專(zhuān)利名稱(chēng)：：沙苑子總黃酮提取物在制備防治肺纖維化藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種傳統(tǒng)中藥的有效部位在制備防治肺纖維化藥物中的應(yīng)用，具體為沙苑子總黃酮提取物在制備防治肺纖維化藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：月市(間質(zhì))纖維化(Pulmonaryfibrosis,PF)又稱(chēng)肺間質(zhì)疾病(interstitiall皿gdisease,ILD)，是一種原因不明以彌漫性肺泡炎和肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，導(dǎo)致肺泡、肺間質(zhì)纖維化，最終可引起呼吸衰竭的疾病。肺纖維化的病理特點(diǎn)主要是長(zhǎng)期肺部炎癥導(dǎo)致肺泡持續(xù)性損傷，肺內(nèi)間質(zhì)細(xì)胞增生及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)的大量沉積和廣泛的肺實(shí)質(zhì)重建。各種因素?fù)p傷肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞后，均可引起肺泡巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，炎癥細(xì)胞及其釋放的細(xì)胞因子介導(dǎo)了早期的肺損傷，損傷的存在和反復(fù)將改變肺組織的微環(huán)境，特別是肺泡室，將導(dǎo)致修復(fù)程序的失調(diào)，最終形成肺纖維化。近年來(lái)，自由基損傷、脂質(zhì)過(guò)氧化成為導(dǎo)致肺纖維化的熱點(diǎn)之一。正常情況下，肺的抗氧化能力與機(jī)體不斷產(chǎn)生自由基的氧化能力之間處于動(dòng)態(tài)平衡。研究證實(shí)，超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，SOD)對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，此酶能清除超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，SOD活性高低直接反映了機(jī)體清除自由基的能力。機(jī)體通過(guò)酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基，氧自由基能攻擊生物體中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化作用，并形成脂質(zhì)過(guò)氧化物，如醛基(丙二醛malondialdehyde，MDA)、酮基、羥基(.0H)、新的自由基等。因此，體內(nèi)MDA的含量可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，間接反映出細(xì)胞損傷的程度。機(jī)體氧化應(yīng)激存在時(shí)，通過(guò)一氧化氮合酶(T-N0S)形成一氧化氮(NO)，可與超氧陰離子結(jié)合，形成過(guò)氧亞硝酸鹽陰離子(0N00-)，從而產(chǎn)生肺毒性。膠原纖維是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，其生化成份是膠原蛋白(collagen,簡(jiǎn)稱(chēng)膠原)，羥脯氨酸(hydro鄧roline,HYP)是機(jī)體膠原蛋白的主要成分之一，約占其氨基酸總量的13.4%，組織中HYP含量可作為膠原組織代謝、衡量膠原含量及反映間質(zhì)膠原纖維沉積的重要指標(biāo)。成纖維細(xì)胞增生聚集是肺間質(zhì)纖維化的一個(gè)重要特征，成纖維細(xì)胞參與人體各種組織和器官的損傷、修復(fù)和再生。眾多研究結(jié)果證實(shí)，與其他器官纖維化一樣，肺纖維化(PF)是ECM過(guò)度沉積的過(guò)程，其中主要涉及炎癥因子、脂質(zhì)過(guò)氧化、自由基損傷、細(xì)胞間膠原沉積及成纖維細(xì)胞增生等因素的共同作用。此外，信號(hào)分子途徑之間可能相互影響，存在多條旁路途徑參與PF的形成與發(fā)展?？傊?，PF的發(fā)病機(jī)制是多種因素、多個(gè)環(huán)節(jié)參與的緩慢的錯(cuò)綜復(fù)雜的過(guò)程，目前尚無(wú)可作用于多途徑、多環(huán)節(jié)的特異有效的藥物防治肺纖維化。中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn)，在慢性肺纖維化疾病的治療中顯示了一定優(yōu)勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn)黃酮類(lèi)化合物具有抗炎、抗氧化、抗變態(tài)反應(yīng)、抗菌和抗病毒等多方面的藥理作用。2006年4月19日，本發(fā)明人曾獲中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利證書(shū)，公開(kāi)了中藥沙苑子和/或沙苑子黃酮提取物在制備預(yù)防或治療肝纖維化及癌癥藥物中的應(yīng)用(專(zhuān)利號(hào)ZL2003101064290,公告日2006年4月19日)。中藥沙苑子(shayuanzi)為豆科扁莖黃芩(AstragaluscomplanatasR.Br)植物的干燥成熟種子，具有溫補(bǔ)肝腎，固精、縮尿、益肝明目的功效，為補(bǔ)益肝腎的傳統(tǒng)中藥。二十世紀(jì)八十年代起，對(duì)沙苑子的化學(xué)成分和藥理作用研究表明沙苑子主要含有黃酮類(lèi)、三萜類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、甾醇、多糖及鐵、鋅、銅等微量元素，其中沙苑子黃酮有沙苑子苷(complanatuside)、沙苑子新苷(neocompalnoside)、沙苑子楊梅苷(myricompalnoside)、鼠李擰檬素-3-0-P-D-葡糖糖苷(rhomnocitrin_3_0_P_D_glucoside)、紫云英苷(astragalin)、山奈酷(kaompferol)、楊梅樹(shù)皮素(myricetin)、毛蕊黃酮-7-0-葡萄糖苷(calycosin-7-O-glucoside)等。現(xiàn)代藥理研究表明，沙苑子具有解熱鎮(zhèn)痛、保肝降脂、抗炎、抗肝纖維化等作用。沙苑子總黃酮(totalflavonoidsofAstragaluscomplanali)是從沙苑子(shayuanzi)中提取的一個(gè)有效部位，至今未見(jiàn)沙苑子總黃酮提取物應(yīng)用于防治肺纖維化疾病的文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是研究沙苑子總黃酮提取物在制備防治肺纖維化藥物中的應(yīng)用，尤其是從中藥中提取分離防治肺纖維化的有效部位，以便制備療效好、毒副作用小、價(jià)格便宜、服用方便可供長(zhǎng)期使用的抗肺纖維化藥物。為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供技術(shù)方案如下沙苑子總黃酮提取物在制備防治肺纖維化藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案是通過(guò)氣管內(nèi)滴注博萊霉素(Bleomycin,BLM)制備小鼠肺纖維化模型。該模型的病理過(guò)程與人類(lèi)特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(IPF)相似，作為肺纖維化的經(jīng)典模型而被廣泛應(yīng)用。