專利名稱：SIRT1在制備下調(diào)細胞周期蛋白如cyclin D1表達的藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及SIRTl在制備調(diào)控細胞周期蛋白表達的藥物中的用途，特別地，本 發(fā)明涉及SIRTl在制備下調(diào)cyclin DU cyclin E或CDK2表達的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
新生內(nèi)膜形成與血管重塑密切相關(guān)，主要包括血管平滑肌細胞的增殖、遷移、 凋亡以及基質(zhì)成分合成、降解及重新排列等過程。過度的血管平滑肌細胞增殖是動脈粥 樣硬化、肺動脈高壓、系統(tǒng)性高血壓、腹主動脈瘤及經(jīng)皮腔內(nèi)血管成形術(shù)后再狹窄等心 血管疾病的重要病理基礎(chǔ)。細胞增殖正常與否與細胞周期密切相關(guān)。細胞周期分為Gl期(DNA合成準(zhǔn)備 期)、S期(DNA合成期)、G2期(有絲分裂準(zhǔn)備期)和M期(有絲分裂期)。在哺乳動 物的整個細胞周期調(diào)控中，Gl —S期的調(diào)控是至關(guān)重要的核心過程，它決定細胞對外界 增殖信號如各種生長因子等的加工、反應(yīng)，決定細胞是進入有絲分裂，還是發(fā)生凋亡抑 或進入靜止期GO期，修復(fù)損傷DNA (Hunter and Pines. 1994)。細胞增殖主要通過以下三 種蛋白進行調(diào)控周期蛋白依賴性蛋白激酶(Cyclin-dependentkinase，CDK)，周期蛋白 (Cyclin)，周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制因子(Cyclin-dependent kinase inhibitor, CKI)。 細胞周期的Gl到S期轉(zhuǎn)換受到多種Cyclin-CDK復(fù)合物的正性調(diào)控，同時受到CKI兩 個亞家族INK4和Cip/Kip的負性調(diào)控。在周期蛋白中cyclin Dl在細胞周期中最早被合 成，于Gl中期到達高峰，并與CDK4/CDK6形成復(fù)合物，對決定G1/S期轉(zhuǎn)換的限制點 進行調(diào)控。其中cyclin D1/CDK4和cyclin E/CDK2兩個復(fù)合物是極其重要的G1/S轉(zhuǎn)換 禾口 DNA 合成的決定因素(Baldin，Lukas et al. 1993 ； Quelle, Ashmun et al. 1993 ； Tsai, Lees et al.1993 ； Ohtsubo, Theodoras et al.1995)。有活性的 cyclin D-CDK4/CDK6 復(fù)合 物可以磷酸化視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白(retinoblastoma，Rb)，從而釋放E2F，促進細胞周期 進行。CydinE/CDK2復(fù)合物在Gl期中、晚期合成增加，加速細胞進入S期，并促使 DNA合成。在許多細胞體系里，生長因子刺激后cyclin Dl比cyclin E更早被誘導(dǎo)表達升 高。因此，cyclin Dl相關(guān)的激酶遠比cyclin E相關(guān)的激酶更早被大量激活(Sherr.1993)。 CDK4主要與cyclin Dl形成復(fù)合物，而CDK2 (NCBI登錄號NM 001798)則結(jié)合cyclin E 和cyclinA形成復(fù)合物。另外，cyclin Dl表達也先于CDK4的激活，同時CDK4蛋白水平 也在 PDGF 刺激后顯著升高(Koyama，Nishizawa et al. 1996 ； Koyama, Raine et al. 1996 ； Rao. 1999 ； Kronemann, Nockher et al. 1999)。在上述細胞周期調(diào)控中起到重要作用的人cyclin Dl基因(NCBI登錄號 NM_053056.2)于1991年在甲狀旁腺腺瘤中被克隆發(fā)現(xiàn)，它位于11號染色體長臂1區(qū)三帶 (llql3)，包含5個外顯子。cyclin Dl最初是被作為集落刺激因子激活的早期反應(yīng)基因從 小鼠骨髓巨噬細胞中分離獲得(Matsushime，Roussel et al.1991)，目前對cyclin Dl的調(diào)控 主要見于對其轉(zhuǎn)錄水平及其蛋白通過泛素化途徑降解的研究(Diehl，Zindy et al.1997)。cyclin Dl基因啟動子區(qū)域含有多個順式反應(yīng)元件，其中包括AP_1 (activator protein-1)， NF- κ B (nuclear factor- κ B)，SPl 以及激活轉(zhuǎn)錄因子 ATF (activating transcription factor) / cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白 CREB (cAMP-responsive element-binding protein)等(Schneider, Oswald et al.2002)。cyclin Dl作為細胞周期調(diào)節(jié)因子之一，在正常人體組織中呈低水平表 達，當(dāng)cyclin Dl表達失控時，將引起細胞增殖周期失調(diào)，導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生。目前cyclin Dl已經(jīng)被確認為一個癌基因，其過度表達是多種人類原發(fā)性腫瘤(如甲狀旁腺腺瘤，乳 腺癌，結(jié)腸癌，淋巴瘤，黑素瘤以及前列腺癌等)的特征，對腫瘤的診斷及預(yù)后具有重 要意義。cyclin Dl的轉(zhuǎn)基因和缺失鼠的研究結(jié)果進一步明確了其與腫瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān) 性。cyclin Dl過表達拮抗很多因素引起的腫瘤細胞生長抑制。cyclin Dl轉(zhuǎn)基因鼠自發(fā)形 成肝癌，并且反義cyclin Dl能抑制其肝癌生長(Deane NG et al.2001 ； Uto H et al.2001)。 同時cyclin Dl轉(zhuǎn)基因鼠乳房過增生，并且易罹患乳腺癌(Wang et al.1994)。當(dāng)同時敲除 cyclin DU D2和D3后，對小鼠胚胎正常的組織發(fā)育幾乎沒有什么影響，但在缺乏cyclin D的胚胎細胞中誘導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)化，該細胞仍然正常，這說明抑制過度活躍的cyclin D可能阻 斷癌癥細胞增殖(Kozar K et al.2004)。實驗證明，瘤細胞中注射cyclin Dl抗體、反義寡 核苷酸或?qū)敕戳xcyclin Dl重組質(zhì)粒，可一定程度抑制Gl — S期過渡，改變或逆轉(zhuǎn)細胞 惡性表型(Reed JC et al.1999)。近年來研究發(fā)現(xiàn)cyclin Dl還可以調(diào)控細胞代謝，脂肪細 胞分化，并且可以作為細胞衰老的標(biāo)志。Cyclin E基因(NCBI登錄號NM_57182.1)定位于人染色體19ql2 13，由4個 外顯子和3個內(nèi)含子組成，編碼395個氨基酸，蛋白分子量為50KD。cyclin E不僅參與 細胞周期G1/S的正性調(diào)控，其過表達可以直接激活CDK2，從而造成腫瘤細胞的異常增 殖。另外也可能導(dǎo)致腫瘤細胞對內(nèi)分泌治療產(chǎn)生耐受性(Harwell RM et al.2004 ； Span PN et al.2003)。cyclin E在很多腫瘤中的表達在質(zhì)和量上都有異常。乳腺癌中cyclin E的增 加不僅與腫瘤組織分級和臨床分期有關(guān)，而且與不良預(yù)后和較高死亡率有關(guān)。目前，現(xiàn)有技術(shù)中記載人類SIRTl(SIRTuin 1，NCBI登錄號為ΝΜ_012238) 是NAD+依賴的III類組蛋白去乙?；福琒IRTl基因位于人10號染色體，編碼747個 氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，其在各物種之間呈現(xiàn)高度的保守性，在7個SIRT成員中與酵母 Sir2 (silence information regulator2)的同源性最高。