專利名稱：：蔓生白薇苷c在制備治療瘧疾藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及藥物，具體涉及化合物蔓生白薇苷c在制備治療瘧疾藥物中的應(yīng)用，尤其涉及化合物蔓生白薇苷c在制備治療由瘧原蟲引起的瘧疾藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：瘧疾是地球上發(fā)生最頻繁的寄生蟲病，是由按蚊進(jìn)行傳播、具有潛在致命危險(xiǎn)的疾病。每年全球有5億左右的瘧疾病例，導(dǎo)致超過(guò)100萬(wàn)人死亡，絕大部分發(fā)生在非洲。世界衛(wèi)生組織指出瘧疾平均每30秒殺死一個(gè)5歲以下的兒童。瘧疾由瘧原蟲引起。帶有瘧原蟲的雌按蚊叮咬人體后，將瘧原蟲注入人體，經(jīng)1020天會(huì)發(fā)生典型的瘧疾臨床癥狀，可分為四期發(fā)冷期、發(fā)熱期、出汗期和間歇期。瘧疾的反復(fù)發(fā)作后，病人會(huì)出現(xiàn)貧血、肝脾腫大，甚至出現(xiàn)腦型、超高熱型、厥冷型和胃腸型等兇險(xiǎn)癥狀，甚至危及生命。隨著已有抗瘧藥物的耐藥性的不斷增加，瘧疾的發(fā)病率日益增加，亟待具有新型治療作用的抗瘧藥物的發(fā)現(xiàn)。紅細(xì)胞內(nèi)期的瘧原蟲在其酸性食物泡內(nèi)水解宿主的血紅蛋白以獲得自身生命所需的能量和氨基酸。生物學(xué)研究表明，在瘧原蟲的食物泡內(nèi)包涵一系列的水解酶，如天冬氨酸蛋白酶(plasm印sins)，半胱氨酸蛋白酶(falcipains)，和金屬蛋白酶(falcilysins)。這些酶已成為瘧疾化學(xué)治療的潛在的靶標(biāo)。半胱氨酸蛋白酶是MT約為2100030000的蛋白質(zhì)，在pH46.5時(shí)具有最高水解活性，它的活性部位具有半胱氨酸殘基。瘧原蟲的半胱氨酸蛋白酶屬于木瓜蛋白酶家族。已知的瘧原蟲半胱氨酸蛋白酶有四個(gè)亞型，falcipain-l(瘧原蟲半胱氨酸蛋白酶-l)，falcipain-2A(瘧原蟲半胱氨酸蛋白酶-2A)，falcipain-2B(瘧原蟲半胱氨酸蛋白酶-2B)，falcipain-3(瘧原蟲半胱氨酸蛋白酶-3)。Falcipain1是第一個(gè)表達(dá)得到的瘧原蟲半胱氨酸蛋白酶，其生物學(xué)研究表明，它對(duì)瘧原蟲的無(wú)性生殖階段并無(wú)影響，但能顯著的影響卵囊的功能。Falcipain-2A，falcipain-2B具有97%的同源性，僅在氨基酸序列的7位有所不同。通過(guò)寡核苷酸探針的監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，falcipain-2BmRNA的表達(dá)水平比f(wàn)alcipain-2A低。然而falcipain-2A和falcipain-2B在癥原蟲營(yíng)養(yǎng)體晚期其表達(dá)的時(shí)間依賴性和峰值極為相似，這表明兩種不同的亞型具有相似的生物學(xué)功能。Falcipain-3與falcipain-2在催化域有66.6%的同源性，但是它們表達(dá)的階段有所不同。Falcipain-2在營(yíng)養(yǎng)體階段表達(dá)達(dá)到最高峰，而falcipain-3在更為成熟的瘧原蟲階段表達(dá)達(dá)到高峰。在這幾種亞型中，對(duì)于falcipain-2的研究最多，因此其抑制劑的開(kāi)發(fā)亦受到更為廣泛的關(guān)注。中醫(yī)中藥治療瘧疾已經(jīng)有很長(zhǎng)的歷史，比如在《素問(wèn)*剌虐論》中就提出了用針灸預(yù)防治療瘧疾，在中草藥方面，除了聞名世界的青蒿外，威靈仙、水蜈蚣、鴉膽子、常山、鵝不食草、檳榔、翻白草、石龍芮等也在民間用來(lái)治療瘧疾。從中藥青蒿中發(fā)現(xiàn)的活性化合物青蒿素用于治療瘧疾取得了很好的效果，廣泛用于臨床，因此從中藥中尋找具有抗虐活性的化合物意義重大。本發(fā)明人通過(guò)多年的基礎(chǔ)研究積累了2000多種，并建立了天然產(chǎn)物庫(kù)，通過(guò)對(duì)庫(kù)中化合物進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)了蔓生白薇苷C具有抗瘧作用。白薇為蘿摩科鵝絨藤屬植物直立白薇、蔓生白薇的根，中醫(yī)理論中白薇具有清熱涼血、利尿通淋、解毒療瘡的功效，用于陰虛發(fā)熱、骨蒸勞熱、產(chǎn)后血虛發(fā)熱等癥。