專利名稱：具有纖溶亢進(jìn)的凝血病的治療的制作方法
具有纖溶亢進(jìn)的凝血病的治療
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有纖溶亢進(jìn)的凝血病的領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明涉及治療血友病疾病，諸如血友病A或血友病B。
背景技術(shù)：
血友病是損傷身體的控制血凝固或凝血的能力的一組遺傳性遺傳病癥，所述凝血在血管破裂時用于停止出血。血友病A，最常見的形式，產(chǎn)生自因子VIII的基因突變；血友病B，也稱為Christmas病，產(chǎn)生自因子IX的基因突變。血友病B，如血友病A，是X連鎖的及占血友病病例的約12%。癥狀與血友病A的相同損傷之后過量的出血；及自發(fā)出血，尤其進(jìn)入承重關(guān)節(jié)，軟組織及粘液膜。重復(fù)的出血進(jìn)入關(guān)節(jié)導(dǎo)致關(guān)節(jié)積血，導(dǎo)致常常使需要關(guān)節(jié)置換的疼痛致殘關(guān)節(jié)病。軟組織中的血腫可導(dǎo)致壞死性凝集的血組成的假腫瘤；它們可阻礙，壓縮或破裂到相鄰器官和可導(dǎo)致感染。一旦形成，血腫難以治療，甚至用手術(shù)。壓縮之后的神經(jīng)恢復(fù)差，導(dǎo)致麻痹。如果不檢測，涉及消化道，中樞神經(jīng)系統(tǒng)，或氣道/腹膜后空間的那些出血發(fā)作可導(dǎo)致死亡。顱內(nèi)出血是血友病患者死亡的主要原因。在美國估計有100，000例先天性血友病。這些中，約20，000是血友病B的情況， 該患者的血或者完全缺乏因子IX，或血漿因子IX組分嚴(yán)重地缺陷。因此疾病存在改變程度的嚴(yán)重性，需要從每周達(dá)一年一次或兩次的治療。完全缺陷情況需要每周一次替代治療；部分缺陷情況需要僅當(dāng)出血發(fā)作發(fā)生時治療，其可稀少至一年一次。先天性，部分缺陷情況中的出血發(fā)作通常由暫時獲得的感受性而非由損傷單獨導(dǎo)致。靜脈內(nèi)注射足夠大量的新鮮血漿，或相當(dāng)?shù)牧康男迈r血暫時校正缺陷受試者的缺陷。有益效應(yīng)常常持續(xù)2或3周，盡管通過對患者的血體外測試測量的凝固缺陷呈現(xiàn)改善僅2或3天。該用新鮮血漿或新鮮血的治療有效，但其具有幾個嚴(yán)重的缺點(1)其需要大量的新鮮血漿的現(xiàn)成可利用性；(2)需要血漿施用的住院治療；(3)大量的患者成為致敏于重復(fù)的血或血漿輸注及最終遭遇致死的輸注反應(yīng)；(4)至好血漿可僅部分緩和缺乏；及(5)延長的治療或手術(shù)是不可能的，因為需要的大量的血或血漿會導(dǎo)致急性和致死的水腫。改善的治療包括用因子VIII或因子IX濃縮物靜脈內(nèi)替代治療。但是，此治療也有幾個缺點(1)當(dāng)治療主要出血發(fā)作時，甚至在迅速檢測和治療之后仍保留組織損傷； (2)大量的患者成為用凝血因子難治，且發(fā)展針對凝血因子的抑制性抗體(所謂的具有抑制物的血友病)；(3)盡管改善的病毒滅活方法，仍有增加的被致死的病毒諸如HIV和丙型肝炎污染的風(fēng)險(在USA，估計大于50%的血友病群，超過10，000人，自變質(zhì)的血供給感染 HIV) ； (4)，在發(fā)展中國家，分離的且尤其重組體凝血因子非常昂貴，且通常不可利用。在替代治療外治療或預(yù)防出血是挑戰(zhàn)，因為在血友病中出血是可歸因于如下三重缺陷的復(fù)合病理生理過程(1)減少的經(jīng)低組織因子濃度的外在通路的凝血酶產(chǎn)生，(2)減少的經(jīng)固有通路的凝血酶產(chǎn)生的次級爆發(fā)，及(3)纖溶系統(tǒng)被固有通路的缺陷性下調(diào)。通常接受這樣的事實，減少的凝血酶產(chǎn)生導(dǎo)致減少的凝固傾向，由此導(dǎo)致增加的出血風(fēng)險。