專利名稱：具有抗腫瘤與免疫調(diào)節(jié)活性的小麥麩皮多糖及其提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有抗腫瘤與免疫調(diào)節(jié)活性的小麥麩皮多糖及其提取方法。
背景技術(shù)：
小麥麩皮是小麥加工的副產(chǎn)物，主要由小麥種皮、糊粉層及殘余胚乳組成。小麥 麩皮是典型的谷物膳食纖維原料，其組成復(fù)雜，除了主要的細(xì)胞壁構(gòu)成物質(zhì)阿拉伯木聚糖 (或稱戊聚糖)夕卜，還有纖維素、木質(zhì)素、葡聚糖、植酸、淀粉等。目前在我國，小麥麩皮絕大 部分用作畜禽飼料和微生物發(fā)酵培養(yǎng)基，高附加值與深入的研究開發(fā)主要集中在將其作為 膳食纖維原料，發(fā)揮潤腸通便，降血脂等生理功能，或作為面團改良劑或食用膠的應(yīng)用功能 等方面。 國內(nèi)專利中，多以小麥麩皮為原料制備膳食纖維，如"麥麩的多功能轉(zhuǎn)化-膳 食纖維的提取方法(200410006552. x)"、"多酶分步法制備小麥麩膳食纖維粉的方法
(200510019123. 0)"、"一種從小麥麩中提取多功能膳食纖維的方法(200610024903. 9)"、 "一種利用超聲波輔助酶解制備麥麩膳食纖維的方法(200710135501. 0)"，產(chǎn)品均為不可溶 性的麩皮膳食纖維。 多糖是由多個單糖分子縮合、失水而成，是一類分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜且龐大的糖類物質(zhì)。 多糖種類繁多，功能性質(zhì)各異，除淀粉主要作為能量提供者外，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)許多來源于天 然藥用植物、真菌、藻類等的多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗凝血、降血脂、降 血糖、抗輻射、抗突變等方面的生物活性。以小麥麩皮為原料開展此方面的研究與產(chǎn)品開 發(fā)，相關(guān)報道很少。 植酸又名六磷酸肌醇，通常以植酸鹽的形式廣泛存在于植物細(xì)胞壁中(如小麥麩 皮)。植酸因具有很強的金屬螯合能力，會影響食物中礦物質(zhì)的吸收，過去曾被視為營養(yǎng)抑 制劑；另一方面，植酸本身是一種用途廣泛的食品添加劑和化工原料，實際生產(chǎn)中也有從小 麥麩皮中提取植酸的工藝。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種提取具有抗腫瘤與免疫調(diào)節(jié)活性的多糖的方法。
本發(fā)明所提供的提取多糖的方法，包括如下步驟用木聚糖酶酶解小麥麩皮，得到 酶解產(chǎn)物，即得到多糖；所述木聚糖酶與所述小麥麩皮的配比為(5U-12.5U) : lg小麥麩 皮，具體可為(6. 25U-10U) : lg小麥麩皮。 上述過程中，所述用木聚糖酶酶解小麥麩皮的方法具體可包括如下步驟將所述 小麥麩皮、水與所述木聚糖酶混合，再進行酶解反應(yīng)；酶解反應(yīng)的溫度為50°C -e(rc，酶解 反應(yīng)的pH值為5. 0-5. 5，酶解反應(yīng)的時間為2. Oh-4. 0h。 上述過程中，所述用木聚糖酶酶解小麥麩皮的方法中，所述小麥麩皮與所述水的 配比可為lkg : (4-7)L。 上述過程中，在所述酶解前，所述方法還可包括如下對所述小麥麩皮進行預(yù)處理的步驟將所述小麥麩皮進行脫植酸處理和脫淀粉處理，得到脫植酸和脫淀粉的小麥麩皮。
所述脫植酸處理的方法可包括如下步驟用酸性溶液浸泡所述小麥麩皮，收集固相，即得到所述脫植酸的小麥麩皮；所述酸性溶液為鹽酸溶液；所述酸性溶液的pH值為3. 0-3. 5、所述浸泡的時間為10h-14h、所述浸泡的溫度為23°C _27°C ;所述小麥麩皮與所述酸性溶液的配比為lkg : (4-5)L。 所述脫淀粉處理的方法可包括如下步驟將所述脫植酸的小麥麩皮進行水洗、過篩，得到脫植酸和脫淀粉的小麥麩皮。 上述過程中，在所述酶解后，所述方法還可包括如下純化的步驟將所述酶解產(chǎn)物用乙醇進行沉淀，收集沉淀。 所述用乙醇進行沉淀的方法中，溫度為4-25t:、時間為12-24h、醇沉濃度為65%、用乙醇進行沉淀的次數(shù)為2次； 上述過程中，在所述酶解后，在所述用乙醇進行沉淀前，所述方法還可包括如下對所述酶解產(chǎn)物進行濃縮處理的步驟將所述酶解產(chǎn)物進行離心，收集上清液，將所述上清液濃縮至所述上清液體積的1/4-1/6，進一步可為1/5-1/6，得到濃縮液。