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，SIRTl能夠去乙 ?；M蛋白(H3，H4)和多種轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄輔助因子，包括MyoD、p300、PGC-1 α、 PPAR γ > NF-κ B、Ku70、p53、FOXO> E2F1等，在胚胎發(fā)育、組織分化、代謝調(diào)節(jié)、 細胞凋亡、DNA損傷修復(fù)，抵抗應(yīng)激，細胞衰老以及腫瘤發(fā)展等方面發(fā)揮重要的作用。鑒于細胞周期蛋白如cyclin Dl在調(diào)控細胞增殖中具有重要的作用，而細胞的過 度增殖與眾多心血管疾病及腫瘤密切相關(guān)，因此，如果能找到能有效調(diào)控cyclin Dl及相 關(guān)細胞周期蛋白的表達，特別是下調(diào)cyclinDl及相關(guān)細胞周期蛋白表達的作用因子，那么 將對與細胞過度增殖導(dǎo)致的眾多心血管疾病及腫瘤的治療具有巨大的治療潛力。同時，如 前所述，SIRTl作為NAD+依賴的III類組蛋白去乙?；?，在很多方面發(fā)揮重要的作用。 然而，現(xiàn)有研究尚未涉及SIRTl在cyclinDl及相關(guān)細胞周期蛋白調(diào)控中的作用情況。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是探究SIRTl在cyclin Dl及相關(guān)細胞周期蛋白表達調(diào)控中的作用并探究SIRTl在心血管疾病治療中的應(yīng)用前景。因此，本發(fā)明 提供了 SIRTl在制備下調(diào)哺乳動物包括人的細胞周期蛋白表達的 藥物中的用途，特別地，所述細胞周期蛋白是cyclinDl、cyclin E或CDK2。特別地，所 述藥物是提純的蛋白質(zhì)類型的藥物，其劑型可以是適于蛋白質(zhì)藥物應(yīng)用的任何劑型，如 注射劑。特別地，所述藥物是能表達SIRTI蛋白的重組核酸構(gòu)建體，其表達載體可以是 任何適用于基因治療用的表達載體，包括常用的病毒載體或非病毒載體，所述表達載體 選自重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、單純皰疹病毒載體或牛痘苗 病毒載體，所述非表達載體選自噬菌體載體或復(fù)制子載體。由于cyclin Dl的過表達與新生內(nèi)膜形成異常密切相關(guān)，而新生內(nèi)膜形成異常是 動脈粥樣硬化等心血管疾病的重要病理基礎(chǔ)，因此，上述基于SIRTl的下調(diào)cyclin Dl及 cyclin E表達的藥物可以進而抑制新生內(nèi)膜形成并可預(yù)防和/或治療由于新生內(nèi)膜形成異 常導(dǎo)致的心血管疾病。具體而言，本發(fā)明通過具體的實驗證明，SIRTl抑制了血清刺激及小鼠頸總動 脈結(jié)扎引起的細胞周期蛋白cyclin Dl表達增高，使血管平滑肌細胞(VSMCs)阻滯在Gl 期，抑制VSMCs增殖和小鼠頸總動脈結(jié)扎引起的細胞增殖，進而抑制新生內(nèi)膜形成。細言之，發(fā)明人首先通過3H_TdR、流式細胞術(shù)檢測SIRTl在體外對細胞增殖和 細胞周期的影響。隨后，通過Western blot、RT-PCR觀察在基礎(chǔ)水平和血清誘導(dǎo)下， 過表達和干擾SIRTl對細胞周期蛋白表達水平的影響；用熒光素酶報告系統(tǒng)檢測過表達 SIRTl對細胞周期蛋白cyclin Dl活性的影響。為驗證體內(nèi)水平SIRTl對小鼠頸總動脈結(jié)扎 引起的細胞周期蛋白cyclin Dl表達增高的下調(diào)作用，構(gòu)建了平滑肌特異性SIRTl轉(zhuǎn)基因 鼠，應(yīng)用RT-PCR、Southern blot、Western blot、免疫組化等方法對平滑肌特異性SIRTl 轉(zhuǎn)基因鼠進行鑒定，用Western blot和免疫組化方法觀察在小鼠頸總動脈結(jié)扎情況下，體 內(nèi)過表達SIRTl對細胞周期蛋白cyclin Dl表達的影響，并進一步應(yīng)用小鼠頸總動脈結(jié)扎 模型，采用HE染色、免疫組化、Masson染色等方法觀察轉(zhuǎn)基因鼠新生內(nèi)膜形成、血管 平滑肌細胞增殖和細胞外基質(zhì)(ECM)。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，腺病毒介導(dǎo)的SIRTl過表達可以抑制基礎(chǔ)水平和血清誘導(dǎo)的原代 血管平滑肌細胞增殖，并使血清誘導(dǎo)的原代血管平滑肌細胞阻滯在Gl期。SIRTl在體內(nèi) 外抑制Gl期開關(guān)分子cyclin Dl的表達，SIRTl轉(zhuǎn)基因鼠可以抑制由頸總動脈結(jié)扎所引起 的新生內(nèi)膜形成，并且可以減少細胞外基質(zhì)。即，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，SIRTl在體內(nèi)外可以降低cyclin Dl的表達，并可能由此使血
管平滑肌細胞阻滯在Gl期，抑制細胞增殖和新生內(nèi)膜形成。因此，SIRTl是調(diào)控平滑肌 細胞增殖的重要基因，提高SIRTl的表達可以作為抑制血管平滑肌細胞增殖和新生內(nèi)膜 形成及影響血管重塑過程的一個新手段。在實驗中也發(fā)現(xiàn)，10% FBS刺激血清饑餓48小時后，已處于靜止期的VSMC、 cyclin D1、cyclin E 及 CDK2 均表達增高，而當(dāng)過表達 SIRT1 時，cyclin D1、cyclin E 及 CDK2的蛋白表達與對照組相比均降低。為排除腺病毒的干擾，在大鼠平滑肌細胞系A(chǔ)lO 中通過轉(zhuǎn)染p3.1SIRTl及pcDNA3.1對照，也同樣發(fā)現(xiàn)過表達SIRTl能下調(diào)cyclin DU cyclin E及CDK2的蛋白表達水平。反之，當(dāng)RNAi干擾SIRTl近50 %時，發(fā)現(xiàn)cyclin Dl的蛋白表達水平升高，而干擾SIRTl后，cyclin E及CDK2蛋白表達水平變化不明顯。同時進一步在頸總動脈結(jié)扎模型中發(fā)現(xiàn)，與相同處理的野生型鼠相比，結(jié)扎28天后的 SIRTl轉(zhuǎn)基因鼠頸總動脈中cyclin Dl蛋白水平明顯降低(ρ < 0.05)?？紤]到cyclin Dl作 為調(diào)控Gl期的早期變化基因，同時根據(jù)上述結(jié)果，在Gl期相關(guān)周期蛋白及周期蛋白依 賴性蛋白激酶中，SIRTl對cyclin Dl具有更為明顯的調(diào)控作用，同時SIRTl過表達在體 外和體內(nèi)均能降低cyclin Dl的蛋白水平，因此進一步研究了 SIRTl能否在轉(zhuǎn)錄水平上對 cyclin Dl進行調(diào)控?，F(xiàn)有研究證明，SIRTl能與AP-I的兩個亞基c-Fos/c-Jun相互作用并確定了 其相互作用的確切的結(jié)構(gòu)域，并且明確了 SIRTl通過去乙?；耙种芻-Fos/c-Jun的 DNA結(jié)合能力來抑制AP-I的轉(zhuǎn)錄活性。研究發(fā)現(xiàn)，SIRTl過表達不僅能降低由血清 誘導(dǎo)的cyclin D ImRNA水平的增高，同時SIRT1還能顯著降低大鼠cyclin D1 (NCBI登 錄號NM_171992)啟動子活性，由c-Fos/c-Jun誘導(dǎo)升高的cyclin Dl啟動子活性也同 樣被SIRTl所抑制。為進一步考察SIRTl能否通過c-Fos/c-Jun實現(xiàn)對cyclin Dl轉(zhuǎn)錄 水平的調(diào)控，分別對包含有AP-I結(jié)合位點的大鼠cyclin Dl啟動子進行刪除和突變， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)刪除-818-814AP-1結(jié)合位點后，cyclin Dl啟動子活性降低0.85倍，但 SIRTl對大鼠cyclin Dl啟動子活性的抑制效應(yīng)依然存在(降低0.4倍)；而進一步刪除包 括-44—41AP-1結(jié)合位點后，cyclin Dl啟動子活性也降低0.94倍，而SIRTl對大鼠cyclin Dl啟動子活性的抑制效應(yīng)幾乎消失(降低0.1倍)；進一步對-44-41AP-1結(jié)合位點進 行突變后，發(fā)現(xiàn)cyclin Dl啟動子活性仍有大幅降低，為0.79倍，而SIRTl對大鼠cyclin Dl啟動子活性的抑制效應(yīng)也有明顯降低(降低0.19倍)。