專利名稱：衣霉素在制備抑制前列腺癌細胞遷移的藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種天然的核苷酸抗生素衣霉素在制備抑制前列腺癌細胞遷移的藥物中的應用。

背景技術：
前列腺癌是全世界范圍內最常見的惡性腫瘤。在美國其發(fā)病率居男性惡性腫瘤首位，死亡率居第二位。隨著人口老齡化和飲食結構的改變，前列腺癌已經(jīng)成為威脅我國老年男性健康的重大疾病。
目前，前列腺癌的治療可分為以下幾種1根治性前列腺切除術主要適用于前列腺癌局限在前列腺以內者，但沒有已侵犯精囊和淋巴結者經(jīng)根治手術后獲長期生存。前列腺癌根治術的手術死亡率1％～5％。目前較廣泛應用的該手術即“保留神經(jīng)的前列腺根治術”。2放射治療外照射80％～90％前列腺癌可得到控制，失敗常因為有轉移。放射治療會伴有很多并發(fā)癥。3內分泌治療前列腺細胞的正常代謝功能依賴于雄激素，在前列腺內變?yōu)殡p氫睪酮，其中僅3％為游離的功能性睪酮，進入前列腺細胞漿內，使之成為雙氫睪酮，隨后與受體結合成復合物進入細胞核，結合于核染色質的DNA；激活的DNA產(chǎn)生mRNA，變應為前列腺細胞蛋白的密碼，對其代謝極為重要，前列腺內細胞對雄激素的信賴各不相同，癌細胞大多數(shù)信賴于雄激素，內分泌治療直接去除雄激素可抑制其生長。4睪丸切除術睪丸切除可使血清睪酮從500ng/dI降至50ng/dl，從而有效地阻止了大多數(shù)依賴雄激素前列腺癌的代謝，使癌消退。睪丸切除術后可能出現(xiàn)陣發(fā)性發(fā)熱、出汗、陽萎等。5雌激素可通過垂體性腺軸降低睪酮水平，抑制垂體釋放促性腺激素黃體化激素(LH)，亦可增加性類固醇結合球蛋白，降低睪丸內睪酮的合成，增加垂體催乳素分泌，降低前列腺細胞內DNA合成，從而使睪酮達到去睪水平，對心血管系統(tǒng)有并發(fā)癥，雌激素連續(xù)應用二年以上去睪成為不可逆。6抗雄激素藥物它們主要作用是阻止雄激素作用于靶細胞，抑制前列腺細胞核的DNA合成。7促性腺釋放激素類似物長期大量應用不僅會引起促性腺激素分泌過多，反而抑制垂體釋放促性腺激素，該藥優(yōu)點是副作用少，無心血管并發(fā)癥，停藥后睪丸功能有可復性。8化學治療由于前列腺癌70％～80％左右依賴雄激素，故優(yōu)先考慮內分泌治療，化學治療常用在內分泌，放射等治療失敗以后采用。
抗生素(Antibiotics)是一類在低濃度時能選擇性地抑制或殺滅其它微生物的低分子量微生物次生代謝產(chǎn)物。自從1929年英國學者弗萊明首先發(fā)現(xiàn)了青霉素以后，抗生素在抗感染、治療癌癥等方面發(fā)揮了重大的作用。在應用于臨床以后，人們對抗生素進行了人為的加工和改造，使得抗生素的冶療效果不斷提高。抗生素是自然賜予人類的寶物，一直到目前為止，都是人類對抗疾病的最直接的武器，在醫(yī)藥領域有著重要的價值，在臨床應用上有不可替代的作用。
在對前列腺癌細胞的研究中我們發(fā)現(xiàn)，按照對雄激素的敏感性，前列腺癌分為激素依賴性和激素非依賴性。體內外實驗發(fā)現(xiàn)，去除睪酮可以引起激素依賴性前列腺癌細胞的凋亡。但是激素非依賴性前列腺癌則失去了正常的細胞凋亡調節(jié)，而且惡性度高，經(jīng)常發(fā)生骨轉移或肺轉移，是臨床致死的重要原因。而實驗中我們所用的PC3細胞正是激素非依賴性前列腺癌細胞。尋求恢復激素非依賴性前列腺癌細胞凋亡的新型分子機制也是腫瘤細胞學前列腺癌領域的重要課題。
文獻報道，CD147分子與前列腺癌PC3細胞的侵襲和轉移相關，封閉CD147分子可以減低PC3細胞的侵襲和轉移能力。CD147是一個跨膜糖蛋白家族，高表達于上皮來源的腫瘤細胞表面，如肺癌，肝癌，乳腺癌等。CD147通過誘導MMP(基質金屬蛋白酶)的分泌促進了腫瘤的浸潤，轉移?；|金屬蛋白酶能降解多種細胞外基質成分，包括層粘蛋白、纖粘蛋白、膠原和基底膜糖蛋白，是癌細胞破壞間質機械屏障，得以向癌周組織浸潤、擴散的最為重要的一類蛋白水解酶。
我們考慮尋找到一種抗生素可使CD147蛋白去糖基化，阻礙或者降低其對基質金屬蛋白酶的分泌，從而抑制癌細胞向癌周組織浸潤、擴散。