本發(fā)明首次選用沙苑子總黃酮提取物作為治療藥物，研究沙苑子總黃酮提取物對(duì)肺纖維化動(dòng)物肺組織和血清相關(guān)生化指標(biāo)及病理學(xué)變化的影響，觀察沙苑子總黃酮提取物對(duì)肺纖維化動(dòng)物模型的防治作用，從而為沙苑子總黃酮提取物用于防治肺纖維化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)所用沙苑子總黃酮提取物，總黃酮含量^50%，批號(hào)070623，由我所植化室利用現(xiàn)有技術(shù)提取，也可商業(yè)購(gòu)得。本發(fā)明人在研究中藥抗肺纖維化疾病的過(guò)程中，以博萊霉素滴注小鼠氣管28天后，與正常組相比，模型組小鼠血清超氧化物歧化酶(S0D)活性顯著降低(P<0.001)，氧化代謝產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量顯著增加(P<0.001)，抑制羥自由基(*0H)產(chǎn)生的能力顯著降低(P<0.001);肺組織中總抗氧化能力(T-A0C)顯著降低(P<0.001)，而MDA含量增加(P<0.05)，總一氧化氮合酶(T-N0S)活性顯著增加(P<0.01)，抑制羥自由基(0H)產(chǎn)生的能力明顯降低(P<0.05)，羥脯氨酸(HYP)顯著升高(P<0.001)，肺系數(shù)顯著增加(P<0.001)。病理觀察所見(jiàn)，肺組織的肺泡炎和纖維化程度顯著加重(P<0.001)，呈典型的肺纖維化實(shí)質(zhì)改變。(實(shí)施例l-6)本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)用中藥沙苑子的有效部位——沙苑子總黃酮提取物(總黃酮含量^50%)，給BLM誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠灌服28天后，沙苑子總黃酮提取物各劑量組小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性顯著增強(qiáng)(P〈0.01)，小鼠血清丙二醛(MDA)含量減少或顯著減少(P<0.05，P<0.001)(實(shí)施例1)。血清抑制羥自由基(OH)的能力明顯增強(qiáng)(P<0.01)(實(shí)施例2)。沙苑子總黃酮提取物各劑量組小鼠肺組織中總抗氧化能力(T-AOC)顯著增強(qiáng)或明顯增強(qiáng)(P<0.OOl，P<0.01)，沙苑子總黃酮提取物各劑量組小鼠肺組織中丙二醛(MDA)含量顯著減少(P<0.001)(實(shí)施例3)。肺組織中總一氧化氮合酶(T-NOS)含量顯著或明顯降低(P<0.OOl，P<0.01)，沙苑子總黃酮提取物各劑量組小鼠肺組織抑制羥自由基(*OH)產(chǎn)生的能力增強(qiáng)或顯著增強(qiáng)(P<0.05，P<0.01)(實(shí)施例4)。沙苑子總黃酮提取物各劑量組小鼠肺組織中羥脯氨酸(HYP)含量顯著降低(P<0.001)，小鼠肺系數(shù)降低、明顯降低或顯著降低(P<0.05，P<0.Ol，P<0.001)(實(shí)施例5)。肺纖維化小鼠肺臟病理學(xué)觀察顯示沙苑子總黃酮提取物各劑量組肺纖維化小鼠與肺纖維化模型組小鼠相比，肺組織結(jié)構(gòu)、肺泡壁厚度、肺泡間隔寬度及成纖維細(xì)胞產(chǎn)生、膠原纖維沉積程度均有不同程度的改善(見(jiàn)附圖l)，結(jié)果表明沙苑子總黃酮提取物各劑量組小鼠肺臟的肺泡炎程度降低或明顯降低(P<0.05，P<0.01)，肺纖維化程度降低或明顯降低(P<0.05，P<0.01)(實(shí)施例6)。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明給昆明種小鼠氣管滴注博萊霉素28天之后，成功制備了小鼠肺纖維化模型。沙苑子總黃酮提取物連續(xù)給藥28天，可降低肺纖維化小鼠肺系數(shù)、月市泡炎程度及肺纖維化程度，提示其具有防治小鼠肺纖維化作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明其防治肺纖維化作用機(jī)制與其抗炎癥作用、提高機(jī)體抗氧化能力、抑制自由基生成、增強(qiáng)自由基清除、減少膠原生成及成纖維細(xì)胞增生有關(guān)。由鑒于此，按本發(fā)明所述沙苑子總黃酮提取物有可能作為潛在的候選藥物，被用于肺阻塞性疾病，特別是肺纖維化的預(yù)防和治療。因此，本發(fā)明的目的是提供一種傳統(tǒng)中藥沙苑子的有效部位——沙苑子總黃酮提取物用于防治肺阻塞性疾病，特別是肺纖維化疾病的藥物中的應(yīng)用。所述制備預(yù)防治療肺纖維化藥物中的應(yīng)用，其沙苑子黃酮提取物包括沙苑子中黃酮類(lèi)化合物及其醫(yī)藥可接受的鹽，為沙苑子黃酮鈉鹽、沙苑子黃酮磺酸鹽。所述制備預(yù)防或治療肺纖維化藥物中的應(yīng)用是指制備預(yù)防或治療肺纖維化的藥物，所述藥物為含有治療有效量的沙苑子和/或沙苑子黃酮提取物和藥學(xué)上可接受的載體?？梢园凑展ぷ髦幸阎姆椒▽⒈景l(fā)明的藥物制成片劑、膠囊劑、丸劑、粉末劑、栓劑、膏劑及溶液劑和懸浮劑。其中優(yōu)選的是適用于胃腸道給藥的膠囊劑和片劑。在制備適用于口服給藥的膠囊齊U、片齊U、丸劑和粉末劑時(shí)，可以使用蔗糖、乳糖、玉米淀粉、微晶纖維素、羧甲基纖維素作為載體或賦形劑。此外，也可以使用制藥工業(yè)中已知的方法和輔助成分將本發(fā)明的藥物制成適于口服給藥的溶液劑和懸浮劑。為了制備適于胃腸道外途徑給藥的溶液劑或懸浮劑，可以使用蒸餾水、注射用水、等滲氯化鈉溶液或葡萄糖溶液，或者低濃度(例如l-100mM)磷酸鹽緩沖液(PBS)作為載體或稀釋劑?？梢栽谶@些胃腸道外給藥的制劑中加入一種或多種其他輔助成分或添加劑，例如可使用抗壞血酸作為抗氧化劑，使用苯甲酸鈉等作為防腐劑。在這些劑型中還可以含有其他適當(dāng)?shù)脑鋈軇?、崩解劑、?rùn)滑劑、著色劑、分散劑或表面活性劑?！阏f(shuō)來(lái)，本發(fā)明藥物組合物的口服給藥劑量為0.l-100mg/Kg體重/天，較好為0.l-50mg/Kg體重/天，最好為l-10mg/Kg體重/天。然而，更確切的用藥劑量應(yīng)根據(jù)待治療的疾病或病例狀況性質(zhì)、嚴(yán)重程度、病人的年齡、體重、待治療病人所用藥的敏感性及給藥方式等因素由臨床醫(yī)生決定。本發(fā)明的目的是提供一種傳統(tǒng)中藥沙苑子提取物沙苑子總黃酮用于預(yù)防和治療肺梗塞性疾病，特別是肺纖維化疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供含有本發(fā)明所述的沙苑子總黃酮提取物，及一種或多種原藥上可接受的載體和/或賦形劑的藥物。本發(fā)明的藥物除含有本發(fā)明制備的沙苑子總黃酮提取物外，還含有一種或多種具有相同或相似作用的其他天然或化學(xué)合成的活性成分。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1、本發(fā)明首次將傳統(tǒng)中藥沙苑子的有效部位——沙苑子總黃酮提取物應(yīng)用于經(jīng)典而被廣泛應(yīng)用的肺纖維化動(dòng)物模型，進(jìn)行防治肺纖維化的實(shí)驗(yàn)研究。2、本發(fā)明發(fā)現(xiàn)沙苑子總黃酮提取物可明顯地降低博萊霉素所致肺纖維化小鼠的肺系數(shù)、肺泡炎程度和肺纖維化程度，提示具有一定的抗肺纖維化作用。3、本發(fā)明發(fā)現(xiàn)沙苑子總黃酮提取物抗博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化作用機(jī)制與其抗炎、抗氧化、抑制自由基生成及增強(qiáng)自由基清除、減少細(xì)胞間質(zhì)膠原生成及成纖維細(xì)胞增生有關(guān)。