上述過程中，在所述酶解后，在對所述酶解產(chǎn)物進行濃縮處理前，所述方法中還可包括如下對所述酶解產(chǎn)物進行滅酶的步驟將所述酶解產(chǎn)物在溫度為90-95t:的條件下滅活10-15min。 上述過程中，凡是涉及到小麥麩皮與某物質(zhì)的配比中，均是指未經(jīng)任何處理的原始小麥麩皮的量。 由上述任一所述方法得到的多糖也屬于本發(fā)明的保護范圍。 所述多糖的主要成分為阿拉伯木聚糖；所述阿拉伯木聚糖的分子量為3. 252X 104Da-3. 450X 104Da。 本發(fā)明的另一個目的是提供一種增強機體免疫功能的藥物、一種腫瘤細(xì)胞抑制劑或一種治療和/或預(yù)防腫瘤的藥物。 本發(fā)明所提供的增強機體免疫功能的藥物，其活性成分為上述任一所述多糖。 本發(fā)明所提供的腫瘤細(xì)胞抑制劑，其活性成分為上述任一所述多糖。 本發(fā)明所提供的治療和/或預(yù)防腫瘤的藥物，其活性成分為上述任一所述多糖。 上述任一所述多糖在制備增強機體免疫功能藥物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。 上述任一所述多糖在制備腫瘤細(xì)胞抑制劑中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
上述任一所述多糖在制備治療和/或預(yù)防腫瘤的藥物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。 上述任一所述藥物或應(yīng)用，所述腫瘤細(xì)胞具體可為S180腫瘤細(xì)胞。
本發(fā)明以小麥麩皮為原料，通過脫植酸、脫淀粉預(yù)處理，采用木聚糖酶輔助提取、二級醇沉、真空干燥等工藝步驟，獲得目標(biāo)多糖，該多糖得率為12.5-15.0% (產(chǎn)品與原料干基的質(zhì)量百分比)，其中阿拉伯木聚糖含量為81. 5-84. 7% (以干基中戊聚糖含量計)。
另參照《藥理實驗方法學(xué)》(人民衛(wèi)生出版社，第三版，徐叔云等主編)進行目標(biāo)多糖抗腫瘤及免疫增強功能實驗小鼠接種S180肉瘤后24小時隨機分為6組陰性對照組(正常小鼠給予同體積的生理鹽水)、模型組(接種腫瘤，給予同體積的生理鹽水)、目標(biāo)多糖3個劑量組(100、200、400mg/kg體重，口服連續(xù)10天)以及陽性對照組復(fù)方環(huán)磷酰胺組(25mg/kg，口服)和香菇多糖注射液組(0. 2mg/kg，腹腔注射)，通過觀察小鼠體重變化、抑瘤率、脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、NK細(xì)胞活性、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能評價該產(chǎn)品的抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)功能。實驗結(jié)果表明，本發(fā)明多糖可增強正常BALB/C小鼠和接種S180腫瘤ICR小鼠的T、 B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能、DTH、 NK細(xì)胞殺傷功能、血清抗體產(chǎn)生水平以及巨噬細(xì)胞吞噬功能；對S180的抑瘤率可達(dá)到50-60%，而陽性對照香燕多糖注射液抑瘤率僅為20-34% ;且本發(fā)明多糖無抗腫瘤藥物可能帶來的降低小鼠體重的副作用。 本發(fā)明方法利用小麥麩皮這一農(nóng)副產(chǎn)品資源，通過加工提取可大量獲得以阿拉伯木聚糖(或稱戊聚糖)為主的多糖產(chǎn)品，動物實驗顯示該多糖的免疫調(diào)節(jié)與抗腫瘤功效堪與臨床上應(yīng)用的抗腫瘤輔助藥物相比，而本多糖由于原料價格低廉，來源豐富，更具市場競爭優(yōu)勢，產(chǎn)業(yè)化發(fā)展前景廣闊。


圖1為多糖提取的流程圖。
具體實施例方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。 小麥麩皮可以從小麥面粉加工企業(yè)(如北京古船面粉集團)購買獲得；木聚糖酶
(xylanase， EC3. 2. 1. 8)為一種商品酶制劑，購自諾維信(中國)投資有限公司。 實施例1、小麥麩皮免疫調(diào)節(jié)與抗腫瘤活性多糖的提取 —、多糖提取多糖提取的流程圖如圖1所示。 1)小麥麩皮預(yù)處理 稱取小麥麩皮100g，分散于500mL pH值為3. 5的稀鹽酸溶液中，于25。C下浸泡12小時。離心分離(1500rpm，30min)，收集沉淀；將沉淀作進一步水洗，洗至溶液澄清，過200
目篩，瀝干水分，得到脫植酸和脫淀粉的小麥麩皮。
2)酶解 將脫植酸和脫淀粉的小麥麩皮分散至400mL清水中，調(diào)節(jié)體系pH值至5. 5，添加0.25g木聚糖酶(木聚糖酶與小麥麩皮的配比為6.25U : lg未經(jīng)預(yù)處理的小麥麩皮)，置于55t:保溫罐中，攪拌提??；反應(yīng)4. Oh后，得到酶解產(chǎn)物；將酶解產(chǎn)物升溫至95t:，保持10min滅酶，冷卻，將得到的產(chǎn)物記作酶解液。 3)將冷卻至室溫的酶解液離心(3000rpm， 30min)，收集上清液；45. (TC下真空濃縮，溶液體積至80mL左右停止(即濃縮至上清液體積的1/5)，得到的產(chǎn)物記作濃縮液。
