專利名稱：聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸納米遞送系統(tǒng)、制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于腫瘤靶向遞送與緩釋給藥系統(tǒng)技術(shù)領(lǐng)域。具體是聚乙二醇單甲醚-聚 乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸(mPEG-PLGA-PLL)陽(yáng)離子聚合物為骨架的納米給藥系統(tǒng)、制備方 法及其在醫(yī)藥中的用途。

背景技術(shù)：
臨床上應(yīng)用化療藥物治療惡性腫瘤在許多情況下獲得了一定的成功，但是，同時(shí) 也存在著一些嚴(yán)重的問(wèn)題。 一個(gè)主要的問(wèn)題是化療藥物普遍缺乏選擇性，導(dǎo)致嚴(yán)重的劑量 依賴性毒副作用的產(chǎn)生，極大地限制了化療藥物的臨床治療效果。另一個(gè)問(wèn)題是腫瘤細(xì)胞 抗藥性的快速出現(xiàn)。因此，對(duì)于能特異性靶向腫瘤細(xì)胞并造成正常細(xì)胞最小損傷的治療方 法的開(kāi)發(fā)，具有非常重要的意義和廣闊的應(yīng)用前景。 近幾十年來(lái)，耙向遞送載體由于其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，能有效的提高治療效果，而備受國(guó) 內(nèi)外關(guān)注。尤其以可生物降解的聚合物為載體的遞送系統(tǒng)得到的迅速的發(fā)展，靶向遞送載 體可以有效的降低藥物的毒副作用，延遲藥物在體內(nèi)的代謝，改善治療效果。許多像聚乳 酸、聚乳酸_羥基乙酸等生物降解材料已經(jīng)廣泛的被用做藥物、基因和成像試劑的遞送載 體，取得了一定的效果。 多數(shù)納米載體在體內(nèi)未到達(dá)靶目標(biāo)前即被巨噬細(xì)胞識(shí)別吞噬，而達(dá)不到治療效 果；由此國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者，將聚乙二醇單甲醚(mPEG)附著在載體的表面，PEG的長(zhǎng)鏈能使納 米載體有效的逃避網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬，從而達(dá)到長(zhǎng)循環(huán)的目的，并且取得了較好的治療 效果?？山到饩酆衔颬LGA，在體內(nèi)可以緩慢降解，可以使藥物隨材料的降解被緩慢釋放出 來(lái)，從而達(dá)到較長(zhǎng)時(shí)間的治療效果，這種材料已獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)。陽(yáng)離子多聚物聚左旋賴 氨酸PLL，生物相容性好，降解產(chǎn)物為人體所必需的氨基酸。多聚左旋賴氨酸復(fù)合物仍帶正 電荷，其結(jié)構(gòu)靈活、穩(wěn)定、易調(diào)整其分子量，可以通過(guò)引入側(cè)鏈和特異靶向性基團(tuán)來(lái)修飾多 聚物骨架，進(jìn)而調(diào)整和改善載體的性能，達(dá)到緩釋藥物的目的。將PLGA和PLL結(jié)合可以發(fā) 揮兩者的優(yōu)點(diǎn)。因此以聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸(mPEG-PLGA-PLL)陽(yáng) 離子聚合物為骨架的納米給藥系統(tǒng)是一種非常優(yōu)異的緩釋藥物載體。 給藥系統(tǒng)的靶向能力是將活性物質(zhì)準(zhǔn)確遞送至靶點(diǎn)的關(guān)鍵，以聚乙二醇單甲 醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸(mPEG-PLGA-PLL)陽(yáng)離子聚合物為骨架的納米給藥系統(tǒng)可 以很好的解決這個(gè)問(wèn)題。研制的納米載體系統(tǒng)直徑可保持在50-500nm。因?yàn)檎＝M織周 圍的血管沒(méi)有縫隙，而腫瘤組織周圍的血管有100納米左右的縫隙，所以納米粒子就會(huì)從 這些縫隙中滲透出來(lái)，并利用增強(qiáng)的滲透保留效應(yīng)聚集于腫瘤部位，然后攻擊癌細(xì)胞，但不 會(huì)損害正常細(xì)胞，從而達(dá)到被動(dòng)靶向的效果。