖IC所示，在圖IB所示的相同個(gè)體中，與CD8 (B)或CD8 (N) *細(xì)胞相比，CD8 (H)抑制了 CD4+T細(xì)胞對(duì)自身抗原MBP和GAD的免疫應(yīng)答，但增強(qiáng)了 CD4+T細(xì)胞對(duì)外來(lái)抗原TT和PPD的免疫應(yīng)答。與在對(duì)照CD8 (B)和CD8 (N)細(xì)胞存在下對(duì)相同抗原的應(yīng)答相t匕，通過(guò)在⑶8 (H)存在下對(duì)自身抗原MBP和GAD的免疫應(yīng)答中整體親和力的降低(反映為ED50的增加)顯示了受抑制的免疫應(yīng)答的典型圖譜。然而，與在對(duì)照CD8(B)和CD8(N)細(xì)胞存在下對(duì)相同抗原的應(yīng)答相比，通過(guò)在CD8(H)存在下對(duì)外來(lái)抗原TT和PH)的免疫應(yīng)答中整體親和力的提高(反映為ED5tl的降低)顯示了增強(qiáng)的免疫應(yīng)答的典型圖譜。該組實(shí)驗(yàn)直接且明確證明了 HLA-E限制性、Hsp60sp特異性的⑶8+T細(xì)胞能夠差異性地在健康人的外周中調(diào)節(jié)對(duì)自身抗原和外來(lái)抗原的免疫應(yīng)答的功能。已經(jīng)在所測(cè)試的多數(shù)TlD患者中檢測(cè)到了由HLA-E限制件⑶8+T細(xì)胞介導(dǎo)的通路的缺陷在之前的研究中，已經(jīng)證明Qa-I限制性⑶8+T細(xì)胞在NOD小鼠中通過(guò)自我/非我區(qū)分控制自發(fā)形成的TlD (15)。為了驗(yàn)證HLA-E限制性⑶8+T細(xì)胞在人TlD的控制中也發(fā)揮主要作用，測(cè)定了從10位TlD患者新鮮分離的MPBC中CD8+T細(xì)胞的功能。所選擇的標(biāo)準(zhǔn)抗原是外來(lái)抗原TT和自身抗原GAD和MBP，因此在該研究的所有實(shí)驗(yàn)中所測(cè)驗(yàn)的每位患者都選擇為DR4+的并且與DR4+健康正常對(duì)照配對(duì)。a)與IH常對(duì)照個(gè)體相比，從所測(cè)試的大多數(shù)TlD患者新鮮分離的CD8+T細(xì)胞都喪失了區(qū)分外周中的自我和非我的能力首先，按照以上所述，使用T細(xì)胞增殖測(cè)試評(píng)價(jià)CD8+T細(xì)胞對(duì)CD4+T細(xì)胞對(duì)自身抗原GAD或MBP比外來(lái)抗原TT的應(yīng)答的影響，以評(píng)價(jià)其區(qū)分自我/非我的功能。因此，為了測(cè)定正常人CD8+T細(xì)胞能否在體外發(fā)揮區(qū)分自我和非我的功能，比較了人PBMC在CD8+T細(xì)胞存在或不存在下對(duì)自身和外來(lái)抗原的整體免疫應(yīng)答。在第一組實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)包含(a)⑶8+T細(xì)胞和⑶4+T細(xì)胞兩者的完整的PBMC群，并利用不同劑量的GAD (和MBP)或TT培養(yǎng)純化的⑶4+T細(xì)胞群。因此，認(rèn)為將PBMC群?jiǎn)为?dú)與純化的⑶4+T細(xì)胞群相比不能明確顯示PBMC中包含的CD8+T細(xì)胞的功能。然而，在利用純化的CD8+T細(xì)胞作為調(diào)節(jié)子進(jìn)行大規(guī)模實(shí)驗(yàn)(表示為圖1C)以顯示HLA-E限制性⑶8+T細(xì)胞能夠區(qū)分自我和非我，然后比較PBMC和純化的CD4+T細(xì)胞的免疫應(yīng)答并組合其它測(cè)試法可以用作對(duì)CD8+T細(xì)胞功能的快速解讀。在按照所述測(cè)驗(yàn)TlD患者中CD8+T細(xì)胞的功能并將其與CD8+T細(xì)胞抑制測(cè)試組合中即是如此。圖2顯示與純化的⑶4+T細(xì)胞相比，正常對(duì)照的PBMC中⑶8+T細(xì)胞的存在顯著抑制了對(duì)自身抗原GAD和MBP的整體應(yīng)答(反映為ED5tl的增加)(圖2Ab)，而增強(qiáng)了對(duì)外來(lái)抗原TT的整體應(yīng)答(反映為ED5tl的降低)(圖2Aa)。