4)用乙醇沉淀多糖 3、向濃縮液中攪拌添加適量95%食用乙醇，調(diào)節(jié)體系乙醇濃度達(dá)到65% (攪拌狀態(tài)下緩慢加入乙醇，盡量避免添加過快造成局部濃度偏高而帶來非目標(biāo)物沉淀)，形成絮凝沉淀，25t:下靜置24h ;離心(3000rpm， 20min)，收集醇沉物；將醇沉物用80mL水重新分散，離心(6000rpm， 30min)，收集上清液。 b、上清液復(fù)用乙醇沉淀，加入95%食用乙醇逐步調(diào)節(jié)體系乙醇濃度達(dá)到60%，靜置24h ;離心(3000rpm， 20min)，收集沉淀。 5)將所得沉淀在真空條件下干燥(55°C，0. 1Kpa)，至物料完全干透(水分含量降至15%以下)；粉碎，過IOO目篩，得到最終多糖產(chǎn)品。
多糖提取的實驗重復(fù)3次。
二、多糖組分分析與鑒定
1)基本組成檢測 產(chǎn)品中水分含量檢驗按GB/T 21305-2007谷物及谷物制品水分的測定常規(guī)法執(zhí)行，戊聚糖含量按地衣酚_鹽酸雙波長法執(zhí)行，具體步驟如下
①標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱量木糖(分析純，Sigma公司，產(chǎn)品目錄號95729)0. 100g，用蒸餾水定容至100mL，從中移取10ml于100ml容量瓶中、定容，配制成100 y g/ml木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。
分別移取木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0m1、0. 4ml、0. 8ml、1. 2ml、1. 6ml和2. 0ml，依次加入6支試管中，用蒸餾水補加體積至3ml，依次再分別加入0. 3ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的地衣酚(Aldrich公司，產(chǎn)品目錄號447420)無水乙醇溶液和3ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 1 %的FeCL3(分析純，國藥集團化學(xué)試劑北京有限公司)濃鹽酸溶液，混合均勻，沸水浴30min，取出迅速冷卻至室溫，用未加木糖溶液的空白管作對照，于670nm、580nm波長下比色，所得吸光值為二波長吸光值的差值(AA二A^-A，)，以AA為縱坐標(biāo)，以對應(yīng)木糖溶液的質(zhì)量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 ②樣品的測定 取適量(0. 010-0. 050g)提取多糖樣品，加入20ml 2mol/L HC1溶液，于密封試管內(nèi)10(TC水浴中水解3h，冷卻后用濾紙過濾；把水解液適當(dāng)稀釋后準(zhǔn)確移取lml于具塞試管中，依次加入2ml蒸餾水、0. 3ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)1 %的地衣酚無水乙醇溶液、3ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 1%的FeCL3濃鹽酸溶液，混合均勻，沸水浴30min ;迅速冷卻至室溫，于670nm、580nm波長下測定吸光度，其它同①。計算公式
戊聚糖含量(％ ) = C*n*0. 88*100/m/106 式中C表示由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到木糖質(zhì)量(i!g) ;n為稀釋倍數(shù)；m為樣品干重(g)。
產(chǎn)品得率計算公式得率(％ )=所得產(chǎn)品干基質(zhì)量(g)/用于提取的小麥麩皮干基質(zhì)量(g) X100X;其中，某物質(zhì)干基質(zhì)量是指將某物質(zhì)中的水分去除后，該物質(zhì)的重量。
對每次提取得到的多糖產(chǎn)品的組成鑒定均重復(fù)3次，結(jié)果取平均數(shù)。
結(jié)果表明，本發(fā)明所得多糖產(chǎn)品得率為12.5%，其中戊聚糖含量為84.7% (以木糖計)。因為是用木糖做的標(biāo)準(zhǔn)曲線，所以戊聚糖量以木糖計，這是標(biāo)準(zhǔn)方法所述。
2)單糖組成分析高效液相色譜(HPLC)法取10mg本發(fā)明所得多糖固體產(chǎn)品，在20ml、lM !^04溶液中10(TC水解3小時；冷
卻，加入BaC03中和至pH7. 0 ;過濾、收集濾液；微濾(小0. 45 y m)，濾液備用。 HPLC條件Sugar pakl、6. 8X300mm色譜柱(Waters公司)；流動相為超純水；流
速0. 5mL/min ;柱溫85°C ;池溫30°C ;進樣量10 y L ;檢測器為示差折光檢測器。 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司，產(chǎn)品目錄號為G5400 ;木糖標(biāo)準(zhǔn)品購Sigma公司，
產(chǎn)品目錄號為95729 ;阿拉伯糖標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司，產(chǎn)品目錄號為10860。 在如上色譜條件下，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間為13. 023min ;木糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留
