專利名稱：：奧沙利鉑殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束及應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬奧沙利鉬靶向制劑的制備與應用，具體涉及奧沙利鉬殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束的制備及其應用。
背景技術：
：化學療法是目前治療癌癥的一種重要手段。然而大多數(shù)化學治療藥物都缺乏體內特異的生物分布，由此導致對正常的細胞及器官造成毒副作用，從而使它們的臨床應用受到限制。此外，腫瘤細胞對藥物的耐藥性以及多藥耐藥性也成為導致腫瘤化療失敗的一個很重要的因素。鉬類藥物是一種具有光譜抗癌活性的化療藥物，也被稱為DNA烷化劑。奧沙利鉬是第三代鉬類抗腫瘤藥物，它通過使DNA交叉連接及抑制DNA合成達到殺死癌細胞的目的。然而奧沙利鉬本身缺乏對腫瘤組織的靶向性，在腫瘤組織中的藥物分布量很少，而且與紅細胞之間的有高度隔離，使得其治療效力大大降低，同時也導致了高發(fā)性的藥物毒副反應如末梢的感覺神經病變以及血小板減少癥等，從而限制了奧沙利鉬的臨床應用。此外，在治療過程中腫瘤組織對奧沙利鉬耐受性的產生也成為導致其化療失敗的一個主要原因。因此，開發(fā)具有靶向性的新型藥物傳遞系統(tǒng)就顯得尤為重要。過去十幾年里已有關于脂質體、納米顆粒等作為藥物載體的報導，值得一提的是近年來新發(fā)展起來的聚合物膠束，被認為是一種具有很大潛力的新型藥物載體。聚合物膠團(polymericmicelles,PMs)由兩親性的聚合物在水性環(huán)境中自發(fā)形成，它以疏水性嵌段作為內核，親水性嵌段作為外殼，具有獨特的核-殼結構。其內核可為難溶性藥物提供儲庫，親水性外殼可使得它在水性環(huán)境中很好地分散，并可對其進行理化性質修飾從而得到我們所期望的特性。聚合物膠束由于其疏水性表面以及較小的粒徑(IO-IOOnm)，可以逃避單核巨噬細胞的吞噬。聚合物膠團自身可通過“增強的滲透及滯留效應”(enhancedpermeabilityandretentioneffect)即EPR效應實現(xiàn)被動靶向，將藥物聚集到腫瘤組織。聚合物膠團還可以通過配體修飾，實現(xiàn)對腫瘤組織的主動靶向。目前，已有將聚合物膠束作為奧沙利鉬藥物載體的報道。Cabral等制備了聚乙二醇和聚谷氨酸的嵌段共聚物[PEG-b-P(Glu)]，用其包裹奧沙利鉬得到的載藥膠團，其體內抗腫瘤活性結果顯示，與游離藥物相比，該載藥膠團大大提高了藥物的抗腫瘤活性，并且具有很好的對腫瘤組織的分布，其在腫瘤組織中的藥物濃度與游離藥物相比提高了20倍。由于奧沙利鉬具有一定的水溶性，用聚合物膠束進行包裹還存在一些困難，關于這方面的報道并不是很多。殼聚糖是一種具有低毒、高生物相容性、可體內降解的陽離子型載體材料。將硬脂酸(stearicacid,SA)嫁接到殼聚糖(chitosan，CS0)的主鏈上，得到兩親性殼聚糖-硬脂酸嫁接物(stearicacid-graftedchitosanoligosaccharide，CSO-SA)。研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖_硬脂酸嫁接物可在水性介質中通過自聚集形成膠束，并具有快速細胞攝取的功能。本發(fā)明采用殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束包封第三代鉬類抗腫瘤藥物奧沙利鉬，制備奧沙利鉬殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束細胞內給藥制劑，通過提高腫瘤細胞內的藥物濃度，提高細胞毒性并逆轉多藥耐藥，為提高奧沙利鉬的臨床抗腫瘤效力提供可能。