因此，這些結(jié)果說明AP-I的 結(jié)合對cyclin Dl啟動子活性的提高起重要作用，同時由于SIRTl對cyclinDl啟動子活性 的降低效應(yīng)可以由-44-41AP-1結(jié)合位點的缺失而部分消除，提示-44-41AP-1結(jié)合位 點對AP-I參與SIRTl對cyclin Dl的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用。用ChIP實驗也證實SIRTl 和c-Fos/c-Jun可以被募集到cyclin Dl啟動子上包含有-44—41AP-1結(jié)合位點的同一區(qū) 域，并且當(dāng)RNAi干擾掉SIRTl的表達時，c-Fos/c-Jun在cyclinDl啟動子上該區(qū)域的募 集增加。因此，上述結(jié)果提示SIRTl可能通過與AP-I的相互作用，降低c-Fos/c-Jun在 cyclin Dl啟動子上的募集來調(diào)節(jié)cyclin Dl啟動子區(qū)的活性。由此可見，本發(fā)明通過體內(nèi)外實驗首次證明SIRTl可下調(diào)cyclin Dl及相關(guān)細胞 周期蛋白如cyclin E和CDK2的表達，由于cyclin Dl及相關(guān)細胞周期蛋白如cyclin E和
CDK2可正向調(diào)控細胞增殖，因此，SIRTl可以負向調(diào)控細胞的增殖作用。因此，蛋白 質(zhì)SIRTl可以制備為蛋白質(zhì)類型的藥物，或者將SIRTl基因制備為重組表達載體類型的核 酸構(gòu)建物。在將上述藥物給予患者之后，直接提供的SIRTl蛋白或者所述核酸構(gòu)建物在 患者體內(nèi)重組表達的SIRTl蛋白能通過下調(diào)cyclin Dl及相關(guān)細胞周期蛋白如cyclin E和 CDK2的表達，抑制患者體內(nèi)血管平滑肌細胞過增殖，并進而抑制新生內(nèi)膜形成并可預(yù)防 和/或治療由于新生內(nèi)膜形成異常導(dǎo)致的心血管疾病或相關(guān)細胞增殖性疾病如腫瘤。


圖1 平滑肌特異性轉(zhuǎn)基因鼠SMC-SIRT1 Tg的構(gòu)建模式圖，用平滑肌特異性啟 動子SM22 α介導(dǎo)人源SIRTl的表達。圖2 Southern blot鑒定獲得兩株轉(zhuǎn)基因鼠Tgl和Tg2，WT為同窩野生型鼠，Tg為轉(zhuǎn)基因鼠。圖3 轉(zhuǎn)基因鼠胸主動脈mRNA水平的過表達，WT為同窩野生型鼠，Tg為轉(zhuǎn)
基因鼠。圖4:轉(zhuǎn)基因鼠胸主動脈SIRTl蛋白水平的過表達，WT為同窩野生型鼠，Tg為 轉(zhuǎn)基因鼠，LCCA為左頸總動脈。
圖5:免疫組化鑒定SIRTl在轉(zhuǎn)基因鼠中膜平滑肌層的特異性表達，IgG為陰性 對照，WT為同窩野生型鼠，Tg為轉(zhuǎn)基因鼠，標(biāo)尺為25μΜ。圖6: HE染色結(jié)果，WT為同窩野生型鼠，Tg為轉(zhuǎn)基因鼠，N代表新生內(nèi)膜， M代表中膜，標(biāo)尺為50 μ Μ。圖7: SIRTl體內(nèi)過表達抑制頸總動脈結(jié)扎引起的新生內(nèi)膜形成，新生內(nèi)膜形成 率用內(nèi)膜/中膜面積比表示，**代表Ρ<0.01。圖8 SIRTl體內(nèi)過表達抑制由頸總動脈結(jié)扎28天引起的細胞增殖，A，SIRTl 體內(nèi)過表達顯著降低PCNA陽性細胞，PCNA陽性細胞為細胞核棕黃色的細胞，標(biāo)尺為 25μΜ； B，SIRTl體內(nèi)過表達顯著降低頸總動脈結(jié)扎28天后的內(nèi)膜PCNA陽性細胞率， ** 代表 P < 0.01。圖9 SIRTl體內(nèi)過表達抑制由頸總動脈結(jié)扎28天引起的血管細胞外基質(zhì)形成， A，SIRTl體內(nèi)過表達顯著降低膠原纖維形成，膠原纖維為血管內(nèi)藍色著色區(qū)域，標(biāo)尺為 50μΜ； B, SIRTl體內(nèi)過表達顯著降低頸總動脈結(jié)扎28天后的內(nèi)膜膠原百分率，**代 表卩< 0.01。圖10 SIRTl轉(zhuǎn)基因鼠由頸總動脈結(jié)扎引起的內(nèi)膜中TUNEL陽性細胞數(shù)在每 1000個細胞(A)和每10000 μ m2 (B)均與野生型鼠相比無顯著差異。圖11 SIRTl過表達抑制基礎(chǔ)狀態(tài)及血清刺激12小時后的血管平滑肌細胞DNA 合成，** 代表 P <0.01，*** 代表 P < 0.001。圖12 SIRTl過表達在血清刺激12小時后使血管平滑肌細胞阻滯在Gl期，*代 表卩< 0.05。圖13: SIRTl過表達在血清刺激12，16，20小時后使大鼠平滑肌細胞系A(chǔ)7r5阻 滯在Gl期，*代表P <0.05。圖14 SIRTl過表達下調(diào)血清刺激引起的血管平滑肌細胞cyclin Dl，cyclin E, CDK2蛋白水平的增高，*代表P <0.05。圖15 SIRTl過表達下調(diào)血清刺激引起的大鼠平滑肌細胞系A(chǔ)lO cyclin Dl, cyclin E，CDK2蛋白水平的增高，*代表P < 0.05。圖16 RNAi SIRTl干擾后進一步上調(diào)血清刺激引起的血管平滑肌細胞cyclin Dl 蛋白水平的增高(A)，而cylinE，CDK2變化不大(B)，*代表P < 0.05。圖17 SIRTl體內(nèi)過表達下調(diào)由頸總動脈結(jié)扎28天后引起的cyclin Dl蛋白水平 的增高，A，蛋白水平結(jié)果；B，免疫組化結(jié)果，細胞核棕黃色的為cyclin Dl陽性細胞，
* 代表 P < 0.05。圖18 SIRTl過表達下調(diào)血清刺激引起的血管平滑肌細胞cyclin Dl mRNA水平 的增高，*代表P <0.05。圖19 大鼠cyclin Dl啟動子AP_1結(jié)合位點及突變位點模式圖，也即大鼠cyclinDl報告基因cyclin DHuc序列。圖20 SIRTl過表達下調(diào)c_Fos和c_Jun引起的cyclin Dl報告基因活性的增高， * 代表 P <0.05，** 代表 P <0.01。圖21 AP-I介導(dǎo)了 SIRTl對cyclin Dl報告基因活性的抑制I，*代表P<0.05， ** 代表 P <0.01，*** 代表 P < 0.001。圖22 AP-I介導(dǎo)了 SIRTl對cyclin Dl報告基因活性的抑制II，***代表P < 0.001。圖23:SIRT1、c_Fos、c_Jun結(jié)合在cyclinDl啟動子區(qū)，上圖柱狀圖為實時定
量PCR結(jié)果，下圖為普通PCR結(jié)果。圖24: SIRTl干擾后，c_Fos，c_Jun在cyclin Dl啟動子上該區(qū)域的募集增加。