6時間為15. 008min ;阿拉伯糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間為16. 285min。 實驗設(shè)3次重復(fù)。經(jīng)測定本發(fā)明所得多糖產(chǎn)品中糖水解產(chǎn)物分別為葡萄糖、木糖、阿拉伯糖；葡萄糖在三種糖中的質(zhì)量百分含量為2. 89%，木糖在三種糖中的質(zhì)量百分含量為62. 30%，阿拉伯糖在三種糖中的質(zhì)量百分含量為34.81%;結(jié)果表明，本發(fā)明所得多糖產(chǎn)品的糖單元組成中95%以上是木糖和阿拉伯糖這兩種五碳糖，葡萄糖含量很低，判定本發(fā)明產(chǎn)品為一種阿拉伯木聚糖(或戊聚糖)產(chǎn)品。 3)產(chǎn)物分子量分布測定多角度激光光散射-高效凝膠過濾色譜法(MALLS-HPSEC) 將本發(fā)明所得產(chǎn)品配制成多糖濃度為5mg/mL的溶液，溶劑為0. 01M、pH7. 2磷酸緩沖液；微濾(小0. 45 ii m)，濾液備用。 測定條件DAWN-EOS多角度激光散射儀(美國Wyatt公司)，HPLC系統(tǒng)(Waters公司)，TSK-gel G4000HHR柱(日本T0S0H公司)，流動相0. OIM、 pH7. 2磷酸緩沖液，流速0. 5mL/min，色譜柱溫為室溫，激光波長690. Onm，運行時間30min。數(shù)據(jù)處理采用Astra軟件。 實驗設(shè)3次重復(fù)。 實驗表明，本發(fā)明所得產(chǎn)品出現(xiàn)兩個可能為糖類物質(zhì)的示差信號峰，由其中一個峰的激光光散射信號計算出該物質(zhì)的平均相對分子質(zhì)量(Mw)為3. 252X 10勺a，該峰樣品量占總進樣量的84. 5% ;另一個峰因無光散射信號，分子量太低而測不出。結(jié)果表明，本發(fā)明產(chǎn)品中的糖類物質(zhì)主要以高分子聚合物形式存在。 綜上結(jié)果得出如下結(jié)論本發(fā)明多糖產(chǎn)品的主要組分為一種分子量在3萬左右、由阿拉伯糖和木糖組成的阿拉伯木聚糖(或稱戊聚糖)。
實施例2、小麥麩皮免疫調(diào)節(jié)與抗腫瘤活性多糖的提取
—、多糖提取
1)小麥麩皮預(yù)處理 稱取小麥麩皮lkg，分散于4L pH值3. 0的稀鹽酸溶液中，于室溫(23°C )下浸泡過夜(IO小時)。離心分離(1500rpm，30min)，收集沉淀；將沉淀作進一步水洗，洗至溶液澄清，過200目篩，瀝干水分，得到脫植酸和脫淀粉的小麥麩皮。
2)酶解 將脫植酸和脫淀粉的小麥麩皮分散至6L清水中，調(diào)節(jié)體系pH值至5. 0，添加4. 5g木聚糖酶(木聚糖酶與小麥麩皮的配比為8U : lg小麥麩皮)，置于6(TC保溫罐中，攪拌提??；反應(yīng)3. 0h后，得到酶解產(chǎn)物；將酶解產(chǎn)物升溫至95°C ，保持10min滅酶，冷卻，將得到的產(chǎn)物記作酶解液。 3)將冷卻至室溫的酶解液離心(3000rpm， 30min)，收集上清液；45. (TC下真空濃縮，溶液體積至1L左右停止(即濃縮至上清液體積的1/6)，得到的產(chǎn)物記作濃縮液。
4)用乙醇沉淀多糖 a、向濃縮液中攪拌狀態(tài)下緩慢添加適量95%食用乙醇，至乙醇濃度達(dá)到65%，形成絮凝沉淀，于4。C下靜置24h ;離心(3000rpm， 20min)，收集醇沉物；將醇沉物用800ml水重新分散，離心(6000rpm， 30min)，收集上清液。 b、上清液復(fù)用乙醇沉淀，加入95%食用乙醇逐步調(diào)節(jié)體系乙醇濃度達(dá)到60%，靜置24h ;離心(3000rpm， 20min)，收集沉淀。 5)將所得沉淀在真空條件下干燥(50°C，0. 1Kpa)，至物料完全干透(水分含量降
至15%以下)；粉碎，過IOO目篩，得到最終多糖產(chǎn)品。 實驗設(shè)3次重復(fù)。 二、多糖組分分析與鑒定 1)基本組成檢測 方法同實施例1中所述一致。 對每次提取得到的多糖產(chǎn)品的組成鑒定均重復(fù)3次，結(jié)果取平均數(shù)。 結(jié)果表明，本發(fā)明所得多糖產(chǎn)品得率為15.0%，其中戊聚糖含量為81.5% (以木
糖計)。 2)單糖組成分析 方法同實施例1中所述一致。
實驗設(shè)3次重復(fù)。經(jīng)測定本發(fā)明所得多糖產(chǎn)品中糖水解產(chǎn)物分別為葡萄糖、木糖、阿拉伯糖；葡萄糖在三種糖中的質(zhì)量百分含量為3. 54%，木糖在三種糖中的質(zhì)量百分含量為61. 25% ，阿拉伯糖在三種糖中的質(zhì)量百分含量為35. 21 % ;結(jié)果表明，本發(fā)明所得多糖產(chǎn)品的糖單元組成中95%以上是木糖和阿拉伯糖這兩種五碳糖，葡萄糖含量很低，判定本發(fā)明產(chǎn)品為一種阿拉伯木聚糖(或戊聚糖)產(chǎn)品。
3)產(chǎn)物分子量分布測定
方法同實施例1中所述一致。