4、沙苑子藥材豐富，價(jià)格低廉，沙苑子總黃酮提取工藝成熟，療效確切，服用方便，可長(zhǎng)期服用。本發(fā)明基于中藥沙苑子提取物沙苑子黃酮組成的藥物，成分單一，療效確切，使用方便，可廣泛應(yīng)用于制備防治肺纖維化及相關(guān)疾病的藥物中。以下實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例證明，而不是限制本發(fā)明。在不違背本發(fā)明的精神和原創(chuàng)前提下，對(duì)發(fā)明個(gè)別技術(shù)步驟進(jìn)行的任何改動(dòng)都將落入本發(fā)明待批權(quán)利要求范圍內(nèi)。下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述圖1為沙苑子總黃酮提取物治療28天對(duì)小鼠肺組織病理形態(tài)變化的影響(HE染色)。其中圖l-A為正常組肺組織結(jié)構(gòu)完整清晰，肺泡壁未見(jiàn)增厚，肺泡腔透亮，腔內(nèi)未見(jiàn)明顯滲出，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)成纖維細(xì)胞增生。圖l-B為模型組肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔增寬，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及成纖維細(xì)胞增生，肺纖維化形成。圖l-C為陽(yáng)性對(duì)照藥潑尼松組肺泡間隔較寬，肺泡腔變窄，較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及成纖維細(xì)胞增生，病變程度較模型組有所減輕。圖l-D為沙苑子總黃酮提取物300mg/kg:沙苑子總黃酮提取物大劑量組肺組織結(jié)構(gòu)較完整清晰，肺泡壁輕度增厚，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，少量成纖維細(xì)胞增生。圖l-E為沙苑子總黃酮提取物150mg/kg:沙苑子總黃酮提取物中劑量組肺組織結(jié)構(gòu)輕度破壞，肺泡壁輕度增厚，較少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，較少成纖維細(xì)胞增生。圖l-F為沙苑子總黃酮提取物75mg/kg:沙苑子總黃酮提取物小劑量組肺泡結(jié)構(gòu)清晰，較多成纖維細(xì)胞增生，有少數(shù)纖維化病灶，病灶處炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。具體實(shí)施方式實(shí)施例11.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察沙苑子總黃酮提取物對(duì)BLM誘發(fā)肺纖維化小鼠血清S0D、MDA的影響1.2實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠60只，雌雄兼有，體重18-22克，清潔級(jí)，由蘇州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(蘇)2007-0007，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(蘇)2007-0035。實(shí)驗(yàn)藥物沙苑子總黃酮提取物(總黃酮含量^50%)，批號(hào)070623，棕黃色、粉末狀固體，蒸餾水溶解，4t:冰箱保存?zhèn)溆?，由本所植化室提供；博萊霉素A5(BLMA5)，白色凍干粉末，15mg/支，由日本化藥株式會(huì)社生產(chǎn)，產(chǎn)品批號(hào)640110，藥品進(jìn)口注冊(cè)證號(hào)H20040205;注射用青霉素鈉，華北制藥股份有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H13020657;4%水合氯醛；醋酸潑尼松片，5mg/片，江蘇徐州平光制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)32022681。試劑與儀器超氧化物歧化酶(SOD)與丙二醛(MDA)試劑盒(批號(hào)20090519)均購(gòu)自南京建成生物技術(shù)研究所。紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，T6新世紀(jì)型，為北京普析通用儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)，儀器編號(hào)18-1650-01-016;高速低溫冷凍離心機(jī)，5417R型，德國(guó)艾本德股份公司生產(chǎn)；電熱恒溫水浴鍋，H.H.S6型，上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司出品。1.3實(shí)驗(yàn)方法動(dòng)物分組昆明種小鼠60只，雌雄兼有，稱(chēng)重、編號(hào)、隨機(jī)分為6組，即正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照藥潑尼松組(6.67mg/kg)、沙苑子總黃酮大劑量組(300mg/kg)、中劑量組(150mg/kg)、小劑量組(75mg/kg)，每組小鼠10只。模型制備模型組與各治療組小鼠采用BLM復(fù)制動(dòng)物肺纖維化模型。具體操作步驟如下實(shí)驗(yàn)時(shí)，小鼠用4%的水合氯醛(0.01ml/g)腹腔注射麻醉，仰臥手術(shù)臺(tái)，固定頭部及四肢，常規(guī)消毒，無(wú)菌條件下行頸正中切口，鈍性分離暴露氣管，lml注射器剌入模型組、沙苑子總黃酮提取物各劑量組及醋酸潑尼松組小鼠氣管軟骨環(huán)間隙緩慢注入BLMA5(5mg/kg)，正常對(duì)照組在相同條件下注入等體積生理鹽水。注藥后立即將小鼠直立，沿身體縱軸左右旋轉(zhuǎn)3-5min，使藥液均勻分布于兩側(cè)肺內(nèi)，然后縫合皮膚、消毒，待小鼠清醒后送清潔級(jí)觀察室常規(guī)飼養(yǎng)。整個(gè)手術(shù)過(guò)程嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作原則。術(shù)前l(fā)日及術(shù)后3天，所有小鼠每天肌肉注射80萬(wàn)單位青霉素鈉(0.lml/只)。給藥方案各組動(dòng)物經(jīng)博萊霉素滴入氣管造模后，第二天開(kāi)始小鼠每隔一天稱(chēng)重一次，按照相應(yīng)的體重灌服給藥，正常組及模型組給予等體積生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組給予潑尼松，各治療組分別給予不同劑量的沙苑子總黃酮提取物。連續(xù)給藥28天。血清的制備各組小鼠眼眶靜脈取全血后3500r/min離心10min，小心取上清置于1.5ml離心管內(nèi)，轉(zhuǎn)移后的上清再次3500r/min離心10min。制備好的血清液-8(TC冰箱保存，以測(cè)定血清中SOD活性和MDA含量等生化指標(biāo)。1.4統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)以；±s表示，采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件，各組數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)，比較組間差異，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。1.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果與正常組相比，肺纖維化模型組小鼠血清SOD活性及MDA含量均顯著降低(P<0.001)。