具體實施例方式下面將通過下述非限制性實施例進一步說明本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在 不背離本發(fā)明精神的情況下，可以對本發(fā)明做出許多修改，這樣的修改也落入本發(fā)明的 范圍。下述實驗方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。實施例實施例1平滑肌特異性人源SIRTl轉(zhuǎn)基因鼠構(gòu)建1.用于制備轉(zhuǎn)基因的SMC-SIRT1的克隆構(gòu)建包含5’擺動序列445個堿基對的小鼠SM22 α啟動子是一個血管平滑肌細胞特 異表達的啟動子，它只在成年大鼠的大動脈及中動脈有活性，而在靜脈或內(nèi)臟平滑肌細 胞，心肌或骨骼肌細胞中均無表達。將含BssH II和BamHI酶切位點的小鼠SM22 α啟動子片段與用BamHI和NotI 雙酶切的人源野生型SIRTl質(zhì)粒用T4DNA連接酶連接并克隆入含PolyA的載體中，經(jīng) 轉(zhuǎn)感受態(tài)大腸桿菌細胞，小提質(zhì)粒單酶切和聯(lián)合酶切鑒定并送測序，所得結(jié)果在網(wǎng)上經(jīng) BLAST比對確認克隆的正確并命名為SMC-SIRT1。相關(guān)結(jié)果見圖1。2.顯微注射用質(zhì)粒DNA的制備與純化將正確的SMC-SIRT1質(zhì)粒經(jīng)大量制備后，用BssHII酶切50 μ g質(zhì)粒DNA，然 后將產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳，切取5.5Kb條帶回收并溶解于2.4mlTE液中。加入 3克氯化銫充分溶解后經(jīng)超速離心后從管底分管接取液體經(jīng)電泳觀察，將含有DNA的管 中液體合并，透析后取少量瓊脂糖電泳觀察質(zhì)量，紫外分光光度計測定濃度，然后按照 l-3ng/ μ 1的濃度稀釋供顯微注射。3小鼠的超排卵和取卵選擇4-6周齡(體重12-16克)C57BL/6小鼠作為卵供體母鼠，腹腔注射孕馬血 清PMS(5U/只鼠)，46-48小時后腹腔注射人絨毛膜促性腺激素hCG(5U/只鼠)后每只 母鼠同一只種鼠(選用C57BL/6與FVB雜交一代的公鼠，8周齡后(體重25克以上)開 始使用)合籠，次日晨檢查精栓，有精栓的小鼠用于取卵。取有精栓之卵供體鼠，引頸 法處死，70%酒精沖洗腹部表皮，剪開腹部皮膚，腹肌 和腹膜，暴露腹腔，沿子宮找到 卵巢及輸卵管，夾住子宮，剝離子宮及卵巢系膜，剪斷子宮與輸卵管連接處；夾住輸卵管，剪斷卵巢與輸卵管連接處，將輸卵管置于M2工作液中。以同樣操作剪取對側(cè)輸卵 管。在解剖顯微鏡下，以鐘表鑷撕開輸卵管膨大部分的輸卵管壁，吸取卵團置于含透明 質(zhì)酸酶的M2培養(yǎng)基中(透明質(zhì)酸酶濃度為0.3mg/ml)；顯微鏡下反復(fù)吸吹后將卵轉(zhuǎn)移至 不含透明質(zhì)酸酶的M2培養(yǎng)基中，重復(fù)洗3-4次。將清洗后的單個卵細胞集中置于M16 培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)至37°C二氧化碳孵箱中(5% CO2)培養(yǎng)待注射。4.顯微注射 將一大滴M2培養(yǎng)液置于注射室中央，上面覆蓋礦物油(Sigma公司)。從CO2 孵箱中轉(zhuǎn)移10-30個卵到注射室M2培養(yǎng)基中，將拉制出的注射針虹吸DNA溶液至尖端 后，接在顯微注射器的正壓出口處，調(diào)整注射時間為50ms，注射壓力為40psi，平衡壓力 為3-4psi，將注射針在低倍鏡監(jiān)視下插入液滴中；腳踏開關(guān)使產(chǎn)生負壓，以持卵針開口 對準(zhǔn)一個受精卵的中部邊緣將受精卵吸牢；換至高倍鏡使受精卵原核清晰可見，選擇較 大的雄原核，把注射針頭部調(diào)整至與原核一個平面上，緩慢插入受精卵透明帶、胞膜、 胞漿、核膜至核基質(zhì)中，腳踏微注射器開關(guān)，可見核膜明顯膨脹，表示DNA溶液已進入 核漿，迅速抽出注射針，觀察注射后的受精卵是否有明顯損傷，用持卵針將注射后的受 精卵轉(zhuǎn)移至液滴左下部，即完成一次注射。將注射后仍完好的受精卵移至另一 M16培養(yǎng) 液中培養(yǎng)待輸卵管轉(zhuǎn)移。顯微注射后完好的卵在M16培養(yǎng)基中(5% C02，37°C)，培養(yǎng) 過夜后分裂成兩細胞的比例約為60-80%。為避免卵長時間體外培養(yǎng)可能對卵發(fā)育產(chǎn)生的 損害，一般將注射當(dāng)天的單細胞受精卵進行輸卵管移卵。5.輸卵管移卵注射后當(dāng)天的單細胞受精卵或培養(yǎng)至第二天的兩細胞受精卵均可用于輸卵管移 卵。取假孕母鼠稱其體重，按0.015ml/g體重給小鼠腹腔注射麻醉劑三溴乙醇(Avertin) 水飽和液，3-7分鐘麻醉進入平穩(wěn)期。將鼠腹側(cè)臥位，70%酒精消毒皮膚，用解剖剪剪開 一個小口，開口處位于脊柱旁側(cè)lcm，約與最后1根肋骨平齊。用鑷子沿切口撕開皮膚 肌肉，透過腹膜可見卵巢(桔黃色)和/或脂肪墊(白色)。然后用鐘表鑷在相當(dāng)于卵巢 上部的腹膜開1個小口。這時應(yīng)盡可能避開血管以防出血。用外科縫合針在腹膜上穿一 根縫合線以便于其后腹膜固定。用無齒鑷夾住脂肪墊并帶出左側(cè)的卵巢、輸卵管與部份 子宮，用動脈夾夾住脂肪墊并將其放在鼠背后側(cè)，這樣卵巢與輸卵管暴露在腹膜外。在 解剖鏡下，用鐘表鑷尖端輕輕撕開輸卵管開口上部的透明膜，開一小口，盡可能避開血 管以防出血模糊視野。將移卵管從開口部插入輸卵管，將卵緩慢吹入輸卵管，直至第二 個氣泡進入壺腹部，不能將礦物油一同吹入。將移卵管略停一下再拔出，以防氣泡以至 卵逸出；去除脂肪夾，將所有組織回位腹腔，縫合肌肉和皮膚切口，等小鼠蘇醒后放回 動物室飼養(yǎng)。輸卵管移卵可在注射當(dāng)天下午4-6點或次日晨進行?？勺鰡蝹?cè)或雙側(cè)輸卵 管移卵。6.轉(zhuǎn)基因鼠的檢測6.1利用PCR鑒定轉(zhuǎn)基因鼠剪鼠的耳或腳趾于鼠耳消化液中，55°C消化至少4小時，煮沸5-10分鐘，室溫 12,000rpm5分鐘，上清即可作為PCR模板。鼠耳消化液成分KCl500mM，Tris-HCl lOOMm，明膠(Sigma G2500) O.lmg/ ml, NP-400.45%, Tween20 0.45%,蛋白酶 K(臨用時加入)0.5mg/ml。
用于鑒定SIRTl 的引物Pl 5' -CTTCAGGTCAAGGGATGGTAT-3 ‘ (SEQ IDNO 1)，P2 5' -GCGTGTCTATGTTCTGGGTAT-3‘ (SEQ ID NO 2)。PCR擴增 產(chǎn)物長度233bp。擴增SIRTl 的 PCR 反應(yīng)條件94°C 5 分鐘，(94°C 20 秒，53°C20 秒，72°C 30 秒)30循環(huán)，72 °C 10分鐘。6.2利用Southern雜交鑒定轉(zhuǎn)基因鼠
6.2.1鼠尾基因組DNA的提取麻醉狀態(tài)下剪取2-3cm長鼠尾，以微火焰去毛，以消毒過的手術(shù)剪沿縱軸剪開 鼠尾部皮膚，鉗住一頭，使皮膚與尾骨剝離。剪碎尾部皮膚組織，置于EP管中，加入 530 μ 1 DNA 抽提緩沖液(IOmM Tris-HCl, pH7.4, IOmM NaCl, 25mM EDTA)、70 μ 1 10% SDS,混勻后，加入40μ1蛋白酶K(10mg/ml)，輕輕混勻后，55°C保溫過夜。消 化完全后，加入70 μ 15M NaCl后，用等體積飽和酚抽提去除蛋白，離心去除酚相，將上 清轉(zhuǎn)至另一 EP管，用650μ1酚氯仿異戊醇(25 24 1)抽提，離心后將上清再用 650 μ 1氯仿異戊醇(24 1)混合液抽提一次，取上清轉(zhuǎn)至另一 EP管中，加入等體積異 丙醇，輕輕搖動離心管數(shù)次，可見絲狀基因組DNA出現(xiàn)，靜置待沉淀完全；用tip頭輕 挑起沉淀，轉(zhuǎn)移DNA至新EP管中，用70%乙醇洗沉淀兩次，晾干后加150 μ ITE溶解沉 淀過夜。溶解完全后，取適量溶液用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢查DNA質(zhì)量，DNA主帶應(yīng) 清晰無降解。做適當(dāng)稀釋后，讀取OD26tlnm值及OD28tlnm值，計算DNA濃度。根據(jù)所測 結(jié)果，用TE緩沖液稀釋至終濃度Iyg/μ 1，4°C保存。6.2.2Southern雜交鑒定轉(zhuǎn)基因鼠取15 μ g上述提取的鼠尾基因組DNA，在200 μ 1反應(yīng)體系中用150單位EcoRI 酶切24小時(雜交目的片段為2.1kb)。酶切體系的配制要點是充分混勻。取1.5 μ 1 在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳，觀察是否完全酶解。如仍有主帶，再加入30單位酶切4小 時。向酶解樣品中加入等體積的酚氯仿，混勻10分鐘后，12,OOOrpm離心10分鐘， 將上清轉(zhuǎn)移到一個新的1.5ml離心管中，加入1/10體積的3M NaAC,兩倍體積的乙 醇，混勻后-20°C放置2小時，12,000rpm，4°C離心10分鐘，棄去上清，用70%乙醇洗 滌一次，12,000rpm，4°C離心10分鐘，棄去上清。晾干后，加入15μ1ΤΕ溶解。取 1 μ 1稀釋到80 μ 1測量OD26tlnm值及OD28tlnm值，計算DNA濃度。取10 μ g酶切后的鼠 尾基因組DNA，在瓊脂糖凝膠上于lV/cm條件下電泳，待溴酚蘭泳動至距點樣孔 約12cm處，停止電泳。