尚未見(jiàn)白薇中的化學(xué)成分具有抗瘧作用的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提研究設(shè)計(jì)蔓生白薇苷C在制備治療瘧疾藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了蔓生白薇苷C在制備治療瘧疾藥物中的應(yīng)用。蔓生白薇苷C的結(jié)構(gòu)式如下蔓生白薇苷c系從直立白薇、蔓生白薇中分離得到的化合物。通過(guò)蔓生白薇苷C與Falcipain-2蛋白酶結(jié)合活性測(cè)定等試驗(yàn)，結(jié)果證明蔓生白薇苷C與FP-2蛋白有明顯的結(jié)合，對(duì)FP-2酶有較高的抑制活性。蔓生白薇苷C體外抗瘧活性測(cè)定，結(jié)果顯示，蔓生白薇苷C有較好的體外抗瘧原蟲活性。因此，可用于制備治療瘧疾的藥物本發(fā)明的另一目的是提供以蔓生白薇苷C為活性成分，用于制備治療瘧疾的藥物組合物，尤其用于制備治療由瘧原蟲引起的瘧疾的藥物組合物。本發(fā)明所述藥物組合物含有治療有效量的蔓生白薇苷C為活性成分，以及含有一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。其中活性成分在藥物組合物中的重量為5-95%。所述藥學(xué)上可接受的載體是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體，例如稀釋劑、賦形劑如水燈；填充劑如淀粉、蔗糖等；粘合劑如明膠、聚乙烯吡咯烷酮；濕潤(rùn)劑如甘油；崩解劑如碳酸鈣、碳酸氫鈉；吸收促進(jìn)劑如季銨化合物；表面活性劑如十六烷醇；吸附載體如高嶺土和皂粘土；潤(rùn)滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣、聚乙二醇等、另外還可以在組合物中加入其它輔劑如香味劑、甜味劑等。本發(fā)明化合物可以組合物的形式通過(guò)口服、鼻吸入、直腸或腸胃外給藥的方式施用于需要這種治療的患者。用于口服時(shí)，可將其職稱常規(guī)的固體制劑如片劑、顆粒劑、膠囊等或制成液體制劑如水或油懸浮劑、糖漿等；用于腸胃外給藥時(shí)，可將其制成注射用的溶液、水貨油性懸浮劑等。本發(fā)明藥物組合物的各種劑型可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)生產(chǎn)方法制備。例如使活性成分與一種或多種載體混合，然后將其制成所需的劑型。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:蔓生白薇苷C的制備白薇干燥根10kg粉碎后，以10倍量90%乙醇回流3次，每次2小時(shí)，合并提取液，減壓回收溶劑，得乙醇提取物，該提取物上大孔樹(shù)脂HP-20柱，分別用蒸餾水和30%EtOH洗脫至洗脫液無(wú)色，再用90%EtOH洗脫至硫酸乙醇皂苷顯色陰性為止，回收90%EtOH洗脫液至干，得90%EtOH洗脫部分。將90%EtOH洗脫部分進(jìn)行硅膠柱層析，以氯仿_甲醇(1:11:10v/v)進(jìn)行梯度洗脫，用薄層層析檢查層析流分，具有相同單一斑點(diǎn)的流分合并，濃縮，分得流分1、2、3、4、5，將其中的第3和第4部分再分別進(jìn)行正相硅膠柱層析，以不同比例的氯仿-甲醇進(jìn)行洗脫，第3流分得AI-VII流分、第4流分得BI-V流分，將其中的BIV流分經(jīng)反復(fù)的RP-C18層析(MeOH:H20)分離、純化，得到蔓生白薇苷C146mg。制得的蔓生白薇苷C用于實(shí)施例2-5。蔓生白薇苷C(cynanversicosideC)，白色無(wú)定形粉末，mpl24-128。C，[a]d28:+49.8。(c=0.562，MeOH)，分子式C28H4。014。經(jīng)光譜數(shù)據(jù)分析和理化性狀測(cè)定與文獻(xiàn)報(bào)道(QiuSheng-Xiang，etal.Phytochemistry，1989，28(11)，3175-3178)的蔓生白薇苷C完全一致。實(shí)施例2:蔓生白薇苷C與Falcipain-2蛋白酶結(jié)合活性測(cè)定Falcipain-2蛋白酶與紫草酸丁酯結(jié)合活性的篩選和動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定基于SPR(表面等離子共振)原理，使用的儀器是Biacore3000(BiacoreAB，Uppsala，Sweden)。