給藥28天后，沙苑子總黃酮提取物各劑量組小鼠血清SOD活性高于模型組小鼠(P<0.05)。沙苑子總黃酮提取物各劑量組小鼠血清MDA含量低于或顯著低于模型組(P<0.05，P<0.001)。陽(yáng)性對(duì)照藥潑尼松組小鼠血清SOD活性高于模型組(P<0.05)，MDA含量顯著低于模型組(P<0.OOl)，見(jiàn)表l。表1沙苑子總黃酮提取物對(duì)肺纖維化小鼠血清中SOD活性和MDA含量的影響(;±s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注##P<0.01，###P<0.001vscontrol;*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vsmodel.1.6結(jié)論造模后28天，模型組小鼠血清SOD活性顯著降低，氧化代謝產(chǎn)物MDA含量顯著增加；連續(xù)給藥28天后，沙苑子總黃酮提取物各劑量組肺纖維化小鼠血清中SOD活性增強(qiáng)，MDA的含量顯著降低或降低。醋酸潑尼松可增強(qiáng)肺纖維化小鼠血清SOD的活性，并可顯著降低MDA的含量。提示沙苑子總黃酮提取物可增強(qiáng)肺纖維化小鼠血清SOD活性，從而增強(qiáng)清除氧自由基，減少血清MDA含量，表明沙苑子總黃酮提取物可降低體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度。實(shí)施例22.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察沙苑子總黃酮提取物對(duì)BLM誘發(fā)肺纖維化小鼠血清血清抑制羥自由基(OH)產(chǎn)生的能力的影響2.2實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠60只，雌雄兼有，體重18-22克，清潔級(jí)，由蘇州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(蘇)2007-0007，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(蘇)2007-0035。實(shí)驗(yàn)藥物沙苑子總黃酮提取物(總黃酮含量》50%)，批號(hào)070623，棕黃色、粉末狀固體，蒸餾水溶解，4t:冰箱保存?zhèn)溆?，由我所植化室提供；博萊霉素A5(BLMA5)，白色凍干粉末，15mg/支，由日本化藥株式會(huì)社生產(chǎn)，產(chǎn)品批號(hào)640110，藥品進(jìn)口注冊(cè)證號(hào)H20040205;注射用青霉素鈉，華北制藥股份有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H13020657;4%水合氯醛；醋酸潑尼松片，5mg/片，江蘇徐州平光制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)32022681。試劑與儀器羥自由基(0H)試劑盒(批號(hào)20090519)購(gòu)買(mǎi)于南京建成生物技術(shù)研究所。紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，T6新世紀(jì)型，為北京普析通用儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)，儀器編號(hào)18-1650-01-016;高速低溫冷凍離心機(jī)，5417R型，德國(guó)艾本德股份公司生產(chǎn)；電熱恒溫水浴鍋，H.H.S6型，上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司出品。2.3實(shí)驗(yàn)方法動(dòng)物分組昆明種小鼠60只，雌雄兼有，稱(chēng)重、編號(hào)、隨機(jī)分為6組，即正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照藥潑尼松組(6.67mg/kg)、沙苑子總黃酮大劑量組(300mg/kg)、中劑量組(150mg/kg)、小劑量組(75mg/kg)，每組小鼠10只。模型制備模型組與各治療組小鼠采用BLM復(fù)制動(dòng)物肺纖維化模型。具體操作步驟如下實(shí)驗(yàn)時(shí)，小鼠用4%的水合氯醛(0.01ml/g)腹腔注射麻醉，仰臥手術(shù)臺(tái)，固定頭部及四肢，常規(guī)消毒，無(wú)菌條件下行頸正中切口，鈍性分離暴露氣管，lml注射器剌入模型組、沙苑子總黃酮提取物各治療組及醋酸潑尼松組小鼠氣管軟骨環(huán)間隙緩慢注入BLMA5(5mg/kg)，正常對(duì)照組在相同條件下注入等體積生理鹽水。注藥后立即將小鼠直立，沿身體縱軸左右旋轉(zhuǎn)3-5min，使藥液均勻分布于兩側(cè)肺內(nèi)，然后縫合皮膚、消毒，待小鼠清醒后送清潔級(jí)觀察室常規(guī)飼養(yǎng)。整個(gè)手術(shù)過(guò)程嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作原則。術(shù)前l(fā)日及術(shù)后3天所有小鼠每天肌肉注射80萬(wàn)單位青霉素鈉(0.lml/只)。給藥方案各組動(dòng)物經(jīng)博萊霉素造模后，第二天開(kāi)始小鼠每隔一天稱(chēng)重一次，按照相應(yīng)的體重灌胃給藥，正常組及模型組給予等體積生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組給予潑尼松，各治療組分別給予不同劑量的沙苑子總黃酮提取物。連續(xù)給藥28天。血清的制備各組小鼠眼眶靜脈取全血后3500r/min離心10min，小心取上清置于1.5ml離心管內(nèi)，轉(zhuǎn)移后的上清再次3500r/min離心10min。制備好的血清液-80。C冰箱保存，以測(cè)定血清抑制羥自由基(*0H)產(chǎn)生的能力。2.4統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)以；士s表示，采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件，各組數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)，比較組間差異，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.5試驗(yàn)結(jié)果造模后28天，與正常組小鼠相比，模型組小鼠血清抑制羥自由基產(chǎn)生能力顯著降低(P<0.001);給藥28天，與模型組小鼠相比，沙苑子總黃酮提取物各劑量組小鼠血清抑制羥自由基產(chǎn)生的能力明顯增強(qiáng)(P<0.01);陽(yáng)性對(duì)照藥潑尼松組小鼠血清抑制羥自由基產(chǎn)生能力顯著增強(qiáng)(P<0.001)，見(jiàn)表2。表2沙苑子總黃酮提取物對(duì)肺纖維化小鼠血清抑制羥自由基產(chǎn)生能力的影響(;±s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注##P<0.01，###P<0.001vscontrol;*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vsmodel.2.6結(jié)論造模28天，模型組小鼠血清抑制羥自由基產(chǎn)生的能力明顯降低；給藥28天，沙苑子總黃酮提取物各劑量組肺纖維化小鼠血清抑制羥自由基產(chǎn)生的能力明顯增強(qiáng)。陽(yáng)性對(duì)照藥潑尼松亦可顯著增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)小鼠血清抑制羥自由基能力。