然而，當(dāng)對(duì)TlD患者的PBMC進(jìn)行相同的測(cè)驗(yàn)時(shí)，PBMC和所純化的CD4+T細(xì)胞之間應(yīng)答自身抗原GAD和MBP或外來(lái)抗原TT的ED5tl均沒(méi)有顯著差異(圖2Ac和2Ad)，這表明來(lái)自TlD患者的⑶8+T細(xì)胞喪失了區(qū)分自我和非我的能力。為了更好更清楚的了解由10位患者和相應(yīng)對(duì)照的自我/非我區(qū)分測(cè)試獲得的大量功能數(shù)據(jù)，需要各個(gè)個(gè)體的除ED5tl以外的另外的較簡(jiǎn)單但卻有意義且可靠的參數(shù)以評(píng)價(jià)T細(xì)胞的功能。因此，本發(fā)明公開了在所測(cè)驗(yàn)的所有正常個(gè)體中，在不存在HLA-E限制性CD8+T細(xì)胞的情況下，外來(lái)抗原(TT或PPD)引發(fā)T細(xì)胞的最大增殖所需的抗原劑量總是高于自身抗原(GAD或MBP)。當(dāng)在正常對(duì)照的⑶4+T細(xì)胞培養(yǎng)中存在HLA-E限制性⑶8+T細(xì)胞時(shí)，這種狀況被逆轉(zhuǎn)。對(duì)來(lái)自6位對(duì)照和10位TlD患者的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。當(dāng)在所有正常對(duì)照中存在調(diào)節(jié)性CD8+T細(xì)胞時(shí)，觀察到引發(fā)應(yīng)答自身抗原GAD和MBP的增殖所需的抗原劑量和引發(fā)應(yīng)答外來(lái)抗原TT和PPD的最大增殖所需的抗原劑量之間具有非常顯著的差異。在新鮮分離的淋巴細(xì)胞和體外致敏的CD8T細(xì)胞中均觀察到了這種結(jié)果。然而，不論存在CD8+T細(xì)胞與否，觀察到從多數(shù)TlD患者新鮮分離的淋巴細(xì)胞引發(fā)最大增殖所需的自身抗原和外來(lái)抗原劑量之間沒(méi)有任何差異(表2)。為了獲得該觀察結(jié)果，設(shè)想了一個(gè)新參數(shù)一自我和非我區(qū)分指標(biāo)(SND指標(biāo))。SND是各個(gè)個(gè)體中對(duì)自身抗原的應(yīng)答比對(duì)外來(lái)抗原的免疫應(yīng)答而引發(fā)最大量T細(xì)胞增殖的抗原劑量的相關(guān)性。利用SND指標(biāo)作為參數(shù)將來(lái)自10位TlD患者和6位正常對(duì)照的結(jié)果(10次測(cè)試)、總結(jié)于圖3C。因此，在缺乏⑶8+T細(xì)胞的⑶4+T細(xì)胞培養(yǎng)物中，TlD患者和正常對(duì)照對(duì)外來(lái)抗原TT應(yīng)答和自身抗原應(yīng)答的SND指標(biāo)之間均沒(méi)有差異(P > O. 05)(參見表I)。然而，與圖2Aa和2Ab所示的代表性結(jié)果相一致，在含有CD8+T細(xì)胞的PBMC培養(yǎng)中，所有正常對(duì)照都顯示不同的圖譜——對(duì)自身抗原GAD的應(yīng)答的SND指標(biāo)增加并顯著高于對(duì)外來(lái)抗原TT的應(yīng)答。在所測(cè)驗(yàn)的所有個(gè)體中，引發(fā)最大增殖所需的外來(lái)抗原劑量相比之下顯著降低(P< O. 05)。這顯示在正常的健康個(gè)體中受到良好控制的自身反應(yīng)性。相比之下，在存在⑶8+T細(xì)胞和不存在⑶8+T細(xì)胞的情況下，在10位TlD患者中有9位均顯示相同的SND指標(biāo)分布圖譜除了患者#4)。這顯示了這9位患者對(duì)自身抗原GAD的不受控制的自身反應(yīng)性(表2)。該觀察結(jié)果進(jìn)一步被9位TlD患者對(duì)另一自身抗原(MBP)的增加的反應(yīng)性所證實(shí)(參見圖4和表)。這些觀察結(jié)果與所測(cè)試的多數(shù)TlD患者的CD8+T細(xì)胞均在區(qū)分自我和非我的功能上具有缺陷的觀點(diǎn)相一致。表I :新鮮分離的⑶4+T細(xì)胞和⑶8+細(xì)胞即PBMC(T1D患者和正常對(duì)照)對(duì)外來(lái)