將納米粒采用靶向基團(tuán)修飾后，耙向基團(tuán)可以 與靶點(diǎn)特異性結(jié)合，具有受體介導(dǎo)的靶向給藥系統(tǒng)形成的主動(dòng)靶向效應(yīng)，使抗腫瘤藥物比 較準(zhǔn)確送到腫瘤細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)惡性腫瘤的靶向治療。采用本發(fā)明所設(shè)計(jì)的以聚乙二醇單甲 醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸(mPEG-PLGA-PLL)陽(yáng)離子聚合物為骨架的納米給藥系統(tǒng)， 可以同時(shí)連接靶向基團(tuán)和包裹兩種以上的活性物質(zhì)從而達(dá)到靶向遞送、多重治療方式結(jié)合的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種以聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸 (mPEG-PLGA-PLL)陽(yáng)離子聚合物為骨架的納米給藥載體系統(tǒng)，mPEG有長(zhǎng)循環(huán)功效，PLGA可 生物降解有緩控釋功效、PLL帶正電荷可以介導(dǎo)與負(fù)電荷的基因結(jié)合。通過(guò)控制載體粒徑 大小可使載體具有被動(dòng)靶向的功能。通過(guò)引入側(cè)鏈和特異靶向性基團(tuán)來(lái)修飾多聚物骨架， 進(jìn)而調(diào)整和改善載體的性能，可使載體具有主動(dòng)靶向的功能。這種載體材料還具有運(yùn)送活 性物質(zhì)、腫瘤治療與診斷、超聲顯影、逆轉(zhuǎn)耐藥等功能。 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于合成合適的載體，使不同的靶向基團(tuán)能有效地嫁
接在載體上，并且包載活性物質(zhì)，從而有效的靶向遞送活性物質(zhì)到靶點(diǎn)。 本發(fā)明所述的陽(yáng)離子聚合物mPEG-PLGA-PLL為 一 系列不同分子量、不同單體比
例的材料，其mPEG-PLGA-PLL陽(yáng)離子聚合物分子量為1. 0X 103_9. 0X 106 ;聚乙二醇單甲
醚/乳酸為i-50 : 50-ioo，乳酸/羥基乙酸為i-ioo : i-ioo，羥基乙酸/賴氨酸為
50-100 : 1-50。 本發(fā)明所述的陽(yáng)離子聚合物材料mPEG-PLGA-PLL的合成方法是開(kāi)環(huán)聚合法。合成 所用的催化劑包括辛酸亞錫、乳酸鋅、SnC^ 2H20和對(duì)甲苯磺酸等。 本發(fā)明所述的陽(yáng)離子聚合物mPEG-PLGA-PLL是優(yōu)良的藥物載體，利用這種材料包 裹藥物，在機(jī)械攪拌、超聲、高壓乳勻機(jī)作用下制備緩釋納米粒，粒徑在10 1000nm以下可 控，表面光滑，均勻度好，顆粒規(guī)則無(wú)粘連，再分散性好，載藥量和包封率高，可用于制備靜 脈或肌肉注射或口服給藥的緩釋納米粒，作為癌細(xì)胞靶向給藥。制備的納米?？梢苑稚⒃?固體、半固體或溶液中。優(yōu)選的是制成注射給藥的藥物制劑形式，尤其是供靜脈注射用。
本發(fā)明所述的與可以與陽(yáng)離子聚合物mPEG-PLGA-PLL連接的靶向基團(tuán)，包括多 肽、葉酸、抗體、轉(zhuǎn)鐵蛋白、糖、聚山梨酯等表面活性劑、甘草酸、甘草次酸、膽酸、低密度脂蛋 白(LDL)、激素、核酸等所有具有可用于修飾的適宜官能團(tuán)的靶向基團(tuán)及其衍生物。所用的 RGD肽是含精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸序列的任何直鏈或環(huán)狀多肽片段，包括含RGD序列的 三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽和十肽，或含RGD類似物(RGDm)的直鏈或環(huán)狀多肽 片段；所用的抗體包裹EGFR等多種抗體；糖類包括半乳糖、殼聚糖、甘露聚糖、膠淀粉、支鏈 淀粉和葡萄聚糖等；靶向基團(tuán)的接枝率為0. 0001% -50%。 本發(fā)明所述的mPEG-PLGA-PLL陽(yáng)離子聚合物和靶向基團(tuán)的連接是通過(guò)陽(yáng)離子聚 合物和多肽之間的官能團(tuán)反應(yīng)形成共價(jià)鍵結(jié)合。 本發(fā)明所述的包載的活性物質(zhì)包括藥物、基因、診斷用顯影劑、微泡內(nèi)容性氣體、 探針。