提示沙苑子總黃酮提取物通過(guò)增強(qiáng)血清抑制羥自由基產(chǎn)生的能力而具有抗氧化作用；實(shí)施例33.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察沙苑子總黃酮提取物對(duì)BLM誘發(fā)肺纖維化小鼠肺組織T_A0C、MDA含量的影響3.2實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠60只，雌雄兼有，體重18-22克，清潔級(jí)，由蘇州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(蘇)2007-0007，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(蘇)2007-0035。實(shí)驗(yàn)藥物沙苑子總黃酮提取物(總黃酮含量》50%)，批號(hào)070623，棕黃色、粉末狀固體，蒸餾水溶解，4t:冰箱保存?zhèn)溆?，由本所植化室提供；博萊霉素A5(BLMA5)，白色凍干粉末，15mg/支，由日本化藥株式會(huì)社生產(chǎn)，產(chǎn)品批號(hào)640110，藥品進(jìn)口注冊(cè)證號(hào)H20040205;注射用青霉素鈉，華北制藥股份有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H13020657;4%水合氯醛；醋酸潑尼松片，5mg/片，江蘇徐州平光制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)32022681。試劑與儀器總抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)試劑盒(批號(hào)20090519)購(gòu)自南京建成生物技術(shù)研究所。紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，T6新世紀(jì)型，為北京普析通用儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)，儀器編號(hào)18-1650-01-016;高速低溫冷凍離心機(jī)，5417R型，德國(guó)艾本德股份公司生產(chǎn)；電熱恒溫水浴鍋，H.H.S6型，上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司出品。3.3實(shí)驗(yàn)方法動(dòng)物分組昆明種小鼠60只，雌雄兼有，稱(chēng)重、編號(hào)、隨機(jī)分為6組，即正常組、模型組、潑尼松組(6.67mg/kg)、大劑量組(300mg/kg)、中劑量組(150mg/kg)、小劑量組(75mg/kg)，每組小鼠10只。模型制備模型組與各治療組小鼠采用BLM復(fù)制動(dòng)物肺纖維化模型。具體操作步驟如下實(shí)驗(yàn)時(shí)，小鼠用4%的水合氯醛(0.01ml/g)腹腔注射麻醉，仰臥手術(shù)臺(tái)，固定頭部及四肢，常規(guī)消毒，無(wú)菌條件下行頸正中切口，鈍性分離暴露氣管，lml注射器剌入模型組、沙苑子總黃酮提取物各治療組及醋酸潑尼松組小鼠氣管軟骨環(huán)間隙緩慢注入BLMA5(5mg/kg)，正常對(duì)照組在相同條件下注入等體積生理鹽水。注藥后立即將小鼠直立，沿身體縱軸左右旋轉(zhuǎn)3-5min，使藥液均勻分布于兩側(cè)肺內(nèi)，然后縫合皮膚、消毒，待小鼠清醒后送清潔級(jí)觀察室常規(guī)飼養(yǎng)。整個(gè)手術(shù)過(guò)程嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作原則。術(shù)前l(fā)日及術(shù)后3天所有小鼠連續(xù)肌肉注射80萬(wàn)單位青霉素鈉(0.lml/只)。給藥方案各組動(dòng)物經(jīng)博萊霉素造模后，第二天開(kāi)始小鼠每隔一天稱(chēng)重一次，按照相應(yīng)的體重灌胃給藥，正常組及模型組給予等體積生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照藥給予潑尼松，各治療組分別給予不同劑量的沙苑子總黃酮提取物。連續(xù)給藥28天。肺組織勻漿制備稱(chēng)取適量肺組織，加入體積為所稱(chēng)取肺組織重量9倍的冰冷生理鹽水，利用內(nèi)切式組織勻漿器制成10%的組織勻漿，然后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定肺纖維化小鼠肺組織中總抗氧化能力(T-AOC)及丙二醛(MDA)的含量。3.4統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)以；±s表示，采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件，各組數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)，比較組間差異，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.5試驗(yàn)結(jié)果造模28天，與正常對(duì)照組小鼠相比，肺纖維化模型組小鼠肺組織總抗氧化能力(T-A0C)顯著降低(P<0.001)，肺組織中丙二醛(MDA)含量下降(P<0.05)。給藥28天，與模型組小鼠相比，沙苑子黃酮各劑量組小鼠肺組織總抗氧化能力(T-AOC)增強(qiáng)、明顯增強(qiáng)、顯著增強(qiáng)(P<0.05，0.01，P<0.OOl)，小鼠肺組織中丙二醛(MDA)含量均顯著下降(P<0.001)。陽(yáng)性對(duì)照藥潑尼松組小鼠肺組織總抗氧化能力(T-AOC)增強(qiáng)(P<0.05)，丙二醛(MDA)含量顯著減少(P<0.001)，見(jiàn)表3。表3沙苑子總黃酮提取物對(duì)肺纖維化小鼠肺組織中T-A0C、MDA濃度的影響(；±s，n=10)組別劑s(rag/kg)T-AOC(U/mgprot))MDA(nmolAigprot)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注##P<0.01，###P<0.001vscontrol;*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vsmodel.3.6結(jié)論造模28天，模型組小鼠肺組織總抗氧化能力(T-AOC)顯著降低，氧化代謝產(chǎn)物丙二醛(MDA)增加。給藥28天，沙苑子總黃酮提取物可明顯增強(qiáng)小鼠肺組織總抗氧化能力(T-AOC)，顯著減少丙二醛(MDA)含量。陽(yáng)性對(duì)照藥醋酸潑尼松亦可增強(qiáng)總抗氧化能力(T-AOC)，并可顯著減少丙二醛(MDA)含量。提示沙苑子總黃酮提取物具有增強(qiáng)肺組織的總抗氧化能力和抗體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的作用。實(shí)施例44.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察沙苑子總黃酮提取物對(duì)BLM誘發(fā)肺纖維化小鼠肺組織中總一氧化氮合酶(T-N0S)活性和抑制羥自由基(OH)產(chǎn)生能力的影響4.2實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠60只，雌雄兼有，體重18-22克，清潔級(jí)，由蘇州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(蘇)2007-0007，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(蘇)2007-0035。