專(zhuān)利名稱(chēng)：損傷組織的功能性再生促進(jìn)藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及損傷組織的功能性再生促進(jìn)藥物。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，已明了損傷組織的修復(fù)過(guò)程中有各種干細(xì)胞參與，通過(guò)將大量的干細(xì)胞 動(dòng)員到損傷部位來(lái)誘導(dǎo)功能性組織再生的新的再生醫(yī)療技術(shù)的開(kāi)發(fā)也在不斷地進(jìn)行。為了 使該新的再生醫(yī)療技術(shù)成為現(xiàn)實(shí)，需要1)體內(nèi)存在豐富的可動(dòng)員到損傷部位的干細(xì)胞、2) 將干細(xì)胞動(dòng)員到損傷部位的因子得以分離、鑒定。可動(dòng)員到損傷部位的干細(xì)胞有存在于損傷部位或其附近組織的組織干細(xì)胞和存 在于末梢血中的骨髓來(lái)源的干細(xì)胞。近年來(lái)，不斷報(bào)告了骨髓來(lái)源的細(xì)胞參與多種損傷組 織的再生，但對(duì)于將骨髓來(lái)源的細(xì)胞動(dòng)員到損傷組織的機(jī)制并不清楚。這里所說(shuō)的骨髓來(lái) 源的細(xì)胞與具有分化為血液細(xì)胞(白細(xì)胞、紅細(xì)胞)的能力的造血系干細(xì)胞不同，其包括目 前以被稱(chēng)為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞為代表的干細(xì)胞或者存在于骨髓中的組織祖細(xì)胞團(tuán)。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是具有分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞的能力的未分化干細(xì)胞，還 能夠分化為成纖維細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、肌腱細(xì)胞等其他的間充質(zhì)的細(xì)胞。近年來(lái)已 證明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠分化為神經(jīng)細(xì)胞、以及能夠分化為上皮細(xì)胞(皮膚角質(zhì)形成細(xì) 胞等)或血管內(nèi)皮細(xì)胞(非專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。組織祖細(xì)胞被定義為具有單方向性地分化為除血 液系統(tǒng)以外的特定組織細(xì)胞的能力的未分化細(xì)胞，包括具有分化為上述間充質(zhì)組織、上皮 組織、神經(jīng)組織、實(shí)質(zhì)器官、血管內(nèi)皮的能力的未分化細(xì)胞。已知SlOO蛋白質(zhì)家族包括約20種蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)主要存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，但其 中一部分被分泌到細(xì)胞外，在組織損傷時(shí)或皮膚癌、炎癥時(shí)擔(dān)負(fù)著各種各樣的功能。另外， 這些蛋白質(zhì)在皮膚的表皮細(xì)胞的分化方面也擔(dān)負(fù)著重要的作用。特別是S100A8和S100A9 已知其表達(dá)在皮膚損傷約1周后被強(qiáng)烈地誘導(dǎo)(非專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。S100A8/A9 ( = MRP-8/14) 異源二聚體與肝素具有親和性(非專(zhuān)利文獻(xiàn)幻。S100A8、S100A9和S100A8/A9異源二聚體 具有誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞遷移到炎癥部位的活性(非專(zhuān)利文獻(xiàn)4)。以往一直認(rèn)為，腦或脊髄的中樞神經(jīng)細(xì)胞一旦受到傷害就無(wú)法再生。但是，近年來(lái) 神經(jīng)干細(xì)胞的存在及其誘導(dǎo)成為可能。另外，正常神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)干細(xì)胞生態(tài)位也得以 鑒定。因此，已可期待一直認(rèn)為不可能恢復(fù)的損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞能夠恢復(fù)。目前，已開(kāi) 展了關(guān)于針對(duì)腦脊髄損傷、退行性疾病等的神經(jīng)再生的研究。腦組織(細(xì)胞)損傷的原因主要是外傷引起的腦挫傷、腦缺血性疾病。作為其他 的原因，可列舉出以腦腫瘤摘除手術(shù)為代表的腦外科手術(shù)所造成的損傷。特別是完全摘除 例如從腦實(shí)質(zhì)細(xì)胞發(fā)生的神經(jīng)膠質(zhì)瘤是因難的，為了避免運(yùn)動(dòng)或語(yǔ)言功能障礙，不得不選 擇部分地進(jìn)行摘除。另外，惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生存預(yù)后不良，從化學(xué)療法或放射療法到近年 來(lái)研究熱門(mén)的免疫、基因治療均沒(méi)有顯示充分的效果。因此，理想的是有能夠摘除盡可能多 的腫瘤細(xì)胞并使其所導(dǎo)致的腦功能損傷恢復(fù)的治療?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
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非專(zhuān)利文獻(xiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)1非專(zhuān)利文獻(xiàn)2非專(zhuān)利文獻(xiàn)3 2001 Nov 26.非專(zhuān)利文獻(xiàn)4 :Ryckman 等、J Immunol. 2003 Mar 15 ； 170 (6) :3233-42.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的課題本發(fā)明的課題在于提供分離、鑒定將分化為損傷組織的細(xì)胞動(dòng)員到損傷部位的因 子、利用了該因子的發(fā)明。用于解決課題的手段如果清楚了分化為損傷組織的細(xì)胞的動(dòng)員因子，則通過(guò)將該因子給藥到體內(nèi)，即 能夠?qū)⒋嬖谟谀┥已械哪軌蚍只癁閾p傷組織的細(xì)胞或存在于局部組織的分化為損傷組 織的細(xì)胞大量地動(dòng)員到損傷部位，從而能夠開(kāi)發(fā)出促進(jìn)功能性組織再生的新的再生醫(yī)療技 術(shù)。本發(fā)明的發(fā)明人研究了在移植皮片植入活體組織的過(guò)程中骨髓來(lái)源的細(xì)胞從皮 膚外組織被動(dòng)員到移植皮片中并參與皮膚組織再生的可能性，并在世界上首次闡明了 1)骨髓來(lái)源的細(xì)胞被大量地動(dòng)員到移植皮膚內(nèi)；幻被動(dòng)員的骨髓來(lái)源的細(xì)胞在移植皮片 內(nèi)能夠分化為真皮成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、表皮角化細(xì)胞，被動(dòng) 員的骨髓來(lái)源的細(xì)胞中包括骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞；；3)將骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞從 末梢血?jiǎng)訂T到植皮片中的是從移植皮膚的壞死組織釋放出的S100A8、S100A9 ；4)純化的 S100A8、S100A9能夠促進(jìn)從骨髓中分離、培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移。本申請(qǐng)基于這些認(rèn) 識(shí)，提供以下的發(fā)明?！?〕一種骨髓細(xì)胞的誘導(dǎo)劑，其含有以下的(a) (f)中的任一項(xiàng)記載的成分；(a)S100A8 蛋白質(zhì)(b)分泌S100A8蛋白質(zhì)的細(xì)胞(c)插入有編碼S100A8蛋白質(zhì)的DNA的載體(d)S100A9 蛋白質(zhì)(e)分泌S100A9蛋白質(zhì)的細(xì)胞(f)插入有編碼S100A9蛋白質(zhì)的DNA的載體?！?〕一種組織再生促進(jìn)劑，其含有以下的(a) (f)中的任一項(xiàng)記載的成分；(a)S100A8 蛋白質(zhì)(b)分泌S100A8蛋白質(zhì)的細(xì)胞(c)插入有編碼S100A8蛋白質(zhì)的DNA的載體(d)S100A9 蛋白質(zhì)(e)分泌S100A9蛋白質(zhì)的細(xì)胞(f)插入有編碼S100A9蛋白質(zhì)的DNA的載體?！?〕一種將骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)到損傷的組織中的方法，其包含將以下的(a) (f)中的
:ffu Y 等、Stem Cells. 200725(10) :2648-2659.
=Eckert RL 等、J Invest Dermatol. 2004 Jul; 123(1) :23-33.