抗原TT和自身抗原GAD的應(yīng)答的T-檢驗(yàn)。使用SND指標(biāo)作為參數(shù)進(jìn)行T-檢驗(yàn)以分析從
自我/非我區(qū)分測(cè)試中獲得的數(shù)據(jù)。
權(quán)利要求
1.測(cè)定受試者的CD8+T細(xì)胞是否能夠功能性地識(shí)別HLA-E/Hsp60sp靶結(jié)構(gòu)的方法，所述方法包括 a)使所述受試者的⑶8+T細(xì)胞樣品與荷載有Hsp60sp的HLA-E+細(xì)胞接觸； b)量化步驟a)中的荷載有Hsp60sp且與所述受試者的CD8+T細(xì)胞接觸的HLA-E+細(xì)胞的増殖； c)使所述受試者的CD8+T細(xì)胞樣品與荷載有不與HLA-E結(jié)合的肽的HLA-E+細(xì)胞接觸； d)量化步驟c)中的荷載有不與HLA-E結(jié)合的肽且與所述受試者的CD8+T細(xì)胞接觸的HLA-E+細(xì)胞的增殖；和 e)比較步驟d)中量化的増殖和步驟b)中量化的増殖， 其中步驟d)中量化的増殖的量大于步驟b)中量化的増殖的量表明所述受試者的⑶8+T細(xì)胞能夠功能性地識(shí)別HLA-E/Hsp60sp靶結(jié)構(gòu)，而其中在步驟d)中量化的增殖的量小于或等于步驟b)中量化的増殖的量表明所述受試者的CD8+T細(xì)胞不能功能性地識(shí)別HLA-E/Hsp60sp 革E結(jié)構(gòu)。
2.測(cè)定受試者的CD8+T細(xì)胞是否能夠功能性地識(shí)別HLA-E/Hsp60sp靶結(jié)構(gòu)的方法，所述方法包括 a)使所述受試者的⑶8+T細(xì)胞樣品與荷載有Hsp60sp的HLA-E+細(xì)胞接觸； b)量化步驟a)中的荷載有Hsp60sp且與所述受試者的CD8+T細(xì)胞接觸的HLA-E+細(xì)胞的増殖； c)使所述受試者的CD8+T細(xì)胞樣品與荷載有B7sp肽的HLA-E+細(xì)胞接觸； d)量化步驟c)中的荷載有B7sp肽且與所述受試者的CD8+T細(xì)胞接觸的HLA-E+細(xì)胞的增殖；和 e)比較步驟d)中量化的増殖和步驟b)中量化的増殖， 其中步驟d)中量化的増殖的量大于步驟b)中量化的増殖的量表明所述受試者的⑶8+T細(xì)胞能夠功能性地識(shí)別HLA-E/Hsp60sp靶結(jié)構(gòu)，而其中在步驟d)中量化的增殖的量小于或等于步驟b)中量化的増殖的量表明所述受試者的CD8+T細(xì)胞不能功能性地識(shí)別HLA_E/Hsp60sp 革巴結(jié)構(gòu)。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其中步驟a)和/或步驟c)中的所述受試者的CD8+T細(xì)胞樣品是從所述受試者獲得的外周血單核細(xì)胞樣品。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述受試者患有自身免疫性疾病。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是I型糖尿病。
6.測(cè)定不知道患有自身免疫性疾病的受試者是否具有發(fā)展為所述自身免疫性疾病的傾向的方法，所述方法包括測(cè)定所述受試者的CD8+T細(xì)胞是否能夠功能性地識(shí)別細(xì)胞表面上的HLA-E/Hsp60sp靶結(jié)構(gòu)并抑制所述細(xì)胞的増殖，其中如果所述受試者的CD8+T細(xì)胞不能功能性地識(shí)別所述細(xì)胞表面上的HLA-E/Hsp60sp靶結(jié)構(gòu)并抑制所述細(xì)胞的増殖，則所述受試者具有發(fā)展為所述自身免疫性疾病的傾向。