電泳完畢，EB染色后紫外燈下觀察電泳結(jié)果，呈現(xiàn)均一的彌 散狀，拍照后，估計條帶所在的位置，切除多余的邊緣。凝膠經(jīng)變性、中和。將膠塊 倒置于水平玻璃上，膠下有紙橋與20XSSC相連，膠上依次覆蓋有尼龍膜、Whatman 3M濾紙、普通新華濾紙或吸水紙及500g重物。室溫下轉(zhuǎn)移12-24小時。轉(zhuǎn)移完畢， 檢查硝酸纖維素膜上及膠上EB染料分布情況，判斷轉(zhuǎn)移效率。用濾紙吸去多余水分， 室溫晾干1小時，選C3程序進行紫外交聯(lián)。將轉(zhuǎn)移了 DNA的尼龍膜在6XSSC中潤 濕后，放入雜交管中，加入適量的快速雜交液，42°C預(yù)雜交40分鐘。在等待預(yù)雜交的 過程中標(biāo)記探針，標(biāo)記按照隨機引物標(biāo)記試劑盒提供的說明書操作。探針模板對應(yīng)于 SIRT1 cDNA起始密碼子下游160bp_360bp，用PCR產(chǎn)物切膠回收的方法得到。PCR 引物序列如下。P3 5 ‘ -CCCCAGAGCGTGAGGTGC-3 ‘ (SEQ ID NO 3), P4 5' -CGTACAAGTTGTCGGCCAGC-3 ' (SEQ ID NO 4)。預(yù)雜交結(jié)束后加入標(biāo)記好 的探針，繼續(xù)雜交1.5-2小時。雜交結(jié)束后洗膜，放射自顯影觀察結(jié)果。結(jié)果如圖2所示οPCR方法研究轉(zhuǎn)基因小鼠中外源基因的遺傳規(guī)律，發(fā)現(xiàn)各株系轉(zhuǎn)基因小鼠后代 中外源基因的出現(xiàn)頻率接近50%，符合孟德爾遺傳規(guī)律。6.2.3轉(zhuǎn)基因鼠胸主動脈SIRTlmRNA水平的過表達。提取轉(zhuǎn)基因和陰性同窩小鼠胸主動脈中總RNA，進行反轉(zhuǎn)錄合成CDNA第一 鏈。cDNA產(chǎn)物各取Iyl作為模板，所用引物與鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠的引物相同，進行PCR 反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因動物的胸主動脈樣品可以擴增出233bp的陽性條 帶，與預(yù)期結(jié)果一致，而陰性同窩鼠樣品中檢測不到擴增產(chǎn)物，提示SIRTl在轉(zhuǎn)基因動 物主動脈的特異性表達。同時使用提取的組織總RNA作為模板，進行同樣的PCR反應(yīng)， 轉(zhuǎn)基因組與陰性對照組都沒有陽性條帶，排除了上述cDNA模板當(dāng)中基因組DNA污染可 能造成的假陽性。將RT-PCR反應(yīng)的產(chǎn)物測序，結(jié)果顯示產(chǎn)物序列與SIRTl轉(zhuǎn)基因序列 相同，這表明在轉(zhuǎn)基因小鼠主動脈內(nèi)SIRTl能夠表達。結(jié)果見圖3。6.2.4用Western-blot鑒定轉(zhuǎn)基因鼠動脈中的SIRTl表達。取轉(zhuǎn)基因小鼠和陰性同窩小鼠胸主動脈，左頸總動脈勻漿提取蛋白質(zhì)，用 Western blot發(fā)現(xiàn)SIRTl在轉(zhuǎn)基因小鼠中的胸主動脈，左頸總動脈均有表達，陰性同窩小 鼠沒有檢測到明顯的條帶(以下如無特殊說明，SIRTl抗體均來源于美國Santa cruz公 司)。結(jié)果見圖4。6.2.5免疫組化鑒定轉(zhuǎn)基因鼠動脈中膜中SIRTl的表達。最后，用免疫組化的方法檢測頸總動脈SIRTl的表達，結(jié)果顯示在陽性轉(zhuǎn)基因 小鼠頸總動脈中膜中有棕黃色信號，而陰性同窩對照僅有非常微弱的陽性信號(可能是 SIRTl抗體對于內(nèi)源性SIRTl也有微弱識別能力)，沒有加一抗的兩組血管作為陰性對 照。說明在血管平滑肌細胞實現(xiàn)SIRTl過表達。結(jié)果見圖5。實施例2小鼠頸總動脈結(jié)扎模型致新生內(nèi)膜形成三溴乙醇(30mg/kg-50mg/kg)腹腔注射麻醉12_14周雄性C57BL/6小鼠。仰
臥位固定小鼠四肢及頭部，使完全暴露頸部，皮膚消毒后行頸上部正中切口?？v向剪開 皮膚及肌層，開口約l-1.5cm。用直和彎眼科鑷輕輕分開甲狀腺，于右下方撕開鞘膜，可 見有血流搏動的左頸總動脈。用小號彎頭止血鉗輕輕挑起左頸總動脈，另一側(cè)用小號彎 頭止血鉗將左頸總動脈和伴行的迷走神經(jīng)分離，并進一步分離至左頸總動脈分叉處，在 接近分叉處用6號手術(shù)縫合線正向反向完全結(jié)扎左頸總動脈。將甲狀腺位置還原，縫合 傷口。左側(cè)頸總動脈結(jié)扎0d，14d，28d的轉(zhuǎn)基因陰、陽性小鼠，經(jīng)腹腔注射麻醉，待 麻醉充分后進行整體灌流法原位固定組織器官。頸上部正中切口完全剪開頸部皮毛，縱 向剪開皮膚及肌層，用直和彎眼科鑷輕輕分開甲狀腺，于左、右下方撕開鞘膜，可見已 經(jīng)結(jié)扎的左頸總動脈和未結(jié)扎的右側(cè)頸總動脈。小號彎頭止血鉗輕輕挑起左頸總動脈的 結(jié)扎線或右側(cè)頸總動脈周圍組織，小心順勢分離頸總動脈，切勿提拉鉗夾損傷動脈，力 求反映動脈原貌，做免疫組化的樣本取頸總動脈血管分叉(結(jié)扎處)至其下0.5cm處至于 中性甲醛溶液中固定24h準(zhǔn)備石蠟包埋。
用于分析基因表達水平的組織取材不做甲醛固定，只需用滅菌PBS沖洗循環(huán)系 統(tǒng)中殘留的血液，取胸腹主動脈、肺臟、肌、肝、腎、心臟液氮速凍，-80°C保存，用于 提取總RNA，作基因表達水平的研究?；蛱崛∽箢i總動脈總蛋白做目的基因表達水平研 究。一根頸總動脈提取的蛋白不足做一次Western blot，故六個樣品組每次每組用3根頸 總動脈一起提取，其結(jié)果反映的是這幾根頸總動脈目的基因蛋白表達的平均水平。經(jīng)常規(guī)的 組織切片，HE染色后，新生內(nèi)膜形成從結(jié)扎14天開始動脈管腔內(nèi)出 現(xiàn)新生內(nèi)膜，到28天動脈管腔內(nèi)徑縮窄近80%并伴有新生內(nèi)膜的形成，說明造模是成功 的。結(jié)扎后28天，與野生型鼠相比，SIRTl轉(zhuǎn)基因鼠的新生內(nèi)膜面積有顯著降低。結(jié) 果見圖6。經(jīng)照相后選離結(jié)扎位置500 μ m切片用圖像分析軟件Image pro plus 6.0進行分
析，圈定內(nèi)腔，內(nèi)彈力膜和外彈力膜后，軟件測量出內(nèi)腔面積，內(nèi)膜面積以及中膜面 積，新生內(nèi)膜厚度由新生內(nèi)膜面積與中膜面積之比來表示。其他后續(xù)分析均在距離結(jié)扎 部位500μιη范圍內(nèi)進行。分別統(tǒng)計了結(jié)扎14天和28天野生型鼠(WT)和SIRTl轉(zhuǎn)基 因鼠(SIRTl-Tg)頸總動脈的內(nèi)膜面積，中膜面積，新生內(nèi)膜面積與中膜面積比(Ι/Μ)以 及新生內(nèi)膜比率(新生內(nèi)膜面積與總血管面積比)，發(fā)現(xiàn)在結(jié)扎后14天，與WT鼠相比， SIRTl-Tg鼠的內(nèi)膜面積，中膜面積，新生內(nèi)膜面積與中膜面積比以及新生內(nèi)膜比率沒有 明顯變化。而結(jié)扎后28天，與WT鼠相比，SIRTl-Tg鼠的內(nèi)膜面積，新生內(nèi)膜面積與 中膜面積比以及新生內(nèi)膜比率都有顯著降低(P <0.01)。其中，SIRTl-Tg鼠的內(nèi)膜面積 僅為WT鼠的46.8%，而新生內(nèi)膜比率也僅為WT鼠的46.6%。由此可以得出結(jié)論，在 SIRTl平滑肌特異性轉(zhuǎn)基因鼠中，由頸總動脈結(jié)扎所導(dǎo)致的新生內(nèi)膜形成受到顯著抑制。 結(jié)果見圖7。實施例3轉(zhuǎn)基因鼠中PCNA的表達作為反映細胞活躍增殖的指標(biāo)，細胞增殖核抗原(PCNA)被廣泛應(yīng)用。為了進 一步驗證SIRTl在體內(nèi)能顯著抑制由頸總動脈結(jié)扎所導(dǎo)致的新生內(nèi)膜形成，首先用SIRTl 免疫組化染色確證了 SIRTl在結(jié)扎28天的轉(zhuǎn)基因鼠動脈中層平滑肌中表達，再比較了結(jié) 扎28天的WT和SIRTl轉(zhuǎn)基因鼠的PCNA免疫組化染色及PCNA染色指數(shù)。在平滑肌 特異表達SIRTl轉(zhuǎn)基因鼠與WT鼠相比，SIRTl轉(zhuǎn)基因鼠PCNA陽性著色(棕褐色或者棕 黃色)細胞數(shù)顯著減少，內(nèi)膜PCNA陽性細胞率也顯著降低(P < 0.01)。結(jié)果見圖8。實施例4轉(zhuǎn)基因鼠中血管細胞外基質(zhì)的形成在血管重塑的進程中，細胞外基質(zhì)(ECM)蛋白如膠原和纖維結(jié)合蛋白的沉著也 起著至關(guān)重要的作用。因此，用Masson染色觀察SIRTl平滑肌特異性轉(zhuǎn)基因是否對結(jié) 扎28天引起的血管重塑有遏制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在SIRTl轉(zhuǎn)基因鼠中，染成藍色的膠 原纖維較WT鼠明顯減少，膠原面積占整個內(nèi)膜面積比有明顯降低(WT : 55.2% ； Tg 34.6%, P <0.01),說明在轉(zhuǎn)基因鼠中，血管細胞外基質(zhì)形成受到明顯抑制。結(jié)果見圖 9。實施例5與野生型鼠相比，轉(zhuǎn)基因鼠由頸總動脈結(jié)扎引起的凋亡細胞數(shù)無顯著