=Robinson MJ等、J Biol Chem. 2002 Feb 1 ；277(5) :3658-65. Epub任一項(xiàng)記載的物質(zhì)給予所述組織受到損傷的對(duì)象的工序；(a)S100A8 蛋白質(zhì)(b)分泌S100A8蛋白質(zhì)的細(xì)胞(c)插入有編碼S100A8蛋白質(zhì)的DNA的載體(d)S100A9 蛋白質(zhì)(e)分泌S100A9蛋白質(zhì)的細(xì)胞(f)插入有編碼S100A9蛋白質(zhì)的DNA的載體?！?〕一種促進(jìn)損傷的組織再生的方法，其包含將以下的(a) (f)中的任一項(xiàng)記載 的物質(zhì)給予所述組織受到損傷的對(duì)象的工序；(a)S100A8 蛋白質(zhì)(b)分泌S100A8蛋白質(zhì)的細(xì)胞(c)插入有編碼S100A8蛋白質(zhì)的DNA的載體(d)S100A9 蛋白質(zhì)(e)分泌S100A9蛋白質(zhì)的細(xì)胞(f)插入有編碼S100A9蛋白質(zhì)的DNA的載體?！?〕以下的(a) (f)中的任一項(xiàng)記載的物質(zhì)在制造骨髓細(xì)胞的誘導(dǎo)劑中的用 途；(a)S100A8 蛋白質(zhì)(b)分泌S100A8蛋白質(zhì)的細(xì)胞(c)插入有編碼S100A8蛋白質(zhì)的DNA的載體(d)S100A9 蛋白質(zhì)(e)分泌S100A9蛋白質(zhì)的細(xì)胞(f)插入有編碼S100A9蛋白質(zhì)的DNA的載體。〔6〕以下的(a) (f)中的任一項(xiàng)記載的物質(zhì)在制造組織再生促進(jìn)劑中的用途；(a)S100A8 蛋白質(zhì)(b)分泌S100A8蛋白質(zhì)的細(xì)胞(c)插入有編碼S100A8蛋白質(zhì)的DNA的載體(d)S100A9 蛋白質(zhì)(e)分泌S100A9蛋白質(zhì)的細(xì)胞(f)插入有編碼S100A9蛋白質(zhì)的DNA的載體?！?〕以下的(a) (f)中的任一項(xiàng)記載的物質(zhì)，其用在將骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)到損傷的組 織的方法中；(a)S100A8 蛋白質(zhì)(b)分泌S100A8蛋白質(zhì)的細(xì)胞(c)插入有編碼S100A8蛋白質(zhì)的DNA的載體(d)S100A9 蛋白質(zhì)(e)分泌S100A9蛋白質(zhì)的細(xì)胞(f)插入有編碼S100A9蛋白質(zhì)的DNA的載體?！?〕以下的(a) (f)中的任一項(xiàng)記載的物質(zhì)，其用在促進(jìn)損傷的組織再生的方法
5中；(a)S100A8 蛋白質(zhì)(b)分泌S100A8蛋白質(zhì)的細(xì)胞(c)插入有編碼S100A8蛋白質(zhì)的DNA的載體(d)S100A9 蛋白質(zhì)(e)分泌S100A9蛋白質(zhì)的細(xì)胞(f)插入有編碼S100A9蛋白質(zhì)的DNA的載體。


圖1為表示GFP骨髓移植小鼠的制作方法的圖。圖2為表示在GFP骨髓移植小鼠背部進(jìn)行皮膚移植后觀察到的移植皮片的GFP熒 光聚集的照片。左照片(A)使用DAPI對(duì)核進(jìn)行了染色。中央的照片(B)的綠色熒光色表 示植皮部位聚集的GFP陽(yáng)性骨髓來(lái)源的細(xì)胞。右照片(C)是將照片(A)與照片(B)重疊后 得到的圖。骨髓來(lái)源的細(xì)胞重構(gòu)了皮膚組織。圖3為表示從切除皮片提取再生誘導(dǎo)因子的方法的圖。圖4為表示使用了 boyden小室測(cè)定的皮膚提取液的骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞遷 移能力的活性測(cè)定結(jié)果的照片。其是用藍(lán)色色素對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行染色而得到的圖 像，所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞從boyden小室的上槽內(nèi)通過(guò)具有8 μ m的微孔的聚碳酸酯膜的 微孔遷移到含有皮膚提取液的下槽側(cè)并附著于膜下槽側(cè)。向下層中加入從2日齡小鼠和6 周齡小鼠采集的皮膚的提取液。圖5為用Wfestern blot法確認(rèn)皮膚提取液中的S100A8、S100A9蛋白質(zhì)的存在情 況的照片。圖6為表示從肝素親和層析柱Ofeparin affinity column)利用NaCl濃度梯度 將皮膚提取液中的Heparin結(jié)合蛋白洗脫的結(jié)果的照片。將各級(jí)分的蛋白質(zhì)用SDS-PAGE 進(jìn)行分離并用銀染色進(jìn)行檢測(cè)。圖7為表示使用了 boyden小室測(cè)定的皮膚提取液的骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞遷 移能力的活性測(cè)定結(jié)果的照片。其是用藍(lán)色色素對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行染色而得到的圖 像，所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞從boyden小室的上槽內(nèi)通過(guò)膜上的微孔遷移到皮膚提取液的 肝素結(jié)合的各分級(jí)(下槽側(cè))中并附著于膜下槽側(cè)。圖8為表示使用Western blot法檢測(cè)皮膚提取液的肝素結(jié)合的各分級(jí)中的 S100A8、S100A9蛋白質(zhì)的存在情況的結(jié)果的照片。圖9為S100A8、S100A9表達(dá)載體的圖。圖10為表示使用了 boyden小室測(cè)定的皮膚提取液的骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞遷 移能力的活性測(cè)定結(jié)果的照片。其是用藍(lán)色色素對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行染色而得到的圖 像，所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞從boyden小室的上槽內(nèi)通過(guò)膜上的微孔遷移到分別含有重組 GST-S100A8、GST-S100A9、皮膚提取液的下層側(cè)并附著于膜下槽側(cè)。圖IlA為從小鼠的尾靜脈給予GST-S100A8、GST-S100A9，然后對(duì)12小時(shí)后末梢血 中的CD45陰性細(xì)胞的級(jí)分進(jìn)行CD44、PDGFRa、PDGFR3的FACS而得到的圖。另外，圖IlB 為用柱形圖表示CD45陰性細(xì)胞群中的各細(xì)胞群的比例的圖，左圖表示CD44陽(yáng)性、PDGFRa
6陽(yáng)性的細(xì)胞群，右圖表示⑶44陽(yáng)性、PDGFRii陽(yáng)性的細(xì)胞群。圖12為表示S100A8對(duì)正常小鼠的皮膚潰瘍治療效果的圖。圖13為表示S100A8對(duì)糖尿病小鼠的皮膚潰瘍治療效果的圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供一種骨髓細(xì)胞的誘導(dǎo)劑，其含有以下的(a) (f)中記載的成分中的 至少一種成分。(a)S100A8 蛋白質(zhì)(b)分泌S100A8蛋白質(zhì)的細(xì)胞(c)插入有編碼S100A8蛋白質(zhì)的DNA的載體(d)S100A9 蛋白質(zhì)(e)分泌S100A9蛋白質(zhì)的細(xì)胞(f)插入有編碼S100A9蛋白質(zhì)的DNA的載體。通過(guò)使用該誘導(dǎo)劑，能夠?qū)⒐撬鑱?lái)源的細(xì)胞誘導(dǎo)到局部(上述成分的給予、添加 部位或其附近、或者損傷部位)從而促進(jìn)組織的功能性再生，因此該誘導(dǎo)劑能夠用作用來(lái) 開(kāi)發(fā)再生醫(yī)療技術(shù)、再生誘導(dǎo)藥物的基礎(chǔ)研究和臨床研究所需的試劑。例如，能夠研究將 骨髓來(lái)源的細(xì)胞動(dòng)員到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的需要的活體組織中以進(jìn)行組織修復(fù)、組織功能再建的程 度。另外，還能夠在試管內(nèi)研究骨髓來(lái)源的細(xì)胞的動(dòng)員所產(chǎn)生的組織再生誘導(dǎo)。另外，通過(guò)使用上述誘導(dǎo)劑，能夠促進(jìn)損傷組織的再生。另外，對(duì)于上述誘導(dǎo)劑，不 僅能夠期待其作為功能性組織再生誘導(dǎo)、促進(jìn)劑的用途，還能夠期待其預(yù)防組織干細(xì)胞的 減少所造成的組織、器官功能降低的、即作為所謂的預(yù)防藥物的用途、或者延緩年齡增長(zhǎng)性 變化的進(jìn)行的、即作為抗衰老藥物的用途。本發(fā)明的誘導(dǎo)劑含有用來(lái)將骨髓細(xì)胞從骨髓動(dòng)員到末梢血中的藥劑，所述藥劑含 有以下的(a) (f)中的任一項(xiàng)記載的成分。(a)S100A8 蛋白質(zhì)(b)分泌S100A8蛋白質(zhì)的細(xì)胞(c)插入有編碼S100A8蛋白質(zhì)的DNA的載體(d)S100A9 蛋白質(zhì)(e)分泌S100A9蛋白質(zhì)的細(xì)胞(f)插入有編碼S100A9蛋白質(zhì)的DNA的載體。將上述藥劑給予血管或肌肉。用來(lái)將骨髓細(xì)胞從骨髓動(dòng)員到末梢血中的藥劑的特征在于，通過(guò)給予到血管或肌 肉，將骨髓細(xì)胞從骨髓動(dòng)員到末梢血中。被動(dòng)員到末梢血中的骨髓細(xì)胞從末梢血中被誘導(dǎo) 到損傷組織。因此，通過(guò)使用該藥劑，能夠?qū)⒐撬杓?xì)胞誘導(dǎo)到損傷部位，從而促進(jìn)組織的功能性 再生，因此該藥劑能夠用作用來(lái)開(kāi)發(fā)再生醫(yī)療技術(shù)、再生誘導(dǎo)藥物的基礎(chǔ)研究和臨床研究 所需的試劑。另外，通過(guò)使用上述藥劑，能夠促進(jìn)損傷組織的再生。特別是通過(guò)將上述藥劑給予 血管或肌肉從而將骨髓來(lái)源的細(xì)胞誘導(dǎo)到損傷部位，使得能夠在從外部難以直接給予藥劑的腦的組織損傷或心臟的組織損傷中促進(jìn)組織的功能性再生。本發(fā)明還提供一種組織再生促進(jìn)劑或組織再生促進(jìn)用試劑盒，其含有以下的 (a) (f)中記載的成分中的至少一種成分。(a)S100A8 蛋白質(zhì)(b)分泌S100A8蛋白質(zhì)的細(xì)胞(c)插入有編碼S100A8蛋白質(zhì)的DNA的載體(d)S100A9 蛋白質(zhì)(e)分泌S100A9蛋白質(zhì)的細(xì)胞(f)插入有編碼S100A9蛋白質(zhì)的DNA的載體。