專(zhuān)利名稱：一種用于預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎的含有蜘蛛酶的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎的含有蜘蛛酶(arazyme)作為活性成分 的組合物。
背景技術(shù)：
關(guān)節(jié)炎是指一種關(guān)節(jié)疾病。關(guān)節(jié)炎可以是從輕微到嚴(yán)重各種形式的損害，可能并 不總是惡化。關(guān)節(jié)炎有關(guān)的疾病是最常見(jiàn)的難治性退行性疾病，全球12%的人口罹患該疾 病。韓國(guó)約有200多萬(wàn)人患有這種疾病。關(guān)節(jié)炎是顯示肌肉骨骼和結(jié)締組織炎癥變化所造 成的所有肌肉骨骼系統(tǒng)癥狀的統(tǒng)稱。這種疾病的特點(diǎn)是慢性炎癥引起組織永久性損害，畸 形和退化，及其產(chǎn)生關(guān)節(jié)、骨、軟骨或脊髓的問(wèn)題(Hofbause, L. C.，et. al.，Arthritis and Rheumatism 44 :253_259，2001)。關(guān)節(jié)炎分為退行性關(guān)節(jié)炎(骨關(guān)節(jié)炎)、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、反應(yīng)性 關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性肌炎、風(fēng)濕性多肌痛等。骨性關(guān)節(jié)炎或磨損又撕裂的關(guān)節(jié)炎，也稱為退行性關(guān)節(jié)炎，是最常見(jiàn)的所有關(guān)節(jié) 炎有關(guān)的疾病，通常發(fā)生在中年和老年人群。骨關(guān)節(jié)炎是一種影響脊椎和下肢關(guān)節(jié)(髖關(guān) 節(jié)、膝蓋和腳關(guān)節(jié))的關(guān)節(jié)炎，超過(guò)60%的人在他們60歲或70歲時(shí)患上這種病。骨關(guān)節(jié)炎 是影響老年人的一種常見(jiàn)疾病。雖然這種疾病在60歲以上的人群中比較常見(jiàn)，但在45歲 以下的人群中，男性比女性更常見(jiàn)，而55歲以上的人群中，女性比男性更普遍。骨關(guān)節(jié)炎根 據(jù)病因主要分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩大類(lèi)。顯示原因不明的磨破關(guān)節(jié)軟骨的癥狀，即顯示退 行性改變的骨關(guān)節(jié)炎被稱為原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎，通常在女性中發(fā)生。原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎的確切 原因和病因還不清楚。繼發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎的原因大致可分為關(guān)節(jié)損傷、軟骨基質(zhì)異常、軟骨下 骨畸形等。退行性關(guān)節(jié)炎是一種隨著年齡增長(zhǎng)發(fā)病越來(lái)越頻繁的慢性關(guān)節(jié)炎，尤其是膝骨關(guān) 節(jié)炎，是一種具有高發(fā)病率的疾病。有報(bào)告指出，通常習(xí)慣久坐生活方式的韓國(guó)人，膝蓋彎 曲成0型，這會(huì)使膝蓋內(nèi)部的壓力異常增加，到中年時(shí)會(huì)增加患骨關(guān)節(jié)炎的可能性。當(dāng)此炎 癥繼續(xù)下去，周?chē)∪馕s可能會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)變形，造成各種社會(huì)損失，諸如醫(yī)療費(fèi)用，降低 了老人的社會(huì)生活質(zhì)量等。類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是炎癥性關(guān)節(jié)炎的最常見(jiàn)類(lèi)型，至2%的人口罹患此疾病。類(lèi) 風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎由滑膜關(guān)節(jié)炎癥導(dǎo)致，10歲以上的任何人都可能發(fā)生。但是，這種疾病在女性 中最常見(jiàn)，常發(fā)生在30至50歲之間。強(qiáng)直性脊柱炎是一種能引起脊柱和骨盆之間的關(guān)節(jié)發(fā)炎的疾病。有時(shí)發(fā)生在髖關(guān) 節(jié)。這種疾病更容易影響男性，男女患病比例約為3 1，通常在20至40歲之間出現(xiàn)。兄 弟姐妹或父母患有強(qiáng)直性脊柱炎的人罹患該疾病的概率是普通人的20倍。系統(tǒng)性紅斑狼瘡是幾種已知的結(jié)締組織疾病之一。系統(tǒng)性紅斑狼瘡是類(lèi)似于類(lèi)風(fēng) 濕性關(guān)節(jié)炎的一種自身免疫性疾病。然而，這種疾病的發(fā)生頻率較低，其癥狀沒(méi)有類(lèi)風(fēng)濕性 關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重。90%患有這種疾病的人是處于20-30和40-50歲年齡段的年輕女性。