發(fā)明內容本發(fā)明的一個目的是提供一種奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束，是為分子靶標位于細胞內的奧沙利鉬，提供一種靶向給藥載體材料，由殼聚糖-硬脂酸嫁接物、奧沙利鉬、卵磷脂和水所組成，其中殼聚糖-硬脂酸嫁接物占總重量的0.5%、奧沙利鉬占總重量的0.009-0.02%、卵磷脂占總重量的0-0.2%、水占總重量的99.27-99.49%；殼聚糖-硬脂酸嫁接物由平均分子量1.5kD51kD的低分子量殼聚糖，與CltlC22的脂肪酸化學嫁接形成，殼聚糖-硬脂酸嫁接物中殼寡糖的氨基取代度為50%。當殼聚糖-硬脂酸嫁接物濃度超過臨界膠束濃度時，在水性介質中可自發(fā)形成嫁接物膠束，膠束具備被細胞快速攝取的功能。本發(fā)明的嫁接物膠束的組成已為專利“表面修飾疏水改性殼寡糖聚合物給藥膠團及其制備方法”(專利號ZL200610051601.0)所涵蓋。本發(fā)明的奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束通過以下制備方法獲得首先采用專利號ZL200610051601.0的方法合成殼聚糖-硬脂酸嫁接物取殼聚糖0.5g,精密稱量，加30mL去離子水80°C下攪拌溶解，稱取硬脂酸0.825g和碳二亞胺(EDC)5.5g，攪拌溶解溶于17mL無水乙醇溶液中，加熱至80°C。在400rpm磁力攪拌條件下將上述乙醇溶液加入殼聚糖溶液中，80°C恒溫攪拌反應4小時，冷卻至室溫(25°C)，將終反應液置透析袋中，蒸餾水透析3天。透析液冷凍干燥后，以無水乙醇洗滌去除殘留的硬脂酸，得殼聚糖_硬脂酸嫁接物。然后通過下述三種方法分別制備奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束(1)探頭超聲法取25mg殼寡糖-硬脂酸嫁接物，精密稱定，加入5mL去離子水，冰浴探頭超聲10次(400w，工作2s停3s)，得5mg/mL的膠束溶液。加入0.5mL藥物濃度為5mg/mL的奧沙利鉬水溶液。冰浴條件下探頭超聲50次(400W，工作2s停3s)，得奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束溶液。(2)薄膜分散法取25mg殼寡糖-硬脂酸嫁接物，精密稱定，加入0.5mL藥物濃度為5mg/mL的奧沙利鉬水溶液中，水浴探頭超聲(同a)溶解后加入0.75mL無水乙醇溶液。45°C下旋轉蒸發(fā)除去溶劑，得到載藥膠束薄膜，將其用5mL去離子水分散，得奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束溶液。(3)卵磷脂介導薄膜分散法取25mg殼寡糖-硬脂酸嫁接物，精密稱定，加入0.5mL藥物濃度為5mg/mL的奧沙利鉬水溶液中，水浴超聲溶解后加入溶度為10mg/mL的卵磷脂乙醇溶液0.75mL。45°C下旋轉蒸發(fā)除去溶劑，得到載藥膠束薄膜，將其用5mL去離子水分散，得奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束溶液。本發(fā)明的另一個目的是提供奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束在制備抗腫瘤藥物中的應用。尤其在在制備抗乳腺癌、大腸癌、肝癌、卵巢癌、白血病藥物中的應用。與奧沙利鉬溶液劑相比，通過奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束給藥，可顯著提高腫瘤細胞內的藥物濃度，提高細胞毒性并逆轉多藥耐藥。本發(fā)明的有益之處是殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束具有聚合物膠束體內的被動靶向和腫瘤細胞的快速攝取功能，通過殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束對奧沙利鉬的包封，可大大提高分子靶標位于腫瘤細胞內的奧沙利鉬的細胞內藥物濃度，提高細胞毒性并逆轉多藥耐藥，為提高奧沙利鉬的臨床抗腫瘤效力提供可能。附圖表說明圖1為奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束對不同腫瘤細胞的生長抑制曲線。圖2為敏感和耐藥腫瘤細胞內藥物濃度的經時變化。具體實施例方式本發(fā)明結合附圖和實施例作進一步的說明。實施例一1)低分子量殼聚糖的制備取市售分子量為450kDa的殼聚糖(脫乙酰度為95%)90g，加至3000mLl.25%(ν/ν)的鹽酸水溶液中，5560°C溫度條件下，溶漲2小時后，加入5%的纖維素酶(w/w)，在5560°C溫度條件下進行降解?？刂品磻獪囟群蜁r間，得低分子量殼聚糖。所得降解反應液，使用50Kda和IOKda超濾膜(Biomax-10,MilliporeCo.，USA)超濾分級后，取分子量1050Kda超濾液冷凍干燥。