該組織再生促進(jìn)劑或組織再生促進(jìn)用試劑盒的特征在于，通過(guò)將其給予損傷組織 部位或其附近、血管或者肌肉，從而將在血液中循環(huán)的骨髓來(lái)源的細(xì)胞從末梢血中誘導(dǎo)到 該損傷組織(局部誘導(dǎo))。另外，作為組織再生促進(jìn)用試劑盒，可例示出含有(1)溶解在纖維蛋白原中的上 述成分和(2)凝血酶的組織再生促進(jìn)用試劑盒、或者含有(1)上述成分、( 纖維蛋白原 和( 凝血酶的組織再生促進(jìn)用試劑盒。在本發(fā)明中，可以使用市售的纖維蛋白原和凝 血酶。例如，可列舉出纖維蛋白原 HT-Wf (Benesis-Mitsubishi Pharma)、Beriplast (ZLB Behring)、Tisseel (Baxter)、Bolheal (化血研)、TachoComb (ZLB Behring)，但并不限定于 這些。作為可再生的組織，沒(méi)有特殊限制，只要是損傷的組織，則任何組織均可，例如可 例示出活體皮膚組織、體內(nèi)活檢(手術(shù))組織(腦、肺、心臟、肝臟、胃、小腸、大腸、胰臟、腎 臟、膀胱、脾臟、子宮、睪丸或血液等)。特別是由于本發(fā)明的藥劑可使從體外難以直接給予 藥劑的組織(腦、心臟等)再生，因此可有效地被利用。被動(dòng)員到損傷組織的骨髓來(lái)源的細(xì)胞通過(guò)分化為各種細(xì)胞來(lái)參與損傷組織的功 能性再生和功能維持、功能強(qiáng)化。在本發(fā)明中，作為損傷組織，可列舉出由引起缺血、灌注不 足/缺氧狀態(tài)的各種病理狀態(tài)、外傷、燒傷、炎癥、自身免疫、基因異常等而導(dǎo)致的損傷的組 織，但并不限定于這些原因。另外，損傷組織也包括壞死組織。作為本發(fā)明的組織，只要是骨髓來(lái)源的細(xì)胞能夠分化的組織，則沒(méi)有特殊限制，例 如可例示出皮膚組織、骨組織、軟骨組織、肌肉組織、脂肪組織、心肌組織、神經(jīng)系統(tǒng)組織、肺 組織、消化道組織、肝/膽/胰組織、泌尿/生殖器等生物體內(nèi)的所有組織。另外，通過(guò)使用 上述組織再生促進(jìn)劑，難治性皮膚潰瘍、皮膚創(chuàng)傷、水皰癥、脫發(fā)癥等皮膚疾病就不用說(shuō)了， 在腦梗塞、心肌梗塞、骨折、肺梗塞、胃潰瘍、腸炎等組織損傷中，誘導(dǎo)功能性組織再生的治 療也是可能的。作為可給予上述組織再生促進(jìn)劑的動(dòng)物種，可列舉出人或非人動(dòng)物，例如可 例示出人、小鼠、大鼠、猴、豬、狗、兔、倉(cāng)鼠、豚鼠等，但并不限定于這些。另外，本發(fā)明的藥劑還可以給予糖尿病患者。已知作為糖尿病的皮膚并發(fā)癥的難 治性皮膚潰瘍比正常人的皮膚潰瘍更難以治愈，但本發(fā)明的藥劑可有效地用于這樣的糖尿 病患者。本發(fā)明的骨髓細(xì)胞為除造血系干細(xì)胞和其來(lái)源的白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板以外的 細(xì)胞，目前包括以被稱(chēng)為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞或骨髓間質(zhì)多能干細(xì)胞或骨髓多能干細(xì)胞的細(xì) 胞為代表的干細(xì)胞或者存在于骨髓中的組織祖細(xì)胞團(tuán)。作為本發(fā)明的骨髓細(xì)胞，為能夠通CN 102076351 A
說(shuō)明書(shū)
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過(guò)骨髓采集(骨髓細(xì)胞采集)或者末梢血采集來(lái)進(jìn)行分離的細(xì)胞。造血系干細(xì)胞為非附 著細(xì)胞，本發(fā)明的骨髓細(xì)胞可以以附著細(xì)胞的形式如下獲得通過(guò)對(duì)從骨髓采集(骨髓細(xì) 胞采集)、末梢血采集獲得的血液中的單核細(xì)胞級(jí)分進(jìn)行培養(yǎng)而獲得。另外，本發(fā)明的骨髓 細(xì)胞包括間充質(zhì)干細(xì)胞，并優(yōu)選具有分化為成骨細(xì)胞(誘導(dǎo)分化可通過(guò)觀察鈣的沉積來(lái)識(shí) 別)、軟骨細(xì)胞(可通過(guò)阿辛藍(lán)染色陽(yáng)性、番紅-ο染色陽(yáng)性等來(lái)識(shí)別)、脂肪細(xì)胞(可通過(guò) 蘇丹III染色陽(yáng)性來(lái)識(shí)別)，進(jìn)一步優(yōu)選具有分化為成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、肌 腱細(xì)胞等間充質(zhì)細(xì)胞，更進(jìn)一步優(yōu)選具有分化為神經(jīng)細(xì)胞、上皮細(xì)胞(例如表皮角化細(xì)胞、 腸道上皮細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞角蛋白家族)、血管內(nèi)皮細(xì)胞的能力，分化后的細(xì)胞并不限定于上述 細(xì)胞，也包括分化為肝臟、腎臟、胰臟等實(shí)質(zhì)器官細(xì)胞的能力。在本發(fā)明中，骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞或骨髓間質(zhì)多能干細(xì)胞或骨髓多能干細(xì)胞 是指存在于骨髓內(nèi)的細(xì)胞，其能夠從骨髓直接采集或者從其他組織(血液、皮膚、脂肪或其 他組織)間接地采集并作為附著于(塑料或者玻璃制)培養(yǎng)皿的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)、增殖，其為 具有分化為骨、軟骨、脂肪等間充質(zhì)組織(間充質(zhì)干細(xì)胞)、或者分化為骨骼肌、心肌、甚至 分化為神經(jīng)組織、上皮組織(多能干細(xì)胞)的能力這樣的特征的細(xì)胞，其可以通過(guò)骨髓血采 集、末梢血采集、甚至通過(guò)采集脂肪等間充質(zhì)組織、皮膚等上皮組織、腦等神經(jīng)組織來(lái)獲得。 另外，骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞或骨髓來(lái)源的多能干細(xì)胞或骨髓多能干細(xì)胞還具有下述特 征通過(guò)將一度附著于培養(yǎng)皿的這些細(xì)胞給予生物體的損傷部位，具有分化為例如構(gòu)成皮 膚的角質(zhì)形成細(xì)胞等上皮組織、構(gòu)成腦的神經(jīng)系統(tǒng)的組織的能力。本發(fā)明的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞或骨髓間質(zhì)多能干細(xì)胞或骨髓多能干細(xì)胞除了具有 分化為成骨細(xì)胞(誘導(dǎo)分化可通過(guò)觀察鈣的沉積等來(lái)識(shí)別)、軟骨細(xì)胞(可通過(guò)阿辛藍(lán)染色 陽(yáng)性、番紅-0染色陽(yáng)性等來(lái)識(shí)別)、脂肪細(xì)胞(可通過(guò)蘇丹III染色陽(yáng)性等來(lái)識(shí)別)的能力 外，優(yōu)選具有分化為例如成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、肌腱細(xì)胞等間充 質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、色素細(xì)胞、表皮細(xì)胞、毛囊細(xì)胞(表達(dá)細(xì)胞角蛋白家族、毛發(fā)角蛋白家族 等)、上皮細(xì)胞(例如表皮角化細(xì)胞、腸道上皮細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞角蛋白家族等)、內(nèi)皮細(xì)胞，并 進(jìn)一步優(yōu)選具有分化為肝臟、腎臟、胰臟等實(shí)質(zhì)器官細(xì)胞的能力，但分化后的細(xì)胞并不限定 于上述細(xì)胞。另外，人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞或骨髓間質(zhì)多能干細(xì)胞或骨髓多能干細(xì)胞可例示出可 通過(guò)骨髓采集(骨髓細(xì)胞采集)、末梢血采集、脂肪采集直接獲得或者通過(guò)將單核細(xì)胞級(jí)分 分離后進(jìn)行培養(yǎng)而以附著細(xì)胞的形式獲得的細(xì)胞，對(duì)此并沒(méi)有限制。作為人骨髓間充質(zhì)干 細(xì)胞或骨髓間質(zhì)多能干細(xì)胞或骨髓多能干細(xì)胞的標(biāo)記，可例示出Lin陰性、CD45陰性、CD44 陽(yáng)性中的全部或一部分，但并不限定于這些。另外，小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞或骨髓間質(zhì)多能干細(xì)胞或骨髓多能干細(xì)胞可例示出 例如可通過(guò)實(shí)施例中記載的方法獲得的細(xì)胞，但對(duì)此并沒(méi)有限制。作為小鼠骨髓間充質(zhì)干 細(xì)胞或骨髓間質(zhì)多能干細(xì)胞或骨髓多能干細(xì)胞的標(biāo)記，可例示出CD44陽(yáng)性、PDGFRα陽(yáng)性、 PDGFRii陽(yáng)性、⑶45陰性、Lin陰性、Sca-I陽(yáng)性、c_kit陰性中的全部或一部分，但并不限定 于這些。組織祖細(xì)胞被定義為具有單方向性地分化為除血液系統(tǒng)以外的特定組織細(xì)胞的 能力的未分化細(xì)胞，包括具有分化為上述的間充質(zhì)組織、上皮組織、神經(jīng)組織、實(shí)質(zhì)器官、血 管內(nèi)皮的能力的未分化細(xì)胞。