實驗設(shè)3次重復(fù)。 經(jīng)測定本發(fā)明所得產(chǎn)品出現(xiàn)兩個可能為糖類物質(zhì)的示差信號峰，其中一個峰平均相對分子質(zhì)量(Mw)為3. 450X 1(^Da，該峰樣品量占總進樣量的83. 6% ;另一峰因無激光信號，分子量測不出(太低)。結(jié)果表明，本發(fā)明產(chǎn)品中的糖類物質(zhì)主要以高分子聚合物形式存在。 綜上結(jié)果得出如下結(jié)論本發(fā)明多糖產(chǎn)品的主要組分為一種分子量在3萬左右的阿拉伯木聚糖(或稱戊聚糖)。 實施例3、小麥麩皮免疫調(diào)節(jié)與抗腫瘤活性多糖的提取
—、多糖提取
1)小麥麩皮預(yù)處理稱取小麥麩皮5kg，分散于20L pH值為3.0的稀鹽酸溶液中，于室溫(27°C )下浸泡過夜(14小時)。離心分離(1500rpm，30min)，收集沉淀；將沉淀作進一步水洗，洗至溶液澄清，過200目篩，瀝干水分，得到脫植酸和脫淀粉的小麥麩皮。
2)酶解 將脫植酸和脫淀粉的小麥麩皮分散至35L清水中，調(diào)節(jié)體系pH值至5. 3，添加20g木聚糖酶(木聚糖酶與小麥麩皮的配比為10U : lg小麥麩皮)，置于5(TC保溫罐中，攪拌提??；反應(yīng)2. 0h后，得到酶解產(chǎn)物；將酶解產(chǎn)物升溫至95°C ，保持10min滅酶，冷卻，將得到
的產(chǎn)物記作酶解液。 3)將冷卻至室溫的酶解液離心(3000rpm， 30min)，收集上清液；45. (TC下真空濃縮，溶液體積至6L左右停止(即濃縮至上清液體積的6/35)，得到的產(chǎn)物記作濃縮液。
4)用乙醇沉淀多糖 a、向濃縮液中攪拌添加適量95X食用乙醇，調(diào)節(jié)體系乙醇濃度達(dá)到65%，形成絮凝沉淀，l(TC下靜置24h ;離心(3000rpm， 20min)，收集醇沉物；將醇沉物用5L水重新分散，離心(6000rpm， 30min)，收集上清液。 b、上清液復(fù)用乙醇沉淀，加入95%食用乙醇逐步調(diào)節(jié)體系乙醇濃度達(dá)到60%，靜置24h ;離心(3000rpm， 20min)，收集沉淀。 5)將所得沉淀在真空條件下干燥(50°C，0. 1Kpa)，至物料完全干透(水分含量降
至15%以下)；粉碎，過IOO目篩，得到最終多糖產(chǎn)品。 二、多糖組分分析與鑒定 1)基本組成檢測 方法同實施例1中所述一致。 對每次提取得到的多糖產(chǎn)品的組成鑒定均重復(fù)3次，結(jié)果取平均數(shù)。 結(jié)果表明，本發(fā)明所得多糖產(chǎn)品得率為14.2%，其中戊聚糖含量為82.6% (以木
糖計)。 2)單糖組成分析 方法同實施例1中所述一致。
實驗設(shè)3次重復(fù)。經(jīng)測定本發(fā)明所得多糖產(chǎn)品中糖水解產(chǎn)物分別為葡萄糖、木糖、阿拉伯糖；葡萄糖在三種糖中的質(zhì)量百分含量為4. 03%，木糖在三種糖中的質(zhì)量百分含量為62. 20%，阿拉伯糖在三種糖中的質(zhì)量百分含量為33. 77%;結(jié)果表明，本發(fā)明所得多糖產(chǎn)品的糖單元組成中95%以上是木糖和阿拉伯糖這兩種五碳糖，葡萄糖含量很低，判定本發(fā)明產(chǎn)品為一種阿拉伯木聚糖(或戊聚糖)產(chǎn)品。
3)產(chǎn)物分子量分布測定
方法同實施例1中所述一致。
實驗設(shè)3次重復(fù)。 經(jīng)測定本發(fā)明所得產(chǎn)品出現(xiàn)兩個可能為糖類物質(zhì)的示差信號峰，其中一個峰平均相對分子質(zhì)量(Mw)為3. 316Xl(^Da，該峰樣品量占總進樣量的84. 1%;另一峰因無激光信號，分子量測不出(太低)。結(jié)果表明，本發(fā)明產(chǎn)品中的糖類物質(zhì)主要以高分子聚合物形式存在。 綜上結(jié)果得出如下結(jié)論本發(fā)明多糖產(chǎn)品的主要組分為一種分子量在3萬左右的
阿拉伯木聚糖(或稱戊聚糖)。 實施例4、小麥麩皮多糖生理功能實驗 參照《藥理實驗方法學(xué)》(人民衛(wèi)生出版社，第三版，徐叔云等主編)進行目標(biāo)多糖抗腫瘤及免疫增強功能實驗。( — )對正常動物體內(nèi)免疫功能增強實驗 考察了本發(fā)明所提取小麥麩皮多糖(以下簡寫為AX)對BALB/C小鼠脾T、 B淋巴
細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能、綿羊紅細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)過敏反應(yīng)(DTH)、血清抗體產(chǎn)生水平以及巨噬細(xì)胞吞
噬功能的作用。 1)材料和方法 實驗動物BALB/c小鼠6_8周齡，雌性，豚鼠，均購自維通利華實驗動物中心，合格證號SCXK(京)2007-0001。飼養(yǎng)于屏障環(huán)境，溫度為21 25°C ，相對濕度40-70% 。試驗開始前給予常規(guī)基礎(chǔ)飼料適應(yīng)5天 7天。 完全培養(yǎng)基RPMI-1640為Gibco BRL公司產(chǎn)品，四甲基噻唑藍(lán)(MTT) 、 SDS、 ConA為Sigma公司產(chǎn)品，二甲基亞楓為Fluka公司產(chǎn)品，青、鏈霉素、胎牛血清(Hyclone公司)，L-谷氨酰胺、HEPES、胰酶為Amresco公司產(chǎn)品。C02培養(yǎng)箱(Thermo Forma，型號38);倒置熒光顯微鏡(Olympus，型號CK40) ;Bio-Tek MQX200型酶標(biāo)儀；離心機(德國HERAEUSLabofuge 400R) ;96和48孔細(xì)胞培養(yǎng)板，Costar公司產(chǎn)品；德國CASY細(xì)胞計數(shù)儀。
