專利名稱：白果蛋白超微粉的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明設(shè)計(jì)一種蛋白制備提取領(lǐng)域，尤其涉及一種白果蛋白超微粉的制備方法。
背景技術(shù)：
銀杏白果，內(nèi)含多種生物活性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，每百克干果中含蛋白質(zhì)134g，脂肪3g，碳 水化合物712g，鈣196mg，胡蘿卜素02mg，硫胺素044mg，尼克酸26mg，另外還含有少量的銀 杏黃酮、白果黃素、白果內(nèi)酯等生物藥用活性物質(zhì)。李時(shí)珍《本草綱目》中有載“白果熟食 溫肺益氣，定喘嗽，縮小便，止白濁。生食降痰，消毒殺蟲(chóng)?！卑坠哂忻黠@的抑制結(jié)核桿菌生 長(zhǎng)、抗癌、抗衰老、抗疲勞、耐缺氧的作用。食則補(bǔ)心養(yǎng)氣，益腎潤(rùn)肺，澀精固元，延年益壽；入 藥可止咳平喘，對(duì)老人哮喘、婦女白帶、小兒遺尿等皆有一定的療效。1992年被我國(guó)衛(wèi)生部 確定為藥食同源果品。白果不僅含有黃酮、萜內(nèi)酯、蛋白質(zhì)和微量元素，而且銀杏油脂中主要含有兩種必 需脂肪酸，即亞油酸和a-亞麻酸。在傳統(tǒng)的加工工藝中，沒(méi)有脫毒工藝，產(chǎn)品中殘留氰氫 酸、白果酸、氫化白果酸和白果酚等銀杏毒素，容易引起不良反應(yīng)，影響人的神經(jīng)系統(tǒng)、消化 系統(tǒng)、皮膚系統(tǒng)和造血系統(tǒng)。而且由于含有不飽和脂肪酸容易引起蠔敗變質(zhì)，采用常規(guī)的破 碎對(duì)白果有效成份的提取率很低，因此，制約了白果粉體產(chǎn)品的深加工。如何將傳統(tǒng)的白果 干果的加工轉(zhuǎn)向白果超微粉體及其高濃蛋白產(chǎn)品，國(guó)內(nèi)外尚沒(méi)有任何報(bào)道。近年來(lái)，超微細(xì)粉化技術(shù)在中藥粉碎中的應(yīng)用日趨增多，運(yùn)用超聲粉碎、超低溫粉 碎等現(xiàn)代超細(xì)微加工技術(shù)，可將原生藥從傳統(tǒng)粉碎工藝得到的中心粒徑150 200目的粉 末(75 ym以下)，提高到現(xiàn)在的中心粒徑為5 10 ym以下，在該細(xì)度條件下，一般藥材細(xì) 胞的破壁率>95%。這種新技術(shù)的采用，可使白果其中的有效成分直接暴露出來(lái)，從而使有 效營(yíng)養(yǎng)成分的溶出更加迅速完全，最大程度地保留了銀杏白果中生物活性物質(zhì)及各種營(yíng)養(yǎng) 成分，提高了藥效。C02超臨界萃取工藝在植物油及植物提取物中應(yīng)用廣泛，國(guó)內(nèi)有文獻(xiàn)報(bào)道利用C02 超臨界萃取工藝萃取白果油，但如果將白果普通的機(jī)械粉碎，再進(jìn)行co2超臨界萃取，白果 油的提取率很低，大量的白果油及酚酸類(lèi)成分仍殘留于粉體中，影響白果進(jìn)一步深加工。因 此，銀杏白果超細(xì)粉體及其功能化食品的深加工藕合技術(shù)研究是銀杏產(chǎn)業(yè)近期研究的熱點(diǎn) 和亟待解決的問(wèn)題。近年來(lái)，關(guān)于蛋白質(zhì)以及多肽的研究進(jìn)展迅速，尤其是一些具有生理和藥物活性 的天然多肽和蛋白質(zhì)，目前已有為數(shù)不少的新成分被發(fā)現(xiàn)，它們不僅在調(diào)節(jié)機(jī)體功能上發(fā) 揮重要的作用，而且在抗艾滋病、癌癥、心腦血管等疾病上也具有活性。白果富含活性蛋白質(zhì)，具有很好的藥用價(jià)值。國(guó)外學(xué)者從白果槲寄生及同科植物 中分到Viscotoxin A2，A1，B及PhOrat oxin等同源多肽，有46個(gè)氨基酸殘基組成。