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在本發(fā)明的誘導(dǎo)劑和本發(fā)明的組織再生促進(jìn)劑中，作為除上述(a) (f)中記載 的成分中的至少一種成分以外的成分，只要不阻礙骨髓來(lái)源的細(xì)胞的誘導(dǎo)或組織再生促 進(jìn)，則沒(méi)有特殊限制。例如，本發(fā)明的組織再生促進(jìn)劑中除了上述(a) (f)中記載的成分 中的至少一種成分以外，還可以含有強(qiáng)化S100A8或S100A9的功能性組織再生誘導(dǎo)功能的 相關(guān)分子(群)，抑制除S100A8或S100A9的期待的效果以外的作用的分子(群)，控制骨 髓來(lái)源的細(xì)胞的增殖或分化的因子，強(qiáng)化、維持這些因子或細(xì)胞的功能的其他因子。作為本發(fā)明的誘導(dǎo)劑或組織再生促進(jìn)劑中的S100A8或S100A9蛋白質(zhì)的來(lái)源的動(dòng) 物種，可列舉出人或非人動(dòng)物，可例示出例如人、小鼠、大鼠、猴、豬、狗、兔、倉(cāng)鼠、豚鼠等，優(yōu) 選為與上述成分所給予的動(dòng)物種相同的動(dòng)物種。作為本發(fā)明的誘導(dǎo)劑或組織再生促進(jìn)劑中的S100A8蛋白質(zhì)，可例示出包含序列 號(hào)1、3或5中記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，但并不限定于這些。本發(fā)明的S100A8蛋白質(zhì)中 也包括與包含序列號(hào)1、3或5中記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)在功能上等同的蛋白質(zhì)。作為 這樣的蛋白質(zhì)，可列舉出例如1)由在序列號(hào)1、3或5中記載的氨基酸序列中替換、缺失、 插入和/或添加1個(gè)或多個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列構(gòu)成，且與包含序列號(hào)1、3或5中 記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)在功能上等同的經(jīng)分離的蛋白質(zhì)；和2)為由與包含序列號(hào)2、 4或6中記載的堿基序列的DNA在嚴(yán)格的條件下雜交的DNA編碼的蛋白質(zhì)，且與包含序列 號(hào)1、3或5中記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)在功能上等同的經(jīng)分離的蛋白質(zhì)。作為本發(fā)明的誘導(dǎo)劑或組織再生促進(jìn)劑中的S100A9蛋白質(zhì)，可例示出包含序列 號(hào)7、9或11中記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，但并不限定于這些。本發(fā)明的S100A9蛋白質(zhì) 中還包括與包含序列號(hào)7、9或11中記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)在功能上等同的蛋白質(zhì)。 作為這樣的蛋白質(zhì)，可列舉出例如1)由在序列號(hào)7、9或11中記載的氨基酸序列中替換、 缺失、插入和/或添加1個(gè)或多個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列構(gòu)成，且與包含序列號(hào)7、9 或11中記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)在功能上等同的經(jīng)分離的蛋白質(zhì)；和2、為由與包含序 列號(hào)8、10或12中記載的堿基序列的DNA在嚴(yán)格的條件下雜交的DNA編碼的蛋白質(zhì)，且與 包含序列號(hào)7、9或11中記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)在功能上等同的經(jīng)分離的蛋白質(zhì)。與包含序列號(hào)1、3、5、7、9或11中記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)在功能上等同的經(jīng) 分離的蛋白質(zhì)可以為包含序列號(hào)1、3、5、7、9或11中記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的同源物 或者旁系同源物。對(duì)于與包含序列號(hào)1、3、5、7、9或11中記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)在功 能上等同的蛋白質(zhì)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過(guò)公知的方法(実験醫(yī)學(xué)別冊(cè)·遺伝子工學(xué)〃 > K ” ”，ppM6-251、羊土社、1991年発行)來(lái)分離。作為與包含序列號(hào)1、3、5、7、9或11中記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)在功能上等同 的蛋白質(zhì)，可列舉出具有骨髓來(lái)源的細(xì)胞的誘導(dǎo)活性的蛋白質(zhì)。由在序列號(hào)1、3、5、7、9或11中記載的氨基酸序列中替換、缺失、插入和/或添加 1個(gè)或多個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列構(gòu)成、且與包含序列號(hào)1、3、5、7、9或11中記載的氨 基酸序列的蛋白質(zhì)在功能上等同的蛋白質(zhì)包括天然存在的蛋白質(zhì)。一般來(lái)說(shuō)，如通過(guò)干擾 素基因等所已知的，真核生物的基因具有多態(tài)性(polymorphism)。根據(jù)該多態(tài)性所產(chǎn)生的 堿基序列的變化的不同而不同，有時(shí)1個(gè)或多個(gè)氨基酸被替換、缺失、插入和/或添加。屬 于這樣自然存在的蛋白質(zhì)且具有在序列號(hào)1、3、5、7、9或11中記載的氨基酸序列中替換、 缺失、插入和/或添加1個(gè)或多個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列、并且與由序列號(hào)1、3、5、7、9
10或11中記載的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)在功能上等同的蛋白質(zhì)也包括在本發(fā)明的S100A8 或S100A9蛋白質(zhì)中。另外，只要是與由序列號(hào)1、3、5、7、9或11中記載的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)在 功能上等同的蛋白質(zhì)，則人為制作的變異蛋白質(zhì)也包括在本發(fā)明中。作為對(duì)給定的堿基序 列施加隨機(jī)變異的方法，已知例如通過(guò)DNA的亞硝酸處理的堿基對(duì)的替換(Hirose，S. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA. ,79 :7258-7260,1982) 該方法中，通過(guò)對(duì)欲導(dǎo)入變異的片 段進(jìn)行亞硝酸處理，能夠在特定的片段中隨機(jī)地導(dǎo)入堿基對(duì)的替換。或者另外，作為在任意 位點(diǎn)導(dǎo)入目標(biāo)變異的技術(shù)，有 gapped duplex 法等(Kramer W. andFritz HJ.，Methods in Enzymo 1.，154 :350-367,1987)。將克隆要導(dǎo)入變異的基因而得到的環(huán)狀雙鏈載體分成單 鏈，使其與在目標(biāo)部位具有變異的合成寡核苷酸雜交。使被限制性?xún)?nèi)切酶切斷而形成線狀 的載體來(lái)源的互補(bǔ)單鏈DNA與上述環(huán)狀單鏈載體黏著(anneal)，用DNA聚合酶填充該載體 與上述合成核苷酸之間的間隙，進(jìn)而通過(guò)連接形成完整的雙鏈環(huán)狀載體。所改變的氨基酸的數(shù)目典型地為50個(gè)氨基酸以?xún)?nèi)、優(yōu)選為30個(gè)氨基酸以?xún)?nèi)、進(jìn)一 步優(yōu)選為5個(gè)氨基酸以?xún)?nèi)(例如1個(gè)氨基酸)。在人為地替換氨基酸的情況下，如果替換為性質(zhì)相似的氨基酸，則容易維持原蛋 白質(zhì)的活性。本發(fā)明的蛋白質(zhì)包括在上述氨基酸替換中進(jìn)行保守性替換而得到的蛋白質(zhì)， 且與包含序列號(hào)1、3、5、7、9或11中記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)在功能上等同的蛋白質(zhì)。 在替換對(duì)于蛋白質(zhì)活性來(lái)說(shuō)重要的區(qū)域的氨基酸等情況下，保守性替換是重要的。這樣的 氨基酸的保守性替換對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟知的。作為相當(dāng)于保守性替換的氨基酸的組，可列舉出例如堿性氨基酸(例如賴(lài)氨酸、 精氨酸、組氨酸)、酸性氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性氨基酸(例如甘 氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性氨基酸(例如丙氨 酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β支鏈氨基酸(例如蘇 氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)等。另外，通過(guò)非保守性替換也能夠使蛋白質(zhì)的活性等進(jìn)一步提高(包括例如恒定的 活化型蛋白質(zhì)(constitutively activated proteins)等)。作為獲得與包含序列號(hào)1、3、5、7、9或11中記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)在功能上 等同的蛋白質(zhì)的其他方法，可列舉出利用雜交反應(yīng)的方法。即，將編碼如序列號(hào)2、4、6、8、 10或12所示的本發(fā)明的S100A8或S100A9蛋白質(zhì)的DNA或其斷片制成探針，分離能夠與其 雜交的DNA。若在嚴(yán)格的條件下實(shí)施雜交反應(yīng)，則能夠選擇同源性高的DNA作為堿基序列， 其結(jié)果是分離的蛋白質(zhì)含有與S100A8或S100A9蛋白質(zhì)在功能上等同的蛋白質(zhì)的可能性增 加。同源性高的堿基序列是指能夠顯示例如70%以上、優(yōu)選90%以上的相同性。另外，嚴(yán)格的條件具體地是指例如在6XSSC、40%甲酰胺、25°C下進(jìn)行雜交、且在 1XSSC、55°C下進(jìn)行洗滌的條件。嚴(yán)格性受鹽濃度、甲酰胺的濃度或溫度等條件的影響，但 只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員，就能夠設(shè)定這些條件以獲得所需的嚴(yán)格性。通過(guò)利用雜交，能夠?qū)⒕幋a例如除包含序列號(hào)1、3、5、7、9或11中記載的氨基酸 序列的蛋白質(zhì)以外的S100A8或S100A9蛋白質(zhì)的同源物的DNA分離。與包含序列號(hào)1、3、5、7、9或11中記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)在功能上等同的蛋 白質(zhì)通常與序列號(hào)1、3、5、7、9或11中記載的氨基酸序列具有高的同源性。高的同源性是