分組及給藥隨機分為5組，分別為空白組(給同量生理鹽水)、陽性藥組(人參多糖注射液山西普德藥業(yè)有限公司，批號20060901)、 AX高、中、低劑量組，口服給藥，每天一次，連續(xù)15天。 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)試驗?zāi)┐谓o藥后lh，將小鼠脫頸椎處死后，無菌操作分別取出各組小鼠的脾臟并制成脾細(xì)胞懸液，并配成5X10e/ml，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 ii 1，再分別加入完全RPMI 1640+ConA(5 y g/ml)溶液或不加剌激劑ConA的1640培養(yǎng)基溶液100iil，置孵箱中37。C培養(yǎng)72h，每孔加入MTT(5mg/ml)20iil，再培養(yǎng)4h，先輕輕吸出上清，每孔再加入100 iU細(xì)胞裂解液(SDS)，過夜培養(yǎng)以充分溶解MTT。次日，用酶標(biāo)儀在570nm處檢測0D值。 綿羊紅細(xì)胞誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH):對末次給藥后的小鼠進行如下處理每只小鼠腹腔注射2% (V/V，用生理鹽水配制)壓積綿羊紅細(xì)胞(SRBC)0.2ml，將其致敏，4天后用游標(biāo)卡尺測量左后足趾部厚度，然后在測量部位每只鼠皮下注射20% (V/V，用生理鹽水配制)SRBC 20iil，于注射后24h測量左后足趾部厚度，同一部位測量3次，取平均值。以攻擊前后足趾部厚度的差值表示DTH的程度。 血清溶血素測定采用半數(shù)溶血值的方法小鼠給藥IO天后，每只小鼠腹腔注射2% SRBC 0. 2ml進行免疫，末次給藥后(即免疫后第5日)，摘除眼球取血，分離血清。血清用生理鹽水300倍稀釋后取lml加入試管，再依次加入0. 5ml 10% SRBC和lml 1 : 8稀釋的豚鼠補體，37。C水浴30min，2000rpm離心10min，取上清lml，加都氏試劑3ml，同時取10% SRBC lml加都氏試劑至4ml，充分混勻，放置10min后，作為空白管，于540nm處測各管0D值。計算公式 樣品管半數(shù)溶血值HC5。=樣品光密度值X稀釋倍數(shù)/SRBC半數(shù)溶血時的光密度值。 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗實驗前4天給每只小鼠腹腔注射2%壓積綿羊紅細(xì)胞(SRBC)0.2ml以激活巨噬細(xì)胞。用頸椎脫臼法處死小鼠后，經(jīng)腹腔注射給予小鼠含10%小牛血清的Hank' s液4ml/只，輕揉腹部20次，以充分洗出腹腔巨噬細(xì)胞，然后輕輕吸出腹腔液2ml于試管內(nèi)，吸取腹腔液0. 5ml與0. 5ml 1 %雞紅細(xì)胞混勻，取混懸液0. 5ml涂片，37t:孵育15min，取出后用生理鹽水沖掉未貼壁細(xì)胞，于甲醇液中固定lmin，染色15min，晾干后，顯微鏡下計數(shù)吞噬率，吞噬率為每IOO個巨噬細(xì)胞中，吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞所占的百分率。 統(tǒng)計學(xué)處理所有資料經(jīng)SPSS8. 0統(tǒng)計軟件處理后用；±s表示，組間比較采用t檢驗。 2)結(jié)果
10備的多糖的結(jié)果如表1所示，實施例2和3中制備的多糖的效果 與其無顯著差異。 表1AX對小鼠免疫指標(biāo)的影響(；±s， n = 8)
組另U_劑量(mg/kg) DTH足趾厚度差(cm) 巨噬細(xì)胞吞噬率(。/。)lftl.清溶rfll素HC50 淋巴細(xì)胞(ODs70nJ
對照/O.OIO士O扁17.4士3.74117.2±66.330.4587±0.畫5
人參多糖500.051±0.016***24.5±4.63**190.8土15.02*0.6656士0.1855*
高劑量AX '2000.026士0.011**21.8士5.90165.4士54.600.6119士0.1358*
中劑量AX '1000.048±0.020***24.1±5.36**190.6±25.49*0.6426±0.2011*