凝膠滲透色譜法測定殼聚糖分子量，采用TSK-gelG3000SW色譜柱，0.lmol/L醋酸鈉(ρΗ6·0)為流動相，以分子量0.73，5.9，11.8，47.3，212.0，788.OKda的葡聚糖標樣制備洗脫曲線，用該洗脫曲線計算殼聚糖分子量。經測定所得殼聚糖的重均分子量為18.OkDa02)殼聚糖_硬脂酸嫁接物合成取上述殼聚糖0.5g，精密稱量，加30mL去離子水80°C下攪拌溶解，稱取硬脂酸0.825g和碳二亞胺伍005.58，攪拌溶解溶于17!^無水乙醇溶液中，加熱至801。在400rpm磁力攪拌條件下將上述乙醇溶液加入殼聚糖溶液中，80°C恒溫攪拌反應4小時，冷卻至室溫(25°C)，將終反應液置透析袋中，蒸餾水透析3天。透析液冷凍干燥后，以無水乙醇洗滌去除殘留的硬脂酸，得殼聚糖_硬脂酸嫁接物。采用2，4，6-三硝基苯磺酸(2，4，6-trinitrobenzenesulfonicacid,TNBS)法測定殼聚糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度(substitutiondegree,SD)。取同分子量的殼聚糖10mg，置于IOml的容量瓶中，用去離子水定容，即得到lmg/ml的殼聚糖儲備液，分別取0、10、50、100、200、300、400、500μ1，用去離子水定容至2.0ml，加入4%碳酸氫納2.Oml和0.1%三硝基苯磺酸2.0ml，于37°C水浴孵育2h。加入2.Omol/L鹽酸2ml，搖勻，超聲趕走氣泡，利用紫外分光光度計在344nm處測定吸光度，制備標準曲線。另精密稱定嫁接物10mg，置于IOml容量瓶中，去離子水定容。取300μ1，同法操作，測定344nm處的吸光度，按標準曲線計算聚合物的氨基取代度為6.89%采用芘熒光法測定殼聚糖-硬脂酸嫁接物的臨界膠束濃度。取0.0012mg/ml芘的丙酮溶液0.5ml放入IOml的試管中，50°C下?lián)]干丙酮。配制0.00lmg/mllmg/ml不同濃度的嫁接物溶液，分別取5ml加入到上述試管中(芘終濃度為7X10-7mol/L)，室溫水浴超聲30min。掃描芘的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，測定在374nm和385nm熒光強度，并以測定1375/1385傾斜率的突然變化確定該嫁接物的臨界膠束濃度為0.119mg/mL。采用微粒粒度及表面電位分析儀，測定殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束的粒徑和表面電位。經測定，lmg/mL的殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束的粒徑和表面電位分別為34.Snm和50.8mV03)奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束制備取25mg殼寡糖-硬脂酸嫁接物，精密稱定，加入5mL去離子水，冰浴探頭超聲10次(400w,工作2s停3s)，得5mg/mL的膠束溶液。加入0.5mL藥物濃度為5mg/mL的奧沙利鉬水溶液。冰浴條件下探頭超聲50(400W,工作2s停3s)，得奧沙利鉬殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束溶液。lmg/mL殼聚糖-硬脂酸嫁接物濃度的奧沙利鉬殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束的粒徑、電位及通過電感耦合等離子質譜儀(ICP-MS)測得的藥物包封率和載藥量結果見表1。殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束的數(shù)均粒徑為30.4nm,電位為50.3mV，藥物包封率為18.1%，藥物負載量為1.78%。實施例二1)低分子量殼聚糖的制備取市售分子量為450kDa的殼聚糖(脫乙酰度為95%)90g，加至3000mLl.25%(ν/ν)的鹽酸水溶液中，5560°C溫度條件下，溶漲2小時后，加入5%的纖維素酶(w/w)，在5560°C溫度條件下進行降解?？刂品磻獪囟群蜁r間，得低分子量殼聚糖。所得降解反應液，使用50Kda和IOKda超濾膜(Biomax-10,MilliporeCo.，USA)超濾分級后，取分子量1050Kda超濾液冷凍干燥。凝膠滲透色譜法測定殼聚糖分子量，采用TSK-gelG3000SW色譜柱，0.lmol/L醋酸鈉(ρΗ6·0)為流動相，以分子量0.73，5.9，11.8，47.3，212.0，788.OKda的葡聚糖標樣制備洗脫曲線，用該洗脫曲線計算殼聚糖分子量。