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中通過(guò)以下步驟測(cè)定所述受試者的CD8+T細(xì)胞是否能夠功能性地識(shí)別所述細(xì)胞表面上的HLA-E/Hsp60sp靶結(jié)構(gòu)并抑制所述細(xì)胞的増殖 a)使所述受試者的⑶8+T細(xì)胞樣品與荷載有Hsp60sp的HLA-E+細(xì)胞接觸； b)量化步驟a)中的荷載有Hsp60sp且與所述受試者的CD8+T細(xì)胞接觸的HLA-E+細(xì)胞的増殖； C)使所述受試者的CD8+T細(xì)胞樣品與荷載有不與HLA-E結(jié)合的肽的HLA-E+細(xì)胞接觸； d)量化步驟c)中的荷載有不與HLA-E結(jié)合的肽且與所述受試者的CD8+T細(xì)胞接觸的HLA-E+細(xì)胞的增殖；和 e)比較步驟d)中量化的増殖和步驟b)中量化的増殖， 其中步驟d)中量化的増殖的量大于步驟b)中量化的増殖的量表明所述受試者的CD8+T細(xì)胞能夠功能性地識(shí)別HLA-E/Hsp60sp靶結(jié)構(gòu)，而其中在步驟d)中量化的增殖的量小于步驟b)中量化的増殖的量表明所述受試者的CD8+T細(xì)胞不能功能性地識(shí)別HLA-E/Hsp60sp祀結(jié)構(gòu)。
8.測(cè)定不知道患有自身免疫性疾病的受試者是否具有發(fā)展為所述自身免疫性疾病的傾向的方法，所述方法包括測(cè)定所述受試者的HLA-E限制性CD8+T細(xì)胞是否能夠區(qū)分自我和非我，其中如果所述受試者的HLA-E限制性CD8+T細(xì)胞不能區(qū)分自我和非我，則所述受試者具有發(fā)展為所述自身免疫性疾病的傾向。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中測(cè)定所述受試者的CD8+T細(xì)胞是否能夠區(qū)分自我和非我包括 A) i)使所述受試者的CD4+細(xì)胞群與(a) —定量的自身抗原和(b) —定量的抗原提呈細(xì)胞接觸，從而由此活化所述CD4+細(xì)胞群； )洗滌所述活化的CD4+細(xì)胞群從而除去所述自身抗原； iii)在所述受試者的CD8+T細(xì)胞群存在下共同培養(yǎng)部分所述活化的CD4+細(xì)胞群和一定量的所述抗原提呈細(xì)胞群； iv)量化所述活化的CD4+細(xì)胞的増殖；和 V)利用不同量的自身抗原重復(fù)步驟A)i)至步驟A) iv)，從而測(cè)定引發(fā)所述活化的CD4+細(xì)胞的最大増殖所需的自身抗原的量并由此測(cè)定自身抗原的ED5tl; B) i)使所述受試者的CD4+細(xì)胞群與(a)外來(lái)抗原和(b) —定量的抗原提呈細(xì)胞接觸，從而由此活化所述CD4+細(xì)胞群； )洗滌所述活化的CD4+細(xì)胞群從而除去所述外來(lái)抗原； iii)在所述受試者的CD8+T細(xì)胞群存在下共同培養(yǎng)來(lái)自步驟B)ii)的部分所述活化的CD4+細(xì)胞群和一定量的所述抗原提呈細(xì)胞群； iv)量化來(lái)自步驟B)iii)的所述活化的CD4+細(xì)胞的增殖；和 V)利用不同量的外來(lái)抗原重復(fù)步驟B) i)至步驟B)iv)，從而測(cè)定引發(fā)所述活化的CD4+細(xì)胞的最大増殖所需的外來(lái)抗原的量并由此測(cè)定外來(lái)抗原的ED5tl ； 其中步驟A)和B)能夠以任意順序進(jìn)行； 和 C)比較所述自身抗原的ED5tl和所述外來(lái)抗原的ED5tl, 其中所述外來(lái)抗原的ED5tl高于所述自身抗原的ED5tl表明所述受試者的CD8+T細(xì)胞不能區(qū)分自我和非我，而其中所述外來(lái)抗原的ED5tl等于或小于所述自身抗原的ED5tl表明所述受試者的CD8+T細(xì)胞能夠區(qū)分自我和非我。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述CD8+T細(xì)胞包含在從所述受試者獲得的外周血單核細(xì)胞樣品中。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述CD8+T細(xì)胞是HLA-E限制性的。