低劑量AX500.025士0.01511123.4士5.15^149.6±64.400.5245±0.1267 *p < 0. 05， **p < 0. 01， ***p < 0. 001與對照組比較 AX對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的促進作用由表1可知，AX高劑量組和中劑量組 在加剌激劑ConA時均可顯著促進脾淋巴細(xì)胞增殖，其作用強度接近陽性對照組_人參多 糖。 AX對綿羊紅細(xì)胞誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)的增強作用利用足趾厚度法測 定了 SRBC綿羊紅細(xì)胞對DTH的誘導(dǎo)作用，結(jié)果表明，AX的高、中和低劑量組的足趾腫脹度 均高于對照組，差異具有顯著性意義，尤其是高劑量組(P<0.01)和中劑量組(P<0. 001) 差異均達(dá)到極顯著水平，表明AX能增強綿羊紅細(xì)胞誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，即可增強 細(xì)胞免疫功能。 AX對血清溶血素產(chǎn)生水平的影響AX的中劑量組能提高小鼠血清半數(shù)溶血值HCs。 值(P < 0. 05)，表明AX可促進小鼠血清抗體的產(chǎn)生。 AX對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的促進作用本試驗結(jié)果表明，AX能夠增強 機體單核_巨噬細(xì)胞的吞噬功能。 綜上所述，本發(fā)明多糖(AX)能夠增強機體的免疫功能。
( 二 )對接種腫瘤模型小鼠抗腫瘤作用及免疫功能的影響 [OH7] 1)材料和方法 實驗動物ICR小鼠18-20g，雄性，購自維通利華實驗動物中心，合格證號 SCXK(京)2007-0001。飼養(yǎng)于屏障環(huán)境，溫度為21 25。C，相對濕度40-70%。試驗開始 前給予常規(guī)基礎(chǔ)飼料適應(yīng)5天 7天。 S180肉瘤細(xì)胞購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心，K562細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué) 院基礎(chǔ)所細(xì)胞中心。其它試劑和儀器同上。 腫瘤接種、分組及給藥每只動物右腋皮下接種S180肉瘤細(xì)胞2X 106，24h后，隨 機分為7組，分別為空白組(給同量生理鹽水)、模型組(給與同量的溶劑對照)、陽性藥組 (臨床輔助抗腫瘤藥物香菇多糖注射液0. 2mg/kg，腹腔注射，山西泰盛制藥有限公司生產(chǎn)， 批號0811031 ;復(fù)方環(huán)磷酰胺(CPX)30mg/kg， 口服，生產(chǎn)廠家天津金世制藥有限公司，批 號20071101) 、AX高、中、低劑量組口服給藥，連續(xù)10天。
11
檢測指標(biāo)體重、瘤重、NK細(xì)胞殺傷功能及脾淋巴細(xì)胞增殖活性。脾淋巴細(xì)胞增殖 活性的實驗方法同上。 NK細(xì)胞殺傷功能實驗靶細(xì)胞(K562)傳代培養(yǎng)，使用前洗滌、調(diào)整細(xì)胞濃度為 4X10s個/ml。制備小鼠脾細(xì)胞，用無菌水輕晃20s以裂解紅細(xì)胞，立即加入2Xhank' s 液恢復(fù)原液壓，再次洗滌后調(diào)整細(xì)胞濃度為2X107個/ml。反應(yīng)孔取靶細(xì)胞(K562)和 效應(yīng)細(xì)胞(脾細(xì)胞)各100iU加入96孔板中；靶細(xì)胞自然釋放孔加入靶細(xì)胞和培養(yǎng)基 各lOOiU ;靶細(xì)胞最大釋放孔加入靶細(xì)胞和2. 5% Triton各100 iU。上述各項均設(shè)3個 平行孔，于37t:培養(yǎng)4h后吸取上清100 iU于新的培養(yǎng)板中，加入LDH基質(zhì)液(DL-乳酸 鋰5X10—^01/L，硝基氯化四氮唑(INT)6. 6X10—W/L， PMS 2. 8X 10—4mol/L，氧化型輔酶 I(NAD)l. 3X10—3mol/L，溶于Tris-HCL(0. 2mol/L，pH8. 2)，需現(xiàn)用現(xiàn)配)100 y 1/孔，室溫反 應(yīng)10min后每孔加入lmol/1 HCL30 y l，在酶標(biāo)儀490nm處測0D值。
統(tǒng)計學(xué)處理同上。
2)結(jié)果 實施例1中所制備的多糖的結(jié)果如表2、3所示，實施例2和3中制備的多糖的效 果與其無顯著差異。 表2和表3結(jié)果顯示AX具有明顯的抑制S180肉瘤生長的作用，400mg/kg組抑瘤 率已經(jīng)接近陽性對照復(fù)方環(huán)磷酰胺，達(dá)到54. 1%，但環(huán)磷酰胺明顯降低小鼠體重，AX則未 見此副作用，陽性對照香菇多糖抑瘤率僅為21. 8%。通過對荷瘤鼠免疫功能的觀察可見AX 具有明顯改善荷瘤鼠免疫功能低下的作用，AX可增強巨噬細(xì)胞吞噬功能、淋巴細(xì)胞增殖活 性及NK細(xì)胞殺傷活性，其提高免疫功能的強度高于陽性對照香菇多糖，這可能是其抑瘤的 主要機制。 表2 AX對小鼠S180移植性腫瘤的抑瘤作用G±s， n = 10)
組別齊糧(mg/kg)實驗前體重 實驗后瘤重(g)抑瘤率(％)
空白 '20.1±0.8528.4±1.27
模型20.2±1.3827.2±3.611.398±0.340
香菇多糖0.220.6±1.2328.9±2.341.093±0.262*21.8
CPX2520.8±1.1321.6±3.31*0.473±0.209***66.2