發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種核苷酸抗生素衣霉素，應用于制備前列腺癌細胞遷移的藥物。
我們了解到CD147蛋白對于前列腺癌PC3細胞侵襲和轉移具有十分重要的作用?？紤]尋找到一種抗生素使CD147蛋白去糖基化，阻礙或者降低其對基質金屬蛋白酶的分泌，從而抑制癌細胞向癌周組織浸潤、擴散。首先在實驗室中培養(yǎng)PC3細胞；然后試用若干種抗生素，例如四環(huán)素、青霉素等等，最終發(fā)現(xiàn)衣霉素(購于FERMENTEK生物制品公司，為唯一性產(chǎn)品。)可阻斷CD147蛋白的糖基化，應用Western blot實驗技術檢測并證實衣霉素處理后PC3細胞中CD147蛋白去糖基化；再次應用劃痕損傷測量了衣霉素處理后PC3細胞的遷移速率，以觀察在衣霉素的處理作用后，PC3細胞的遷移速率是否減緩；最后流式細胞術檢測衣霉素處理后PC3細胞周期變化。
有益效果在癌癥的治療中，癌細胞的遷移和浸潤是影響治療效果的一個難點，衣霉素可以使CD147蛋白去糖基化從而降低PC3細胞的遷移能力，可以開發(fā)為一種新的抑制癌細胞遷移的藥物。



圖1為經(jīng)衣霉素處理后，不同組PC3細胞中CD147蛋白去糖基化水平Western blot結果圖； 圖2為PC3細胞劃痕損傷后細胞遷移距離變化圖； 圖3為未加衣霉素處理的PC3細胞劃痕損傷48h后的細胞遷移圖； 圖4為1ug/ml衣霉素處理后，PC3細胞劃痕損傷48h后的細胞遷移圖； 圖5為0ug/ml衣霉素處理后，PC3細胞劃痕損傷48h后的細胞遷移圖； 圖6為加衣霉素處理的PC3細胞流式圖； 圖71ug/ml衣霉素處理后，PC3細胞的流式圖； 圖810ug/ml衣霉素處理后，PC3細胞的流式圖。

具體實施例方式 1、PC3細胞的培養(yǎng) 從-80℃冰箱中取出凍存的PC3細胞，迅速轉移到37℃水浴鍋中使細胞速溶，800r離心5分鐘，棄上清。用1ml完全培養(yǎng)基將凍存管中的細胞懸起，800r離心5分鐘，棄上清。1ml完全培養(yǎng)基將細胞懸起，用槍吸至10`厘米細胞培養(yǎng)板，加入7ml完全培養(yǎng)基，混勻細胞，放在37℃ 5％CO2恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)至細胞長滿10`厘米細胞培養(yǎng)板。
注完全培養(yǎng)基為DMEM基本培養(yǎng)基中加入10％胎牛血清，1‰雙抗。
2、Western blot檢測CD147蛋白去糖基化水平 在12孔細胞培養(yǎng)板中鋪4個玻璃片備用。消化PC3細胞后分別向12孔板中鋪好玻璃片的4個孔中加入各100ul/孔的PC3細胞，1ml完全培養(yǎng)基。將細胞混勻，用槍頭輕輕壓實鋪在12孔板中的玻璃片，以防止氣泡存留。
將12孔板、放入37℃5％CO2恒溫培養(yǎng)箱中，待細胞長至80％-90％，將細胞分為三組加入以下藥品對照組，1ug衣霉素組，10ug衣霉素組。放入恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時，取出細胞。同上，將細胞分成三組，加藥處理，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時，取出細胞。
吸去培養(yǎng)基，500ul/孔預冷PBS洗細胞，吸出。收集細胞，裂解超聲后對蛋白用BCA蛋白定量試劑盒對其進行蛋白定量。之后將該膜樣品等蛋白量進行SDS-PAGE，并電轉移至PVDF膜上，5％脫脂奶粉室溫封閉1h，與1∶500稀釋后的一抗孵育2h，TBST洗膜3次，每次15min，然后與1∶2000稀釋后的二抗室溫孵育1h，TBST洗膜3次，每次15min，用ECL化學發(fā)光試劑盒發(fā)光顯影，于暗室中進行曝光，顯影，定影。
3、劃痕損傷測量細胞遷移速率 鋪PC3六孔板細胞，加入DMEM完全培養(yǎng)及，恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細胞密度達到80％-90％時，吸去完全培養(yǎng)基，PBS洗一遍換用DMEM基本培養(yǎng)基，使細胞同步化，24小時后吸去基本培養(yǎng)基，用200ul槍頭沿孔板直徑劃痕，PBS洗去劃痕脫落細胞，加入DMEM完全培養(yǎng)基，將細胞分三組做如下處理對照組，1ug衣霉素組，10ug衣霉素組。分別在0h，15h，24h，48h小時用倒置顯微鏡照相，并用ImageJ軟件分析劃痕后細胞遷移變化，主要測量不同時段的劃痕距離，每組測5個值取平均數(shù)。
4、流式細胞儀檢測細胞周期變化 收集上述步驟加藥48小時后的細胞培養(yǎng)液，2000轉離心5分鐘，PBS洗6孔板，100ul/孔胰酶消化細胞，37℃消化2分鐘，培養(yǎng)液終止消化。將消化下的細胞轉至1.5mlEP管中，2000轉離心5分鐘。棄上情，PBS洗細胞一次，離心收集細胞。加0.1ml/孔預冷70％乙醇固定，40分鐘。PBS洗掉乙醇，離心棄上清。加入PI染液0.1ml/孔，4℃避光染色2小時，流式細胞儀分析細胞狀況。
5、結果的分析 (1)、Western blot檢測CD147去蛋白糖基化水平 Western blot檢測結果如圖1所示。六組蛋白分別對應六組細胞，從左到右依次為培養(yǎng)24h對照組；培養(yǎng)24h加入1ug/ml衣霉素處理組；培養(yǎng)24h加入10ug/ml衣霉素處理組；培養(yǎng)48h對照組；培養(yǎng)48h加入1ug/ml衣霉素處理組；培養(yǎng)48h加入10ug/ml衣霉素處理組。對應加入衣霉素的四組出現(xiàn)了特異性反應條帶，同預期的結果相一致，對照組未出現(xiàn)此反應條帶，表明衣霉素確實阻斷了PC3細胞中CD147蛋白的糖基化過程。
(2)、劃痕損傷測量細胞遷移速率 劃痕測量數(shù)據(jù)見表1、圖2，對照組的PC3細胞在劃痕48小時后趨于將劃痕部位長滿；1ug衣霉素作用下細胞遷移速率較對照組慢；10ug衣霉素作用下細胞遷移較1ug衣霉素組更慢。這些變化也可以通過圖3、4、5表現(xiàn)出來。以上結果說明衣霉素可以使CD147蛋白去糖基化，從而降低PC3細胞的遷移能力，且PC3細胞的遷移能力對衣霉素呈劑量依賴，未見衣霉素有促進PC3細胞凋亡的作用。
表1 PC3細胞在不同處理條件下隨時間變化劃痕距離的變化