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藥物治療、運(yùn)動(dòng)療法、手術(shù)療法等都可用于關(guān)節(jié)炎的治療。其中，諸如止痛藥、腎上 腺皮質(zhì)激素制劑、非留體抗炎藥等藥物，通?？梢詼p少炎癥和減輕疼痛，可用作藥物治療， 但并沒(méi)有專(zhuān)門(mén)的治療藥物可用。雖然市售有一種構(gòu)成關(guān)節(jié)軟骨的成分，其作為保健補(bǔ)品來(lái) 發(fā)揮功效，但因其治療效果不能持久，因此需要更多的研究。雖然止痛藥能緩解疼痛，但它們沒(méi)有抗炎作用。除泰諾(Tylenol)外，止痛藥大都 可能引起嗜睡和便秘等。因此，對(duì)關(guān)節(jié)僵硬或水腫來(lái)說(shuō)效果不大。雖然抗炎藥物中的非留體抗炎藥可以像類(lèi)固醇一樣減少炎癥，但就藥理作用模式 或潛在的副作用而言，這類(lèi)藥物與類(lèi)固醇完全不同。非留體抗炎藥物尤其有助于消除由疼 痛以及炎癥導(dǎo)致的僵硬和水腫。然而，當(dāng)內(nèi)服過(guò)量的非留體抗炎藥物或長(zhǎng)期使用，會(huì)出現(xiàn)如 胃壁出血、胃潰瘍、消化不良等副作用。因此，本發(fā)明人對(duì)由Aranicola proteolyticus菌株產(chǎn)生的蜘蛛酶的效果進(jìn)行了 研究，結(jié)果顯示，對(duì)已知與人退行性關(guān)節(jié)疾病的誘導(dǎo)病變相似的新西蘭白兔動(dòng)物模型誘導(dǎo) 骨關(guān)節(jié)炎，并采用蜘蛛酶治療，能抑制TNF-α的表達(dá)，并防止蛋白多糖和膠原蛋白從關(guān)節(jié) 軟骨流失，抑制關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展和保護(hù)關(guān)節(jié)，本發(fā)明人因此作出了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供用于預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎的均含有由Aranicola proteoIyticus產(chǎn)生的蜘蛛酶作為活性成分的組合物和功能保健食品。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種含有蜘蛛酶作為活性成分的預(yù)防和治療關(guān)節(jié) 炎的藥物。本發(fā)明還提供一種用于預(yù)防和改善關(guān)節(jié)炎的含有蜘蛛酶作為活性成分的功能保 健食品。本發(fā)明還提供一種治療關(guān)節(jié)炎的方法，包括對(duì)罹患關(guān)節(jié)炎的個(gè)體施予藥學(xué)上有效 量的蜘蛛酶。本發(fā)明還提供一種預(yù)防關(guān)節(jié)炎的方法，包括給予個(gè)體藥學(xué)上有效量的蜘蛛酶。本發(fā)明還提供蜘蛛酶在制備預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用。此外，本發(fā)明還提供蜘蛛酶在制備預(yù)防和改善關(guān)節(jié)炎的功能保健食品中的應(yīng)用。


結(jié)合附圖和以下具體描述，將更清楚地理解本發(fā)明的上述和其它目的、特征及其 它優(yōu)勢(shì)，其中圖1為示出TNF-α在血漿中表達(dá)水平的測(cè)量結(jié)果圖；圖2為示出目視觀察到的股骨髁變化的一組圖片M 內(nèi)側(cè)；和紅色箭頭侵蝕部分，圖3為示出目視觀察到的股骨脛骨變化的一組圖片；圖4為示出目視觀察到的股骨髁和脛骨變化的各級(jí)評(píng)價(jià)結(jié)果的一組圖；圖5為示出觀察到的用蘇木精_曙紅對(duì)組織樣本染色的組織變化的一組圖片；圖6為示出通過(guò)甲苯胺藍(lán)染色給予蜘蛛酶對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的影響的組織病理結(jié)果的一組圖片；圖7為示出通過(guò)偶氮卡紅染色給予蜘蛛酶對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的影響的組織病理結(jié)果的 一組圖片；圖8為示出給予蜘蛛酶對(duì)關(guān)節(jié)炎的影響的組織病理變化分?jǐn)?shù)的一組圖。
具體實(shí)施例方式通過(guò)參考附圖，對(duì)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案進(jìn)行如下具體描述，有助于更清楚地理 解本發(fā)明的特征和優(yōu)勢(shì)。首先應(yīng)注意基于發(fā)明人可以適當(dāng)定義術(shù)語(yǔ)的概念以最佳描述其發(fā) 明的原則，本文中使用的術(shù)語(yǔ)和詞匯應(yīng)解釋為與本發(fā)明技術(shù)精髓相應(yīng)的意思或含義。另外， 應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，省略有關(guān)本發(fā)明的熟知的功能和結(jié)構(gòu)的詳細(xì)描述，以免不必要地掩蓋本發(fā)明 的重點(diǎn)。下面將給出本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)的定義。本文的術(shù)語(yǔ)“關(guān)節(jié)炎”表示各種細(xì)菌諸如結(jié)核桿菌等進(jìn)入關(guān)節(jié)導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎癥的所 有癥狀。本文的術(shù)語(yǔ)“預(yù)防”表示通過(guò)給予本發(fā)明的組合物抑制關(guān)節(jié)炎的形成或延遲關(guān)節(jié) 炎的進(jìn)展的所有行為。本文的術(shù)語(yǔ)“治療”和“改善”表示通過(guò)給予本發(fā)明的組合物改善或有助于改變關(guān) 節(jié)炎的癥狀的所有行為。本文的術(shù)語(yǔ)“給予”表示通過(guò)任何適當(dāng)?shù)姆椒▽⒈景l(fā)明預(yù)定的組合物引入到個(gè)體中。