11指至少30%以上、優(yōu)選50%以上、進(jìn)一步優(yōu)選80%以上(例如95%以上)的序列具有相同 性。關(guān)于堿基序列或氨基酸序列的相同性，可以利用使用了網(wǎng)絡(luò)的同源性檢索網(wǎng)站來(lái)進(jìn)行 [例如在日本DNA數(shù)據(jù)庫(kù)(DDBJ)中，可以利用FASTA、BLAST、PSI-BLAST和SSEARCH等同源 性檢索[例如日本DNA數(shù)據(jù)庫(kù)(DDBJ)網(wǎng)站上的同源性檢索Search and Analysis)的網(wǎng) 頁(yè):http://www. ddbj. nig. ac. jp/E-mail/homology-j. html]。另夕卜，在 National Center for Biotechnology Information (NCBI)中，還可以進(jìn)行使用了 BLAST 的檢索(例如 NCBI 的 主頁(yè)網(wǎng)站的 BLAST 網(wǎng)頁(yè)http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/ ；Altschul，S. F. et al.， J. Mol. Biol.，1990，215 (3) :403-10 ；Altschul，S. F. & Gish，W. ,Meth. Enzymo 1.，1996，266 460-480 ；Altschul,S.F.et al.，Nucleic Acids Res.，1997，25 :3389-3402)]。例如，在使用Advanced BLAST 2. 1中的氨基酸序列的相同性的計(jì)算中，相同性 (identity)的值(％)可以如下進(jìn)行檢索來(lái)得到程序使用blastp，將Expect值設(shè)定為10、 將 Filter 全部設(shè)定為 0FF，Matrix 使用 BL0SUM62，并將 Gap existence cost,Per residue gap cost 和 Lambda ratio 分別設(shè)定為 11、1、0. 85 (缺省值)(Karlin，S. and S. F. Altschul (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :2264-68 ；Karlin, S. and S. F. Altschul (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873-7)。本發(fā)明的蛋白質(zhì)或在功能上與其等同的蛋白質(zhì)可以是進(jìn)行了糖鏈等生理性修飾、 熒光或放射性物質(zhì)等標(biāo)記或者與其他蛋白質(zhì)的融合等各種修飾而得到的蛋白質(zhì)。特別是在 后文所述的基因重組體中，糖鏈的修飾可能因用于表達(dá)的宿主的不同而產(chǎn)生差異。但是，即 使在糖鏈的修飾方面存在差異，只要顯示與本說(shuō)明書(shū)中公開(kāi)的S100A8或S100A9蛋白質(zhì)相 同的性狀，則均屬于本發(fā)明的S100A8或S100A9蛋白質(zhì)或在功能上等同的蛋白質(zhì)。S100A8或S100A9蛋白質(zhì)不僅可以從活體材料獲得，而且可以通過(guò)將對(duì)其進(jìn)行編 碼的基因整合入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)體系并制成基因重組體(recombinant)來(lái)獲得。為了通過(guò)基因 工程技術(shù)獲得S100A8或S100A9蛋白質(zhì)，可以將上文所述的編碼S100A8或S100A9蛋白質(zhì) 的DNA整合入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)體系并使之表達(dá)。作為本發(fā)明中可應(yīng)用的宿主/載體體系，可舉出 例如表達(dá)載體PGEX和大腸桿菌。由于pGEX可以使外來(lái)基因以與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST) 的融合蛋白質(zhì)的方式表達(dá)(Gene，67 :31_40，1988)，因此通過(guò)熱激將整合了編碼S100A8或 S100A9蛋白質(zhì)的基因的pGEX導(dǎo)入BL21等大腸桿菌株中，在適當(dāng)培養(yǎng)一段時(shí)間后，添加iso propylthio- β -D-galactoside (IPTG)以誘導(dǎo) GST 融合 S100A8 或 GST 融合 S100A9 蛋白質(zhì) 的表達(dá)。本發(fā)明的GST由于吸附于谷胱甘肽瓊脂糖4B，因此表達(dá)產(chǎn)物能夠容易地通過(guò)親和 Mi/rfe (affinity column chromatography) j^M^^ito此外，作為用于獲得S100A8或S100A9蛋白質(zhì)的重組體的宿主/載體體系， 還可以采用下述的體系。首先，當(dāng)利用細(xì)菌作為宿主時(shí)，市售的有利用了組氨酸標(biāo)簽 (hiStidine-tag)、HA標(biāo)簽(HA-tag)、FLAG(FLAG-tag)等的融合蛋白質(zhì)的表達(dá)用載體。關(guān)于 酵母，已公知Pichia屬酵母對(duì)于具有糖鏈的蛋白質(zhì)的表達(dá)是有效的。從糖鏈的添加的角度 出發(fā)，還可以采用利用了以昆蟲(chóng)細(xì)胞為宿主的桿狀病毒載體的表達(dá)體系(Bio/Technology， 6 :47-55,1988)。此外，還利用哺乳動(dòng)物的細(xì)胞可以進(jìn)行利用了 CMV、RSV或SV40等啟動(dòng)子 的載體的轉(zhuǎn)染，這些宿主/載體體系均能夠用作S100A8或S100A9蛋白質(zhì)的表達(dá)體系。另 外，還可以利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體等病毒載體來(lái)導(dǎo)入基因。得到的本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以從宿主細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外(培養(yǎng)基等)分離，然后純化成實(shí)質(zhì)上純且均一的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的分離、純化可以使用在通常的蛋白質(zhì)純化中使用的 分離、純化方法，沒(méi)有任何限定。例如，可以適當(dāng)選擇、組合色譜柱、過(guò)濾器、超濾、鹽析、溶劑 沉淀、溶劑提取、蒸餾、免疫沉降、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳、透析、重結(jié)晶等 以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離、純化。作為色譜法，可列舉出例如親和層析法、離子交換色譜法、疏水性色譜法、凝膠過(guò) 濾法、逆相色譜法、吸附層析法等(Marshak et al. ,Strategies forProtein Purification and Characterization :A Laboratory Course Manual. EdDaniel R. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996)。這些色譜法可以使用液相色譜法例如HPLC、FPLC等液相色譜法 來(lái)進(jìn)行。另外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)優(yōu)選是實(shí)質(zhì)上經(jīng)純化的蛋白質(zhì)。這里，“實(shí)質(zhì)上經(jīng)純化”是 指本發(fā)明的蛋白質(zhì)的純化度(本發(fā)明的蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)成分總體中的比例)為50%以上、 60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、100%或者接近100%。接近100%的 上限依賴(lài)于本領(lǐng)域技術(shù)人員的純化技術(shù)和分析技術(shù)，例如為99. 999%,99. 99%,99. 9%,
99% 等。另外，只要是具有上述純化度的蛋白質(zhì)，則可以是通過(guò)任何純化方法進(jìn)行了純化 的蛋白質(zhì)，包括實(shí)質(zhì)上經(jīng)純化的蛋白質(zhì)。例如，可例示出通過(guò)適當(dāng)選擇或組合上述色譜柱、 過(guò)濾器、超濾、鹽析、溶劑沉淀、溶劑提取、蒸餾、免疫沉降、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電 聚焦電泳、透析、重結(jié)晶等方法而實(shí)質(zhì)上純化得到的蛋白質(zhì)，但并不限定于這些。作為釋放或分泌本發(fā)明的誘導(dǎo)劑或組織再生促進(jìn)劑中的S100A8或S100A9蛋白質(zhì) 的細(xì)胞，基本上體內(nèi)所有的組織來(lái)源的細(xì)胞均可以。作為容易采集和培養(yǎng)的細(xì)胞，可例示出 成纖維細(xì)胞(例如正常皮膚成纖維細(xì)胞和其來(lái)源的細(xì)胞株)，但并不限定于這些。另外，分 泌S100A8或S100A9蛋白質(zhì)的細(xì)胞也可以通過(guò)將下述載體導(dǎo)入成纖維細(xì)胞(例如正常皮膚 成纖維細(xì)胞和其來(lái)源的細(xì)胞株)等哺乳類(lèi)細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞或其他細(xì)胞來(lái)制作，所述載體是 通過(guò)將編碼310(^8或510(^9蛋白質(zhì)的0嫩、或者通過(guò)將編碼分泌信號(hào)的0嫩仏16 CAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTACTG CTG CTG TGG GTT CCA GGT TCC ACT GGT GAC ；序列號(hào) 15)結(jié)合到編碼S100A8或S100A9蛋白質(zhì)的DNA上而得到的DNA插入公知的表達(dá)載體或基 因治療用載體而制作的。作為編碼分泌信號(hào)的DNA，可例示出具有上述序列的DNA，但并不 限定于此。另外，這些細(xì)胞所來(lái)源的動(dòng)物種沒(méi)有特別限制，優(yōu)選使用進(jìn)行組織再生的對(duì)象動(dòng) 物種的細(xì)胞、對(duì)象自身的細(xì)胞、或者與進(jìn)行組織再生的對(duì)象具有血緣關(guān)系的動(dòng)物來(lái)源的細(xì) 胞。編碼本發(fā)明的誘導(dǎo)劑或組織再生促進(jìn)劑中的S100A8或S100A9蛋白質(zhì)的DNA只要 編碼S100A8或S100A9蛋白質(zhì)，則可以是CDNA、也可以是基因組DNA，另外，還可以是天然的 DNA或是人工合成的DNA。編碼S100A8或S100A9蛋白質(zhì)的DNA通常以插入到載體(例如 基因治療用載體)的狀態(tài)包含在本發(fā)明的誘導(dǎo)劑或組織再生促進(jìn)劑中。作為本發(fā)明中的基因治療用載體，可例示出質(zhì)粒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載 體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、仙臺(tái)病毒載體、仙臺(tái)病毒包膜載體、乳頭狀瘤病毒載體 等，但并不限定于這些。該基因治療用載體中還可以包括有效地誘導(dǎo)基因表達(dá)的啟動(dòng)子DNA 序列、控制基因表達(dá)的因子以及對(duì)于維持DNA的穩(wěn)定性所需的分子。另外，本發(fā)明的誘導(dǎo)劑和本發(fā)明的組織再生促進(jìn)劑中也含有屬于S100A8或