但是，過去的幾十年的工作表明，纖溶的缺陷下調(diào)也可在血友病中起到作用。結(jié)果，血友病也可分類為具有纖溶亢進(jìn)的凝血病。新近出版物通過體外顯示，當(dāng)在因子VIII耗竭的及補(bǔ)充了組織纖溶酶原活化物tPA的血漿(FVIII-DP)中形成凝塊時，纖溶不充分下調(diào)，結(jié)果凝塊溶解提前，從而支持此推定(Broze and Higuchi, Bloodl996,88 3815-3823 ；Mosnier et al. ； Thromb. Haemost. 2001,86 1035-1039)。此外，可顯示，此“成熟前溶解”是由于凝血酶_可活化的纖溶抑制劑(TAFI)的減少的或缺乏的活化(Broze和Higuchi，1996)，且顯示，在FVIII-DP 中，含有活化的TAFI的混合物增加凝塊溶解時間。從而得出，穩(wěn)定的TAFI可用于治療血友病(W002/099098)。TAFI在纖溶下調(diào)中起到關(guān)鍵的作用，其為穩(wěn)定的凝塊形成所需要。也稱為血漿羧肽酶原B2或羧肽酶原U的TAFI是血漿酶原，當(dāng)其暴露于凝血酶-血栓調(diào)節(jié)素復(fù)合物時，在 Arg92通過蛋白水解轉(zhuǎn)變?yōu)閴A性羧肽酶(TAFIa或活化的TAFI)，其抑制纖溶。其通過自纖維蛋白去除C-端賴氨酸和精氨酸殘基有利地衰減纖溶，所述纖維蛋白對于結(jié)合及活化纖溶酶原重要。如上所述，與凝血酶復(fù)合的血栓調(diào)節(jié)素(TM)負(fù)責(zé)TAFI活化。血栓調(diào)節(jié)素是發(fā)揮襯于血管的內(nèi)皮細(xì)胞上的凝血酶受體的作用的膜蛋白。凝血酶是凝血級聯(lián)中的中心酶，其將纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，基質(zhì)凝塊形成。起初，局部損傷導(dǎo)致小量的凝血酶從其無活性前體凝血酶原產(chǎn)生。進(jìn)而，凝血酶活化血小板，且其次，某些凝血因子包括因子V和VIII。 后來的作用產(chǎn)生所謂的凝血酶爆發(fā)，大量活化的額外的凝血酶原分子，其最終導(dǎo)致穩(wěn)定的凝塊形成。但是，當(dāng)結(jié)合到血栓調(diào)節(jié)素時，凝血酶活性趨勢性變化凝血酶-血栓調(diào)節(jié)素復(fù)合物的主要特征是其活化蛋白C的能力，其然后通過蛋白水解地滅活必要的輔因子因子Va和因子 VIIIa 下調(diào)凝血級聯(lián)(Esmon et al.，Ann. N. Y. Acad. Sci. (1991)，614 :30_43)，由此提供抗凝活性。凝血酶_血栓調(diào)節(jié)素復(fù)合物也能活化凝血酶_可活化的纖溶抑制劑(TAFI)， 其然后拮抗纖溶(見以上)。成熟人TM由559個殘基的單多肽鏈組成，及由具有下列位置(SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :3給出的氨基酸位置)的5個結(jié)構(gòu)域組成氨基末端"凝集素-樣"結(jié)構(gòu)域，包含6 個表皮生長因子(EGF)-樣重復(fù)子的"6EGF-樣重復(fù)結(jié)構(gòu)域"，0-糖基化結(jié)構(gòu)域，跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域
權(quán)利要求
1.血栓調(diào)節(jié)素類似物用于生產(chǎn)治療具有纖溶亢進(jìn)的凝血病的藥物的用途，其中所述 TM類似物特征在于以治療有效劑量呈現(xiàn)抗纖維蛋白溶解效應(yīng)。