實(shí)驗(yàn)藥物沙苑子總黃酮提取物(總黃酮含量》50%)，批號(hào)070623，棕黃色、粉末狀固體，蒸餾水溶解，4t:冰箱保存?zhèn)溆?，由本所植化室提供；博萊霉素A5(BLMA5)，白色凍干粉末，15mg/支，由日本化藥株式會(huì)社生產(chǎn)，產(chǎn)品批號(hào)640110，藥品進(jìn)口注冊(cè)證號(hào)H20040205;注射用青霉素鈉，華北制藥股份有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H13020657;4%水合氯醛；醋酸潑尼松片，5mg/片，江蘇徐州平光制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)32022681。試劑與儀器總一氧化氮合酶(T-NOS)和羥自由基(*0H)試劑盒(批號(hào)20090519)購(gòu)買(mǎi)于南京建成生物技術(shù)研究所。紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，T6新世紀(jì)型，為北京普析通用儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)，儀器編號(hào)18-1650-01-016;高速低溫冷凍離心機(jī)，5417R型，德國(guó)艾本德股份公司生產(chǎn)；電熱恒溫水浴鍋，H.H.S6型，上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司出品。4.3實(shí)驗(yàn)方法動(dòng)物分組昆明種小鼠60只，雌雄兼有，稱(chēng)重、編號(hào)、隨機(jī)分為6組，即正常組、模型組、潑尼松組(6.67mg/kg)、大劑量組(300mg/kg)、中劑量組(150mg/kg)、小劑量組(75mg/kg)，每組小鼠10只。模型制備模型組與各治療組小鼠采用BLM復(fù)制動(dòng)物肺纖維化模型。具體操作步驟如下實(shí)驗(yàn)時(shí)，小鼠用4%的水合氯醛(0.01ml/g)腹腔注射麻醉，仰臥手術(shù)臺(tái)，固定頭部及四肢，常規(guī)消毒，無(wú)菌條件下行頸正中切口，鈍性分離暴露氣管，lml注射器剌入模型組、沙苑子總黃酮提取物各治療組及醋酸潑尼松組小鼠氣管軟骨環(huán)間隙緩慢注入BLMA5(5mg/kg)，正常對(duì)照組在相同條件下注入等體積生理鹽水。注藥后立即將小鼠直立，沿身體縱軸左右旋轉(zhuǎn)3-5min，使藥液均勻分布于兩側(cè)肺內(nèi)，然后縫合皮膚、消毒，待小鼠清醒后送清潔級(jí)觀察室常規(guī)飼養(yǎng)。整個(gè)手術(shù)過(guò)程嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作原則。術(shù)前l(fā)日及術(shù)后3天小鼠每天肌肉注射80萬(wàn)單位青霉素鈉(0.lml/只)。給藥方案各組動(dòng)物經(jīng)博萊霉素造模后，第二天開(kāi)始小鼠每隔一天稱(chēng)重一次，按照相應(yīng)的體重灌胃給藥，正常組及模型組給予等體積生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組給予潑尼松，各治療組分別給予不同劑量的沙苑子總黃酮提取物。連續(xù)給藥28天。肺組織勻漿制備稱(chēng)取適量肺組織，加入體積為所稱(chēng)取肺組織重量9倍的冰冷生理鹽水，利用內(nèi)切式組織勻漿器制成10%的組織勻漿，然后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定肺組織總一氧化氮合酶(T-NOS)活性和抑制羥自由基(OH)產(chǎn)生的能力。4.4統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)以；±s表示，采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件，各組數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)，比較組間差異，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果造模28天，與正常對(duì)照組小鼠相比，肺纖維化模型組小鼠肺組織中總一氧化氮合酶(T-NOS)的活性明顯增強(qiáng)(P<0.01)，而抑制羥自由基(OH)產(chǎn)生的能力明顯降低(P<0.01);與模型組小鼠相比，沙苑子總黃酮提取物各劑量組小鼠肺組織中總一氧化氮合酶(T-NOS)活性明顯增強(qiáng)或顯著增強(qiáng)(P<0.Ol，P<0.001)，而沙苑子總黃酮提取物各劑量組小鼠肺組織抑制羥自由基產(chǎn)生的能力增強(qiáng)或明顯增強(qiáng)(P<0.05，P<0.01);陽(yáng)性對(duì)照藥潑尼松組小鼠肺組織中總一氧化氮合酶(T-NOS)活性顯著增強(qiáng)(P<0.001)，抑制羥自由基產(chǎn)生的能力增強(qiáng)(P<0.05)，見(jiàn)表4。表4沙苑子總黃酮提取物對(duì)肺纖維化小鼠肺組織中T-NOS活性和抑制羥自由基產(chǎn)生能力的影響(；±s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注##P<0.01，###P<0.001vscontrol;*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vsmodel.4.6結(jié)論造模28天，模型組小鼠肺組織中總一氧化氮合酶(T-NOS)活性明顯增強(qiáng)，肺組織抑制羥自由基(OH)產(chǎn)生能力下降。連續(xù)給藥28天后，沙苑子總黃酮提取物各劑量組可顯著減弱肺纖維化小鼠肺組織中的一氧化氮合酶(T-NOS)的活性，增強(qiáng)肺組織抑制羥自由基(*0H)產(chǎn)生的能力。陽(yáng)性對(duì)照藥潑尼松亦可顯著降低肺組織一氧化氮合酶活性，同時(shí)增強(qiáng)肺組織抑制羥自由基(*0H)產(chǎn)生的能力。以上結(jié)果提示沙苑子總黃酮提取物通過(guò)減弱一氧化氮合酶活性而減少一氧化氮的產(chǎn)生；并通過(guò)增強(qiáng)肺組織抑制羥自由基(*0H)產(chǎn)生的能力而減少體內(nèi)羥自由基的生成，從而減少對(duì)肺組織的損傷。實(shí)施例55.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察沙苑子總黃酮提取物對(duì)BLM誘發(fā)肺纖維化小鼠肺組織中羥脯氨酸(HYP)和肺系數(shù)的影響5.2實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠60只，雌雄兼有，體重18-22克，清潔級(jí)，由蘇州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(蘇)2007-0007，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(蘇)2007-0035。實(shí)驗(yàn)藥物沙苑子總黃酮提取物(總黃酮含量^50%)，批號(hào)070623，棕黃色、粉末狀固體，蒸餾水溶解，4t:冰箱保存?zhèn)溆?，由本所植化室提供；博萊霉素A5(BLMA5)，白色凍干粉末，15mg/支，由日本化藥株式會(huì)社生產(chǎn)，產(chǎn)品批號(hào)640110，藥品進(jìn)口注冊(cè)證號(hào)H20040205;注射用青霉素鈉，華北制藥股份有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H13020657;4%水合氯醛；醋酸潑尼松片，5mg/片，江蘇徐州平光制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)32022681。