本文的術(shù)語(yǔ)“個(gè)體”表示所有動(dòng)物，諸如人、猴子、犬、山羊、豬、大鼠等，其罹患關(guān)節(jié) 炎，其癥狀可以通過(guò)給予本發(fā)明的組合物得到改善。本文的術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上有效量”表示應(yīng)用于醫(yī)療時(shí)，足以在合理的收益或風(fēng)險(xiǎn)比率下 治療疾病的量，所述比率可以根據(jù)多種因素來(lái)確定，這些因素包括疾病的種類(lèi)和嚴(yán)重程度、 藥物活性、敏感性、給藥時(shí)間、排泄率、給藥周期、聯(lián)用藥物和藥學(xué)領(lǐng)域熟知的其它因素。以下將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述。本發(fā)明提供含有蜘蛛酶作為活性成分的預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎的藥物。本發(fā)明的蜘蛛酶可以優(yōu)選地按照包括如下步驟的方法來(lái)制備，但不限于此1)培養(yǎng) Aranicola proteolyticus 菌株以得至Ij培養(yǎng)液；2)過(guò)濾所述培養(yǎng)液以得到上清液；和3)采用樹(shù)脂從上清液中純化蜘蛛酶。在制備方法中，優(yōu)選以Aranicola proteolyticus菌株作為產(chǎn)蜘蛛酶的微生物，更 優(yōu)選使用1996年7月29日保藏在KRIBB (韓國(guó)生物技術(shù)資源研究所)的KCTC (韓國(guó)典型培 養(yǎng)物保藏中心)的Aranicola proteolyticus HY_3(保藏號(hào)=KCTC 0268BP)，但不限于此。Aranicola proteolyticus ΗΥ-3(Nephila clavata) W^JS^^i^ 的需氧型革蘭氏陰性菌，0. 5-0. 8mm大小，圓形，可移動(dòng)，對(duì)過(guò)氧化氫酶呈陽(yáng)性，但對(duì)氧化酶 呈陰性(W0 01/57222)。優(yōu)選使用由上述方法得到的蜘蛛酶，更優(yōu)選使用由下面的方法得到的蜘蛛酶。優(yōu) 選藥品級(jí)的培養(yǎng)Aranicola proteolyticus的基本材料，當(dāng)只進(jìn)行純化操作時(shí)，更易于得到具有更高純度的產(chǎn)品。培養(yǎng)后，進(jìn)行硫酸銨沉淀(或丙酮沉淀)，然后離心和過(guò)濾回收蜘蛛 酶。大部分由微生物產(chǎn)生的其它蛋白質(zhì)與蜘蛛酶具有不同的沉淀濃度?；厥罩┲朊负?，通 過(guò)膜過(guò)濾進(jìn)行首次純化以除去雜質(zhì)，使用超過(guò)濾系統(tǒng)進(jìn)行最終純化，以獲得純蜘蛛酶。所得 到的高濃度蜘蛛酶溶液用凍干機(jī)凍干，得到可用的蜘蛛酶粉末。本發(fā)明的蜘蛛酶可以通過(guò)下面的方法來(lái)制備，但不限于此1)將含有蜘蛛酶編碼區(qū)的核苷酸序列的DNA克隆到表達(dá)載體中；2)將步驟1)克隆的表達(dá)載體引入到宿主細(xì)胞；3)對(duì)步驟2)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞進(jìn)行篩選；和4)從步驟3)篩選的宿主細(xì)胞中獲得表達(dá)的蜘蛛酶。在該方法中，步驟1)含有蜘蛛酶編碼區(qū)的核苷酸序列優(yōu)選SEQ ID No 2所示的 DNA,或者在嚴(yán)格條件下與含有SEQ ID No 2所示的核苷酸序列的DNA雜交的DNA。該嚴(yán)格 條件在雜交后的洗滌過(guò)程中確定。例如，該嚴(yán)格條件是指室溫下用6X SSC和0.5% SDS洗 滌15分鐘，在45°C下用2 X SSC和0. 5% SDS洗滌30分鐘，在50°C下用0. 2 X SSC和0. 5% SDS洗滌30分鐘，重復(fù)洗滌兩次。更優(yōu)選地，該嚴(yán)格條件是指在較高溫度下洗滌。具體地， 除最后兩次在60°C下用0. IXSSC和0. 洗滌外，其它與上述條件相同。本領(lǐng)域技術(shù)人員 可以確定或調(diào)整這種嚴(yán)格條件。此處的表達(dá)載體優(yōu)選本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)革蘭氏陰 性菌或革蘭氏陽(yáng)性菌。也可以使用市售的載體，更優(yōu)選地，該載體包含用于更好篩查的藥物 抗性基因。只要不影響蜘蛛酶基因的任何載體都可以使用。在該方法中，步驟2)的宿主細(xì)胞可以選自細(xì)菌諸如大腸桿菌(E.coli)和枯草桿 菌(Bacillus subtilis)以及酵母菌諸如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、假絲酵 母(Candia)和畢赤酵母(Phicia)，但不限于此。在該方法中，優(yōu)選地，步驟3)中轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的篩選可通過(guò)將藥物抗性基因?qū)?入載體來(lái)篩選，或者與DNA印跡(Southern blotting)或PCR結(jié)合來(lái)篩選，但不限于此。在該方法中，步驟4)得到的蜘蛛酶可以包括由任何蛋白純化方法獲得的蜘蛛酶。 例如，優(yōu)選地，可以采用下述方法實(shí)現(xiàn)蛋白純化柱層析、過(guò)濾、超濾、鹽析、溶劑沉淀法、溶 劑萃取法、蒸餾法、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電點(diǎn)電泳、透析或重結(jié)晶、但不 限于此?？刹捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)的蛋白表達(dá)系統(tǒng)獲得由DNA編碼的蜘蛛酶?？?