專利名稱：聚乙二醇修飾的熒光磁性硅納米載體及制法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)領(lǐng)域，具體地涉及一種熒光磁性硅納米載體。本發(fā)明還涉及上述熒光磁性硅納米載體的制備方法。本發(fā)明還涉及上述熒光磁性硅納米載體在制備治療腦部疾病藥物和制備作為細(xì) 胞標(biāo)記藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
各種惡性腫瘤及帕金森病等中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病嚴(yán)重威脅著人類的健康，腦部藥 物治療的最大障礙是由于血腦屏障的存在，幾乎所有大分子藥物和98%的小分子藥物都不 能透過血腦屏障，而納米技術(shù)的應(yīng)用因其粒徑超小，比表面積大等優(yōu)點(diǎn)為非創(chuàng)傷性轉(zhuǎn)運(yùn)藥 物或基因入腦提供了一種很有潛力的腦部給藥方式。本發(fā)明所合成的熒光磁性硅納米載體(FMSNs)兼具熒光示蹤與核磁共振造影技 術(shù)的功能，并可以載藥將診斷和治療相結(jié)合，還可以應(yīng)用于細(xì)胞標(biāo)記、細(xì)胞定量分析和磁性 分離等。但據(jù)目前報(bào)道，熒光磁性硅納米載體尚不能跨越血腦屏障進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)，且該納米 載體還存在熒光泄漏；血液循環(huán)半衰期短，易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(REQ吞噬等缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種PEG通過PAMAM修飾的熒光磁性硅納米載體。本發(fā)明的又一目的在于通過PAMAM的鍵合增加大量官能團(tuán)進(jìn)而大大增加PEG的結(jié) 合量，促使熒光磁性硅納米載體克服血腦屏障進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)，并且還緩解了熒光泄露問題；同 時(shí)也提供制備上述熒光磁性硅納米載體的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的熒光磁性硅納米載體，以直徑5納米 10納米的 順磁性!^e3O4為內(nèi)核，包埋在二氧化硅形成的硅殼內(nèi)部；該硅納米載體中同時(shí)包埋有熒光物 質(zhì)；該硅納米載體的表面分別修飾有氨基的聚酰胺-胺樹狀大分子(PAMAM)及聚乙二醇分 子(PEG)。所述的熒光磁性硅納米載體，其中，所述熒光物質(zhì)為熒光素異硫氰酸酯或羅丹明 異硫氰酸酯。本發(fā)明提供的制備上述表面修飾有聚乙二醇的熒光磁性硅納米載體，其主要步驟 為將聚酰胺-胺樹枝狀大分子修飾的熒光磁性硅納米載體(PFMSNs)分散在無水 甲醇溶液中，加入聚乙二醇，避光攪拌，用磁鐵從反應(yīng)溶液中分離出棕黃色的固體，所得固 體采用傾注法用雙蒸水洗滌，真空干燥，得到表面修飾有聚乙二醇的熒光磁性硅納米載體 (PEG-PFMSNs)。所述的方法，其中，所述聚酰胺-胺樹狀大分子包括所有商品化的半代和整代及 其對(duì)硅球的直接修飾。
所述的方法，其中，所述聚乙二醇包括在硅球上所有分子量的聚乙二醇大分子。本發(fā)明的熒光磁性硅納米載體可以用于制備治療腦部疾病的藥物，以及用于制備 診斷腦部疾病的試劑。本發(fā)明的熒光磁性硅納米載體還可以用于制備作為細(xì)胞標(biāo)記藥物。本發(fā)明首次分別將聚乙二醇分子以及聚酰胺-胺樹狀大分子共價(jià)鍵合在熒光磁 性硅納米載體的表面，同時(shí)載體內(nèi)部鑲嵌的熒光染料不僅可以用于熒光示蹤又可以作為模 型藥物研究。該載體表面由于覆蓋聚酰胺-胺樹狀分子，具有大量可供修飾的官能團(tuán)，可用 于連接更易于靶向血腦屏障的抗體而成為具有靶向藥物載體的潛力。研究結(jié)果表明此材 料通過頸動(dòng)脈注射，可以穿越血腦屏障，從而使其在診斷和治療腦部疾病方面具有巨大的 潛力。