AX10020.3±0.8327.3±1.480.937±0.255**32.9
AX20020.1±1.2426.9±2.250.802±0.265***42.6
AX40020.7±1.2827.4±3.180.642±0.309***54.1 *p < 0. 05， **p < 0. 01， ***p < 0. 001與模型組比較。 表3 AX對S180移植性腫瘤小鼠免疫指標(biāo)的影響G±s， n = 10)組另IJ_劑量(mg/kg)NK細(xì)胞活性(y。)巨噬細(xì)胞吞噬率(％) 淋巴細(xì)胞活性(00570師)
空白23.9±4.116.9±2.90.4405±0.0398
模型17.7±3.3**10.2±2.4***0.3942±0.0334*
香菇多糖0.223.4±3.4"19.6±3.2"A■■0.4655±0.0382"
CPX2521.9±3.8A8.9±3.10.4277±0.0446
AX10031.0±3.6"A22.1±5.0"*0.4706±0.0914A
AX20036.6±6.9A"26.3±4.8"*0.5260±0.0497A"
AX40042.5±4.0"A34.9±3.9*"0.4494±0.0501"
*p < 0. 05，**p < 0. 01，***p<0. OOl與空白對照組比較; < 0. 05，"p < 0. 01，
p < 0. 001與模型對照組比較。
1權(quán)利要求
一種提取多糖的方法，包括如下步驟用木聚糖酶酶解小麥麩皮，得到酶解產(chǎn)物，即得到多糖；所述木聚糖酶與所述小麥麩皮的配比為(5U-12.5U)∶1g小麥麩皮。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述用木聚糖酶酶解小麥麩皮的方法包 括如下步驟將所述小麥麩皮、水與所述木聚糖酶混合，再進行酶解反應(yīng)；酶解反應(yīng)的溫度 為50°C -6(TC，酶解反應(yīng)的pH值為5. 0-5. 5，酶解反應(yīng)的時間為2. 0h_4. 0h。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述酶解前，包括如下對所述小麥麩皮進行預(yù)處理的步驟將所述小麥麩皮進行脫植酸處理和脫淀粉處理，得到脫植酸和脫淀粉的小麥麩皮。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述酶解后，包 括如下純化的步驟將所述酶解產(chǎn)物用乙醇進行沉淀，收集沉淀。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述酶解后，在 所述用乙醇進行沉淀前，包括如下對所述酶解產(chǎn)物進行濃縮處理的步驟將所述酶解產(chǎn)物進行離心，收集上清液，將所述上清液濃縮至所述上清液體積的1/4-1/6，得到濃縮液。
6. 由權(quán)利要求l-5中任一所述方法得到的多糖。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的多糖，其特征在于所述多糖包括阿拉伯木聚糖；所述阿拉伯 木聚糖的分子量為3. 252X 104Da-3. 450X 104Da。
8. —種增強機體免疫功能的藥物、一種腫瘤細(xì)胞抑制劑或一種治療和/或預(yù)防腫瘤的 藥物，其活性成分為權(quán)利要求6或7所述多糖。
9. 權(quán)利要求6或7所述多糖在制備增強機體免疫功能藥物中的應(yīng)用、權(quán)利要求6或7 所述多糖在制備腫瘤細(xì)胞抑制劑中的應(yīng)用或權(quán)利要求6或7所述多糖在制備治療和/或預(yù) 防腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的抑制劑或藥物或權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述 腫瘤細(xì)胞為S180腫瘤細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有抗腫瘤與免疫調(diào)節(jié)活性的多糖及其提取方法。該提取多糖的方法，包括如下步驟用木聚糖酶酶解小麥麩皮，得到多糖；木聚糖酶與所述小麥麩皮的配比為(5U-12.5U)∶1g小麥麩皮。本發(fā)明方法利用小麥麩皮這一農(nóng)副產(chǎn)品資源，通過加工提取可大量獲得以阿拉伯木聚糖(或稱戊聚糖)為主的多糖產(chǎn)品，動物實驗顯示該多糖的免疫調(diào)節(jié)與抗腫瘤功效堪與臨床上應(yīng)用的抗腫瘤輔助藥物相比，而本多糖由于原料價格低廉，來源豐富，更具市場競爭優(yōu)勢，產(chǎn)業(yè)化發(fā)展前景廣闊。
文檔編號A61P37/04GK101705268SQ20091023735
公開日2010年5月12日 申請日期2009年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月10日
發(fā)明者任霞, 劉紅芝, 周素梅, 張曉娜, 曹麗, 王強 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所