以從表達(dá)蜘蛛酶的細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化蜘蛛酶。優(yōu)選地，本發(fā)明的蜘蛛酶選自如下蛋白組成的組中的一種，但不限于此(a)具有如SEQ ID No 1所示的氨基酸序列的蛋白；(b)由含有如SEQ ID No 2所示的核苷酸序列編碼區(qū)的DNA編碼的蛋白；(c)具有如SEQ ID NO=I所示的氨基酸序列通過(guò)替換、缺失、插入和/或添加一個(gè) 或多個(gè)氨基酸突變的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白與含有如SEQ ID No :1所示的氨基酸序 列的蛋白具有同等功能；以及(d)由在嚴(yán)格條件下與含有SEQ ID No 2所示核苷酸序列的DNA雜交的DNA編碼 的蛋白，所述蛋白與含有如SEQ ID No :1所示的氨基酸序列的蛋白具有同等功能。在嚴(yán)格的條件下雜交能夠提供核苷酸序列具有高同源性的DNA，表明分離的蛋白 非?？赡芫哂信c蜘蛛酶功能相同的蛋白。具有高同源性的核苷酸序列表示核苷酸序列與 SEQ ID No :2所示的核苷酸序列具有70%或更高的同源性，優(yōu)選地為80%或更高，更優(yōu)選
7地為90%或更高，最優(yōu)選地，與SEQ ID No :2所示的核苷酸序列具有95%或更高的同源 性。此外，可以使用與SEQ ID No :1所示的氨基酸序列具有70%或更高同源性的氨基酸序 列，優(yōu)選地為80%或更高，更優(yōu)選地為90%或更高，最優(yōu)選地，可以使用與SEQ ID No 1所 示的氨基酸序列具有95%或更高同源性的氨基酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇常規(guī)算 法確定同源率?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法在嚴(yán)格的條件下通過(guò)DNA-DNA雜交 進(jìn)行雜交，如前所述，在雜交后洗滌過(guò)程中確定雜交中嚴(yán)格的條件(Hames和HigginS，EdS. Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, U. K. ,1985)。本發(fā)明提供一種含有蜘蛛酶作為活性成分的預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎的藥物。關(guān)節(jié)炎包括退行性關(guān)節(jié)炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、銀屑 病關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性肌炎或者風(fēng)濕性多肌痛。為了研究蜘蛛酶對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的影響，采用已知與人退行性關(guān)節(jié)疾病的誘導(dǎo)病變相 似的新西蘭白兔動(dòng)物模型，通過(guò)斷裂右前肢的前十字韌帶誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎，然后給予蜘蛛酶。在本發(fā)明中，從給予蜘蛛酶的兔中采集血液，從血液中分離血清，用ELISA法 (0皿肚11^1^ ，研發(fā)體系)在血清中分析1順-(1。結(jié)果確定，與對(duì)照組相比，給予蜘蛛酶的 試驗(yàn)組抑制了參與初始炎癥反應(yīng)過(guò)程的TNF-α的表達(dá)。因此，可以確定通過(guò)抑制炎癥誘導(dǎo) 因子TNF-α的表達(dá)，本發(fā)明的蜘蛛酶對(duì)誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病有效果。為了研究給予蜘蛛酶的兔關(guān)節(jié)軟骨的變化，從脛骨分離股骨，摘除周?chē)∪猓缓?觀察關(guān)節(jié)軟骨表面。結(jié)果，觀察到給予蜘蛛酶的試驗(yàn)組的軟骨損傷小于對(duì)照組。因此，可以 確定本發(fā)明的蜘蛛酶對(duì)關(guān)節(jié)炎具有療效。為了觀察組織變化和膠原蛋白及蛋白多糖的損失程度，制備已分離的股骨和脛骨 的組織切片，分別用蘇木精_曙紅(H&E)、偶氮卡紅和甲苯胺藍(lán)染色，隨后在光學(xué)顯微鏡下 觀察。結(jié)果，與對(duì)照組相比，給予蜘蛛酶的試驗(yàn)組全部顯示較小的關(guān)節(jié)軟骨損傷或較少的蛋 白多糖和膠原蛋白損失。因此，由于本發(fā)明的蜘蛛酶顯示出的軟骨損傷與非甾體抗炎藥塞 來(lái)昔布類(lèi)似，以及蛋白多糖和膠原蛋白的微弱的損失，可以確定蜘蛛酶能夠用于預(yù)防和治 療骨關(guān)節(jié)炎。通過(guò)結(jié)果可以確定，給予本發(fā)明的蜘蛛酶，能夠抑制已經(jīng)誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物模 型中骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展和緩解疾病的癥狀。已證實(shí)，攝取蜘蛛酶能抑制炎癥誘導(dǎo)因子TNF-α 的表達(dá)，阻止蛋白多糖和膠原蛋白從關(guān)節(jié)軟骨中損失。因此，本發(fā)明的蜘蛛酶可用于預(yù)防和 治療關(guān)節(jié)炎，進(jìn)而抑制骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展和保護(hù)骨關(guān)節(jié)。除了蜘蛛酶以外，本發(fā)明預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎的藥物還可以含有一種或多種具有與 蜘蛛酶相同或相似功能的活性成分。對(duì)于給藥而言，除活性成分外，還可以通過(guò)加入一種或 多種藥用載體來(lái)制備藥物制劑。