圖1是本發(fā)明PEG-PFMSNs的透射電子顯微鏡(TEM)圖。圖2是載體的熱失重分析(TGA)圖；其中曲線A是公知產(chǎn)品FMSNs ； 曲線B是本發(fā)明中間產(chǎn)品PFMSNs ；曲線C是本發(fā)明PEG-PFMSNs ；圖中的橫坐標(biāo)為溫度，縱坐標(biāo)為剩余重量百分?jǐn)?shù)。圖3是載體的kta電勢(shì)圖。圖4是大鼠頸動(dòng)脈注射載體后腦內(nèi)分布情況。圖5是大鼠頸動(dòng)脈注射載體后，腦組織亞細(xì)胞水平透射電子顯微鏡結(jié)果。其中，圖 fe中，本發(fā)明載體位于腦血管內(nèi)皮細(xì)胞膜中；圖恥及(1中，本發(fā)明載體位于神經(jīng)元軸突中； 圖5c中，本發(fā)明載體位于神經(jīng)元樹突中；圖k為腦血管切面圖；圖5f為圖k中血管的局 部放大圖(表示血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接完好，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整)；圖6是大鼠頸動(dòng)脈注射載體后，腦組織切片神經(jīng)元細(xì)胞免疫熒光染色后分析結(jié) 果。其中，圖6a為單純激發(fā)紅色熒光時(shí)顯示的神經(jīng)元免疫熒光染色結(jié)果；圖6b為單純激發(fā) 綠色熒光時(shí)顯示的本發(fā)明載體自帶綠色熒光結(jié)果圖；圖6c為a和b的疊加圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明為了改善硅納米粒的生物相容性，解決泄露的問題并提高表面官能團(tuán)數(shù) 量，用高聚物聚酰胺-胺樹枝狀大分子(PAMAM)對(duì)其表面進(jìn)行修飾，不僅阻止了熒光分子或 藥物分子的泄漏，改善了生物不相容和聚集的問題，而且也使載體具有更多可供載藥或基 因的官能團(tuán)；更重要的是，本發(fā)明選用了柔軟有彈性且水溶性好的聚乙二醇分子(PEG)修 飾在PAMAM的外圍來解決載體血液半衰期短以及易被RES系統(tǒng)吞噬的問題。PEG的柔性鏈 可以阻止血漿蛋白對(duì)硅納米載體的吸附，減少了被RES系統(tǒng)識(shí)別吞噬的可能性，從而延長(zhǎng) 了載體在血液中的循環(huán)時(shí)間，增加細(xì)胞內(nèi)外的濃度梯度，促進(jìn)載體穿越血腦屏障。PAMAM.PEG的鍵合，不僅克服了熒光磁性硅納米載體的一些缺陷，更重要的是改變 了它在體內(nèi)的過程，使其能夠有效穿越血腦屏障，為載體穿越血腦屏障并同時(shí)達(dá)到診斷和 治療腦部疾病的目的提供了理論基礎(chǔ)。本發(fā)明提供了表面修飾有聚乙二醇的熒光磁性硅納米載體。為敘述上的方便，將表面修飾有聚乙二醇的熒光磁性硅納米載體用PEG-PFMSNs表示，如圖1所示。聚乙二醇通過樹狀分子修飾的熒光磁性硅納米載體，具有好的光穩(wěn)定性和生物相 容性，不僅用來實(shí)現(xiàn)高效、穩(wěn)定的體內(nèi)外組織或細(xì)胞的標(biāo)記和造影，同時(shí)由于內(nèi)部可以包 覆、納米載體中PAMAM的氨基可以共價(jià)或物理結(jié)合藥物、DNA等，因此可用作基因和藥物載 體。本發(fā)明的聚乙二醇修飾的熒光磁性硅納米載體，用來評(píng)估對(duì)血腦屏障的穿透能 力。本發(fā)明制備熒光磁性硅納米載體的方法中采用共沉淀法制備Fii3O4,在!^eCl3 · 6H20、(NH4)2Fe(SO4)2 · 6H20、NH3 · H20、油酸及 水的存在下，制得了 Fe53O4磁性納米粒子。采用的是油包水微乳液法制備FMSNsJf I^e3O4粉末懸浮在環(huán)己烷中，加入曲拉通 X-100、正己醇、H20、正硅酸乙酯(TEOS)，攪拌后加入氨水，通過TEOS的水解和縮聚，在磁性 Fe3O4外面形成第一層二氧化硅，再加FITC-APS的乙醇溶液和TE0S，反應(yīng)形成FITC鑲嵌的