(1)Falcipain-2質(zhì)粒(pQE30-Fa12)的構(gòu)建根據(jù)Falcipain-2cDNA序列設(shè)計(jì)引物，正向和反向引物分另l」為5，CGTGGATCCCAAATGAATTATGAAG3，和5，ATATGTCGACTTATTCAATTAATGGAATG3，，包含BamHI和SalI酶切位點(diǎn)，通過(guò)PCR擴(kuò)增Falcipain-2片段，將酶切后的PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pQE30連接后鑒定正確，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌M15(Qiagen)進(jìn)行表達(dá)。(2)Falcipain-2(FP-2)蛋白的表達(dá)與純化將構(gòu)建好的質(zhì)粒pQE30-Fa12轉(zhuǎn)入大腸桿菌M15中得到表達(dá)工程菌，將工程菌培養(yǎng)于含100iig/mL氨芐青霉素和50iig/mL卡那霉素的10mLLB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L)。然后按1:100轉(zhuǎn)接入1L含氨芐青霉素和卡那霉素的新鮮LB培養(yǎng)基中，37t:下，220轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)。當(dāng)0D600達(dá)到約0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度0.5mM，同時(shí)將溫度降到25t:培養(yǎng)12小時(shí)進(jìn)行蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。4000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘收集菌體，收集好后放于-8(TC超低溫冰箱保存過(guò)夜。將菌體用20mL的緩沖液1(20mMTris-Cl，O.5MNaCl，and10mM咪唑，pH8.0)懸起，將懸浮液冰浴上超聲波破碎(300W，工作30分鐘，一次5秒，中間間隔10秒)。破碎后得到的細(xì)胞勻漿在4°C，以10000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，棄上清，用20mL的buffer2(6M胍HC120mMTris-Cl250mMNaCl20mM咪唑，pH8.0)溶解沉淀，室溫下溫和攪拌1小時(shí)，10000轉(zhuǎn)/分離心30min，并將上清上樣到用綁定緩沖液2(6MguanidineHCl，20mMTris-Cl，250mMNaCl，pH8.0)平衡好的Ni2+_NTA柱上，先后用沖洗緩沖液1(8M尿素，20mMTris-Cl，500mMNaClpH8.0)和沖洗緩沖液2(8M尿素，20mMTris-Cl，30mM咪唑)各30ml洗去非特異性結(jié)合的雜蛋白，再用洗脫緩沖液(8M尿素，20MmTris-Cl，lM咪唑)10ml洗去目的蛋白，用SDS-PAGE檢測(cè)蛋白的分子量和純度。(3)FP-2包涵體蛋白的復(fù)性將純化得到的蛋白加入10mMDTT，37。C下溫浴45分鐘后，將蛋白溶液稀釋到10g/ml進(jìn)行透析(透析液100mMTris-Cl，lmMEDTA，20%甘油，250mML-精氨酸，lmM谷胱甘肽，lmM氧化型谷胱甘肽(GSSG)，pH8.0)過(guò)夜。將透析好的蛋白濃縮即可用作酶抑制活性的測(cè)定。(4)FP-2蛋白的偶聯(lián)徹底清洗Biacore3000機(jī)器后，用PBS緩沖液(10mM4_羥基哌嗪乙磺酸，150mMNaCl，3mMEDTAand0.005%(v/v)surfactantP20，pH7.4)平衡機(jī)器至基線平穩(wěn)。0.2MN_ethyl_N'-dimethylaminopropylcarbodiimide(N-乙基-N'_二甲基氨丙基碳二亞胺)和50mMMN-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)1:1混禾P，以5yL/min進(jìn)樣7分鐘以活化芯片表面。FP-2蛋白用10mM乙酸鈉，pH4.2，稀釋至終濃度為69iig/ml，以5iiL/min流速進(jìn)樣。最后，用1M鹽酸乙醇胺，pH8.5以5iiL/min流速進(jìn)樣7分鐘，封閉芯片表面，最終FP-2蛋白的偶聯(lián)量為9300RU左右。