試劑與儀器羥脯氨酸(HYP)試劑盒(批號(hào)20090519)購(gòu)買(mǎi)于南京建成生物技術(shù)研究所。紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，T6新世紀(jì)型，為北京普析通用儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)，儀器編號(hào)18-1650-01-016;高速低溫冷凍離心機(jī)，5417R型，德國(guó)艾本德股份公司生產(chǎn)；電熱恒溫水浴鍋，H.H.S6型，上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司出品。5.3實(shí)驗(yàn)方法動(dòng)物分組昆明種小鼠60只，雌雄兼有，稱(chēng)重、編號(hào)、隨機(jī)分為6組，即正常組、模型組、潑尼松組(6.67mg/kg)、大劑量組(300mg/kg)、中劑量組(150mg/kg)、小劑量組(75mg/kg)，每組小鼠10只。模型制備模型組與各治療組小鼠采用BLM復(fù)制動(dòng)物肺纖維化模型。具體操作步驟如下實(shí)驗(yàn)時(shí)，小鼠用4%的水合氯醛(0.01ml/g)腹腔注射麻醉，仰臥手術(shù)臺(tái)，固定頭部及四肢，常規(guī)消毒，無(wú)菌條件下行頸正中切口，鈍性分離暴露氣管，lml注射器剌入模型組、沙苑子總黃酮提取物各治療組及醋酸潑尼松組小鼠氣管軟骨環(huán)間隙緩慢注入BLMA5(5mg/kg)，正常對(duì)照組在相同條件下注入等體積生理鹽水。注藥后立即將小鼠直立，沿身體縱軸左右旋轉(zhuǎn)3-5min，使藥液均勻分布于兩側(cè)肺內(nèi)，然后縫合皮膚、消毒，待小鼠清醒后送清潔級(jí)觀察室常規(guī)飼養(yǎng)。整個(gè)手術(shù)過(guò)程嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作原則。術(shù)前l(fā)日及術(shù)后3天所有小鼠連續(xù)肌肉注射80萬(wàn)單位青霉素鈉(0.lml/只)。給藥方案各組動(dòng)物經(jīng)博萊霉素造模后，第二天開(kāi)始小鼠每隔一天稱(chēng)重一次，按照相應(yīng)的體重灌胃給藥，正常組及模型組給予等體積生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組給予潑尼松，各治療組分別給予不同劑量的沙苑子總黃酮提取物。連續(xù)給藥28天。羥脯氨酸測(cè)定動(dòng)物處死當(dāng)日，取右肺中葉約30克置于帶刻度的10ml玻璃離心管中，-20°。冰箱保存，以備測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組小鼠肺組織中羥脯氨酸的含量；測(cè)定方法具體如下將0.5ml水解液準(zhǔn)確加入冷凍保存小塊肺組織的刻度玻璃試管內(nèi)，混勻，加蓋后沸水浴水解20min，其中10min混勻一次。之后將試管液體pH值調(diào)至6.5左右，加適量活性炭，混勻，轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，3500r/min離心10min，取上清0.5ml，依次加入三種反應(yīng)試劑，混勻，6(TC水浴15min，冷卻后3500r/min離心10min，取上清于550nm，lcm光鏡下測(cè)定各管的吸光度，按說(shuō)明書(shū)公式計(jì)算肺組織中HYP含量。肺系數(shù)測(cè)定各組小鼠在處理當(dāng)日，各組小鼠處理前12小時(shí)禁食，不禁水，處理當(dāng)日小鼠稱(chēng)體重，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的平均體重作為觀察指標(biāo)。各組經(jīng)頸椎脫臼法處死，在無(wú)菌條件下分離出氣管和兩側(cè)肺臟，稱(chēng)重。按以下公式計(jì)算肺系數(shù)，肺系數(shù)=肺濕重(mg)/體重(g)，肺系數(shù)是反映小鼠炎癥和纖維化程度的一個(gè)重要指標(biāo)。5.4統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)以；±s表示，采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件，各組數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)，比較組間差異，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果造模后給藥28天，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠體重顯著減輕，肺組織中HYP含量顯著增加(P<0.001)，肺系數(shù)顯著高于正常組(P<0.001);沙苑子總黃酮提取物各劑量組小鼠體重顯著增加，小鼠肺組織中HYP的含量明顯低于模型組(P<0.001)，肺系數(shù)均低于、明顯低于或顯著低于模型組(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。陽(yáng)性對(duì)照藥潑尼松組小鼠肺組織中羥脯氨酸含量與模型組相比顯著降低(P<0.001)，肺系數(shù)亦有所下降，(P>0.05)，見(jiàn)表5。表5沙苑子總黃酮提取物對(duì)肺纖維化小鼠肺組織中羥脯氨酸(HYP)和肺系數(shù)的影響(；±s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注##P<0.01，###P<0.001vscontrol;*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vsmodel.5.6結(jié)論造模28天后，模型組小鼠體重顯著減輕，肺組織中羥脯氨酸含量顯著升高，肺系數(shù)顯著增加。給藥28天，沙苑子總黃酮提取物可增加或顯著增加纖維化小鼠體重，可顯著降低小鼠肺組織中羥脯氨酸含量，明顯降低肺系數(shù)。陽(yáng)性對(duì)照藥醋酸潑尼松亦可減少肺纖維化小鼠肺組織羥脯氨酸含量，降低肺系數(shù)。提示沙苑子總黃酮提取物可通過(guò)降低肺組織中羥脯氨酸的含量而減少肺泡間質(zhì)膠原的生成，并可降低肺系數(shù)，從而發(fā)揮抗纖維化作用。實(shí)施例66.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察沙苑子總黃酮提取物對(duì)BLM誘發(fā)肺纖維化小鼠肺組織病理形態(tài)的影響6.2實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠60只，雌雄兼有，體重18-22克，清潔級(jí)，由蘇州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(蘇)2007-0007，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(蘇)2007-0035。實(shí)驗(yàn)藥物沙苑子總黃酮提取物(總黃酮含量^50%)，批號(hào)070623，棕黃色、粉末狀固體，蒸餾水溶解，4t:冰箱保存?zhèn)溆茫杀舅不姨峁?