國(guó)內(nèi) 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)的鄧乾春采用(NH4)2S04鹽溶鹽析法得到了一種白果清蛋白(GAP)，經(jīng)分離純 化從中鑒定出一種在GAP中占主要級(jí)分的新蛋白，命名為GAP II a，分子量為29248U，氨 基酸組成為脂肪族氨基酸殘基占33. 21 % (共90個(gè))，芳香族氨基酸殘基占7. 38 % (共20個(gè))，羥基氨基酸殘基與含硫氨基酸殘基占26. 57 % (共72個(gè))，酸性氨基酸殘基及其 酰胺占23. 61% (共64個(gè))，堿性氨基酸殘基占6. 27% (共17個(gè))。經(jīng)證實(shí)GAP具有較 明顯的生物活性，具有抗生物氧化活性，能顯著增強(qiáng)小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用，增強(qiáng)免疫功能低 下模型小鼠的免疫調(diào)節(jié)能力，刺激模型小鼠造血功能的恢復(fù)，并能提高模型小鼠的抗氧化 能力，且對(duì)Y射線輻射損傷小鼠的保護(hù)作用。黃文報(bào)道了 GAP對(duì)黃瓜鐮刀孢菌(Fusarium oxysporum)、瓜類(lèi)炭疽菌(Colletotrichum orbiculare)、小麥全燭病菌(Gaeumannomyces graminis)等真菌有很強(qiáng)的抑制作用，而且對(duì)金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、 大腸桿菌(Escherichia Coli)等細(xì)菌也有一定的作用。陳曉清等人從海水小球藻 (Chlorellapacifica)提取液中通過(guò)硫酸銨沉淀，DEAE-52離子交換層析和S印hadexG_200 凝膠過(guò)濾層析后分離純化出1種抗菌蛋白，經(jīng)測(cè)定，兩個(gè)亞基的相對(duì)分子量分別為61kD和 70kD，且純化的蛋白質(zhì)對(duì)產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)和中華根霉(Rhizopus chinensis)有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和腸炎病病 原菌(Ameromonas punctata)也有抑制作用，其抗真菌活性比抗細(xì)菌強(qiáng)。在蛋白質(zhì)的提取分離方法方面，BETTY A.EIPPER于1972年提取了小鼠微管蛋 白，采用了以下方法于0-4°C下粉碎并均勻化小鼠腦組織，室溫下放入pH6. 5的0. 05mol/ L焦磷酸鈉，2. 5mmol/L MgCl2溶液，0. 24mol/L蔗糖溶液和0. lmmol/L鳥(niǎo)苷酸溶液中，提取 可溶性蛋白(離心條件16，000Xg，30min)，上清液進(jìn)行飽和硫酸銨分級(jí)沉淀，分級(jí)范圍為 30 % 50 %。蛋白提取液上DEAE-纖維素樹(shù)脂，用PPMg (0. 05mol/L焦磷酸鈉，2. 5mmol/ LMgCl2)溶液平衡樹(shù)脂，O.Olmol/L NaCl溶液淋洗，再用0. 26mol/L NaCl溶液洗脫微管蛋 白。Mary. C KENNEDY等人對(duì)牛肝臟的Cytosolic Aconitase蛋白進(jìn)行了一系列純化步驟。 制備過(guò)程都形成了一定的模式，即破碎勻質(zhì)一超聲鹽提取一飽和鹽析一透析除鹽一上離子 交換層析柱一透析除鹽一上凝膠層析柱一透析除鹽一進(jìn)行電泳制備或分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高品質(zhì)的白果高濃蛋白超微粉的加工方法。