藥物包括任何適合制成納米粒給藥系統(tǒng)的抗腫瘤藥物，可為有機(jī)藥物、水溶性藥物或 水不溶性藥物抗癌藥，如抗葉酸類(如甲氨蝶呤)、抗嘌呤類(如巰嘌呤)、抗嘧啶類(如氟 尿嘧啶、替加氟)、核苷酸還原酶抑制藥(如羥基脲)、脫氧核糖核苷酸多聚酶抑制藥(如環(huán) 胞苷)、直接影響和破壞DNA結(jié)構(gòu)及其功能的藥物(如氮芥、環(huán)磷酰胺、氮甲、順鉑、絲裂霉 素、喜樹(shù)堿)、抑制蛋白質(zhì)合成的藥(如阿霉素丄-門冬酰胺酶、柔紅霉素、光輝霉素)、影響 微管蛋白質(zhì)組裝和紡錘絲形成的藥物(長(zhǎng)春新堿、依托泊苷)和用于核磁成像、超聲或CT 等成像儀器所用的顯影劑活性藥物或診斷試劑，診斷試劑分為用于超聲、核磁共振、CT和PET的診斷試劑。基因包括SiRNA、自殺基因、抑癌基因、反義核酸等用于治療的基因；微泡 內(nèi)容性氣體包括空氣、氟碳?xì)怏w、六氟化硫等用于超聲微泡顯影劑。 本發(fā)明所述的陽(yáng)離子聚合物載體包載微泡內(nèi)容性氣體后可用于超聲顯影，實(shí)體腫 瘤定位并且通過(guò)超聲空化效應(yīng)輔助腫瘤治療。 本發(fā)明所述的以聚乙二醇單甲醚_聚乳酸羥基乙酸_聚賴氨酸(mPEG-PLGA-PLL) 陽(yáng)離子聚合物為骨架的納米給藥系統(tǒng)，可以同時(shí)連接靶向基團(tuán)和包裹兩種以上的活性物質(zhì) 從而達(dá)到靶向遞送、藥物和基因的共治療、多重治療方式結(jié)合的目的。 本發(fā)明所述的mPEG-PLGA-PLL陽(yáng)離子聚合物為骨架的納米給藥系統(tǒng)，可以通過(guò)以 下制備方法制備 復(fù)乳法將合成得到的多肽修飾的陽(yáng)離子聚合物溶于乙酸乙酯、二氯甲烷或二氯 甲烷和丙酮混合的有機(jī)溶劑中，加入藥物水溶液，超聲或高壓乳勻得到初乳，再加入水分散 介質(zhì)，乳化得到復(fù)乳后，攪拌或旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)相，即得納米?；鞈乙?。 共沉淀法將合成得到的多肽修飾的陽(yáng)離子聚合物和藥物一起溶于丙酮中，攪拌 條件下滴加到水分散介質(zhì)中，攪拌揮盡有機(jī)溶劑，即得納米?；鞈乙?。 乳化溶劑擴(kuò)散法將合成得到的多肽修飾的陽(yáng)離子聚合物和藥物溶于丙酮/ 二 氯甲烷混合溶劑中，加入到水分散介質(zhì)中，超聲或高壓乳勻乳化，乳液在室溫下?lián)]盡有機(jī)溶 劑，即得納米?；鞈乙骸?本發(fā)明所述的mPEG-PLGA-PLL陽(yáng)離子聚合物納米給藥載體系統(tǒng)的制備方法，其特 征在于所述的分散介質(zhì)為右旋糖苷40-70、普朗尼克F68或聚乙烯醇PVA。分散介質(zhì)濃度為 0.01-10% (w/v)。 本發(fā)明所述的水分散介質(zhì)包括右旋糖苷40、右旋糖苷70、普朗尼克F68等各種適 合于制備納米粒的表面活性劑，其濃度為0. 1 10%。 本發(fā)明所述的有機(jī)溶劑包括乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、乙醇等各種適合于制備納 米粒的有機(jī)溶劑。 本發(fā)明所述的以聚乙二醇單甲醚_聚乳酸羥基乙酸_聚賴氨酸(mPEG-PLGA-PLL)
陽(yáng)離子聚合物納米給藥載體系統(tǒng)，其特征在于該納米給藥系統(tǒng)可以同時(shí)連接靶向基團(tuán)和包
裹兩種以上的活性物質(zhì)從而達(dá)到靶向遞送、多重治療方式結(jié)合的目的。 本發(fā)明所述的mPEG-PLGA-PLL陽(yáng)離子聚合物納米給藥載體系統(tǒng)，其特征是在藥
物載體方面的應(yīng)用包括對(duì)藥物的遞送、長(zhǎng)循環(huán)、可生物降解、緩控釋、被動(dòng)靶向、主動(dòng)靶向、
運(yùn)送活性物質(zhì)、腫瘤治療與診斷、超聲顯影、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥特性及對(duì)疾病的診斷和治療。 本發(fā)明所述的mPEG-PLGA-PLL陽(yáng)離子聚合物納米給藥載體系統(tǒng)的制備方法，其特 征在于可以制備成凍干劑保存和應(yīng)用，凍干支架劑包括海藻糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、右旋糖 苷、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇等。支架劑含量為0.01-20% (w/v)。 本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)便，適于大規(guī)模生產(chǎn)，特別適應(yīng)于制備腫瘤靶向的抗腫瘤藥納 米粒給藥系統(tǒng)。