2.權(quán)利要求1的用途，其中所述血栓調(diào)節(jié)素類似物呈現(xiàn)一個或更多下列特征(i)與凝血酶的結(jié)合親和力相比兔肺血栓調(diào)節(jié)素降低，和/或與凝血酶的結(jié)合親和力具有大于0. 2nM的kD值；和/或(ii)相比TM類似物TMeM388L的輔因子活性減小的輔因子活性，(iii)相比TM類似物TMeM388L增加的TAFI活化活性與輔因子活性比。
3.權(quán)利要求1或2的用途，其中具有纖溶亢進(jìn)的凝血病選自下列疾病血友病A，血友病B，血友病C，von Willebrandt病(vWD)，獲得性von Willebrandt病，因子X缺乏，副血友病，凝血因子I，II，V或VII的遺傳性病癥，循環(huán)抗凝劑所致的出血性病癥或獲得性凝血缺乏。
4.以上權(quán)利要求中任一項的用途，其中所述血栓調(diào)節(jié)素類似物用于治療選自下列的一種或更多種出血事件顱內(nèi)或其他CNS出血，關(guān)節(jié)、微毛細(xì)管、肌肉、消化道、呼吸道、腹膜后空間或軟組織出血。
5.以上權(quán)利要求中任一項的用途，其中所述血栓調(diào)節(jié)素類似物在出血發(fā)作時施用。
6.權(quán)利要求1 3中任一項的用途，其中所述血栓調(diào)節(jié)素類似物在增加的出血風(fēng)險，例如手術(shù)或拔牙之前施用。
7.以上權(quán)利要求中任一項的用途，其中所述血栓調(diào)節(jié)素類似物施用給用血/血漿輸注或凝血因子取代治療難治的患者。
8.以上權(quán)利要求中任一項的用途，其中所述血栓調(diào)節(jié)素類似物以多劑量施用，優(yōu)選在跨不到1周至4周的整個時期每天，每兩天或每3天，每4天，每5天，每6天或每7天一次， 更優(yōu)選作為慢性施用。
9.以上權(quán)利要求中任一項的用途，其中所述血栓調(diào)節(jié)素類似物作為腸胃外應(yīng)用給予， 可優(yōu)選作為靜脈內(nèi)或皮下應(yīng)用給予。
10.以上權(quán)利要求中任一項的用途，其中所述血栓調(diào)節(jié)素類似物是可溶性TM類似物。
11.權(quán)利要求10的用途，其中所述血栓調(diào)節(jié)素類似物是人可溶性TM類似物。
12.以上權(quán)利要求中任一項的用途，其中所述血栓調(diào)節(jié)素類似物包含選自下列的至少一種結(jié)構(gòu)域EGF3，EGF4，EGF5，EGF6，優(yōu)選包含片段EGF3 EGF6和更優(yōu)選包含EGF結(jié)構(gòu)域 1 6。
13.以上權(quán)利要求中任一項的用途，其中所述血栓調(diào)節(jié)素類似物由EGF結(jié)構(gòu)域EGFl EGF6組成，且更優(yōu)選由EGF結(jié)構(gòu)域EGF3 EGF6組成。
14.以上權(quán)利要求中任一項的用途，其中所述血栓調(diào)節(jié)素類似物具有對應(yīng)于成熟血栓調(diào)節(jié)素的氨基酸序列(SEQ ID NO :1或SEQ IDNO :3所示)的氨基酸序列，且包括一種或更多種以下修飾(a)去除氨基酸1 3(b)M388L(c)R456G(d)H457Q(e)S474A，及以 P490 終止。
15.以上權(quán)利要求中任一項的用途，其中所述血栓調(diào)節(jié)素類似物具有包含與SEQID NO 2具有至少85%，或至少90%或95%序列同一性的序列的氨基酸序列。
16.以上權(quán)利要求中任一項的用途，其中所述血栓調(diào)節(jié)素類似物在對應(yīng)于天然序列的下列位置(根據(jù)SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 3)的一個或更多位置具有氨基酸修飾(aa349Asp(bb355Asn(ac357Glu(ad358Tyr(ae359Gln(af361Gln(ag363Leu(ah364Asn(ai368Tyr(aj371Val(ak374Glu(al376Phe(am384His(an385Arg(ba387Gln(bb389Phe(be398Asp(bd400Asp(be402Asn(bf403Thr(bg408Glu(bh411Glu(bi413Tyr(bj414Ile(bk415Leu(bl416Asp(bm417Asp(bn420Ile(bo423Asp(bp424Ile(bq425Asp(br426Glu(ca428Glu(cb429Asp(cc(Cd(ce(Cf (Cg (ch(Ci (Cj (ck(Cl(cm (cn