二氧化硅包覆層。PEG-PFMSNs的制備，采用了聚酰胺-胺樹狀大分子對(duì)FMSNs進(jìn)行修飾，增加了表面 的官能團(tuán)數(shù)目，然后將PEG修飾到PFMSNs的表面上，得到PEG-PFMSNs。本發(fā)明提供的PEG-PFMSNs，由于在熒光磁性硅納米載體(FMSNs)表面共價(jià)鍵合了 聚乙二醇分子及聚酰胺-胺樹狀大分子，有效的覆蓋了硅殼表面的FITC分子，避免了其對(duì) 周圍環(huán)境的接觸所導(dǎo)致的毒副作用。同時(shí)阻止了納米粒包覆的FITC的外泄，保持了 FITC 的光穩(wěn)定性。本發(fā)明提供的載體，在進(jìn)行頸動(dòng)脈注射后，能有效地穿越血腦屏障；且穿越機(jī)制為 跨胞作用，為診斷和治療腦部疾病開辟了一條新的途徑。實(shí)施例11) !^e3O4 的制備采用Lopez-Lopez et al法合成油酸包被的！^e3O4磁性納米粒子將3. 04g FeCl3 ·6Η20 與 2. 65g (NH4) 2Fe (SO4) 2 ·6Η20 混合(摩爾比 Fe3+ Fe2+ = 2 1.2)，溶于 40ml 水中，劇烈攪拌并超聲，迅速加入8ml NH3 -H2O (25% )和0. 8ml油酸，N2保護(hù)下反應(yīng)1小時(shí)， 升溫至95°C，冷卻，調(diào)pH值至5 6，用永磁鐵從反應(yīng)溶液中分離出黑色的!^e3O4固體，所得 固體采用傾注法用水洗滌三次后，乙醇洗三次，真空干燥。2) FMSNs 的制備室溫下將40mg !^e3O4粉末溶于308ml環(huán)己烷中，攪拌下加入75. 5ml曲拉通X-100、 64ml正己醇、13.6ml H20、1. 6ml正硅酸乙酯(TEOS)，攪拌6小時(shí)。然后加入4. 6鈿1氨水 (25%)，反應(yīng)M小時(shí)，加入800μ 1FITC-APS乙醇溶液和l.anl TE0S，避光攪拌M小時(shí)。用 永磁鐵從反應(yīng)溶液中分離出紅棕色的SiO2(FITC)OFe3O4固體，所得固體采用傾注法用無水 乙醇洗五次，無水甲醇洗一次，再分散在40ml無水甲醇中。3) ICP-PAMAM 的制備室溫下將121. ;3mg 2. 0代聚酰胺-胺(PAMAM)樹枝狀大分子溶于8ml無水甲醇中， 磁力攪拌下加入9. 3μ 1(0. 028mmol)異氰酸丙基三乙氧基硅烷(ICP)，避光攪拌M小時(shí)。4)中間產(chǎn)品PFMSNs的制備
室溫下將上述ICP-PAMAM的溶液加入到300mg FMSNs的甲醇溶液中，避光攪拌48 小時(shí)。用永磁鐵從反應(yīng)溶液中分離出PFMSNs固體，所得固體采用傾注法用無水乙醇洗三 次，無水甲醇洗兩次后，真空干燥。5)PEG_PFMSNs 的制備室溫下將IOOmg PFMSNs重懸在40ml pH = 8. 0的磷酸鹽緩沖液(PBS)中超聲攪 拌，加入 Tresylated MPEG-5000(PAMAM TresylatedMPEG-5000mol/mol = 1 16)，反應(yīng) 4小時(shí)。用磁鐵從反應(yīng)溶液中分離出PEG-PAMAM-SiO2(FITC)OFi53O4固體，其透射電鏡圖見圖 1，雙蒸水洗三次后，真空干燥。本發(fā)明產(chǎn)品PEG-PFMSNs的熱失重(TGA)、X-射線光電子能譜分析(XPS)及kta 電勢(shì)的表征見圖2、3及表1。從圖2中可以看出a、b、c的剩余重量百分?jǐn)?shù)逐漸減小從而證明熒光磁性硅納米載 體的表面官能團(tuán)的正確鍵合。從圖3中可以看出熒光磁性硅納米載體表面修飾后^ta電勢(shì)相應(yīng)改變也證明載 體表面官能團(tuán)的正確鍵合。表1是載體的X-射線光電子能譜表征結(jié)果；選擇MgK α靶(hv = 1253. 6eV)，功 率 250W (12. 5 X 20mA)，采用固定通能(FAT-FixedAnalyzer Transimission)模式工作，本 底真空優(yōu)于10_7pa(I(T9Torr)。以污染碳峰的Cls (觀4. 6eV)為定標(biāo)表準(zhǔn)，扣除荷電效應(yīng)的 影響從而確定樣品的真實(shí)結(jié)合能(讀數(shù)誤差士0. 2eV)。通過分析修飾了 PEG的硅殼熒光 磁性納米粒與未修飾PEG的硅殼熒光磁性納米粒表面各元素的含量相比，Si2p含量減少， 而Nls的含量先增加(由于PAMAM的修飾)，再減少(由于PEG的修飾)，可以得到PEG及 PAMAM成功修飾到了 FMSNs的外圍。表 1