圖1是mPEG-PLGA-PLL-RGD納米粒粒徑分布圖(NicompTM-380ZLS粒度測(cè)定儀，美國(guó)Particle Sizing Systems公司) 圖2是Mitoxantrone-loaded mPEG-PLGA-PLL-RGD的納米粒粒徑分布圖 (NicompTM-380ZLS粒度測(cè)定儀，美國(guó)Particle Sizing Systems公司)
圖3是mPEG-PLGA-PLL-RGD納米粒抑制MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的圖片
圖4是藥物在動(dòng)物體內(nèi)組織的分布圖，尾靜脈注射Mitoxantrone-loadedmPEG-PL GA-PLL-RGD納米粒后，分別在4h、28h和51h測(cè)定載藥納米粒在動(dòng)物體內(nèi)組織的分布
圖5是納米粒抑制動(dòng)物腫瘤生長(zhǎng)的圖。將生理鹽水組，游離的米托 惠酉昆(Mitoxantrone)藥物，Mitoxantrone—loaded mPEG_PLGA_PLL纟內(nèi)米粒， Mitoxantrone-loaded mPEG-PLGA-PLL-RGD納米粒每4天通過(guò)尾靜脈給藥一次，之后測(cè)量 腫瘤體積，治療周期為36天。A是腫瘤體積的生長(zhǎng)曲線，B是治療后腫瘤的照片
圖6是Mitoxantrone-loaded mPEG-PLGA-PLL納米粒對(duì)耐藥的乳腺癌細(xì)胞 (MCF-7/MIT)的逆轉(zhuǎn)耐藥圖片
符號(hào)說(shuō)明 圖1 :粒徑為橫坐標(biāo)，強(qiáng)度為縱坐標(biāo) 圖2 :粒徑為橫坐標(biāo)，強(qiáng)度為縱坐標(biāo) 圖3 :納米粒濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo) 圖4 :心、肺、肝、脾、腎、腫瘤為橫坐標(biāo)，米托蒽醌含量為縱坐標(biāo) 圖5 : (A)天數(shù)為橫坐標(biāo)，腫瘤體積為縱坐標(biāo) 附圖中，Saline :生5里鹽7JC， Mitoxantrone :米托惠酉昆，Mitoxantrone—loadedmPE G-PLGA-PLL Nanoparticles :mPEG-PLGA-PLL包載米托蒽醌納米粒，Mitoxantrone-loaded mPEG-PLGA-PLL-RGD Nanoparticles :mPEG-PLGA-PLL-RGD包載米托蒽醌納米粒
(B)腫瘤體積大小實(shí)物圖 圖6 :游離的米托蒽醌、mPEG-PLGA-PLL-RGD包載米托蒽醌納米粒為橫坐標(biāo)，米托
蒽醌的蓄積量為縱坐標(biāo) MCF7/MIT :人乳腺癌耐藥細(xì)胞株 MCF7 :人乳腺癌細(xì)胞株
具體實(shí)施例方式
下面以實(shí)施例對(duì)本發(fā)明加以進(jìn)一步的說(shuō)明，但是不限制本發(fā)明的內(nèi)容。實(shí)施例l、 聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸(mPEG-PLGA-PLL)的制備(1)聚乙二醇單甲 醚-聚乳酸羥基乙酸(mPEG-PLGA)的制備抽真空加熱干燥耐熱玻璃管，加入一定摩爾質(zhì)量
比的丙交酯/乙交酯原料(比例為8 : 2、7 : 3、6 : 4、5 : 5)，加入占原料總量質(zhì)量百分比
為1% 20%、分子量范圍為350 5000的PEG，再加入催化劑，通氮?dú)?，加熱溶解抽真空?冷卻固化抽真空2小時(shí)后封管，120-15(TC反應(yīng)8-50h。 (2)聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙 酸-叔丁氧羰基(mPEG-PLGA-Boc(Z))的制備一定量mPEG-PLGA溶于干燥有機(jī)溶劑，攪拌 加入B0C-L-苯丙氨酸(1 15eqv.)、N，N-二環(huán)己基碳二亞胺(1 15eqv. ) ，0 40。C緩慢 滴加4- 二甲氨基吡啶，氮?dú)獗Ｗo(hù)，室溫?cái)嚢? 3天，過(guò)濾，堿洗水洗(或透析)，濃縮，加冰 甲醇或冰乙醚沉淀出產(chǎn)物，過(guò)濾，真空干燥。(3)聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-氨基 (PEG-PLGA-NH2)的制備取mPEG-PLGA-Boc (Z)溶于干燥有機(jī)溶劑中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，(TC攪拌滴