17.432Phe 434Ser 436Val 438His 439Asp 440Leu 443Thr 444Phe 445Glu 456Arg 458Ile ；或者 461Asp0以上權(quán)利要求中任--項的用途，其中所述血栓調(diào)節(jié)素類似物在根據(jù)SEQ ID NO 1或SEQ ID NO :3的第376位具有苯丙氨酸的修飾，優(yōu)選取代為脂肪族氨基酸，更優(yōu)選取代為甘氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸或異亮氨酸，以及最優(yōu)選取代為丙氨酸。
18.以上權(quán)利要求中任一項的用途，其中所述血栓調(diào)節(jié)素類似物具有一個或更多根據(jù) SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 3的下列氨基酸的修飾(a)387Gln ；(b)388Met ； (b) 389Phe,其中氨基酸缺失，插入一個或更多額外的氨基酸或優(yōu)選取代。
19.以上權(quán)利要求中任一項的用途，其中所述血栓調(diào)節(jié)素類似物以其氧化的形式使用， 優(yōu)選用氯胺T，過氧化氫或高碘酸鈉氧化。
20.權(quán)利要求19的用途，其中TM類似物中的一個或更多甲硫氨酸殘基被氧化，優(yōu)選第 388位的甲硫氨酸殘基(根據(jù)SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 3)。
21.用于篩選適于治療具有纖溶亢進(jìn)的凝血病的血栓調(diào)節(jié)素的類似物的方法，其中血栓調(diào)節(jié)素呈現(xiàn)一個或更多下列特征(i)減小的與凝血酶的結(jié)合親和力， ( )減小的輔因子活性， (iii)增加的TAFI活化活性， 包括下列步驟(a)制造血栓調(diào)節(jié)素序列(SEQID NO :1或SEQ ID NO 3)的一個或更多氨基酸取代， 優(yōu)選在權(quán)利要求15中列出的氨基酸位置；(b)就一個或更多下列特征，比較修飾的類似物與對照分子，可優(yōu)選為兔肺TM或可溶性人TM類似物(ba)與凝血酶的結(jié)合親和力(KD值)；(bb)輔因子活性；(be) TAFI活化活性或TAFIa勢； (bd)TAFI活化活性和輔因子活性的比；(be)蛋白氧化的效應(yīng)；(bf)體外測定中對及時凝塊溶解的效應(yīng)；或者(bg)在凝血_關(guān)聯(lián)的動物模型中的效應(yīng)。
22.治療具有纖溶亢進(jìn)的凝血病的方法，包含施用治療有效量的權(quán)利要求1 20中任一項的血栓調(diào)節(jié)素類似物。
全文摘要
本發(fā)明涉及血栓調(diào)節(jié)素類似物用于生產(chǎn)治療具有纖溶亢進(jìn)的凝血病的藥物的用途，諸如血友病病癥。這些血栓調(diào)節(jié)素類似物以治療有效劑量呈現(xiàn)抗纖維蛋白溶解效應(yīng)。公開了新蛋白修飾以及它們的鑒定方法。
文檔編號A61K38/36GK102481344SQ200980160203
公開日2012年5月30日 申請日期2009年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月12日
發(fā)明者J·H·弗雷, K-U·皮德森, M·E·納舍姆 申請人:帕昂德國有限公司