13S100A9蛋白質(zhì)的部分多肽且具有誘導(dǎo)骨髓來(lái)源的細(xì)胞的活性的多肽、分泌該部分多肽的細(xì) 胞或插入有編碼該部分多肽的DNA的載體。關(guān)于本發(fā)明的誘導(dǎo)劑或組織再生促進(jìn)劑的給予方法，可列舉出經(jīng)口給予法或非經(jīng) 口給予法，作為所述的給予方法，具體地可列舉出注射給予、經(jīng)鼻給予、經(jīng)肺給予、經(jīng)皮給予 等。例如，可以通過(guò)血管內(nèi)注射(動(dòng)脈內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射等)、肌肉內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、皮 下注射等來(lái)全身(血中或肌肉中)或局部(例如皮下、皮內(nèi)、皮膚表面、眼球或眼瞼結(jié)膜、鼻 腔粘膜、口腔內(nèi)和消化管粘膜、陰道/子宮內(nèi)粘膜或者損傷部位等)地給予本發(fā)明的誘導(dǎo)劑 或組織再生促進(jìn)劑。另外，可以根據(jù)患者的年齡、癥狀來(lái)選擇適當(dāng)?shù)慕o予方法。當(dāng)給予S100A8或 S100A9蛋白質(zhì)時(shí)，例如每次給予可以在每Ikg體重在0. OOOOOOlmg IOOOmg的范圍中選擇 給予量?；蛘撸梢岳缭诿课换颊?. 00001 lOOOOOmg/body的范圍內(nèi)選擇給予量。當(dāng) 給予分泌S100A8或S100A9蛋白質(zhì)的細(xì)胞或插入有編碼S100A8或S100A9蛋白質(zhì)的DNA的 基因治療用載體時(shí)，可以按照S100A8或S100A9蛋白質(zhì)在損傷組織中的量達(dá)到上述范圍內(nèi) 的方式給予。但是，本發(fā)明的誘導(dǎo)劑或組織再生促進(jìn)劑并不限于這些給予量。本發(fā)明的誘導(dǎo)劑或組織再生促進(jìn)劑可以按照常規(guī)方法制成制劑(例如 Remington' s Pharmaceutical Science， latest edition， Mark Publishing Company, Easton, U. S. A)，還可以同時(shí)含有醫(yī)藥上可容許的載體或添加物。可列舉出例如表面活性 齊U、賦形劑、著色劑、香料、防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、懸浮劑、等滲劑、粘合劑、崩解劑、潤(rùn)滑 劑、流動(dòng)性促進(jìn)劑、矯味劑等，但并不限于這些，還可以適當(dāng)使用其他常用的載體。具體而 言，可列舉出輕質(zhì)硅酸酐、乳糖、結(jié)晶纖維素、甘露醇、淀粉、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素 鈉、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯醇縮醛二乙基氨基乙酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、 明膠、中鏈脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯固化蓖麻油60、白糖、羧甲基纖維素、玉米淀粉、無(wú)機(jī) 鹽類(lèi)等。另外，上述的S100A8或S100A9蛋白質(zhì)、分泌S100A8或S100A9蛋白質(zhì)的細(xì)胞、插 入有編碼S100A8或S100A9蛋白質(zhì)的DNA的載體、S100A8或S100A9蛋白質(zhì)的部分多肽、分 泌該部分多肽的細(xì)胞或者插入有編碼該部分多肽的DNA的載體的用途還可以表示為下述 (1) ⑶。(1) 一種促進(jìn)損傷的組織再生的方法，其包含將S100A8或S100A9蛋白質(zhì)、分泌該 蛋白質(zhì)的細(xì)胞、插入有編碼該蛋白質(zhì)的DNA的載體、該蛋白質(zhì)的部分多肽、分泌該部分多肽 的細(xì)胞或者插入有編碼該部分多肽的DNA的載體給予所述組織受到損傷的對(duì)象的工序。(2) 一種將骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)到損傷的組織的方法，其包含將S100A8或S100A9蛋白 質(zhì)、分泌該蛋白質(zhì)的細(xì)胞、插入有編碼該蛋白質(zhì)的DNA的載體、該蛋白質(zhì)的部分多肽、分泌 該部分多肽的細(xì)胞或者插入有編碼該部分多肽的DNA的載體給予所述組織受到損傷的對(duì) 象的工序。(3) S100A8或S100A9蛋白質(zhì)、分泌該蛋白質(zhì)的細(xì)胞、插入有編碼該蛋白質(zhì)的DNA的 載體、該蛋白質(zhì)的部分多肽、分泌該部分多肽的細(xì)胞或者插入有編碼該部分多肽的DNA的 載體在制造骨髓細(xì)胞的誘導(dǎo)劑或組織再生促進(jìn)劑中的用途。(4) S100A8或S100A9蛋白質(zhì)、分泌該蛋白質(zhì)的細(xì)胞、插入有編碼該蛋白質(zhì)的DNA的 載體、該蛋白質(zhì)的部分多肽、分泌該部分多肽的細(xì)胞或者插入有編碼該部分多肽的DNA的
14載體，其用于將骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)到損傷的組織的方法中。(5)S100A8或S100A9蛋白質(zhì)、分泌該蛋白質(zhì)的細(xì)胞、插入有編碼該蛋白質(zhì)的DNA的 載體、該蛋白質(zhì)的部分多肽、分泌該部分多肽的細(xì)胞或者插入有編碼該部分多肽的DNA的 載體，其用于促進(jìn)損傷的組織再生的方法中。作為上述組織受到損傷的對(duì)象，可列舉出人或非人動(dòng)物，可例示出例如人、小鼠、 大鼠、猴、豬、狗、兔、倉(cāng)鼠、豚鼠等，但并不限于這些。需要說(shuō)明的是，本說(shuō)明書(shū)中引用的全部現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)被引入本說(shuō)明書(shū)中以作為參 照。
實(shí)施例以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步具體地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。〔實(shí)施例1〕目的評(píng)價(jià)體內(nèi)移植皮膚組織功能性再生時(shí)的骨髓來(lái)源的細(xì)胞的參與情況方法為了上述目的通過(guò)以下的方法進(jìn)行研究。1)利用植入GFP骨髓移植小鼠的活體皮膚移植系統(tǒng)，對(duì)移植皮片功能性再生時(shí)的 骨髓來(lái)源的細(xì)胞的參與程度進(jìn)行研究。具體地，對(duì)C57BL/6雄性小鼠(6 8周齡)照射致 死量的放射線(IOGy)，隨后通過(guò)尾靜脈移植GFP(green fluorescent protein)轉(zhuǎn)基因小鼠 來(lái)源的骨髓細(xì)胞(5 X IO6個(gè)/0. Iml生理性磷酸緩沖溶液pH7. 4)(圖1)。2)待移植骨髓細(xì)胞植入(6周時(shí)間)后，在得到的GFP骨髓移植小鼠的背部皮膚上 移植新生小鼠皮膚(雌性)。3)待移植皮片植入和充分地皮膚組織再生G周時(shí)間)后，利用熒光立體顯微鏡觀 察移植皮片區(qū)域的GFP熒光的聚集程度。4)通過(guò)活檢在吸入麻醉下采集移植皮片，使用帶冷卻裝置的切片機(jī)制作皮膚冷凍 切片(6μπι)，用4%多聚甲醛固定(30分鐘)，將組織內(nèi)細(xì)胞核用DAPI染色，使用含有熒光 漂白防止劑的封固劑將組織封固，然后利用激光共聚焦顯微鏡研究GFP陽(yáng)性骨髓來(lái)源的細(xì) 胞是否存在。結(jié)果在植入GFP骨髓移植小鼠的活體皮膚移植系統(tǒng)中，再生的皮膚組織的表皮 角化細(xì)胞、真皮成纖維細(xì)胞、以及平滑肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞大多顯示GFP熒光，其顯示這些細(xì) 胞是骨髓來(lái)源的細(xì)胞(圖幻。即，移植皮膚的功能性再生時(shí)所需的上皮和間充質(zhì)細(xì)胞中很 多是通過(guò)骨髓來(lái)源的干細(xì)胞供給的。討論以上結(jié)果啟示，在皮膚損傷時(shí)骨髓細(xì)胞聚集到損傷部位，通過(guò)分化為構(gòu)建皮 膚的各種器官來(lái)參與皮膚的功能性再生。另外，可以推測(cè)植皮皮片中存在使能夠分化為各 種器官的骨髓細(xì)胞聚集的物質(zhì)。據(jù)報(bào)告骨髓內(nèi)存在造血系干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞這兩種干細(xì)胞系統(tǒng)。本次的研 究顯示，很難推測(cè)出被大量動(dòng)員到移植皮膚內(nèi)的骨髓來(lái)源的上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞是由骨 髓來(lái)源的造血系干細(xì)胞供給的，其強(qiáng)烈啟示骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞可能參與移植組織的 功能性再生。即，推測(cè)從植皮后即處于灌注不足、壞死方向的移植皮膚組織釋放出骨髓來(lái)源 的間充質(zhì)干細(xì)胞動(dòng)員因子，將來(lái)自骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)末梢血液循環(huán)動(dòng)員到移植皮片 內(nèi)，從而誘導(dǎo)功能性皮膚組織再生。