6加干燥的三氟乙酸，滴加10 60分鐘，繼續(xù)反應(yīng)1 3小時(shí)，旋蒸去除溶劑與未反應(yīng)三氟乙 酸，殘?jiān)苡谟袡C(jī)溶劑，冰甲醇或冰乙醚沉淀，過(guò)濾，真空干燥。(4)聚乙二醇單甲醚-聚乳 酸羥基乙酸-帶保護(hù)基的聚賴氨酸(mPEG-PLGA-PZLL)的制備取PEG-PLGA-M^溶于干燥有 機(jī)溶劑中，加入N-羧酸酐(NCA) (1 60eqv.)，氮?dú)獗Ｗo(hù)，室溫反應(yīng)l 5天，濃縮，冰甲醇或 冰乙醚沉淀，過(guò)濾，真空干燥。(5)mPEG-PLGA-PLL的制備取mPEG-PLGA-PZLL溶于定量三氟 乙酸中，加入少量體積分?jǐn)?shù)為33%的氫溴酸(HBr)醋酸溶液，(TC反應(yīng)O. 5-8h，冰甲醇或冰 乙醚沉淀，過(guò)濾，真空干燥。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)的接枝取mPEG-PLGA-PZLL 溶于二甲亞砜中，隨后加入RGD和N， N〃 -羰基二咪唑(CDI)，攪拌反應(yīng)2-72h。反應(yīng)結(jié)束 后將溶液至于透析袋中透析3-96h，隨后凍干保存。 葉酸的接枝將葉酸溶于蒸餾水中，氨水調(diào)節(jié)pH值10. 0-11.0，加入共聚物 mPEG-PLGA-PZLL，再少量的加入EDC，攪拌反應(yīng)24-72小時(shí)。過(guò)濾，濾渣用水洗，然后凍 干，密封、備用?？贵w的接枝將抗體溶于蒸餾水中加入EDC和NHS攪拌，然后加入共聚物 mPEG-PLGA-PZLL，攪拌反應(yīng)2_48小時(shí)，之后透析，然后凍干，密封、備用。轉(zhuǎn)鐵蛋白的接枝 將轉(zhuǎn)鐵蛋白溶于蒸餾水中加入l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和 N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)攪拌，然后加入共聚物mPEG-PLGA-PZLL，攪拌反應(yīng)2-48小時(shí)，之 后透析，然后凍干，密封、備用。 實(shí)施例2、包載鹽酸米托蒽醌藥物的mPEG-PLGA-PLL納米粒的制備 采用乳化蒸發(fā)法制備，取材料mPEG-PLGA-PLL溶于二氯甲烷或二氯甲烷和丙酮的
混合溶劑中，加入鹽酸米托蒽醌的水溶液，超聲乳化后，再加入含F(xiàn)68水溶液中，再次超聲。
然后室溫下攪拌0. 5-5h除去有機(jī)相，即得納米?；鞈乙骸Ｉ鲜鲋频玫募{米粒粒徑控制在
10-1000nm。 采用薄膜乳化法制備，取材料mPEG-PLGA-PLL和鹽酸米托蒽醌溶于丙酮溶劑中， 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，隨后加入一定量水溶液，室溫下攪拌0. 5-6h，即得納米粒混懸液。上述制得 的納米粒粒徑控制在10-1000nm。 采用透析法制備，取材料mPEG-PLGA-PLL溶于二甲亞砜溶劑中，加入鹽酸米托蒽 醌，攪拌均勻；隨后將有機(jī)溶液在攪拌的條件下滴入水中，隨后攪拌。之后將溶液裝入透析 袋中透析3-72小時(shí)，除去有機(jī)溶劑；即得納米?；鞈乙骸Ｉ鲜鲋频玫募{米粒粒徑控制在 10-1000nm之間。 采用界面沉淀法制備，取材料mPEG-PLGA-PLL和鹽酸米托蒽醌溶于丙酮溶劑中， 在一定攪拌速度下，將上述溶液注入一定濃度、體積的聚乙烯醇(PVA)溶液，加壓揮發(fā)去除 丙酮，即得納米?；鞈乙?。上述制得的納米粒粒徑控制在10-1000nm。實(shí)施例3、包載基因 的mPEG-PLGA-PLL納米粒的制備 采用乳化蒸發(fā)法制備取材料mPEG-PLGA-PLL溶于二氯甲烷或二氯甲烷和丙 酮的混合溶劑中，加入含F(xiàn)68水溶液中超聲。然后室溫下攪拌0. 5-5h除去有機(jī)相，得 mPEG-PLGA-PLL納米粒溶液。將適量的mPEG-PLGA-PLL納米粒溶液在充分?jǐn)嚢柘轮鸬渭尤?等體積的質(zhì)粒DNA溶液中，低溫孵育30min，即得到載DNA基因的納米粒。