12.測(cè)定受試者的CD8+T細(xì)胞是否能夠區(qū)分自我和非我的方法，所述方法包括 A) i)使純化的CD4+細(xì)胞群與(a) —定量的自身抗原和(b) —定量的抗原提呈細(xì)胞接觸，從而由此活化所述CD4+細(xì)胞群； )洗滌所述活化的CD4+細(xì)胞群從而除去所述自身抗原； iii)在所述受試者的CD8+T細(xì)胞群存在下共同培養(yǎng)部分所述活化的CD4+細(xì)胞群和一定量的所述抗原提呈細(xì)胞群； iv)量化所述活化的CD4+細(xì)胞的増殖；和 V)利用不同量的自身抗原重復(fù)步驟A)i)至步驟A) iv)，從而測(cè)定引發(fā)所述活化的CD4+細(xì)胞的最大増殖所需的自身抗原的量并由此測(cè)定所述純化的CD4+細(xì)胞群的自身抗原的ED50 ； B) i)使從所述受試者獲得的外周血單核細(xì)胞樣品與(a)自身抗原和(b)抗原提呈細(xì)胞群接觸，從而由此活化CD4+細(xì)胞群； )洗滌所述活化的CD4+細(xì)胞群從而除去所述自身抗原； iii)在所述受試者的CD8+T細(xì)胞群存在下共同培養(yǎng)部分步驟B)ii)的所述活化的CD4+細(xì)胞群和一定量的抗原提呈細(xì)胞； iv)量化來(lái)自步驟B)iii)的所述活化的CD4+細(xì)胞的增殖；和 V)利用不同量的自身抗原重復(fù)步驟B) i)至步驟B) iv)，從而測(cè)定引發(fā)所述活化的CD4+細(xì)胞的最大増殖所需的自身抗原的量并由此測(cè)定所述外周血單核細(xì)胞樣品的自身抗原的ED50 ； 其中步驟A)和B)能夠以任意順序進(jìn)行； 和 C)比較所述自身抗原的ED5tl和所述外來(lái)抗原的ED5tl, 其中所述外來(lái)抗原的ED5tl高于所述自身抗原的ED5tl表明所述受試者的CD8+T細(xì)胞不能區(qū)分自我和非我，而其中所述外來(lái)抗原的ED5tl等于或小于所述自身抗原的ED5tl表明所述受試者的CD8+T細(xì)胞能夠區(qū)分自我和非我。
13.測(cè)定受試者的⑶8+T細(xì)胞是否能夠功能性地識(shí)別HLA-E/Hsp60sp靶結(jié)構(gòu)的方法，所述方法包括 a)使所述受試者的⑶8+T細(xì)胞樣品與荷載有Hsp60sp的HLA-E+細(xì)胞接觸； b)量化步驟a)中的荷載有Hsp60sp且與所述受試者的CD8+T細(xì)胞接觸的HLA-E+細(xì)胞的増殖； c)使所述受試者的CD8+T細(xì)胞樣品與荷載有不與HLA-E結(jié)合的肽的HLA-E+細(xì)胞接觸； d)量化步驟c)中的荷載有不與HLA-E結(jié)合的所述肽且與所述受試者的CD8+T細(xì)胞接觸的HLA-E+細(xì)胞的增殖；和 e)比較步驟d)中量化的増殖和步驟b)中量化的増殖，其中步驟d)中量化的増殖的量大于步驟b)中量化的増殖的量表明所述受試者的CD8+T細(xì)胞能夠功能性地識(shí)別HLA-E/Hsp60sp靶結(jié)構(gòu)，而其中在步驟d)中量化的增殖的量小于步驟b)中量化的増殖的量表明所述受試者的CD8+T細(xì)胞不能功能性地識(shí)別HLA-E/Hsp60sp祀結(jié)構(gòu)。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中步驟a)和/或步驟c)中的所述受試者的CD8+T細(xì)胞樣品是從所述受試者獲得的外周血單核細(xì)胞樣品。
15.如權(quán)利要求13-14中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述受試者患有自身免疫性疾病。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述自身免疫性疾病是I型糖尿病。
17.如權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述受試者是人。
18.測(cè)定受試者是否可能發(fā)展為自身免疫性病癥的方法，所述方法包括測(cè)定受試者的CD8+T細(xì)胞是否能夠區(qū)分自我和非我，其中CD8+T細(xì)胞不能區(qū)分自我和非我的受試者被確定為可能發(fā)展為自身免疫性疾病。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中通過(guò)權(quán)利要求12所述的方法來(lái)確定所述受試者的CD8+T細(xì)胞能夠區(qū)分自我和非我。