經測定所得殼聚糖的重均分子量為18.OkDa02)殼聚糖_硬脂酸嫁接物合成取上述殼聚糖0.5g，精密稱量，加30mL去離子水80°C下攪拌溶解，稱取硬脂酸0.825g和碳二亞胺(EDC)5.5g，攪拌溶解溶于17mL無水乙醇溶液中，加熱至80°C。在400rpm磁力攪拌條件下將上述乙醇溶液加入殼聚糖溶液中，80°C恒溫攪拌反應4小時，冷卻至室溫(25°C)，將終反應液置透析袋中，蒸餾水透析3天。透析液冷凍干燥后，以無水乙醇洗滌去除殘留的硬脂酸，得殼聚糖_硬脂酸嫁接物。采用2，4，6-三硝基苯磺酸(2，4，6-trinitrobenzenesulfonicacid,TNBS)法測定殼聚糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度(substitutiondegree,SD)。取同分子量的殼聚糖10mg，置于IOml的容量瓶中，用去離子水定容，即得到lmg/ml的殼聚糖儲備液，分別取0、10、50、100、200、300、400、500μ1，用去離子水定容至2.0ml，加入4%碳酸氫納2.Oml和0.三硝基苯磺酸2.0ml，于37°C水浴孵育2h。加入2.Omol/L鹽酸2ml，搖勻，超聲趕走氣泡，利用紫外分光光度計在344nm處測定吸光度，制備標準曲線。另精密稱定嫁接物10mg，置于IOml容量瓶中，去離子水定容。取300μ1，同法操作，測定344nm處的吸光度，按標準曲線計算聚合物的氨基取代度為6.89%采用芘熒光法測定殼聚糖-硬脂酸嫁接物的臨界膠束濃度。取0.0012mg/ml芘的丙酮溶液0.5ml放入IOml的試管中，50°C下?lián)]干丙酮。配制0.00lmg/mllmg/ml不同濃度的嫁接物溶液，分別取5ml加入到上述試管中(芘終濃度為7X10-7mol/L)，室溫水浴超聲30min。掃描芘的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，測定在374nm和385nm熒光強度，并以測定1375/1385傾斜率的突然變化確定該嫁接物的臨界膠束濃度為0.119mg/mL。采用微粒粒度及表面電位分析儀，測定殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束的粒徑和表面電位。經測定，lmg/mL的殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束的粒徑和表面電位分別為34.Snm和50.8mV03)奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束制備取25mg殼寡糖-硬脂酸嫁接物，精密稱定，加入0.5mL藥物濃度為5mg/mL的奧沙利鉬水溶液中，水浴超聲溶解后加入0.75mL無水乙醇溶液。45°C下旋轉蒸發(fā)除去溶劑，得到載藥膠束薄膜，將其用5mL去離子水分散，得奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束溶液。lmg/mL殼聚糖-硬脂酸嫁接物濃度的奧沙利鉬殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束的粒徑、電位及通過電感耦合等離子質譜儀(ICP-MS)測得的藥物包封率和載藥量結果見表1。殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束的數(shù)均粒徑為44.9nm,電位為51.8mV,藥物包封率為41.3%，藥物負載量為3.97%。實施例三1)低分子量殼聚糖的制備取市售分子量為450kDa的殼聚糖(脫乙酰度為95%)90g，加至3000mLl.25%(ν/ν)的鹽酸水溶液中，5560°C溫度條件下，溶漲2小時后，加入5%的纖維素酶(w/w)，在5560°C溫度條件下進行降解?？刂品磻獪囟群蜁r間，得低分子量殼聚糖。所得降解反應液，使用50Kda和IOKda超濾膜(Biomax-10,MilliporeCo.，USA)超濾分級后，取分子量1050Kda超濾液冷凍干燥。凝膠滲透色譜法測定殼聚糖分子量，采用TSK-gelG3000SW色譜柱，0.lmol/L醋酸鈉(ρΗ6·0)為流動相，以分子量0.73，5.9，11.8，47.3，212.0，788.OKda的葡聚糖標樣制備洗脫曲線，用該洗脫曲線計算殼聚糖分子量。