可用的藥用載體包括生理鹽水、無(wú)菌水、林格氏液、緩沖鹽 溶液、右旋糖溶液、麥芽糊精溶液、甘油、乙醇、及其一種或多種混合物，以及必要時(shí)，還可加 入其它常規(guī)添加劑，如抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑等。還可通過(guò)另外添加稀釋劑、分散劑、表 面活性劑、粘合劑和潤(rùn)滑劑來(lái)制備注射劑，如溶液、懸浮液、乳液等，粉末、片劑、膠囊劑、丸 劑、顆粒劑或注射用液體。此外，可針對(duì)每種疾病或根據(jù)個(gè)體，通過(guò)本領(lǐng)域和雷明頓的藥劑 學(xué)(Mack Publishing Company,Easton PA, 18th, 1990)中描述的適當(dāng)方法，優(yōu)選地以適當(dāng)?shù)?形式制備組合物。本發(fā)明預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎的組合物可以根據(jù)所需的方法口服或胃腸外(例如，靜脈、皮下、腹腔或局部注射)給藥。組合物的有效劑量可以根據(jù)體重、年齡、性別、健康 狀況、飲食、給藥時(shí)間、給藥方法、排泄率和疾病的嚴(yán)重程度來(lái)確定。蜘蛛酶的劑量為每天 0. 01-5000mg/kg,優(yōu)選每天0. 01-10mg/kg,每天給藥一次，優(yōu)選每天給藥數(shù)次。本發(fā)明還提供一種治療關(guān)節(jié)炎的方法，包括對(duì)罹患關(guān)節(jié)炎的個(gè)體給予藥學(xué)上有效 量的蜘蛛酶。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種預(yù)防關(guān)節(jié)炎的方法，包括對(duì)個(gè)體給予藥學(xué)上有效量的蜘蛛 酶?？梢源_定，由于本發(fā)明的蜘蛛酶能抑制炎癥誘導(dǎo)因子TNF-α的表達(dá)和防止關(guān)節(jié) 軟骨蛋白多糖和膠原蛋白的損失，從而抑制關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展和保護(hù)關(guān)節(jié)，因此通過(guò)給予個(gè)體 含有所述蜘蛛酶的組合物，可有益于預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎。除了本發(fā)明的蜘蛛酶外，給藥還包括給予與蜘蛛酶相同或相似功能的一種或多種 活性成分。給藥可能通過(guò)口服或胃腸外起作用，并可以通常的藥物制劑形式給予。給藥單位可以包含個(gè)體劑量的1、2、3或4倍，或者1/2、1/3或1/4倍。個(gè)體劑量?jī)?yōu) 選地包含給藥一次的有效藥物的量，相當(dāng)于每天常規(guī)給藥劑量的1、1/2、1/3或1/4倍。本 發(fā)明組合物的有效劑量為0. 01-5000mg/kg，優(yōu)選0. 01-10mg/kg，優(yōu)選一天給藥1-6次。本發(fā)明提供蜘蛛酶在制備預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用?？梢源_定，由于本發(fā)明的蜘蛛酶能抑制炎癥誘導(dǎo)因子TNF-α的表達(dá)和防止關(guān)節(jié) 軟骨蛋白多糖和膠原蛋白的損失，從而抑制關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展和保護(hù)關(guān)節(jié)，因此其可用作預(yù)防 和治療關(guān)節(jié)炎的藥物的活性成分。本發(fā)明還提供含有蜘蛛酶作為活性成分的用于預(yù)防和改善關(guān)節(jié)炎的功能保健食
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ΡΠ O此外，本發(fā)明提供蜘蛛酶在制備預(yù)防和改善關(guān)節(jié)炎的功能保健食品中的應(yīng)用。當(dāng)本發(fā)明的Aranicola proteolyticus培養(yǎng)液或從其中分離的蜘蛛酶用作食品 添加劑時(shí)，Aranicola proteolyticus培養(yǎng)液或從其中分離的蜘蛛酶可以按照常規(guī)方法單 獨(dú)或與其它食品成分混合添加。采用上述相同的方式獲得和使用蜘蛛酶。可以根據(jù)使用 目的(預(yù)防、保健或治療)適當(dāng)確定活性成分的混合量。一般來(lái)說(shuō)，在制作食品或飲料時(shí)， Aranicola proteolyticus培養(yǎng)液或從其中分離的蜘蛛酶優(yōu)選地以0. 01-10重量份添加， 更優(yōu)選地，以0. 05-1重量份添加。然而，為了健康和衛(wèi)生，或?yàn)榱吮３纸】甸L(zhǎng)期攝取，用量 可等于或小于上述范圍，但活性成分的用量可以相當(dāng)于或高于上述范圍，因?yàn)榫桶踩珕?wèn)題 而言，上述范圍都是無(wú)礙的。對(duì)食物的種類(lèi)沒(méi)有特定的限制?？梢蕴砑釉系氖称肥纠ㄈ忸?lèi)、香腸、面包、 面包、巧克力、糖果、點(diǎn)心、甜點(diǎn)、比薩餅、面條、面粉制品、果糕、包括冰淇淋的乳制品、湯、飲 料、茶、飲料、酒精飲料和復(fù)合維生素等，一般意義的各類(lèi)保健食品也包括在內(nèi)。像其它傳統(tǒng)的飲料一樣，本發(fā)明組合物的保健飲料還可以包括各種風(fēng)味調(diào)料或天 然的碳水化合物等=。上述天然碳水化合物可以是單糖諸如葡萄糖和果糖，二糖諸如麥芽 糖和蔗糖，多糖諸如糊精和環(huán)糊精，以及糖醇諸如木糖醇、山梨醇和赤蘚糖醇。作為甜味劑， 可以使用天然甜味劑如奇異果甜蛋白和甜菊提取物，合成甜味劑如糖精和阿斯巴甜。一般 來(lái)說(shuō)，每100ml本發(fā)明的飲料中，天然碳水化合物的含量一般約為0.01-0. 04g，優(yōu)選地為0. 