復(fù)乳-液中干燥法亦稱溶劑揮發(fā)法，即將基因溶解于水作為內(nèi)水相，PLGA溶解于 二氯甲烷作為油相，兩者超聲后，形成油包水(W/0)的初乳，然后倒入聚乙烯醇水溶液，再
次乳化成水包油包水的復(fù)乳(w/o/w)，攪拌蒸去有機(jī)溶劑固化微球，離心洗滌，真空干燥后以60Co輻照滅菌。 實(shí)施例4、包載基因和藥物的mPEG-PLGA-PLL納米粒的制備 采用乳化蒸發(fā)法制備，取材料mPEG-PLGA-PLL溶于二氯甲烷或二氯甲烷和丙酮的 混合溶劑中，加入鹽酸米托蒽醌的水溶液，超聲乳化后，再加入含F(xiàn)68水溶液中，再次超聲。 然后室溫下攪拌0. 5-5h除去有機(jī)相，即得納米粒混懸液。將適量的mPEG-PLGA-PLL納米粒 溶液在充分?jǐn)嚢柘轮鸬渭尤氲润w積的質(zhì)粒DNA溶液中，低溫孵育30min，即得到載基因和藥 物的納米粒。 實(shí)施例5、包載微泡內(nèi)容性氣體的mPEG-PLGA-PLL納米粒的制備
采用雙乳化法，將mPEG-PLGA-PLL溶于二氯甲烷中，充分?jǐn)嚢柚疗渫耆芙?作連 續(xù)相)，然后在其中加入雙蒸水(為分散相)，超聲后，成乳白色乳化液(W/0微球)，將乳化 液(分散相)倒入適量PVA溶液中(連續(xù)相)，均質(zhì)機(jī)均質(zhì)(W/0/W微球)。然后加入異丙 醇溶液中，高溫下攪拌，使微球表面固化、二氯甲烷盡量自然揮發(fā)，再經(jīng)多次雙蒸水與正己 烷洗滌、離心(去除二氯甲烷)，收集微球，待其室溫干燥后加入適量雙蒸水混勻，置_45°C 真空冷凍干燥機(jī)中真空冷凍干燥48h，然后停止抽氣，將全氟丙烷氣體緩慢充入冷凍干燥室 內(nèi)至大氣壓，關(guān)閉冷凍干燥機(jī)氣閥并保持6 8h即得mPEG-PLGA-PLL微泡超聲造影劑。
實(shí)施例6、葉酸修飾mPEG-PLGA-PLL包載米托蒽醌藥物的納米粒的制備
葉酸修飾mPEG-PLGA-PLL溶于二氯甲烷或二氯甲烷和丙酮的混合溶劑中，加入鹽 酸米托蒽醌的水溶液，超聲乳化后，再加入含F(xiàn)68水溶液中，再次超聲。然后室溫下攪拌 0. 5-5h除去有機(jī)相，即得納米?；鞈乙骸Ｉ鲜鲋频玫募{米粒粒徑控制在10-1000nm。
實(shí)施例7、 EGFR抗體修飾mPEG-PLGA-PLL包載米托蒽醌藥物的納米粒的制備
取材料mPEG-PLGA-PLL溶于二氯甲烷或二氯甲烷和丙酮的混合溶劑中，加入鹽 酸米托蒽醌的水溶液，超聲乳化后，再加入含F(xiàn)68水溶液中，再次超聲。然后室溫下攪拌 0. 5-5h除去有機(jī)相，即得納米?；鞈乙?；隨后將EDC和NHS加入到納米粒溶液中，攪拌2h， 之后將表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)抗體加入到溶液中，然后攪拌4h，得EGFR抗體修飾的納米 粒。 實(shí)施例8、荷MDA-MB-231乳腺癌小鼠的建模和聚乙二醇單甲醚_聚乳酸羥基乙 酸_聚賴氨酸_精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸包載米托蒽醌(mPEG-PLGA-PLL-RGD-loadedMi toxantrone)納米粒在荷MDA-MB-231乳腺癌小鼠體內(nèi)分布及其治療的研究
將MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞(2X105/0. 2ml)注入裸鼠的前肢腋部皮下，2周后， 腫瘤建模成功。隨后將荷人乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231)乳腺癌小鼠隨機(jī)分為3組(每 組4只)，隨后注入mPEG-PLGA-PLL-RGD-loaded Mitoxantrone納米粒，之后相應(yīng)的分別 在2h、4h和51h處死動(dòng)物。取出心、肝、脾、肺、腎和腫瘤組織。之后將組織稱重研磨提 取組織內(nèi)藥物，按下列高效液相條件進(jìn)行測(cè)試色譜柱Kromasil 100_5C18(250mmX4. 6mm ID)，保護(hù)柱AUTO Science C. 270A，柱溫30。C ，流動(dòng)相甲醇0. 16mol. L—1乙酸銨緩沖 液(PH2. 7)(48 : 52)，流速1.0ml *min—、檢測(cè)波長(zhǎng)599nm，進(jìn)樣量10ii1。從實(shí)驗(yàn)結(jié) 果可以看出，動(dòng)物的心、肝、肺等組織濃度較低，說(shuō)明納米粒具有較好的生物相容性，能有 效的逃離網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬。但腫瘤組織的藥物濃度顯著的高于其他臟器組織，盡管 腫瘤組織的藥物濃度隨著時(shí)間延長(zhǎng)有一定的降低，但是仍維持在一個(gè)較高的水平。表明 mPEG-PLGA-PLL-RGD-loaded Mitoxantrone納米粒能有效的耙向腫瘤組織。