經測定所得殼聚糖的重均分子量為18.OkDa02)殼聚糖_硬脂酸嫁接物合成取上述殼聚糖0.5g，精密稱量，加30mL去離子水80°C下攪拌溶解，稱取硬脂酸0.825g和碳二亞胺(EDC)5.5g，攪拌溶解溶于17mL無水乙醇溶液中，加熱至80°C。在400rpm磁力攪拌條件下將上述乙醇溶液加入殼聚糖溶液中，80°C恒溫攪拌反應4小時，冷卻至室溫(25°C)，將終反應液置透析袋中，蒸餾水透析3天。透析液冷凍干燥后，以無水乙醇洗滌去除殘留的硬脂酸，得殼聚糖_硬脂酸嫁接物。采用2，4，6-三硝基苯磺酸(2，4，6-trinitrobenzenesulfonicacid,TNBS)法測定殼聚糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度(substitutiondegree,SD)。取同分子量的殼聚糖10mg，置于IOml的容量瓶中，用去離子水定容，即得到lmg/ml的殼聚糖儲備液，分別取0、10、50、100、200、300、400、500μ1，用去離子水定容至2.0ml，加入4%碳酸氫納2.Oml和0.1%三硝基苯磺酸2.0ml，于37°C水浴孵育2h。加入2.Omol/L鹽酸2ml，搖勻，超聲趕走氣泡，利用紫外分光光度計在344nm處測定吸光度，制備標準曲線。另精密稱定嫁接物10mg，置于IOml容量瓶中，去離子水定容。取300μ1，同法操作，測定344nm處的吸光度，按標準曲線計算聚合物的氨基取代度為6.89%采用芘熒光法測定殼聚糖-硬脂酸嫁接物的臨界膠束濃度。取0.0012mg/ml芘的丙酮溶液0.5ml放入IOml的試管中，50°C下?lián)]干丙酮。配制0.00lmg/mllmg/ml不同濃度的嫁接物溶液，分別取5ml加入到上述試管中(芘終濃度為7X10-7mol/L)，室溫水浴超聲30min。掃描芘的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，測定在374nm和385nm熒光強度，并以測定1375/1385傾斜率的突然變化確定該嫁接物的臨界膠束濃度為0.119mg/mL。采用微粒粒度及表面電位分析儀，測定殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束的粒徑和表面電位。經測定，lmg/mL的殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束的粒徑和表面電位分別為34.Snm和50.8mV03)奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束制備及其理化性質測定取25mg殼寡糖-硬脂酸嫁接物，精密稱定，加入0.5mL藥物濃度為5mg/mL的奧沙利鉬水溶液中，水浴超聲溶解后加入溶度為lOmg/mL的卵磷脂乙醇溶液0.75mL。45°C下旋轉蒸發(fā)除去溶劑，得到載藥膠束薄膜，將其用5mL去離子水分散，得奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束溶液。lmg/mL殼聚糖-硬脂酸嫁接物濃度的奧沙利鉬殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束的粒徑、電位及通過電感耦合等離子質譜儀(ICP-MS)測得的藥物包封率和載藥量結果見表1。殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束的數(shù)均粒徑為95.7nm,電位為51.8mV，藥物包封率為47.2%,藥物負載量為3.50%。4)奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束在抗腫瘤治療中的應用采用大腸癌(SGC-7901)細胞、卵巢(SK0V3)癌細胞、肝癌(BEL-7402)細胞、白血病(K562)細胞、乳腺癌(MCF-7)細胞和耐阿霉素乳腺癌(MCF-7/Adr)細胞為模型細胞，以游離藥物作對照，通過四唑鹽比色法(MTT法)考察奧沙利鉬殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束對腫瘤細胞的細胞毒性，評價奧沙利鉬殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束的抗腫瘤活性。