20.測(cè)定患有自身免疫性疾病的受試者是否能夠通過(guò)施用荷載有Hsp60sp的細(xì)胞治療所述免疫疾病的方法，所述方法包括測(cè)定所述受試者的CD8+T細(xì)胞是否功能性地識(shí)別HLA-E/Hsp60sp靶結(jié)構(gòu)，其中CD8+T細(xì)胞不能功能性地識(shí)別HLA-E/Hsp60sp靶結(jié)構(gòu)的患有自身免疫性疾病的受試者被確定為能夠通過(guò)施用荷載Hsp60sp的細(xì)胞來(lái)治療。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中通過(guò)權(quán)利要求13所述的方法確定所述受試者的CD8+T細(xì)胞能夠功能性地識(shí)別HLA-E/Hsp60sp靶結(jié)構(gòu)。
22.測(cè)定受試者的HLA-E限制性⑶8+T細(xì)胞是否被HLA-E/Hsp60sp活化的方法，所述方法包括 a)使從所述受試者獲得的包含HLA-E限制性⑶8+T細(xì)胞的樣品與包含HLA-E/Hsp60sp的組合物接觸；和 b)檢測(cè)步驟(a)是否引起所述樣品的HLA-E限制性CD8+T細(xì)胞分泌細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞溶解酶， 其中所述樣品的HLA-E限制性CD8+T細(xì)胞分泌細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞溶解酶表明所述受試者的HLA-E限制性⑶8+T細(xì)胞被HLA-E/Hsp60sp活化，而其中在步驟b)中沒(méi)有可檢測(cè)的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞溶解酶的分泌表明所述受試者的HLA-E限制性CD8+T細(xì)胞沒(méi)有被HLA-E/Hsp60sp活化。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述包含HLA-E/Hsp60sp的組合物是經(jīng)轉(zhuǎn)染表達(dá)HLA-E且荷載有Hsp60sp的細(xì)胞。
24.如權(quán)利要求22或23任一項(xiàng)所述的方法，其中所述經(jīng)轉(zhuǎn)染表達(dá)HLA-E的細(xì)胞是B721細(xì)胞。
25.如權(quán)利要求22-24中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞溶解酶是穿孔素、顆粒酶A或顆粒酶B。
26.如權(quán)利要求22-25中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品是血液樣品或者源自血液。
27.如權(quán)利要求22-26中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)使所述樣品與結(jié)合有可檢測(cè)的標(biāo)記物的抗細(xì)胞溶解酶抗體接觸來(lái)檢測(cè)所述細(xì)胞溶解酶。
28.鑒定樣品中的功能性HLA-E限制性⑶8+T細(xì)胞的方法，所述方法包括 a)使所述樣品與包含HLA-E/Hsp60sp的組合物接觸；和 b)檢測(cè)步驟(a)是否引起所述樣品的細(xì)胞分泌細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞溶解酶， 其中所述樣品的細(xì)胞分泌細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞溶解酶表明所述樣品包含功能性HLA-E限制性⑶8+T細(xì)胞。
29.預(yù)防性地治療受試者而免于發(fā)展為自身免疫性疾病的方法，所述方法包括向所述受試者施用荷載有Hsp60sp肽的樹突細(xì)胞從而活化所述受試者中的HLA-E限制性CD8+T細(xì)胞并由此預(yù)防性地治療所述受試者而免于發(fā)展為所述自身免疫性疾病。
30.治療患有自身免疫性疾病的受試者的方法,所述方法包括向所述受試者施用荷載有Hsp60sp肽的樹突細(xì)胞從而活化所述受試者中的HLA-E限制性CD8+T細(xì)胞并由此治療所述自身免疫性疾病。
31.治療患有自身免疫性疾病的受試者的方法,所述方法包括 a)測(cè)定從所述受試者獲得的HLA-E限制性CD8+T細(xì)胞是否能夠區(qū)分自我和非我；和 b)如果在步驟a)中測(cè)定的所述受試者的HLA-E限制性CD8+T細(xì)胞不能區(qū)分自我和非我，則向所述受試者施用荷載有Hsp60sp的外來(lái)體或樹突細(xì)胞從而活化所述受試者中的HLA-E限制性CD8+T細(xì)胞并由此治療所述自身免疫性疾病。