02-0. 03g。除上述成分外，可向本發(fā)明的Aranicola proteolyticus培養(yǎng)液或從其中分離的 蜘蛛酶加入各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)、香料、著色劑、果膠酸及其鹽、海藻酸及其鹽、有 機(jī)酸、保護(hù)性膠體增粘劑、PH值調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、甘油、醇、常被加入到蘇打中的二氧 化碳(carbonators)等。本發(fā)明的Aranicola proteolyticus培養(yǎng)液或從其中分離的蜘蛛 酶也可加入天然果汁、水果飲料、和可加入到蔬菜飲料的新鮮果肉。這些成份可以單獨(dú)使用 或結(jié)合使用。這些成分的混合比例其實(shí)并不重要，但以本發(fā)明的Aranicola proteolyticus 培養(yǎng)液或從其中分離的蜘蛛酶的重量為100份計(jì)，通常選擇按重量計(jì)0. 01-0. 1份之間的范 圍。以下將參考下面的實(shí)施例、實(shí)驗(yàn)例和制備例具體描述本發(fā)明。然而，下面的實(shí)施例、實(shí)驗(yàn)例和制備例僅作說(shuō)明之用，不應(yīng)以任何方式限制本發(fā)明 的范圍。<實(shí)施例1>蜘蛛酶的制備為了制備本發(fā)明的活性成分蜘蛛酶，在22 °C在培養(yǎng)基中培養(yǎng)Aranicola proteolyticus HY-3 (KCTC 0268BP)(胰蛋白胨0. 5%，酵母提取物 0. 5%，氯化鈉 0. 1%，氯 化鉀0.05%，氯化鈣0.02%，硫酸鎂0.02%) 18小時(shí)。通過(guò)膜過(guò)濾過(guò)濾培養(yǎng)液(2 μ m過(guò)濾 器，Satorius，美國(guó))從細(xì)胞中分離上清液。通過(guò)膜過(guò)濾(IOkDa的膜過(guò)濾器，Pall sept, PALL公司，USA)濃縮該上清液。由于本發(fā)明的蜘蛛酶基本上具有負(fù)離子特性，因此通過(guò) 經(jīng)50mM tris-HCl緩沖液(pH值7. 6)預(yù)處理的使用DEAE-纖維素(美國(guó)Sigma公司)的 離子交換樹(shù)脂(美國(guó)Sigma公司)和經(jīng)20mM tris-HCl緩沖液(pH值7. 6)預(yù)處理的使 用Sephadex G_75(美國(guó)Sigma公司)的凝膠過(guò)濾交換樹(shù)脂來(lái)純化濃縮液。純化的酶液 在10% SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠)上電泳，并驗(yàn)證條帶譜圖。結(jié)果，本 發(fā)明的蜘蛛酶被鑒定為不含亞單位的單體且在約51. 5kDa處顯示條帶。然而，Aranicola proteolyticus HY-3菌株(KCTC0268BP)可在各種市售培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以生產(chǎn)蜘蛛酶，可以 通過(guò)各種方法分離和純化其培養(yǎng)液。本發(fā)明蜘蛛酶具有如SEQ ID No :1所示的氨基酸序 列，和編碼所述氨基酸序列的如SEQ ID No :2所示的核苷酸序列。<實(shí)施例2>實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的安排<2_1>實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)在本實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明人采用新西蘭白兔(Orient Co.，Ltd.，Seoul, Korea)。購(gòu)買(mǎi) 時(shí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為9周齡，它們的體重范圍為1. 2-1. 5kg。動(dòng)物15周齡時(shí)，開(kāi)始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)給藥， 它們當(dāng)時(shí)的體重范圍在2. 1-2. 7kg。購(gòu)買(mǎi)后，目視檢查動(dòng)物，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)7天。在適 應(yīng)期間，觀察一般癥狀，只選擇健康的動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。這些動(dòng)物在慶北國(guó)立大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院病理部的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行適應(yīng)和飼養(yǎng)，該實(shí)驗(yàn) 室配備自動(dòng)溫度/濕度調(diào)節(jié)器，其中溫度為22 士 2°C，相對(duì)濕度調(diào)節(jié)為55 士 10%，光照間隔 設(shè)定為12小時(shí)(09:00開(kāi)燈和21:00關(guān)燈)。未檢出任何影響實(shí)驗(yàn)的飼養(yǎng)環(huán)境變化。在整 個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的溫度/濕度由自動(dòng)溫度/濕度調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)，定期檢查(每3個(gè)月 1次)環(huán)境條件。從環(huán)境檢查中，未檢出任何可能影響試驗(yàn)的變化。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，一只 動(dòng)物安置在地板上一個(gè)帶有鋼網(wǎng)的養(yǎng)殖箱中，該養(yǎng)殖箱安裝有光亮的鋁合金和一個(gè)可移動(dòng) 的糞便托盤(pán)(寬度480，長(zhǎng)度610，高度450mm)。對(duì)于個(gè)體識(shí)別，同時(shí)使用油標(biāo)簽的皮膚