差異細胞凋亡也參與了頸總動脈結(jié)扎引起的血管重塑過程，為此，通過TUNEL染 色考察了 SIRTl在體內(nèi)是否通過影響細胞凋亡來抑制血管重塑過程。經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，雖然SIRTl轉(zhuǎn)基因鼠組在內(nèi)膜中TUNEL陽性細胞數(shù)在每1000個細胞和每10000 μ m2均有降 低，但不具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果見圖10。實施例6SIRT1抑制血管平滑肌細胞的增殖在小鼠頸總動脈結(jié)扎模型中觀察到與野生型鼠相比，平滑肌特異SIRTl轉(zhuǎn)基 因鼠能顯著抑制新生內(nèi)膜形成，明顯降低PCNA陽性細胞數(shù)，顯著降低ECM的形成，但 是并沒有發(fā)現(xiàn)細胞凋亡有明顯的差異。為進一步考察SIRTl是否在體外也能抑制血管平 滑肌細胞增殖并探討其分子機制，取原代大鼠動脈平滑肌細胞，分別用MOI值為100的 腺病毒Ad-GFP和Ad-SIRTl感染12小時后，換無血清DMEM培基饑餓48小時使細胞 同步化，再用含10% FBS的DMEM培基培養(yǎng)24小時，分別取0小時和24小 時的細胞， 采用[3H]-TdR摻入的方法測定10% FBS對VSMC DNA合成的作用。結(jié)果顯示10% FBS誘導(dǎo)可以顯著增加VSMC的[3H]_TdR摻入量，而過表達SIRTl可使基礎(chǔ)狀態(tài)下和血 清刺激24小時VSMC的[3H]_TdR摻入量顯著減少(P < 0.01和P < 0.001)。結(jié)果見圖 11。過表達SIRTl可以抑制10% FBS誘導(dǎo)的VSMC增殖，為此進一步用流式細胞儀 檢測了過表達SIRTl對VSMC在血清刺激時細胞周期改變的影響。首先分別用MOI值為 100的腺病毒Ad-GFP和Ad-SIRTl感染VSMC24小時，然后用無血清DMEM培養(yǎng)基繼 續(xù)培養(yǎng)24小時使細胞同步化。之后換成含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別在0、 4、8、12、16、20、24小時檢測細胞周期變化。結(jié)果顯示，通過血清饑餓法可以很好地 使細胞阻滯在G0/G1，通過同步化后，VSMC基本90%以上處于G0/G1期。再重新給予 10% FBS刺激后，在最初的4小時內(nèi)，細胞仍處于G0/G1期。從8小時開始，Ad-GFP 組的細胞開始進入S期，G0/G1期細胞減少，而Ad-SIRTl組仍處于G0/G1期。12小 時，Ad-GFP組G0/G1期細胞進一步減少，S期細胞明顯增多，而Ad-SIRTl組的細胞周 期明顯落后于Ad-GFP組。20小時后，兩者細胞周期進程間的差距開始減小，直到血清 作用24小時后，由SIRTl引起的細胞周期阻滯效應(yīng)才逐漸消失。結(jié)果見圖12。利用大鼠平滑肌細胞系A(chǔ)7r5進行上述的細胞周期檢測實驗，也發(fā)現(xiàn)相似的結(jié) 果，過表達SIRTl能在10% FBS重新刺激饑餓的大鼠平滑肌細胞系A(chǔ)7r512，16，20小時 后是細胞阻滯在G0/G1期。結(jié)果見圖13。實施例7SIRT1抑制血管平滑肌細胞Gl期細胞周期蛋白cyclin Dl, cyclin E及 CDK2和結(jié)扎28天頸總動脈中Gl期細胞周期蛋白cyclin Dl的表達過表達SIRTl可以抑制10 % FBS誘導(dǎo)的VSMC增殖，并使VSMC阻滯在Gl 期，因此，用Western blotting檢測了 Gl期相關(guān)周期蛋白的變化。發(fā)現(xiàn)過表達SIRTl 可以下調(diào)Gl期重要的相關(guān)周期蛋白cyclin Dl, cyclin E及CDK2的蛋白表達水平。結(jié)果 見圖14。為了驗證過表達SIRTl可以下調(diào)Gl期相關(guān)周期蛋白cyclin Dl，cyclinE&CDK2 的蛋白表達水平，用卩00貼3.1和卩3.131町1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染平滑肌細胞系八10 24小時后，再無 血清培基饑餓24小時，重新?lián)Q為含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，在血清刺激12小時 后，也發(fā)現(xiàn)過表達SIRTl可以下調(diào)Gl期相關(guān)周期蛋白cyclin Dl, cyclin E及CDK2的蛋
白表達水平。結(jié)果見圖15。利用SIRTl干擾腺病毒感染原代血管平滑肌細胞24小時后，再無血清培基饑餓24小時，在與對照(Ad-U6-vector)相比感染量一致的情況下，換為含10% FBS的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，血清刺激12小時，發(fā)現(xiàn)干擾掉SIRTl后能夠上調(diào)cyclin Dl的蛋白表達水 平，而cyclin E，CDK2的蛋白表達水平變化不大(所用SIRTl抗體來源為Millipore公司 的upstate)。結(jié)果見圖16。文獻報導(dǎo)在大鼠頸總動脈球囊損傷模型中，伴隨VSMC增殖，cyclin Dl蛋白水 平也增高(Slater，Koutsouki et al.2004)。因此，為進一步驗證過表達SIRTl是否在體內(nèi) 也能下調(diào)cyclin Dl的表達水平，利用小鼠頸總動脈結(jié)扎模型，用Western blot和免疫組 化檢測發(fā)現(xiàn)結(jié)扎28天后，cyclin Dl蛋白表達增高，組化結(jié)果顯示陽性著色程度明顯增 強，而動脈血管平滑肌特異的SIRTl轉(zhuǎn)基因鼠與野生型鼠相比，cyclin Dl蛋白表達明顯 降低，并且cyclin Dl的陽性著色程度也明顯減低。結(jié)果見圖17。實施例8SIRT1過表達下調(diào)了血管平滑肌細胞中cyclin Dl的mRNA水平進一步在VSMC中觀察到，10% FBS可以誘導(dǎo)cyclin Dl mRNA表達水平增高， 而SIRTl過表達則抑制了由10% FBS所誘導(dǎo)的cyclin Dl mRNA表達水平增高。用于 擴增大鼠 cyclin Dl mRNA 的引物P5 5 ‘ -GCGAAGTGGAGACCATCCG-3 ‘ (SEQ ID NO 5) , P6 5 ‘ -GTCCACATCTCGGACGTCG-3 ‘ (SEQ ID NO 6)。 PCR擴增產(chǎn)物長度860bp。 用于擴增大鼠β _肌動蛋白mRNA的引物P7 5‘ -GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3‘ (SEQ ID NO 7), P8 5' -TAGAGCCACC AATCCACACAGAG-3 ‘ (SEQ ID NO 8)。PCR 擴增產(chǎn)物長度 42 Ibp。結(jié)果見圖I8。實施例9AP-1介導(dǎo)了 SIRTl對cyclin Dl表達的抑制作用之前的研究發(fā)現(xiàn)SIRTl抑制cyclin Dl mRNA水平的表達，提示SIRTl可能影響 cyclin Dl啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。