細胞以含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)在培養(yǎng)瓶中，置于37°C培養(yǎng)箱中，通入5%C02(相對濕度為95%)，2天換一次培養(yǎng)液，并于倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，待細胞生長至近融合時，用胰蛋白酶消化，將細胞按10000/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h，待細胞貼壁生長后，吸去培養(yǎng)液，用PBS沖洗一遍，然后加入新鮮的培養(yǎng)液，同時分別加入不同濃度的奧沙利鉬載藥膠團及游離奧沙利鉬溶液，每個濃度設3個平行孔，并設陰性對照孔，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，每孔中加入5mg/mlMTT水溶液20μ1，再培養(yǎng)4h，吸去孔內培養(yǎng)液，每孔中再加入DMSOlOOy1溶解紫色結晶產物，37°C振搖30min后，用酶標儀在570nm測定吸光度。細胞毒性結果見表2和圖1。結果顯示，通過嫁接物膠束介導可顯著增加奧沙利鉬藥物對腫瘤細胞的毒性，并可以實現(xiàn)逆轉耐藥，其逆轉倍數(shù)約為5.72倍。圖IA中，SGC-7901細胞()游離藥物和()實施例三載藥膠束；SK0V3細胞(■)游離藥物和(□)實施例三載藥膠束；BEL-7402細胞(▲)游離藥物和(Δ)實施例三載藥膠束；Κ562細胞(·)游離藥物和(〇)實施例三載藥膠束。圖IB中，MCF-7細胞(■)游離藥物和(口)實施例三載藥膠束；MCF-7/Adr細胞(·)游離藥物和(〇)實施例三載藥膠束。LogC表示藥物濃度的對數(shù)。5)奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束的細胞內經時藥物濃度測定當MCF-7和MCF-7/Adr細胞成對數(shù)生長時，把他們按100，000/孔的密度接種在24孔培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)24小時，待細胞貼壁生長后，向其中加入奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束膠團(恒定藥物濃度為20μg/ml)，并以同濃度的游離藥物作對照，于37°C分別孵育2h、4h、6h、8h、12h后，棄去原培養(yǎng)液，用冰PBS(pH7.4)沖洗3次，終止藥物的攝取和除去粘附在細胞膜上的藥物。向細胞中加入50μ1胰酶，將粘附在培養(yǎng)板上的細胞消化下來，然后向其中加入950μ1PBS，收集細胞懸液，用電感耦合等離子質譜儀(ICP-MS)測定各時間點細胞內奧沙利鉬的濃度。細胞懸液中蛋白濃度校正取上述細胞懸液20uL，加入96孔培養(yǎng)板中，加入200uL的BCA工作液，37°C下放置30min以上。用酶聯(lián)檢測儀在570nm處測定吸光值。根據已知濃度的牛血清白蛋白制作標準曲線，并用該曲線計算細胞懸液中的蛋白濃度。細胞內的藥物濃度經時測定結果見圖2。結果顯示，通過嫁接物膠束介導可顯著增加腫瘤細胞內的藥物濃度；在短時間內，細胞內藥物濃度隨著孵育時間的延長而增加。與腫瘤細胞共孵育12h后，MCF-7細胞中以嫁接物膠束形勢給藥的細胞內藥物濃度與以游離藥物形式給藥相比提高了4.57倍；MCF-7/Adr細胞中以嫁接物膠束形勢給藥的細胞內藥物濃度與以游離藥物形式給藥相比提高了4.77倍。表1不同方法制得的奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束理化性質<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>PI代表數(shù)均粒徑的分散指數(shù)表2奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束對不同腫瘤細胞的IC5tl值<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>IC50表示半數(shù)細胞致死濃度。