〔實(shí)施例2〕目的皮膚組織提取液內(nèi)存在的骨髓來(lái)源的組織干細(xì)胞誘導(dǎo)因子的鑒定方法為了鑒定被推測(cè)是從處于灌注不足狀態(tài)的切除皮膚釋放的骨髓間充質(zhì)干細(xì) 胞動(dòng)員因子，按照以下的方法進(jìn)行研究。1)為了獲得小鼠骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞，從C57BL/6小鼠的大腿骨或下腿骨采 集小鼠的骨髓細(xì)胞，將含10%胎牛血清的D-MEM(Nacalai公司制)作為細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)基加 入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在37°C、二氧化碳?xì)怏w濃度為5%的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞增值到其所 占的面積相對(duì)于培養(yǎng)皿底面積為70 100%時(shí)，用0. 25%胰蛋白酶ImMEDTA(Nacalai公司 制)將細(xì)胞從培養(yǎng)皿上剝離下來(lái)，再在相同的條件下進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代操作至少重復(fù)5 次以上。然后，將這些附著細(xì)胞分離培養(yǎng)，用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞表面抗原進(jìn)行分析，確認(rèn)為 Lin陰性、⑶45陰性、⑶44陽(yáng)性、Sca-I陽(yáng)性、c-kit陰性。確認(rèn)這些細(xì)胞能夠分化為骨細(xì) 胞、脂肪細(xì)胞且具有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的性質(zhì)。2)將從5只新生小鼠O日齡)獲得的游離皮片浸漬到生理性磷酸緩沖液 pH7.4(PBS) 5ml內(nèi)，在4°C下進(jìn)行M小時(shí)的孵育后，為了除去組織，在4°C的條件下以440G 離心10分鐘，回收上清液，從而制作皮膚提取液。另外，同樣地將從1只6周齡小鼠獲得的 游離皮片浸漬到生理性磷酸緩沖液PH7. 4 (PBS) 5ml內(nèi)，在4°C下孵育M小時(shí)后，為了除去組 織，在4°C的條件下以440G離心10分鐘，回收上清液，從而制作皮膚提取液。3)為了確認(rèn)獲得的皮膚提取液中存在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)活性，本發(fā)明人等使 用boyden小室對(duì)已形成細(xì)胞株的C57BL6小鼠骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞遷移活性進(jìn)行了研 究。具體而言，在boyden小室的下槽(容量為25 μ 1)中加入2日齡或6周齡小鼠的皮膚 提取液(5μ 1)與DMEMQOy 1)的混合液，置于具有8 μ m微孔的聚碳酸酯膜上，然后與該碳 酸酯膜相接地置于boyden小室上槽(容量為50 μ 1)，向其中加入骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì) 胞懸浮液(5Χ IO4個(gè)/50ml培養(yǎng)液DMEM/10%胎牛血清)，在(X)2培養(yǎng)箱內(nèi)、在37°C下培養(yǎng) 4 M小時(shí)。培養(yǎng)后，將小室的上槽拿開(kāi)，取出有機(jī)硅樹(shù)脂薄膜，利用染色定量地研究通過(guò) 所述微孔遷移到小室下槽的骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量(圖4)。4)各采集約2cm2的2日齡小鼠、6周齡小鼠的皮膚，在液氮中快速冷凍后，用研缽 粉碎。使用RNeasHQiagen)從這些樣品中提取并純化RNA。使用純化的RNA利用微陣列技 術(shù)篩選在2日齡小鼠中更多地表達(dá)的mRNA。2日齡小鼠的2倍以上的得分高的基因有767 個(gè)。從這些基因中，研究與肝素親和性高的蛋白質(zhì)、具有分泌可能性的蛋白質(zhì)、2日齡小鼠的 6倍以上的得分高的基因，結(jié)果存在上游第57個(gè)的基因即S100A9。這里，用Western blot 法檢測(cè)S100A9和已知與S100A9形成異源二聚體的S100A8在2日齡皮膚提取液中的存在 情況。即，將2日齡皮膚提取液5μ1與SDS-PAGE sample buffer 5 μ 1 (Bio-fcid)混合， 在98°C下用加熱塊加熱5分鐘，然后冷卻至25°C。將該樣品施于12. 5%丙烯酰胺凝膠的 e-PAGEL(ATTO)上，用電泳裝置(ATTO)以40mA電泳75分鐘?；厥针娪竞蟮哪z，用印跡裝 置(blotting device) (ATTO)，將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到預(yù)先用100%甲醇處理的長(zhǎng)7cm、 寬9cm的PVDF膜(Millipore)上。轉(zhuǎn)印在120mA下進(jìn)行75分鐘。轉(zhuǎn)印結(jié)束后回收PVDF 膜，在含4%脫脂乳的PBSfcacalai)中室溫下振蕩30分鐘。然后，將回收的PVDF膜浸漬到 將抗S100A8抗體(R&D)或抗S100A9 (R&D) 5 μ 1用IOmL的含4%脫脂乳的PBS稀釋得到的 液體中，室溫下振蕩60分鐘。除去抗體液后，用30mL的含0. 1 % Tween 20的PBS將膜在室溫下振蕩洗滌5分鐘。洗滌重復(fù)5次。洗滌后，將膜加入將HRP標(biāo)記抗goat IgG抗體(GE healthcare) 5 μ 1用IOmL的含4%脫脂乳的PBS稀釋而得到的液體中，在室溫下振蕩45分 鐘。在除去抗體液后，用30mL的含0. 1% Tween 20的PBS將膜在室溫下振蕩洗滌5分鐘。 洗滌重復(fù)5次。用ECL檢測(cè)試劑盒(GE healthcare)使膜發(fā)光從而使膠片感光。利用顯影 裝置對(duì)膠片進(jìn)行顯影，得到S100A8和S100A9的蛋白質(zhì)的信號(hào)(圖5)。5)進(jìn)行肝素親和層析柱·色譜法以對(duì)皮膚提取液內(nèi)的具有骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干 細(xì)胞動(dòng)員活性的因子進(jìn)行純化。以下操作使用FPLC裝置(GEhealthcare)進(jìn)行。首先，將2 日齡小鼠皮膚提取液用4°C的9倍容積的20mM磷酸緩沖液pH7. 5稀釋到10倍(稀釋液A)。 預(yù)先使 20mM 磷酸緩沖液 pH7. 5 (300ml)流到 HiPr印 16/10 Heparin FF (GE Healthcare) 中使對(duì)柱平衡。然后，使稀釋液A與柱結(jié)合。然后，用20mM磷酸緩沖液pH 7.5(300ml)對(duì) 柱進(jìn)行洗滌。為了將吸附的蛋白質(zhì)洗脫，制作(A液)20mM磷酸緩沖液pH 7. 5、IOmMNaCl與 (B液)20mM磷酸緩沖液pH 7. 5、500mMNaCl。起始以A液100%/B液為0%進(jìn)行送液、緩緩 地增加B液的比例并最終以A液0% /B液為100%進(jìn)行送液?？偹鸵毫繛?50mL。將洗脫 液每個(gè)3mL地分級(jí)到有機(jī)硅樹(shù)脂涂覆的試管中。將分級(jí)的樣品各5 μ 1與SDS-PAGE sample buffer 5 μ 1 (Bio-Rad)混合，在98°C下用加熱塊加熱5分鐘，然后冷卻至25°C。將該樣品 施于(5-20% graduent)丙烯酰胺凝膠的e-PAGEL (ATTO)上，用電泳裝置(ATTO)以40mA電 泳75分鐘。電泳后用Dodeca silver stain kit (Bio-Rad)檢測(cè)電泳后的蛋白質(zhì)(圖6)。分別與上文同樣地使用boyden小室評(píng)價(jià)經(jīng)分級(jí)的樣品的遷移活性(圖7)。分別與上文同樣地使用Wfestern blot法檢測(cè)經(jīng)分級(jí)的樣品中S100A8和S100A9 蛋白質(zhì)的存在情況(圖8)。6)使用Trizol (invitrogen)從新生小鼠皮膚提取RNA，然后使用Superscript III cDNA synthesis kit (Invitrogen)合成 cDNA。將該 cDNA 作為模板，使用 PCR(聚合 酶鏈反應(yīng))法對(duì)S100A8和S100A9的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，將這些cDNA插入到哺乳類(lèi)細(xì)胞的表 達(dá)蛋白質(zhì)的質(zhì)粒載體PCAGGS中，以使在氨基酸序列的N末端添加有GST tag的序列(序 列號(hào)13(氨基酸序列)、序列號(hào)14(DNA序列))的蛋白質(zhì)表達(dá)(圖9)。使用脂轉(zhuǎn)染試 劑(Invitrogen)將 pCAGGS-GST_S100A8 或 pCAGGS-GST_S100A9 轉(zhuǎn)染到人胎腎細(xì)胞來(lái)源的 HEK293培養(yǎng)細(xì)胞株中，48小時(shí)后回收細(xì)胞和培養(yǎng)上清液。將細(xì)胞和培養(yǎng)上清液在4°C下 以4400g離心5分鐘，使上清液(上清液A)與細(xì)胞分離，分別進(jìn)行回收。向細(xì)胞中加入含 0. 1% Tween20的PBS在冰冷卻下對(duì)其進(jìn)行30秒的超聲處理，破壞細(xì)胞膜。然后，在4°C下 以4400g離心5分鐘以回收上清液(上清液B)。將上清液A和上清液B混合，添加到預(yù)先 用 30mL 的 PBS 替換了緩沖液的 HiTrap GST FF column (GE healthcare, 5mL)中。添加后 用PBSlOOmL對(duì)柱進(jìn)行洗滌，用含有還原型谷胱甘肽的20mM磷酸緩沖液(pH. 8)將吸附的蛋 白質(zhì)洗脫。研究使用了重組S100A8和S100A9的boyden小室的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移活 性。將純化的S100A8和S100A9蛋白質(zhì)的濃度調(diào)整到0. Ing/ μ L且溶解于DMEM而得到的 樣品或用4倍容積的DMEM稀釋2日齡小鼠皮膚提取液而得到的樣品加入到boyden小室的 下層。陰性對(duì)照同樣地使用從轉(zhuǎn)染了未插入S100A和S100A9 cDNA的對(duì)照載體的細(xì)胞提 取蛋白質(zhì)、并從HiTrap GST FF column洗脫而得到的級(jí)分。將樣品加入下層后，置于具有 8 μ m的微孔的聚碳酸酯膜上，然后與該聚碳酸酯膜相接地置于boyden小室上槽(容量為 50 μ 1)，向其中加入骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞懸浮液(5 X IO4個(gè)/50ml培養(yǎng)液DMEM/10%胎牛血清)，在(X)2培養(yǎng)箱內(nèi)、在37°C下培養(yǎng)4 M小時(shí)。