通過(guò)本發(fā)明 制備的白果高濃蛋白超微粉，破壁率大于98%，總蛋白大于90%、分子量分布17KD-20KD、 粒徑為1_25μπι;同時(shí)制備原味高品質(zhì)白果油。本專利制備的高濃蛋白超微粉無(wú)油脂和氰 氫酸、白果酸、白果酚等白果毒素殘留，而且分子量分布易為人體吸收，能明顯提高機(jī)體的 免疫功能。該方法具有資源利用率高、成本低，產(chǎn)品附加值高的特點(diǎn)，而且對(duì)環(huán)境友好。本發(fā)明的技術(shù)解決方案一種白果蛋白超微粉的制備方法，由以下步驟組成第一步，低溫干燥將秋季收集的新鮮白果在-10°c至-50°c下冷凍干燥，再除去 外殼和內(nèi)衣，將果仁粉碎，紅外快速測(cè)定，得到含水重量百分比小于6%、粒度在10目-50目 的白果粗粉，第二步，低溫破壁在溫度低于10°C下，將所述白果粗粉采用噴式低溫氣流粉碎 機(jī)破壁粉碎得到白果超微粉，氣流粉碎機(jī)分級(jí)輪頻率20-60HZ，空氣壓力0. 8-1. 5MPa,加料 速度為lkg/h-3kg/h，粉碎時(shí)間5-50min，第三步，低溫去脂將白果超微粉采用CO2超臨界萃取，萃取壓力10_30MPa，萃取 溫度25-50°C，萃取時(shí)間l-4h，C(V流量10-30L/h，采用質(zhì)量濃度為-15%石油醚作為夾帶劑，第四步，低溫鹽溶解和鹽析采用超聲波在溫度低于10°C下提取所述CO2超臨界 萃取剩下的白果超微粉，提取劑為0. 15-0. 30mol/L NaCl鹽溶液，所述白果超微粉與提取劑 比例為1 4-1 20(g/ml)，提取時(shí)間10-60min，提取次數(shù)2-6次，第五步，鹽析采用質(zhì)量濃度為10% -15%單寧酸、質(zhì)量濃度為10% -15%的三氯 乙酸(TCA)、(MM)2SO4 (APS)、乙醇和丙酮等任一種溶劑或幾種混合溶劑加入到超聲波低溫 提取液中，鹽溶液與提取液的體積比為1 3-5，沉淀離心，分離得到白果蛋白，第六步，膜分離將鹽析得到的白果蛋白溶于去離子水中，采用分子量15KD-25KD 的超濾離心濃縮管分離，超濾膜為聚醚砜，離心力12000g-15000g，離心時(shí)間10-50min，得 到白果蛋白的濃縮液，第七步，色譜柱分離采用二乙氨基乙基纖維素(DEAE-cellulose)和葡聚糖凝膠 G50 (Sephadex G50)柱色譜依次分離白果蛋白的濃縮液，洗脫劑采用pH = 8. 0的0. I-Imol/ L不同濃度的NaCl溶液，第八步，冷凍干燥將色譜柱分離得到的高濃蛋白液采用-10°C至-50°C冷凍干燥 15-48h，再低溫氣流破壁，低溫氣流破壁的條件與第二步低溫破壁的條件相同，使其粒度在 1-25 μ m0上述技術(shù)方案中，所述白果品種為泰興龍眼、隨州圓型果、泰興大佛指、靈川梅型 果、興安長(zhǎng)柄果、靈川馬玲果中的一種。第二步低溫破壁的溫度為o-io°c。超聲波提取的溫 度為0-10°C。所述超臨界萃取溫度為40°C、壓力為20MPa、流速為15L/h、時(shí)間為3h。第五 步所述溶劑為(MM)2SO4或質(zhì)量濃度為10% -15%的單寧酸。每年秋天收集的新鮮白果除去外種皮后，白果的水份含量高于50%，在自身酶的 作用下發(fā)生化學(xué)成分的代謝，酶降解，容易發(fā)霉變質(zhì)，蛋白質(zhì)和油脂等營(yíng)養(yǎng)成分破壞。因此， 傳統(tǒng)的保存方法是將白果在太陽(yáng)下曬干、或熱烘干，白果的水分仍在10%左右，由于高溫容 易引起蛋白質(zhì)的化學(xué)變性，因此，本專利的加工方法為了保證白果的品質(zhì)和蛋白質(zhì)不發(fā)生 降解，采用冷凍干燥的方法，將含水量在50% -65%新鮮白果脫殼后在-10°c至-50°c冷凍 干燥，冷凍時(shí)間6-50小時(shí)，優(yōu)選-15°C -25°C，冷凍時(shí)間10-28小時(shí)，含水量< 6%。