8
在治療實(shí)驗(yàn)中，每4天相應(yīng)的將生理鹽水，游離的米托蒽醌(Mitoxantrone)藥物，Mitoxantrone—loaded mPEG_PLGA_PLL纟內(nèi)米粒禾口 Mitoxantrone_loadedmPEG_PLGA-PLL-RGD納米粒通過(guò)尾靜脈給藥一次，隨之測(cè)量腫瘤體積，治療周期為36天。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，Mitoxantrone-loadedmPEG-PLGA-PLL-RGD納米粒組的腫瘤體積則明顯的低于游離的米托蒽醌(Mitoxantrone)藥物組和Mitoxantrone-loadedmPEG-PLGA-PLL納米粒組；Mitoxantrone-loaded mPEG-PLGA-PLL-RGD纟內(nèi)米粒組的抑瘤率(91.27%)顯著的高于游離的米托蒽醌(Mitoxantrone)藥物組(10.32%)和Mitoxantrone-loadedmPEG-PLGA-PLL納米粒組(42.06% )的抑瘤率，表明Mitoxantrone-loadedmPEG-PLGA-PLL-RGD納米粒對(duì)荷MDA-MB-231乳腺癌小鼠具有顯著的抑瘤效果。
實(shí)施例9、以mPEG-PLGA-PLL陽(yáng)離子聚合物為骨架的納米給藥系統(tǒng)作為藥物和基因載體的應(yīng)用。 所制備的包載米托蒽醌的mPEG-PLGA-PLL陽(yáng)離子聚合物為骨架的納米粒對(duì)耐藥的乳腺癌細(xì)胞(MCF-7/MIT， BCAP37/MDR)具有逆轉(zhuǎn)耐藥的功能。mPEG-PLGA-PLL陽(yáng)離子聚合物為骨架的納米粒能夠增加抗癌藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的蓄積；見(jiàn)附圖，提高抗癌藥物對(duì)非耐藥與耐藥腫瘤細(xì)胞的毒性，在一定程度上能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性，可增加細(xì)胞膜流動(dòng)性，提高藥物的細(xì)胞膜滲透性，并且抑制或減少P-gp蛋白對(duì)作用底物的外排，抑制耐藥細(xì)胞的多藥耐藥基因(MDRI)、人多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)和胎盤型谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶信使核糖核酸(GST-pmRNA)水平及降低P-糖蛋白(P_gp) ， ABCG2外排作用所需的ATP水平。mPEG-PLGA-PLL陽(yáng)離子聚合物為骨架的納米?？梢愿淖兡Ｐ退幍捏w內(nèi)藥動(dòng)學(xué)和組織分布參數(shù)，能夠顯著延長(zhǎng)模型藥在大鼠和小鼠體內(nèi)的血循環(huán)時(shí)間，改變體內(nèi)各臟器的藥物分布。
權(quán)利要求
一種以聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸陽(yáng)離子聚合物為骨架的納米粒給藥系統(tǒng)，其特征在于所述的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸陽(yáng)離子聚合物的分子量為1.0×103-9.0×106，聚乙二醇單甲醚/乳酸的摩爾比為1-50∶50-100，乳酸/羥基乙酸的摩爾比為1-100∶1-100，羥基乙酸/賴氨酸的摩爾比為50-100∶1-50；所述的納米粒粒徑在10-1000nm；所述的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸陽(yáng)離子聚合物至少一種或一種以上的被不同靶向基團(tuán)修飾或/和載不同的活性物質(zhì)。