培養(yǎng)后，將小室的上槽拿開(kāi)，取 出聚碳酸酯膜，利用染色定量地研究通過(guò)其微孔遷移到小室下槽的骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì) 胞的數(shù)量(圖10)。7)從8周齡雄性小鼠的尾靜脈注入上述純化的GST-S100A8和S100A9重組蛋白質(zhì) 250yL(lng/yL)。12小時(shí)后在異氟醚吸入麻醉下，用肝素涂覆的ImL的注射器從小鼠的 心臟采集末梢血lmL，與3mL的PBS混合，然后輕輕地層置(overlaid)于3mL的Ficol (GE healthcare)的上部。用離心機(jī)在25°C下以400g離心40分鐘?；厥罩虚g層的白色混濁層的 細(xì)胞作為單核細(xì)胞級(jí)分。向回收的細(xì)胞中加入ImL的溶血?jiǎng)〩LB溶液(免疫生物研究所)， 在室溫下孵育5分鐘。重復(fù)該溶血操作2次。加入IOmL的PBS，在25°C下以440g離心5分 鐘以除去上清液，從而回收細(xì)胞。將該細(xì)胞1，000, 000個(gè)與分別用PBS稀釋100倍的抗小鼠 PE 標(biāo)記 PDGFR α 抗體(e-Bioscience)、ΡΕ 標(biāo)記抗小鼠 PDGFR β 抗體(e-Bioscience)、FITC 標(biāo)記抗小鼠 CD45 抗體(BD biosciences)、PerCy5 標(biāo)記抗小鼠 CD44 抗體(BDbiosciences) 在室溫下孵育20分鐘。其后，將該細(xì)胞在25°C以440g離心5分鐘以除去上清液。加入 含多聚甲醛的PBS 400yL，作為流式細(xì)胞分析的樣品。抗體使用(I)PDGFRa /⑶45/ ⑶44(II)PDGFβ/⑶45/⑶44的組合。分析結(jié)果為研究PDGFRα (或β)和⑶44的表達(dá)細(xì)胞 與CD45弱陽(yáng)性-陰性細(xì)胞的比例(圖11Α、圖11Β)。結(jié)果通過(guò)研究切除的2日齡小鼠皮膚和6周齡小鼠皮膚的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷 移活性，結(jié)果可見(jiàn)與6周齡小鼠相比2日齡小鼠的皮膚提取液具有更強(qiáng)的活性。根據(jù)DNA 微陣列分析的結(jié)果可見(jiàn)，S100A9在2日齡小鼠皮膚中強(qiáng)烈地表達(dá)?？梢?jiàn)將皮膚提取液用肝 素柱進(jìn)行粗純化得到的樣品的間充質(zhì)干細(xì)胞遷移活性與含有S100A9和S100A8相關(guān)。制作 了這些蛋白質(zhì)的表達(dá)載體，并使用ΗΕΚ293生產(chǎn)、純化了重組蛋白質(zhì)。在使用了 boyden小室 的分析中證明這些S100A8、S100A9純化品具有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移活性。另外可見(jiàn)，通 過(guò)小鼠靜脈給予，這些蛋白質(zhì)表現(xiàn)出了將PDGFRa、CD44陽(yáng)性細(xì)胞群動(dòng)員到末梢血中的活 性(圖11)。討論這次本發(fā)明的發(fā)明人在世界上首次發(fā)現(xiàn)了游離皮片產(chǎn)生S100A8和S100A9， 所產(chǎn)生的S100A8和S100A9具有強(qiáng)的使骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞遷移的活性。另外，骨髓間 充質(zhì)干細(xì)胞已知是能夠分化為骨組織、脂肪組織、軟骨組織、成纖維細(xì)胞等的多能干細(xì)胞， 最近也指出，骨髓來(lái)源的細(xì)胞中存在能夠分化為心肌、神經(jīng)細(xì)胞、表皮細(xì)胞等組織的多能干 細(xì)胞。這次植皮片的表皮細(xì)胞、毛囊細(xì)胞、皮下組織的成纖維細(xì)胞等由骨髓來(lái)源的細(xì)胞構(gòu) 成，因此認(rèn)為S100A8或S100A9能夠?qū)⒐撬鑱?lái)源的組織干細(xì)胞動(dòng)員到植皮片中，從而誘導(dǎo)損 傷組織的功能性修復(fù)。由于S100A8和S100A9通過(guò)靜脈注射給予能夠?qū)⒐撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞 動(dòng)員到末梢血中，從而使得難以局部給予的深部組織(腦、心臟、脊髄等)也能夠通過(guò)末梢 循環(huán)來(lái)進(jìn)行給予。相信通過(guò)利用本發(fā)明技術(shù)來(lái)制造藥品，能夠在損傷組織再生時(shí)將包含間 充質(zhì)干細(xì)胞的骨髓來(lái)源的組織干細(xì)胞動(dòng)員到局部，從而不僅能夠使皮膚組織的組織損傷愈 合，而且期待在腦、肌肉、骨等各種組織損傷愈合過(guò)程中也能夠縮短愈合時(shí)間、使損傷組織 功能性再生等效果?！矊?shí)施例3〕目的確認(rèn)S100A8對(duì)正常小鼠和糖尿病小鼠的皮膚潰瘍治療效果方法將重組S100A8蛋白質(zhì)給予小鼠皮膚潰瘍模型，從而對(duì)潰瘍治療效果進(jìn)行
18研究。受驗(yàn)小鼠使用移植了表達(dá)GFP的骨髓細(xì)胞的C57/B16小鼠或糖尿病模型小鼠BKS. Cg-m+/+L印rdb/J(db小鼠)。在小鼠皮膚上制作直徑為6mm的皮膚潰瘍。在小鼠制作的皮 膚潰瘍的皮膚缺損部分周?chē)钠つw迅速收縮。本實(shí)驗(yàn)中，為了制作缺損皮膚不收縮而通過(guò) 再生皮膚覆蓋來(lái)進(jìn)行治療的模型，在皮膚缺損部將外徑為10mm、內(nèi)徑為6mm、厚度為0. 5mm 的硅橡膠制的圓盤(pán)用皮膚手術(shù)用粘接劑(Aron alpha Α)和尼龍線固定到潰瘍周?chē)钠つw。 然后將重組S100A8蛋白質(zhì)以1. 5 μ g/天、連續(xù)7天直接給予潰瘍面。另外，為了防止?jié)?面干燥，用膜敷料劑Tegaderm(3M)保護(hù)表面。為了確認(rèn)治療效果，測(cè)定經(jīng)時(shí)的潰瘍面積。結(jié)果和討論在正常小鼠中可見(jiàn)，從治療開(kāi)始第7天以后，S100A8治療組比對(duì)照組 的潰瘍面積顯著地縮小(圖12)。另外，在糖尿病小鼠中也可見(jiàn)，從治療開(kāi)始第7天以后， S100A8治療組比對(duì)照組的潰瘍面積顯著地縮小(圖13)。即，確認(rèn)在正常小鼠、糖尿病小鼠 中皮膚潰瘍均顯著地縮小的效果。從該結(jié)果確認(rèn)，S100A8不僅對(duì)正常小鼠而且對(duì)糖尿病小 鼠也具有皮膚潰瘍的治療效果。產(chǎn)業(yè)上的可利用性根據(jù)本發(fā)明，能夠提供含有S100A8或S100A9的骨髓來(lái)源的細(xì)胞誘導(dǎo)劑或組織再 生促進(jìn)劑。通過(guò)將S100A8或S100A9開(kāi)發(fā)成骨髓來(lái)源的細(xì)胞動(dòng)員藥物，使得促進(jìn)難治性損 傷組織的功能性再生的新的再生醫(yī)療技術(shù)成為可能。S100A8或S100A9由因供血不足而陷 于缺氧狀態(tài)并處于壞死方向的組織細(xì)胞釋放，其具有將骨髓來(lái)源的細(xì)胞或其來(lái)源的各種細(xì) 胞動(dòng)員到其局部的作用。被動(dòng)員的骨髓來(lái)源的細(xì)胞通過(guò)分化為各種組織所需的細(xì)胞譜系， 從而促進(jìn)了因灌注不足、壞死而喪失的功能恢復(fù)，即促進(jìn)了所謂的功能性組織再生。例如， 通過(guò)將S100A8或S100A9給予由皮膚的血流障礙引起的難治性皮膚潰瘍部，能夠?qū)⒐撬鑱?lái) 源的細(xì)胞動(dòng)員到潰瘍面，被動(dòng)員的細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而改善了局部的血流。同時(shí) 通過(guò)分化為成纖維細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、毛囊細(xì)胞、甚至分化為表皮細(xì)胞，從而不再是纖維性瘢 痕愈合，而是誘導(dǎo)、促進(jìn)了具有必要的皮膚附屬器官的功能性皮膚再生。即使在心肌梗塞或 腦梗塞等其他器官的灌注不足性壞死狀態(tài)中，也可期待S100A8、S100A9作為其功能性組織 再生誘導(dǎo)劑同樣地有效。
權(quán)利要求
1.一種骨髓細(xì)胞的誘導(dǎo)劑，其含有以下的(a) (f)中的任一項(xiàng)記載的成分；(a)S100A8蛋白質(zhì)(b)分泌S100A8蛋白質(zhì)的細(xì)胞(c)插入有編碼S100A8蛋白質(zhì)的DNA的載體(d)S100A9蛋白質(zhì)(e)分泌S100A9蛋白質(zhì)的細(xì)胞(f)插入有編碼S100A9蛋白質(zhì)的DNA的載體。
2.—種組織再生促進(jìn)劑，其含有以下的(a) (f)中任一項(xiàng)所記載的成分；(a)S100A8蛋白質(zhì)(b)分泌S100A8蛋白質(zhì)的細(xì)胞(c)插入有編碼S100A8蛋白質(zhì)的DNA的載體(d)S100A9蛋白質(zhì)(e)分泌S100A9蛋白質(zhì)的細(xì)胞(f)插入有編碼S100A9蛋白質(zhì)的DNA的載體。
全文摘要
本發(fā)明的發(fā)明人研究了在移植皮片植入活體組織的過(guò)程中骨髓來(lái)源的細(xì)胞從皮膚外組織被動(dòng)員到移植皮片并參與皮膚組織再生的可能性，并在世界上首次闡明了1)骨髓來(lái)源的細(xì)胞被大量地動(dòng)員到移植皮膚內(nèi)；2)被動(dòng)員的骨髓來(lái)源的細(xì)胞在移植皮片內(nèi)能夠分化為真皮成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、表皮角化細(xì)胞，被動(dòng)員的骨髓來(lái)源的細(xì)胞中包括骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞；3)將骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞從末梢血?jiǎng)訂T到植皮片中的是從移植皮膚的壞死組織釋放的S100A8、S100A9；4)純化的S100A8、S100A9能夠促進(jìn)從骨髓中分離、培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移。
文檔編號(hào)A61K31/7088GK102076351SQ20098012524
公開(kāi)日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2009年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月30日
發(fā)明者山崎尊彥, 玉井克人, 知野剛直, 金田安史 申請(qǐng)人:吉諾米克斯股份有限公司, 國(guó)立大學(xué)法人大阪大學(xué)