；博萊霉素A5(BLMA5)，白色凍干粉末，15mg/支，由日本化藥株式會(huì)社生產(chǎn)，產(chǎn)品批號(hào)640110，藥品進(jìn)口注冊(cè)證號(hào)H20040205;注射用青霉素鈉，華北制藥股份有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H13020657;4%水合氯醛；醋酸潑尼松片，5mg/片，江蘇徐州平光制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)32022681。實(shí)驗(yàn)儀器光學(xué)顯微鏡，OLYMPUSCX31。6.3實(shí)驗(yàn)方法動(dòng)物分組昆明種小鼠60只，雌雄兼有，稱(chēng)重、編號(hào)、隨機(jī)分為6組，即正常組、模型組、潑尼松組(6.67mg/kg)、大劑量組(300mg/kg)、中劑量組(150mg/kg)、小劑量組(75mg/kg)，每組小鼠10只。模型準(zhǔn)備模型組和各給藥組采用博萊霉素復(fù)制動(dòng)物肺纖維化模型，具體方法實(shí)驗(yàn)小鼠用4%的水合氯醛(0.01ml/g)腹腔注射麻醉。取仰臥固定位，常規(guī)消毒，行頸正中切口，鈍性分離暴露氣管，模型組，醋酸潑尼松組、治療組于氣管軟骨環(huán)間隙穿剌緩慢注入BLMA5(5mg/kg)，正常對(duì)照組注入等體積生理鹽水，注藥后立即將小鼠直立旋轉(zhuǎn)3-5min，使藥液均勻分布于兩側(cè)肺內(nèi)，然后縫合皮膚，并在縫合處消毒，待清醒后送清潔級(jí)觀察室飼養(yǎng)。給藥方案造模第二天開(kāi)始給藥，給藥組按上述劑量給藥，每天一次，正常組和模型組按同樣的方法給予同等體積的蒸餾水，連續(xù)給藥28天。肺組織病理切片染色取右肺，按常規(guī)病理學(xué)方法進(jìn)行固定、包埋、切片。將病理切片進(jìn)行HE染色，然后參照Szaopiel等方法略加改良將肺泡炎和肺纖維化的程度分為四級(jí)0級(jí)，無(wú)病理明顯改變，肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡透亮，肺泡間隔正常；極少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，極少量成纖維細(xì)胞生成；無(wú)膠原纖維生成；1級(jí)，輕度病理改變，肺泡結(jié)構(gòu)略有紊亂，肺泡間隔因炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和成纖維細(xì)胞增生而增寬；較少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，較少量成纖維細(xì)胞增生；較少量膠原纖維生成，病變范圍小于全肺的20%;2級(jí)，中度病理改變，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡間隔明顯增寬；少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，少量成纖維細(xì)胞增生，少量膠原纖維生成，病變范圍占全肺的20%50%;3級(jí)，重度病理改變，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡融合，肺泡間隔顯著增寬；大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，大量成纖維細(xì)胞增生，大量膠原纖維沉積，可見(jiàn)明顯的肺纖維化病灶，病變范圍占全肺的50%以上。6.4統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)以；±s表示，采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件，各組數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)，比較組間差異，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。6.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果造模28天后，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠肺組織中肺泡炎程度和肺纖維化程度顯著加重(P<0.001)，呈肺纖維化實(shí)質(zhì)病變；與模型組相比，沙苑子總黃酮提取物各劑量組小鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)，肺泡間隔炎細(xì)胞浸潤(rùn)，膠原沉積及成纖維細(xì)胞增生，均有不同程度的改善。肺泡炎和肺纖維化程度均減輕或明顯減輕(P<0.05，P<0.01);陽(yáng)性對(duì)照藥潑尼松組小鼠肺組織肺泡炎及肺纖維化程度均較模型組小鼠呈減輕趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表6、圖1。表6肺泡炎和肺纖維化程度評(píng)分結(jié)果G±s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>人劑,纖i.加()0.83±0.4f0.83±().72"中劑量組1500.70±0.48":s0.73±0.79"'小劑量組750.70±0.48"0.83±0.72"注##P<0.01與假手術(shù)組比較；*P<0.05，**P<0.01與模型組比較6.6結(jié)論造模28天，模型組小鼠肺組織肺泡炎和肺纖維化程度顯著加重，呈典型的肺纖維化實(shí)質(zhì)病變。給藥28天，沙苑子總黃酮提取物各劑量組小鼠肺系數(shù)明顯降低，肺組織肺泡炎及肺纖維化程度明顯減輕。提示在本實(shí)驗(yàn)條件下，成功復(fù)制了小鼠肺纖維化模型。沙苑子總黃酮提取物可明顯降低肺纖維化小鼠的肺泡炎和肺纖維化程度，具有防治肺纖維化疾病的作用。綜上所述，沙苑子總黃酮提取物具有預(yù)防和治療抗肺纖維化作用，其機(jī)制可能與其具有抗炎作用、抗氧化作用和抑制膠原生成作用及成纖維細(xì)胞增生有關(guān)。LU'"」假手術(shù)組(lOml/kg)模型組(lOml/kg)權(quán)利要求沙苑子總黃酮提取物在制備防治肺纖維化藥物中的應(yīng)用。2.權(quán)利要求1所述沙苑子總黃酮提取物在制備防治肺纖維化藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述沙苑子總黃酮提取物中總黃酮的含量為^50%。3.權(quán)利要求1所述制備預(yù)防或治療肺纖維化藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物為含有治療有效劑量的沙苑子總黃酮提取物可與藥學(xué)上可接受的載體結(jié)合制備藥物。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種沙苑子總黃酮提取物在制備防治肺纖維化藥物中的應(yīng)用，通過(guò)氣管內(nèi)滴注博萊霉素(BLM)復(fù)制小鼠肺纖維化模型。首次使用沙苑子總黃酮提取物作為治療藥物，觀察肺纖維化動(dòng)物肺組織和血清相關(guān)生化指標(biāo)及病理學(xué)變化，闡明沙苑子總黃酮提取物對(duì)肺纖維化動(dòng)物模型的治療作用及其機(jī)制，從而為沙苑子總黃酮提取物用于治療肺纖維化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。所述的藥物為含有治療有效量的沙苑子總黃酮提取物可與藥學(xué)上可接受的載體結(jié)合制備藥物。文檔編號(hào)A61K131/00GK101744868SQ200910186880公開(kāi)日2010年6月23日申請(qǐng)日期2009年12月28日優(yōu)先權(quán)日2009年12月28日發(fā)明者周忠繼,蔣小崗,賀海彪,郭次儀,顧振綸申請(qǐng)人:蘇州中藥研究所