表面元素組成(％)_ __ Cls Ols Si2p NlsFMSNs43.0944^810.29L81 PFMSNs 46.58 32.85 8.91 11.67
PEGylated PFMSNs_45.54_343_827_11.3實(shí)施例2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)1)大鼠頸動(dòng)脈注射通過頸內(nèi)動(dòng)脈將載體注入大鼠體內(nèi)大鼠以10%水合氯醛 (l.ani/kg體重)腹腔注射麻醉，仰臥固定，頸正中切口，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和 頸內(nèi)動(dòng)脈，電凝頸外動(dòng)脈的兩個(gè)細(xì)小分支，在頸外動(dòng)脈的第一個(gè)分支前結(jié)扎，在結(jié)扎處的 遠(yuǎn)心端電凝。將頸外動(dòng)脈反折并從其插管通過頸外動(dòng)脈用蠕動(dòng)泵將載體的生理鹽水溶液 (ang/aiil/^80g體重)注入頸內(nèi)動(dòng)脈，然后再注入0. 5ml生理鹽水，取出導(dǎo)管，頸外動(dòng)脈注藥 處結(jié)扎，縫合。2)取腦組織及后固定注射藥物1小時(shí)后，大鼠以10%水合氯醛(1. 2ml/kg)腹腔 注射麻醉，仰臥固定，沿胸廓下沿打開胸腔，在心尖處用眼科剪剪一個(gè)小開口，將灌注針由 左心室插入總動(dòng)脈，固定灌注針，打開灌注泵，緩慢灌注生理鹽水，同時(shí)輕輕按摩肝臟，待肝 臟發(fā)白后，相同速度用4%多聚甲醛繼續(xù)灌注，調(diào)慢流速至5ml/min，繼續(xù)灌注至各組織發(fā)硬為止(約20 30min)，斷頭取腦置于30%的蔗糖溶液陳化至組織沉于瓶底。3)冰凍切片將腦組織從蔗糖溶液中取出后，用蒸餾水清洗干凈，切成適宜大小 的塊置于冰臺(tái)上。液氮中速凍10秒，以水包埋組織，切成厚度為30 μ m展于載玻片上，或切 成50 μ m的薄片懸浮于PBS溶液中。4)納米粒在腦組織的分布實(shí)驗(yàn)(DAPI染色)展于載玻片上的組織切片與DAPI溶 液避光孵育15分鐘，吸去DAPI溶液，以PBS溶液洗三次，甘油封固。激光共聚焦顯微鏡下觀 察。結(jié)果見圖4，圖4中可發(fā)綠色熒光(圖4中箭頭所指部分)的為本發(fā)明載體PEG-PFMSNs 中的FITC，發(fā)藍(lán)色熒光的為DAPI染細(xì)胞核的結(jié)果。可觀察到載體在腦內(nèi)細(xì)胞的分布情況， 以及可見其穿越血腦屏障分布在腦細(xì)胞胞質(zhì)中的結(jié)果。5)納米粒穿越血腦屏障的實(shí)驗(yàn)(超薄切片透射電子顯微鏡實(shí)驗(yàn))將腦組織切成 Imm3的小塊，置于2. 5%的戊二醛溶液中固定，以環(huán)氧樹脂包埋，用超薄切片機(jī)將包埋好的 腦組織切成超薄切片，包埋在150目的銅網(wǎng)上，染色后在透射電子顯微鏡HITACHI-7650上 觀察載體進(jìn)入細(xì)胞情況。見圖5，從圖5中可以很清楚的觀察到載體在腦血管內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)及 星形膠質(zhì)細(xì)胞的分布，另外，在神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)中也發(fā)現(xiàn)了納米粒的分布，同時(shí)也能觀察到腦 血管內(nèi)皮細(xì)胞連接緊密且細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，證明載體可以穿越血腦屏障，且其穿越機(jī)制為 跨胞作用。