如果不 采用本專利技術(shù)處理，由于水份高(一般高于15%或達(dá)到50%以上)白果蛋白易酶解，產(chǎn) 生異味，也容易霉變，影響到白果的風(fēng)味。如果采用熱干燥或日曬處理，白果原有的揮發(fā)性 成分容易損失，同時(shí)油脂容易產(chǎn)生酸敗。本專利低溫冷凍的白果含水率低于6%，不僅易于 保存，比傳統(tǒng)的方法可延長(zhǎng)貨架期半年，而且保持了白果的原質(zhì)和原風(fēng)味。傳統(tǒng)的白果蛋白粉的制備是先將新鮮白果高溫蒸煮，使殼變脆，用機(jī)械輥筒軋殼 分離，再用直接蒸氣沖去內(nèi)衣膜等預(yù)處理，果仁用去離子水噴淋后涼干，用磨漿機(jī)打成固體 粒度在200μπι以上的漿液，50°C -80°C真空濃縮，制成固含量25% -35%的懸浮液，再在進(jìn) 風(fēng)溫度190°C -220°C下噴霧干燥得含水量在10%左右的粉體；冷凍干燥白果粉末中蛋白質(zhì) 含量11. 78%大于噴霧干燥白果粉末中蛋白質(zhì)含量9. 76%。這是由于經(jīng)過(guò)高溫處理，白果 蛋白、多肽、酶等活性物已變性，不能保持原有蛋白和多肽的結(jié)構(gòu)。不同干燥方式對(duì)白果粉末顆粒度產(chǎn)生影響，冷凍干燥的白果粉末顆粒呈現(xiàn)長(zhǎng)形、 針形、扁片形、橢圓形等，形狀多樣，且不規(guī)則(圖la)；而噴霧干燥的白果粉末顆粒大多接 近球形(圖lb)。這是由于噴霧干燥經(jīng)過(guò)了霧化器的造粒過(guò)程，使顆粒均勻且形狀基本相
5同；冷凍干燥干燥過(guò)程中物料靜止在平面上，沒(méi)有造粒過(guò)程，料液隨意結(jié)合，形成的顆粒形 狀多樣化。本發(fā)明將新鮮白果在-10°C至-50°C冷凍干燥，冷凍干燥后的白果經(jīng)機(jī)械輥筒破 殼分離，風(fēng)機(jī)分級(jí)去除囊衣、胚芽后，采用噴式低溫氣流粉碎機(jī)破壁粉碎，氣流粉碎機(jī)分級(jí) 輪頻率20-60HZ，溫度< 10°C，空氣壓力0. 8-1.5MPa，加料速度為lkg/h_3kg/h，粉碎時(shí)間 5-50min,白果超微粉的粒徑為1_25 μ m，破壁率大于98 %，不僅有效地保持了白果蛋白質(zhì) 的活性組分未變性，而且破壁可以大大提高超臨界對(duì)油脂的萃取率，比傳統(tǒng)的方法可延長(zhǎng) 貨架期半年，而且保持了白果的原質(zhì)和原風(fēng)味，有利于提高鹽溶性蛋白質(zhì)的提取率。白果粗粉中含有3-10%油脂，容易引起蠔敗變質(zhì)，因此將白果粉中的油脂分離可 延長(zhǎng)白果粉的保存期。傳統(tǒng)的辦法采用壓榨制油和非極性溶劑提取制油。本發(fā)明收集江蘇泰興大佛指，扁佛指，七星果，龍眼等七個(gè)品種的白果，對(duì)比超聲 波萃取法、索氏提取法和二氧化碳超臨界萃取白果油的工藝，分別考察對(duì)白果油收率的影 響。如表1。表1不同萃取方式對(duì)白果油脂萃取率比較
油脂收率馬鈴大佛子龍眼東臺(tái)東鄉(xiāng)西鄉(xiāng)蝙蝠指七星 (% )
權(quán)利要求