cyclin Dl的表達主要受轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)，多種轉(zhuǎn)錄因子 與cyclin Dl啟動子的特異性結(jié)合位點結(jié)合后啟動cyclin Dl的轉(zhuǎn)錄，其中AP_1 (c-Fos, c-Jun)受血清誘導(dǎo)激活，參與細胞增殖調(diào)控，同時c-Fos，c-Jun也激活cyclin Dl，使細 胞越過Gl期，進入S期。本發(fā)明在HEK293細胞系里發(fā)現(xiàn)SIRTl可以通過降低c-Fos/ c-Jun的乙?；絹硪种艫P-I的轉(zhuǎn)錄活性，提示SIRTl可能是通過與AP-I的相互 作用實現(xiàn)對cyclin Dl的調(diào)節(jié)。因此，構(gòu)建了含有大鼠cyclin Dl啟動子區(qū)的報告基因 (cyclin D1 -Iuc，序列見SEQ IDNO 9,所用引物序列為P9和P10，序列見SEQ ID NO 10-11)，利用熒光素酶報告系統(tǒng)將SIRTl表達質(zhì)粒和pGL3-cydinDl-luc (各0.2 μ g/孔) 共轉(zhuǎn)染接種于24孔板的AlO血管平滑肌細胞系，與共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1和pGL3-Cydin Dl-Iuc的對照相比，SIRTl可以使cyclin Dl的啟動子活性降低0.4倍(由1.378降為 0.833)。c-Fos和c-Jun都分別能激活cyclin Dl的啟動子活性，與共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1和 pGL3-cyclin DHuc的對照相比，c_Fos可以使cyclin Dl的啟動子活性增高2.21倍(由 1.378升為3.047)，c_Jun可以使cyclin Dl的啟動子活性增高1.9倍(由1.378升為2.625)。 而共轉(zhuǎn)了 pcDNA-SIRTl后，由c_Fos導(dǎo)致的cyclin Dl啟動子活性的升高和C-Jun導(dǎo)致的啟動子活性的升高均顯著降低(分別由3.047降為1.24及由2.625降為1.511)，且有統(tǒng)計 學(xué)意義。結(jié)果見圖19和圖20。SIRTl可以下調(diào)由C-Fos和C-Jun激活的cyclin Dl報告基因活性，提 示SIRTl可能通過c-Fos和c-Jun調(diào)節(jié)cyclin Dl的轉(zhuǎn)錄。通過預(yù)測發(fā)現(xiàn)在大鼠cyclin Dl 啟動子區(qū)(-903-0)內(nèi)有兩個 AP-I 結(jié)合位點-818—814 (5’_GTCA_3’) 及-44—41 (5’ -GTCA-3’)，分別對包含這兩個位點的大鼠cyclin D1報告基因cyclin Dl-Iuc 截短，獲得缺失-818—814 (5’-GTCA_3’) AP-I 結(jié)合位點的 cyclin Dl-900-luc (序 列見SEQ ID NO: 12，所用引物序列為Pll和P12，序列見SEQ ID NO: 13-14)，以 及缺失-818—814(5’-GTCA_3’)及-44—41 (5’_GTCA_3’)兩個 AP-1 結(jié)合位點的 cyclin Dl-200-luc(序列見SEQ ID NO 15，所用引物序列為P13和P14，序列見SEQ ID NO: 16-17)。利用熒光素酶報告系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，缺失-818—814 (5’-GTCA_3’) AP-I結(jié)合 位點的cyclin Dl-900-luc, cyclin Dl啟動子活性有大幅降低，為0.85倍(由1.378降 為0.207)，說明AP-I的結(jié)合對cyclin Dl啟動子活性的提高起極其重要的作用，但與 pcDNA-SIRTl共轉(zhuǎn)后cyclin Dl-900-luc啟動子活性仍有0.4倍(由0.207降為0.123) 降低；而同時缺失-818—814 (5’-GTCA-3’)及-44—41 (5’_GTCA_3’) AP-1 結(jié)合位 點的cyclin Dl-200-luc, cyclin Dl啟動子活性降低0.94倍(由1.378降為0.088)，與 pcDNA-SIRTl 共轉(zhuǎn)后 Cyclin Dl-200-luc 僅有 0.1 倍(由 0.088 降為 0.078)降低，這說 明-44—41 (5’-GTCA_3’) AP-I結(jié)合位點對于SIRTl調(diào)節(jié)cyclin Dl的啟動子活性很重 要。為此，進一步將-44—41(5’-01€入-3’)入 -1的結(jié)合位點突變?yōu)?’-0^^-3’， 獲得cyclin Dl-APm-Iuc (序列見SEQ ID NO: 18，所用引物序列為P15和P16，序列見 SEQ ID NO 19-20)。突變了 AP-I結(jié)合位點后cyclinDl啟動子活性仍有大幅降低，為 0.79 倍(由 1.378 降為 0.29)，與 pcDNA-SIRTl 共轉(zhuǎn)后 cyclin Dl-APm-Iuc 僅有 0.19 倍 (由0.29降為0.236)降低，這一結(jié)果說明SIRTl對cyclinDl啟動子活性的降低效應(yīng)可以 由-44—41(5’-GTCA-3’)AP-l結(jié)合位點的缺失而部分消除，提示轉(zhuǎn)錄因子AP-1在SIRTl 對cyclin Dl表達降低的調(diào)節(jié)中起重要作用，而且-44—41 (5’_GTCA_3’) AP-1結(jié)合位點對 AP-I參與SIRTl對cyclinDl的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用。結(jié)果見圖21和圖22。實施例10SIRT1、c-Fos> c_Jun 結(jié)合在 cyclin Dl 啟動子區(qū)研究發(fā)現(xiàn)，SIRTl調(diào)節(jié)基因表達的基本模式是通過結(jié)合序列特異的轉(zhuǎn)錄因子， 從而被募集到特定基因的啟動子或增強子上，對該基因進行調(diào)控，或者SIRTl可以作為 去乙?；钢苯尤ヒ阴；M蛋白 H3、H4 (Leibiger and Berggren 2006) (Vaquero, Scher et al.2004)來調(diào)節(jié)基因表達。上述結(jié)果證明轉(zhuǎn)錄因子AP-I在SIRTl對cyclin Dl表達降低 的調(diào)節(jié)中起重要作用，那么SIRTl是否通過AP-I被募集到cyclin Dl的啟動子上，從而對 其進行調(diào)控？通過ChIP實驗發(fā)現(xiàn)在VSMC中SIRTl可以結(jié)合在cyclin Dl的啟動子區(qū)，且 與c-Fos/c-Jun有共同的結(jié)合區(qū)域(圖23)。其中普通PCR中擴增包括AP-I結(jié)合位點的 大鼠 cyclin D1 啟動子序列的引物為P17 5' GAGGGGGATACCAGAGGACC 3‘ (SEQ ID NO 21)，P18 5' CCTGGCATGTACTCGCTCAAAA 3‘ (SEQ ID NO 22)，產(chǎn)物 長度409bp ；所用實時定量PCR引物為P19 5' TGCTCCCGAGCCCCCT 3' (SEQ ID NO 23)，P20 5' CCCTGTAGTCCGAGTGACGTTACT 3 ‘ (SEQ ID NO 24)，產(chǎn)物 長度109bp。實施例IlSIRTlRNAi干擾增加了 c_Fos和c_Jun在cyclin Dl啟動子區(qū)的招募通過ChIP實驗還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)SIRTl被干擾掉后，c-Fos和C-Jun在cyclin Dl啟動 子區(qū)結(jié)合增加，提示SIRTl可能影響C-Fos和C-Jun被募集到cyclin Dl啟動子區(qū)。實時
定量PCR結(jié) 果見圖24。
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Nature.369 (6482) 669-71.