10標(biāo)記和每只養(yǎng)殖箱的組區(qū)分卡。固體兔飼料(Agribrands Purina Korea, Inc.)自由飼喂， 瓶裝的自來(lái)水和測(cè)試材料混合的飲用水自由飲用。<2_2>在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎已知，不僅需要誘導(dǎo)重復(fù)的關(guān)節(jié)損傷，而且還需在兔模型中摘除膝半月板誘導(dǎo)與 人退行性關(guān)節(jié)炎類(lèi)似的病變。通過(guò)撕裂前十字韌帶的方法誘導(dǎo)兔骨關(guān)節(jié)炎(Hulth A.等， Acta Orthp Scand. 41 :522_530，1970)。在本實(shí)驗(yàn)中，撕裂兔的前十字韌帶以誘導(dǎo)關(guān)節(jié)不 穩(wěn)，同時(shí)摘除內(nèi)側(cè)半月板以誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎。撕裂所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的右膝前十字韌帶以誘導(dǎo)關(guān)節(jié)不穩(wěn)，同時(shí)摘除內(nèi)側(cè)半月板以 誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎。對(duì)左膝進(jìn)行Sharm-手術(shù)，用作給予受試材料的對(duì)照。按下述方法撕裂前 十字韌帶和摘除內(nèi)側(cè)半月板。手術(shù)前動(dòng)物禁食6-12小時(shí)，只供應(yīng)飲用水。隨后，肌肉注 射 1. 25ml/6mg/kg 甲苯噻嗪麻醉劑(Rompun，Bayer Korea Ltd.)和 0. 2ml/10mg/kg 舒泰 50(Zoletil 50) (Virbac)以麻醉動(dòng)物。兔被麻醉后，從兔膝內(nèi)側(cè)撕裂皮膚和肌肉筋膜，由于 斷開(kāi)了皮膚和膝蓋破裂，因此撕裂暴露的關(guān)節(jié)囊，部分股骨和脛骨暴露出來(lái)。暴露后，切斷 股骨關(guān)節(jié)面和脛骨關(guān)節(jié)面之間的前十字韌帶，摘除內(nèi)側(cè)半月板。手術(shù)后，縫合撕裂的肌肉筋 膜和皮膚。手術(shù)后，按0. lml/10mg/kg注射抗生素慶大霉素(SamU Median Co.，Ltd. )3天， 以防止周?chē)M織因手術(shù)而發(fā)生感染。為了有效地誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎，實(shí)驗(yàn)組的所有動(dòng)物均使用 跑步機(jī)經(jīng)受強(qiáng)迫運(yùn)動(dòng)任務(wù)，每天5分鐘。<2-3>實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的組織將實(shí)驗(yàn)組分為3組，每組使用4-5只體重在2. 1-2. 7kg的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。陽(yáng)性對(duì)照組 每日供給塞來(lái)昔布(輝瑞制藥韓國(guó)有限公司)，濃度為每250-300ml自來(lái)水10mg/kg/天，試 驗(yàn)組每天飼喂本發(fā)明的組合物，用250-300ml自來(lái)水稀釋至250mg/kg。用于陽(yáng)性對(duì)照組的 塞來(lái)昔布(輝瑞)是非留體抗炎藥，通常指定給予骨關(guān)節(jié)炎的患者。與傳統(tǒng)的非留體抗炎 藥相比，雖然用塞來(lái)昔布對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的患者顯示出較好的治療效果，但其治療骨關(guān)節(jié)炎，是 由于其較少誘發(fā)消化性潰蕩(Loewen PS. focus on clinical aspects. 4 :268_75，2002)。 陰性對(duì)照組的所有動(dòng)物每天供應(yīng)等體積的250-300ml自來(lái)水。每天采用相同的給藥途徑和 給藥方法飼喂所有動(dòng)物等體積的受試材料和250-300ml自來(lái)水。[表 1]試驗(yàn)組的組織
權(quán)利要求
一種預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎的藥物，含有蜘蛛酶(arazyme)作為有效成分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎的藥物，其中所述蜘蛛酶為下述之一(a)具有如SEQID No 1所示的氨基酸序列的蛋白；(b)由含有如SEQID No :2所示的核苷酸序列編碼區(qū)的DNA編碼的蛋白；(c)具有如SEQID NO :1所示的氨基酸序列通過(guò)替換、缺失、插入和/或添加一個(gè)或多 個(gè)氨基酸突變得到的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白與含有如SEQ ID No :1所示的氨基酸序 列的蛋白具有同等功能；以及(d)由在嚴(yán)格條件下與含有SEQID No 2所示核苷酸序列的DNA雜交的DNA編碼的蛋 白，所述蛋白與含有如SEQ ID No :1所示的氨基酸序列的蛋白具有同等功能。