(5)化合物篩選底物Z-Phe-Arg-pNAHC1(BachemAG)作為陽(yáng)性對(duì)照。實(shí)施例1制得的蔓生白薇苷C用100%匿SO溶解，母液濃度為10mM。用HBS-EP緩沖液稀釋化合物，至終濃度為1PM和10iiM，DMS0的終濃度為0.1%。根據(jù)紫草酸丁酯與芯片上FP-2蛋白的結(jié)合的RU(ResponseUnit，共振單位)值，判斷化合物是否具有結(jié)合活性。有結(jié)合活性的化合物可進(jìn)行詳細(xì)的動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果證明蔓生白薇苷C與FP-2蛋白有明顯的結(jié)合。(6)動(dòng)力學(xué)測(cè)定蔓生白薇苷C用工作緩沖液HBS-EP(含O.1%匿SO)，分別配成不同的濃度梯度，以30iU/min進(jìn)樣lmin，解離2min，然后用相同緩沖液穩(wěn)定2min。得到蔓生白薇苷C與FP-2蛋白相互作用的傳感圖，再用Biacore分析軟件中的1:1(Langmuir)結(jié)合模型或穩(wěn)態(tài)模型進(jìn)行擬合，得到確切的動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)常數(shù)。(6)試驗(yàn)結(jié)果表1陽(yáng)性對(duì)照和蔓生白薇苷C與FP-2蛋白結(jié)合常數(shù)的測(cè)試結(jié)果。序號(hào)編號(hào)KD一)1蔓生白薇苷c5.782Z-Phe-Arg-pNA.HC1~32.1實(shí)施例3蔓生白薇苷C對(duì)falcipain-2蛋白酶百分抑制活性的測(cè)定(1)Falcipain-2(FP-2)蛋白的表達(dá)與純化和FP-2包涵體蛋白的復(fù)性參見(jiàn)實(shí)施例2(2)本發(fā)明化合物對(duì)FP-2酶抑制活性的測(cè)定在197iiL的100mMNaOAc，10mMDTT，pH5.5的buffer體系中加入FP-2蛋白(終濃度10g/ml)和溶于匿SO的待測(cè)化合物溶液，終濃度10M和0M(陰性對(duì)照)，室溫下孵育30min后用MDSpectraMaxM5酶標(biāo)儀于激發(fā)波長(zhǎng)excitation355nm;發(fā)射波長(zhǎng)emission460nm處連續(xù)測(cè)15min內(nèi)的RFU值，計(jì)算出反應(yīng)速率Km，以下列公式得出待測(cè)化合物在10M下百分抑制率，計(jì)算公式為(對(duì)照組Km值_實(shí)驗(yàn)組Km值)/對(duì)照組Km值X100%(3)化合物活性測(cè)試結(jié)果蔓生白薇苷C對(duì)falcipain-2的抑制率為83%。實(shí)施例4蔓生白薇苷C對(duì)falcipain-2蛋白酶半數(shù)有效抑制濃度(IC5。)的測(cè)定選取IOM抑制率在50%以上的化合物測(cè)IC5。，選擇合適的化合物濃度梯度，即蔓生白薇苷C溶液，實(shí)驗(yàn)方法和體系如實(shí)施例3。根據(jù)化合物在不同濃度下FP-2酶活的反應(yīng)速率Km，計(jì)算化合物在不同濃度下對(duì)FP-2酶活的抑制率，使用Sigmoidal公式用origin軟件進(jìn)行擬合得到化合物的IC5。值，結(jié)果蔓生白薇苷C對(duì)falcipain-2酶活抑制IC5。值為1.54M。提示蔓生白薇苷C具有較好的抗瘧活性。實(shí)施例5蔓生白薇苷C體外抗瘧活性測(cè)定抗癥活性可以通過(guò)測(cè)量癥原蟲LDH活性來(lái)確定(Jain，M.;Khan，S.I.;Tekwani，B丄；Jacob，M.R.;Singh，S.;Singh，P.P.;Jain，R.Synthesis,antimalarial,antileishmanial，andantimicrobialactivitiesofsome8_quinolinamineanalogues.Bioorg.Med.Chem.2005，13，4458-4466.)。在含10iiL連續(xù)稀釋測(cè)試樣本的96孔板的每個(gè)孔中加入感染了D6orW2株P(guān).falciparum的紅細(xì)胞混懸液(200yL，在RPMI1640培養(yǎng)集中加入10%人血清和601g/mL阿米卡星，使瘧原蟲血癥達(dá)到2%，紅細(xì)胞壓積達(dá)到2%)，然后用90%^，5%02，and5%C02組成的混合氣體沖洗板，在培育房?jī)?nèi)培育72小時(shí)，溫度保持在37t:。