(3)、流式細胞檢測結果 圖6、7、8為細胞流式結果圖，從圖中峰值變化及數(shù)據(jù)我們可以發(fā)現(xiàn)在不加藥的情況下，處于S期的PC3細胞為38.764％，G2期0.510％，加入10ug衣霉素后，處于S期的PC3細胞為17.557％，G2期10.196％，加入1ug衣霉素后，處于S期的PC3細胞為17.873％，G2期0.547％，說明衣霉素可以促使PC3細胞提前進入G2期。
綜上，可以看出衣霉素在對PC3細胞的作用中只體現(xiàn)出了抑制細胞遷移的作用，并沒有促進PC3細胞凋亡的作用，且10ug的衣霉素比1ug時對細胞的遷移能力影響更大。流式檢測細胞周期結果表明，衣霉素是通過影響細胞周期中S期和G2的變化來影響細胞的遷移能力的，是由于衣霉素使CD147蛋白去糖基化向胞漿轉移，通過某些信號因子傳遞到細胞核，使細胞核對細胞周期產(chǎn)生了影響。
權利要求
1.衣霉素在制備抑制前列腺癌細胞遷移的藥物中的應用，其特征是此種抗生素可阻斷CD147蛋白的糖基化，從而抑制了PC3細胞的浸潤和擴散。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術領域，具體涉及衣霉素在制備抑制前列腺癌細胞遷移的藥物中的應用。CD147蛋白對于前列腺癌PC3細胞侵襲和轉移具有十分重要的作用。尋找到一種抗生素使CD147蛋白去糖基化，阻礙或者降低其對基質金屬蛋白酶的分泌，抑制癌細胞向癌周組織浸潤、擴散。首先培養(yǎng)PC3細胞；然后試用若干種抗生素，應用Western blot實驗技術檢測，證實此種抗生素處理后PC3細胞中CD147蛋白去糖基化；再應用劃痕損傷測量了此種抗生素處理后PC3細胞的遷移速率；最后流式細胞術檢測抗生素處理后PC3細胞周期變化。此種抗生素可抑制了PC3細胞的浸潤和擴散。從而開發(fā)為一種新藥。
文檔編號A61K31/7072GK101810634SQ201010164879
公開日2010年8月25日 申請日期2010年5月7日 優(yōu)先權日2010年5月7日
發(fā)明者李曉萌, 潘瑩, 高陽, 金浩, 王妍青 申請人:東北師范大學