序列表
<110>中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所
<120>SIRT1在制備下調(diào)細胞周期蛋白如cyclin D1表達的藥物中的用途
<130>890091CG
<160>24
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223> 引物 P1
<400>1
cttcaggtca agggatggta t 21
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223> 引物 P2
<400>2
gcgtgtctat gttctgggta t 21
<210>3
<211>18<212>DNA <213>人工 <220>
<223> 引物 P3 <400>3
ccccagagcg tgaggtgc18
<210>4 <211>20 <212>DNA <213>人工 <220>
<223> 引物 P4 <400>4
cgtacaagtt gtcggccagc20
<210>5 <211>19 <212>DNA <213>人工 <223> 引物 P5 <400>5
gcgaagtgga gaccatccg19
<210>6 <211>19 <212>DNA <213>人工 <220>
<223> 引物 P6 <400>6
gtccacatct cggacgtcg19
<210>7 <211>21 <212>DNA <213>人工 <220>
<223> 引物 P7 <400>7
gagagggaaa tcgtgcgtga c21
<210>8 <211>23<210>11<211>31<212>DNA<213> 人工<220><223> 引物 P10<400>11agtccgctcg agcgggttgg gtccggtgtc t31<210>12<211>972<212>DNA<213> 人工<220><223> 大鼠 cyclin D1 報告基因 cyclin Dl-900-luc 序列<400>12ctgtaagaag gcaaatctca gaccccatcc ccacccccac cccaccccca gcgaggagga 60atagatgaag gaaataatgg ccaccatctt gagctgttgc tgagattttc ggggttttat120tttattttat ttttgagcga gtacatgcca ggctggggac cctttaaagc tcaaagatac180ccctctggcc ctttgcaacc accccagtgc gccaggaggg agcctgcacg agaacttagg 240gctcgtctgg catcttcgcc tgttacacag ttcctgaatt ttacacgtgt tgatgaaatt300gaaagaagtc gaggacgacg ggatttctta gcaatcggtc cgcccgtggg tgccctcgtg 360gcgtcctcgg aaacgcgccc attctctccg cttaagtata gggtgtcctt gcacccccca 420
cgatcccctt ccatacattc tttcttggct tgcgtgtggc ctggcctccc tcctagctgt480ccccctgtcc agagccgccg ctaccccacc ttcacaggtc tcggaggacc cacttgggga 540aagaagcccc cctccccatt gcccttgccc cgctctttcc cagcttagag agaagcagtc 600ccggcgattt gcatatctac gaaggccgag gggggagggg gcaggctttg ggtttgtccc 660cccccacccc cgccgctcac tgctcccgag ccccctcccc ctgcgcccgc ctcggcccgc 720cccccctcct ttttctctgc ccggctttga tctctgctta acaacagtaa cgtcactcgg780actacagggg agttttgttg aagttgcaaa gtcctgcagc ctccagaggg ctgttggcgc 840agtagcagag agctgcagac tccgcgcgct ccggagaccg gtcgtagagc gcgaggcagc 900gcgcgtcagc agcagacacc ggacccaacc cgctcgagat ctgcgatcta agtaagctgg 960catccgtacg tg972<210>13<211>37<212>DNA<213> 人工<220><223> 引物 Pll<400>13
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agtccgacgc gttaagaagg caaatctcag accccat37<210>14<211>31<212>DNA<213> 人工<220><223> 引物 P12<400>14agtccgctcg agcgggttgg gtccggtgtc t31<210>15<211>197<212>DNA<213> 人工<220><223> 大鼠 cyclin D1 報告基因 cyclin Dl-200-luc 序列<400>15ctcggactac aggggagttt tgttgaagtt gcaaagtcct gcagcctcca gagggctgtt60ggcgcagtag cagagagctg cagactccgc gcgctccgga gaccggtcgt agagcgcgag 120gcagcgcgcg tcagcagcag acaccggacc caacccgctc gagatctgcg atctaagtaa 180gctggcatcc gtacgtg197<210>16<211>37<213> 人工<220><223> 引物 P13<400>16agtccgacgc gtctcggact acaggggagt tttgttg37<210>17<211>31<212>DNA<213> 人工<220><223> 弓丨物 P14<400>17agtccgctcg agcgggttgg gtccggtgtc t31<210>18<211>1060<212>DNA<213> 人工
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<223> 大鼠 cyclin D1 報告基因 cyclin Dl-APm-luc 序列
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ccctgtagtc cgagtgacgt tact
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[037權(quán)利要求
1.SIRT1在制備下調(diào)哺乳動物包括人的細胞周期蛋白表達的藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述細胞周期蛋白是cyclinDl、cyclinE 或 CDK2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述藥物是提純的蛋白質(zhì)類型的藥物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于所述藥物的劑型為適于蛋白質(zhì)藥物應(yīng)用的 任何劑型。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于所述藥物的劑型為注射劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述藥物是表達SIRTl蛋白質(zhì)的重組核酸 構(gòu)建體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于所述重組核酸構(gòu)建體的表達載體是任何適 用于基因治療的表達載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于所述表達載體是病毒載體或非病毒載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于所述病毒載體選自重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、 腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、單純皰疹病毒載體或牛痘苗病毒載體，所述非病毒載體 選自噬菌體載體或復(fù)制子載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及SIRT1在制備下調(diào)細胞周期蛋白如cyclin D1表達的藥物中的用途。特別地，所述藥物是提純的蛋白質(zhì)類型的藥物，其劑型可以是適于蛋白質(zhì)藥物應(yīng)用的任何劑型。所述藥物是能表達SIRTI蛋白的重組核酸構(gòu)建體，其表達載體可以是任何適用于基因治療用的表達載體，包括病毒載體如重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、單純皰疹病毒載體、牛痘苗病毒載體等和非病毒載體如噬菌體載體、復(fù)制子載體等。
文檔編號A61P9/00GK102008718SQ20091009232
公開日2011年4月13日 申請日期2009年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月7日
發(fā)明者劉德培, 張慶軍, 張慧娜, 李莉, 陳厚早, 高鵬 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所