一種白果蛋白超微粉的制備方法，其特征在于由以下步驟組成第一步，低溫干燥將秋季收集的新鮮白果在 10℃至 50℃下冷凍干燥，再除去外殼和內(nèi)衣，將果仁粉碎，得到含水重量百分比小于6％、粒度在10目 50目的白果粗粉，第二步，低溫破壁在溫度低于10℃下，將所述白果粗粉采用噴式低溫氣流粉碎機(jī)破壁粉碎得到白果超微粉，氣流粉碎機(jī)分級(jí)輪頻率20 60Hz，空氣壓力0.8 1.5MPa，加料速度為1kg/h 3kg/h，粉碎時(shí)間5 50min，第三步，低溫去脂將白果超微粉采用CO2超臨界萃取，萃取壓力10 30MPa，萃取溫度25 50℃，萃取時(shí)間1 4h，CO2流量10 30L/h，采用質(zhì)量濃度為1％ 15％石油醚作為夾帶劑，第四步，低溫鹽溶解和鹽析采用超聲波在溫度低于10℃下提取所述CO2超臨界萃取剩下的白果超微粉，提取劑為0.15 0.30mol/L NaCl鹽溶液，所述白果超微粉與提取劑比例為1∶4 1∶20(g/ml)，提取時(shí)間10 60min，提取次數(shù)2 6次，第五步，鹽析采用質(zhì)量濃度為10％ 15％單寧酸、質(zhì)量濃度為10％ 15％的三氯乙酸(TCA)、(NH4)2SO4(APS)、乙醇和丙酮等任一種溶劑或幾種混合溶劑加入到超聲波低溫提取液中，鹽溶液與提取液的體積比為1∶3 5，沉淀離心，分離得到白果蛋白，第六步，膜分離將鹽析得到的白果蛋白溶于去離子水中，采用分子量15KD 25KD的超濾離心濃縮管分離，超濾膜為聚醚砜，離心力12000g 15000g，離心時(shí)間10 50min，得到白果蛋白的濃縮液，第七步，色譜柱分離采用二乙氨基乙基纖維素(DEAE cellulose)和葡聚糖凝膠G50(Sephadex G50)柱色譜依次分離白果蛋白的濃縮液，洗脫劑采用pH＝8.0的0.1 1mol/L不同濃度的NaCl溶液，第八步，冷凍干燥將色譜柱分離得到的高濃蛋白液采用 10℃至 50℃冷凍干燥15 48h，再低溫氣流破壁使其粒度在1 25μm。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白果蛋白超微粉的制備方法，其特征在于白果品種為泰興龍 眼、隨州圓型果、泰興大佛指、靈川梅型果、興安長(zhǎng)柄果、靈川馬玲果中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白果蛋白超微粉的制備方法，其特征在于第二步低溫破壁的 溫度為o-io°c。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白果蛋白超微粉的制備方法，其特征在于超聲波提取的溫度 為 O-IO0Co
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白果蛋白超微粉的制備方法，其特征在于第三步所述超臨界 萃取溫度為40°C、壓力為20MPa、流速為15L/h、時(shí)間為3h。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白果蛋白超微粉的制備方法，其特征在于第五步所述溶劑為 (MM)2SO4或質(zhì)量濃度為10% -15%的單寧酸。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種白果蛋白超微粉的制備方法，其特征在于低溫干燥新鮮白果、低溫氣流破壁，低溫去脂、通過(guò)鹽溶解和鹽析、10KD-30KD超濾膜分離、DEAE-cellulose柱分離、冷凍干燥、低溫氣流粉碎等工藝，制備的白果蛋白超微粉分子量在17KD-20KD，含水量＜5％，總蛋白大于90％，粒徑為1-25μm，破壁率大于98％。制備的白果油收率明顯提高，相對(duì)于普通白果粉超臨界萃取的白果油收率提高20％-35％。
文檔編號(hào)A61P37/04GK101983969SQ201010112088
公開(kāi)日2011年3月9日 申請(qǐng)日期2010年2月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月12日
發(fā)明者葉建中, 周彬, 王成章, 程耀波, 陳虹霞, 陳西娟, 馬維新 申請(qǐng)人:中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所;邳州鑫源生物制品有限公司