權利要求一種奧沙利鉑殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束，其特征在于，由殼聚糖-硬脂酸嫁接物、奧沙利鉑、卵磷脂和水所組成，其中殼聚糖-硬脂酸嫁接物占總重量的0.5％、奧沙利鉑占總重量的0.009-0.02％、卵磷脂占總重量的0-0.2％、水占總重量的99.27-99.49％；殼聚糖-硬脂酸嫁接物由平均分子量1.5kD～51kD的低分子量殼聚糖，與C10～C22的脂肪酸化學嫁接形成，殼聚糖-硬脂酸嫁接物中殼寡糖的氨基取代度為1％～50％。2.根據權利要求1所述的一種奧沙利鉬殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束的制備方法，其特征在于，先根據CN100417417C的公開的方法獲得殼聚糖-硬脂酸嫁接物，再通過三種方法分別制備奧沙利鉬殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束(1)殼聚糖_硬脂酸嫁接物制備取殼聚糖0.5g，精密稱量，加30mL去離子水80°C下攪拌溶解，稱取硬脂酸0.825g和碳二亞胺(EDC)5.5g，攪拌溶解溶于17mL無水乙醇溶液中，加熱至80°C。在400rpm磁力攪拌條件下將上述乙醇溶液加入殼聚糖溶液中，80°C恒溫攪拌反應4小時，冷卻至室溫(25°C)，將終反應液置透析袋中，蒸餾水透析3天。透析液冷凍干燥后，以無水乙醇洗滌去除殘留的硬脂酸，得殼聚糖-硬脂酸嫁接物；(2)奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束制備A.探頭超聲法取25mg殼寡糖-硬脂酸嫁接物，加入5mL去離子水，冰浴探頭400w超聲10次，得5mg/mL的膠束溶液，加入0.5mL藥物濃度為5mg/mL的奧沙利鉬水溶液，冰浴條件下探頭400W超聲50次，得奧沙利鉬殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束溶液；B.薄膜分散法取25mg殼寡糖-硬脂酸嫁接物，精密稱定，加入0.5mL藥物濃度為5mg/mL的奧沙利鉬水溶液中，水浴超聲溶解后加入0.75mL無水乙醇溶液，45°C下旋轉蒸發(fā)除去溶劑，得到載藥膠束薄膜，將其用5mL去離子水分散，得奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束溶液；C.卵磷脂介導薄膜分散法取25mg殼寡糖-硬脂酸嫁接物，精密稱定，加入0.5mL藥物濃度為5mg/mL的奧沙利鉬水溶液中，水浴超聲溶解后加入溶度為lOmg/mL的卵磷脂乙醇溶液0.75mL，45°C下旋轉蒸發(fā)除去溶劑，得到載藥膠束薄膜，將其用5mL去離子水分散，得奧沙利鉬殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束溶液。3.根據權利要求2所述的一種奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束的制備方法，其特征在于，步驟B和C中，水浴超聲的條件同A。4.根據權利要求1所述的一種奧沙利鉬殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束在制備抗腫瘤藥物中的應用。5.根據權利要求4所述的一種奧沙利鉬殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于，在制備抗乳腺癌、大腸癌、肝癌、卵巢癌、白血病藥物中的應用。全文摘要本發(fā)明提供一種奧沙利鉑殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束，由0.5％殼聚糖-硬脂酸嫁接物、0.009-0.02％奧沙利鉑、0-0.2％卵磷脂和水所組成。通過(1)探頭超聲法(2)薄膜分散法，(3)卵磷脂介導薄膜分散法分別制備獲得。殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束具有聚合物膠束體內的被動靶向和腫瘤細胞的快速攝取功能，通過殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束對奧沙利鉑的包封，可大大提高分子靶標位于腫瘤細胞內的奧沙利鉑的細胞內藥物濃度，提高細胞毒性并逆轉多藥耐藥，提高奧沙利鉑的臨床抗腫瘤效力?？稍谥苽淇鼓[瘤藥物中的應用。文檔編號A61P35/00GK101797220SQ20101014112公開日2010年8月11日申請日期2010年4月6日優(yōu)先權日2010年4月6日發(fā)明者杜永忠,胡富強,袁弘申請人:浙江大學