32.如權(quán)利要求29、30或31所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是I型糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、銀屑病、硬皮病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡，在實(shí)施方式中，所述自身免疫性疾病是斑禿、強(qiáng)直性脊柱炎、抗磷脂綜合征、自身免疫性阿狄森氏病、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性肝炎、自身免疫性內(nèi)耳病、自身免疫性淋巴細(xì)胞增生綜合征(ALPS)、自身免疫性血小板減少性紫癜(ATP)、白塞氏病、大皰性類天皰瘡、心肌病、乳糜瀉-皮膚炎、慢性疲勞免疫功能障礙綜合征(CFIDS)、慢性炎癥性脫髓鞘多發(fā)性神經(jīng)病、瘢痕性類天皰瘡、冷凝集素病、肢端硬皮綜合征、克隆氏病、德戈斯病、皮肌炎、幼年型皮肌炎、盤狀狼瘡、原發(fā)性混合型冷球蛋白血癥、纖維肌痛-纖維肌炎、格雷夫斯病、格-巴ニ氏綜合征、橋本氏甲狀腺炎、特發(fā)性肺纖維化、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、IgA腎病、胰島素依賴型糖尿病(I型)、幼年型關(guān)節(jié)炎、狼瘡、美尼爾氏病、混合結(jié)締組織病、多發(fā)性硬化、重癥肌無(wú)力、尋常性天皰瘡、惡性貧血、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、多軟骨炎、多腺性綜合征、風(fēng)濕性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原發(fā)性無(wú)丙種球蛋白血癥、原發(fā)性膽汁性肝硬化、銀屑病、雷諾氏現(xiàn)象、賴特氏綜合征、風(fēng)濕熱、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病、硬皮病、干燥綜合征、全身肌強(qiáng)直綜合征、大動(dòng)脈炎、顳動(dòng)脈炎/巨細(xì)胞動(dòng)脈炎、潰瘍性結(jié)腸炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜風(fēng)或韋格納肉芽腫。
33.如權(quán)利要求29-32中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述Hsp60sp肽具有SEQID ΝΟ:1所示的序列。
34.如權(quán)利要求29-33中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樹突細(xì)胞為不成熟的樹突細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及測(cè)定受試者的CD8+T細(xì)胞是否功能性地識(shí)別HLA-E/Hsp60sp靶結(jié)構(gòu)的方法，該方法包括a)使所述受試者的CD8+T細(xì)胞樣品與荷載有Hsp60sp的HLA-E+細(xì)胞接觸，b)量化所接觸的HLA-E+的增殖，c)使受試者的CD8+T細(xì)胞樣品與荷載有不與HLA-E結(jié)合的肽的HLA-E+細(xì)胞接觸，d)在接觸受試者的CD8+T細(xì)胞后量化荷載有不與HLA-E結(jié)合的肽的HLA-E+細(xì)胞的增殖，e)比較在步驟d)中量化的增殖和步驟b)中量化的增殖。
文檔編號(hào)G01N33/53GK102725634SQ201080037955
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2010年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月24日
發(fā)明者L·舍斯, 蔣紅 申請(qǐng)人:紐約市哥倫比亞大學(xué)理事會(huì)