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎的藥物，其中所述蜘蛛酶分離自 Aranicola proteolyticus 培養(yǎng)液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎的藥物，其中所述Aranicola proteolyticus % Aranicola proteolyticus HY—3 (:KCTC0268BP)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎的藥物，其中所述關(guān)節(jié)炎為退行性關(guān)節(jié)炎 (骨關(guān)節(jié)炎)、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑 狼瘡、多發(fā)性肌炎或風(fēng)濕性多肌痛。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎的藥物，其中所述預(yù)防和治療的藥物抑制 TNF-α的表達(dá)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎的藥物，其中所述預(yù)防和治療的藥物抑制 關(guān)節(jié)軟骨的損傷。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎的藥物，其中所述預(yù)防和治療的藥物抑制 蛋白多糖從關(guān)節(jié)軟骨流失。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎的藥物，其中所述預(yù)防和治療的藥物抑制 膠原蛋白從關(guān)節(jié)軟骨流失。
10.一種治療關(guān)節(jié)炎的方法，包括對(duì)需要治療的對(duì)象給予藥學(xué)上有效量的蜘蛛酶。
11.一種預(yù)防關(guān)節(jié)炎的方法，包括對(duì)需要治療的對(duì)象給予藥學(xué)上有效量的蜘蛛酶。
12.蜘蛛酶在制備預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用。
13.一種用于預(yù)防和改善關(guān)節(jié)炎的功能保健食品，含有蜘蛛酶作為有效成分。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的用于預(yù)防和改善關(guān)節(jié)炎的功能保健食品，其中所述蜘蛛酶 為下述之一(a)具有如SEQID No 1所示的氨基酸序列的蛋白；(b)由含有如SEQID No :2所示的核苷酸序列編碼區(qū)的DNA編碼的蛋白；(c)具有如SEQID NO :1所示的氨基酸序列通過(guò)替換、缺失、插入和/或添加一個(gè)或多 個(gè)氨基酸突變的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白與含有如SEQ ID No :1所示的氨基酸序列的 蛋白具有同等功能；以及(d)由在嚴(yán)格條件下與含有SEQID No 2所示核苷酸序列的DNA雜交的DNA編碼的蛋 白，所述蛋白與含有如SEQ ID No :1所示的氨基酸序列的蛋白具有同等功能。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的用于預(yù)防和改善關(guān)節(jié)炎的功能保健食品，其中所述蜘蛛酶 分離自 Aranicola proteolyticus 培養(yǎng)液。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的用于預(yù)防和改善關(guān)節(jié)炎的功能保健食品，其中所述 Aranicola proteolyticus 為 Aranicola proteolyticus HY_3(保藏號(hào)KCTC 0268BP)。
17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的用于預(yù)防和改善關(guān)節(jié)炎的功能保健食品，其中所述關(guān)節(jié)炎 選自下組退行性關(guān)節(jié)炎(骨關(guān)節(jié)炎)、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、銀 屑病關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性肌炎和風(fēng)濕性多肌痛。
18.蜘蛛酶在制備預(yù)防和改善關(guān)節(jié)炎的功能保健食品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種用于預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎的含有蜘蛛酶(arazyme)作為活性成分的組合物。更具體地，本發(fā)明的由Aranicola proteolyticus生產(chǎn)的蜘蛛酶通過(guò)抑制炎癥誘導(dǎo)因子TNF-α的表達(dá)、防止蛋白多糖和膠原蛋白從關(guān)節(jié)軟骨流失來(lái)抑制關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展和保護(hù)關(guān)節(jié)，可有效用作預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎的組合物。
文檔編號(hào)A61K38/20GK101945665SQ200980104926
公開(kāi)日2011年1月12日 申請(qǐng)日期2009年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月11日
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