LDH活性用MalstatTM試劑(FlowInc.，Portland,OR)測(cè)定，測(cè)定程序參照Makler禾口Hinrichs的禾呈序(M.T.MaklerandD.J.Hinrichs，MeasurementofthelactatedehydrogenaseactivityofPlasmodi咖falcipar咖asanassessmentofparasitemia.J.Am.J.Trop.Med.Hyg.1993,48(2):205-210)。簡(jiǎn)要說(shuō)來(lái)，就是將20yL培育的混合物同100iiLheMalstat試劑混合，在室溫下培育30分鐘.然后加入20微升NBT/PES的混合物(NBT/PES比例為1:1)(Sig腿，St.Louis,M0)，在黑暗條件下培育1小時(shí)。之后，加入100iiL5%醋酸溶液終止這一反應(yīng)，并用650nm來(lái)檢測(cè)板.藥物對(duì)照組中加入青蒿素和氯喹。從劑量-效應(yīng)曲線中計(jì)算出IC5。。測(cè)定化合物抗瘧活性的選擇性指標(biāo)時(shí)，也要測(cè)定他們?cè)隗w外對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的毒性.測(cè)試在96孔組織培養(yǎng)板中進(jìn)行(J.Mustafa,S.I.Khan，G.Ma，L.A.WalkerandI.A.Khan，SynthesisandAnticancerActivitiesofFattyAcidAnalogsofPodophyllotoxin.Lipids.2004，39(2):167-172.)。在96孔板中以25，000個(gè)/孔的密度種植非洲綠猴腎異倍體細(xì)胞并培育24小時(shí).加入不同濃度的樣品，即蔓生白薇苷CDMS0溶液，濃度為528.8ng/ml、1586.4ng/ml、4760g/ml，繼續(xù)培育48小時(shí)。利用NeutralRedassay方法測(cè)定存活細(xì)胞數(shù)，從劑量-效應(yīng)曲線中計(jì)算出IC5。.用阿霉素作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。蔓生白薇苷C的對(duì)D6和W2的IC5。值如下表藥物<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>結(jié)果顯示，蔓生白薇苷C有較好的體外抗瘧原蟲活性。權(quán)利要求蔓生白薇苷C在制備治療瘧疾藥物中的應(yīng)用，其特征在于蔓生白薇苷C的結(jié)構(gòu)式如下2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物為治療由瘧原蟲引起的瘧疾的藥物。3.—種治療瘧疾的藥物組合物，其特征在于含有如權(quán)利要求1中所述的蔓生白薇苷C和藥學(xué)上可以接受的載體。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物組合物，其特征在于活性成分蔓生白薇苷C在藥物組合物中的重量含量為5-95%。全文摘要本發(fā)明提供了蔓生白薇苷C在制備治療瘧疾藥物中的應(yīng)用，蔓生白薇苷C的結(jié)構(gòu)式如下并提供了含有所述的蔓生白薇苷C和藥學(xué)上可以接受的載體組成的藥物組合物。所述活性成分蔓生白薇苷C在藥物組合物中的重量含量為5-95％。通過(guò)蔓生白薇苷C與Falcipain-2蛋白酶結(jié)合活性測(cè)定等試驗(yàn)，結(jié)果證明蔓生白薇苷C與FP-2蛋白有明顯的結(jié)合，對(duì)FP-2酶有較高的抑制活性。蔓生白薇苷C體外抗瘧活性測(cè)定，結(jié)果顯示，蔓生白薇苷C有較好的體外抗瘧原蟲活性。因此，可用于制備治療瘧疾的藥物，有較大的臨床應(yīng)用價(jià)值。文檔編號(hào)A61P33/06GK101693036SQ20091019747公開(kāi)日2010年4月14日申請(qǐng)日期2009年10月21日優(yōu)先權(quán)日2009年10月21日發(fā)明者單磊,盧偉強(qiáng),張衛(wèi)東,張壽德,李洪林,蘇娟,陳瞳,黃瑾申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué);華東理工大學(xué);