2. 如權(quán)利要求1所述的以聚乙二醇單甲醚_聚乳酸羥基乙酸_聚賴氨酸陽(yáng)離子聚合物 為骨架的納米粒給藥系統(tǒng)，其特征在于所述的聚乙二醇單甲醚_聚乳酸羥基乙酸_聚賴氨 酸陽(yáng)離子聚合物采用丙交酯開(kāi)環(huán)聚合合成聚乳酸，叔丁氧羰基保護(hù)的苯丙氨酸與聚乳酸端 基的羥基反應(yīng)后氨基脫保護(hù)，上述反應(yīng)產(chǎn)物與三光氣法制備的氨基酸環(huán)內(nèi)酸酐密閉聚合得 到聚乳酸_聚賴氨酸嵌段共聚物，再脫氨基保護(hù)獲得。
3. 如權(quán)利要求l所述的以聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸陽(yáng)離子聚合物 為骨架的納米粒給藥系統(tǒng)，其特征在于上述的靶向基團(tuán)是葉酸、抗體、轉(zhuǎn)鐵蛋白、糖、聚山梨 酯等表面活性劑、多肽、甘草酸、甘草次酸、膽酸、低密度脂蛋白、激素、核酸及其衍生物。
4 如權(quán)利要求1所述的以聚乙二醇單甲醚_聚乳酸羥基乙酸_聚賴氨酸陽(yáng)離子聚合物 為骨架的納米粒給藥系統(tǒng)，其特征在于陽(yáng)離子聚合物和靶向基團(tuán)的接合是通過(guò)所述的陽(yáng)離 子聚合物與靶向基團(tuán)的官能團(tuán)之間反應(yīng)形成共價(jià)鍵結(jié)合。
5. 如權(quán)利要求1所述的以聚乙二醇單甲醚_聚乳酸羥基乙酸_聚賴氨酸陽(yáng)離子聚合物 為骨架的納米粒給藥系統(tǒng)，其特征在于所述的活性物質(zhì)是藥物、基因、診斷用顯影劑或微泡 內(nèi)容氣體。
6. 如權(quán)利要求5所述的以聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸_聚賴氨酸陽(yáng)離子聚合物 為骨架的納米粒給藥系統(tǒng)，其特征在于所述的藥物是抗腫瘤藥物或腫瘤診斷試劑。
7. 如權(quán)利要求6所述的以聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸_聚賴氨酸陽(yáng)離子聚合物 為骨架的納米粒給藥系統(tǒng)，其特征在于所述的抗腫瘤藥物是紫杉醇、消炎痛、甲氨蝶呤、巰 嘌呤、氟尿嘧啶、替加氟、羥基脲、環(huán)胞苷、氮芥、環(huán)磷酰胺、氮甲、順鉑、絲裂霉素、喜樹(shù)堿、阿 霉素、L 一門冬酰胺酶、柔紅霉素、光輝霉素、長(zhǎng)春堿、依托泊苷或p53基因。
8. 如權(quán)利要求6所述的以聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸_聚賴氨酸陽(yáng)離子聚合物 為骨架的納米粒給藥系統(tǒng)，其特征在于所述的腫瘤診斷試劑為用于超聲、核磁共振、計(jì)算機(jī) 斷層掃描或正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描的腫瘤診斷試劑。
9. 如權(quán)利要求7所述的以聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸_聚賴氨酸陽(yáng)離子聚合物 為骨架的納米粒給藥系統(tǒng)，其特征在于所述的基因是SiRNA、自殺基因、抑癌基因或反義核 酸。
全文摘要
本發(fā)明屬于納米技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明公開(kāi)了聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸(mPEG-PLGA-PLL)陽(yáng)離子聚合物納米給藥載體系統(tǒng)的制備及其應(yīng)用，該納米給藥系統(tǒng)可被修飾而具有多功能特性，如腫瘤靶向、逆轉(zhuǎn)耐藥和醫(yī)學(xué)診斷功能，可用于負(fù)載有機(jī)藥物、水溶性藥物、水不溶性藥物或用于診斷用的顯影劑。本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)便，適于大規(guī)模生產(chǎn)，特別適應(yīng)于制備靶向給藥系統(tǒng)。
文檔編號(hào)A61K47/34GK101732723SQ20091024757
公開(kāi)日2010年6月16日 申請(qǐng)日期2009年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月30日
發(fā)明者于暉, 亓雪蓮, 劉培峰, 孫穎, 李曉昱, 段友容, 王琪, 陳曉炎 申請(qǐng)人:上海市腫瘤研究所