6)納米粒進(jìn)入腦組織神經(jīng)元實(shí)驗(yàn)(腦組織冰凍切片的免疫熒光染色)組織冰凍 切片與一抗NeuN(l 1000稀釋)避光孵育過夜Q4h)，用加曲拉通X-100的磷酸鹽緩沖液 (PBST)洗三次，再加入二抗(Alexa594標(biāo)記，1 300稀釋)孵育2-3小時(shí)，甘油封固。激 光共聚焦顯微鏡下觀察。結(jié)果見圖6，從圖6中可以看出，紅色熒光(神經(jīng)元細(xì)胞)與綠色 熒光(本發(fā)明產(chǎn)品)重疊后形成黃色熒光，證明兩者處于同一位置(共定位)，這意味著載 體確實(shí)進(jìn)入神經(jīng)元細(xì)胞胞質(zhì)。
權(quán)利要求
1.一種熒光磁性硅納米載體，以順磁性!^e3O4為內(nèi)核，包埋在二氧化硅形成的硅殼 中間；該硅納米載體中同時(shí)包埋有熒光物質(zhì)；該硅納米載體的表面分別修飾有氨基聚酰 胺-胺樹枝狀大分子及聚乙二醇分子。
2.如權(quán)利要求1所述的硅殼熒光磁性納米粒，其中，所述順磁性!^e3O4的直徑為5納 米 10納米。
3.如權(quán)利要求1所述的熒光磁性硅納米載體，其中，所述熒光物質(zhì)為熒光素異硫氰酸 酯、羅丹明異硫氰酸酯或其他熒光染料。
4.一種制備權(quán)利要求1所述硅殼熒光磁性納米粒的方法，其主要步驟為將聚酰胺-胺樹枝狀大分子修飾的熒光磁性硅納米載體分散在無水甲醇溶液中，加 入聚乙二醇，避光攪拌，用磁鐵從反應(yīng)溶液中分離出棕黃色的固體，所得固體采用傾注法洗 滌，真空干燥，得到表面修飾有聚乙二醇的熒光磁性硅納米載體。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述聚酰胺-胺樹狀大分子包括所有代數(shù)對(duì)硅球的 直接修飾。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述聚酰胺-胺樹狀大分子包括在硅球上所有逐代 合成的半代和整代的聚酰胺-胺樹狀大分子，以及能產(chǎn)生氨基的所有試劑。
7.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述聚乙二醇包括所有分子量或端基的聚乙二醇。
8.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述的傾注法洗滌是采用雙蒸水洗滌。
9.權(quán)利要求1所述的熒光磁性硅納米載體在制備治療或診斷腦部疾病的藥物或試劑 中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1所述的熒光磁性硅納米載體在制備作為細(xì)胞標(biāo)記藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
一種熒光磁性硅納米載體，以順磁性Fe3O4為內(nèi)核，包埋在二氧化硅形成的硅殼中間；該硅納米載體中同時(shí)包埋有熒光物質(zhì)；該硅納米載體的表面分別修飾有氨基聚酰胺-胺樹枝狀大分子及聚乙二醇分子。制備方法是，共沉淀法制備超順磁性Fe3O4，用二氧化硅包埋Fe3O4和熒光染料，通過增加納米載體表面氨基數(shù)將更多的聚乙二醇修飾在硅納米載體表面。該載體不僅能熒光示蹤、磁共振造影，還可用于連接針對(duì)靶組織的抗體、配體、配基和藥物等。與未修飾的熒光磁性硅納米載體相比，經(jīng)聚乙二醇修飾的載體延長(zhǎng)了其在血液中的循環(huán)時(shí)間，進(jìn)而提高了載體穿越血腦屏障的能力，為腦部疾病的診斷及治療提供了一條新的途徑。
文檔編號(hào)A61K49/00GK102058891SQ200910237830
公開日2011年5月18日 申請(qǐng)日期2009年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月11日
發(fā)明者葉玲, 庫(kù)姝婷, 王迎, 閆峰, 黃珊珊 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)