專利名稱：組織工程化乳房移植物及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)工程中用組織工程方法構(gòu)建人工器官技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及 一種組織工程化乳房移植物及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
由于種族、遺傳及營養(yǎng)等原因，相當(dāng)一部分的女性乳房發(fā)育不良或松弛萎縮。隆乳 術(shù)以其立竿見影的效果受到廣大愛美女性的青睞。乳房填充是目前用來改善女性乳房發(fā)育 不良或松弛萎縮，以及由于腫瘤切除或外傷等原因造成的乳房缺失的治療方法。在美國每 年有20萬女性接受隆胸手術(shù)，中國國內(nèi)每年隆胸人數(shù)尚無準(zhǔn)確統(tǒng)計，而文獻(xiàn)推測人數(shù)可能 在30萬至50萬之間。目前，目前國內(nèi)外醫(yī)學(xué)隆乳的方法大致可分為注射法和手術(shù)法。注 射法使用的材料有自體脂肪顆粒；而手術(shù)法則使用硅膠囊假體置入隆乳。目前，國內(nèi)外最常用的隆乳方法包括(1)自體脂肪注射。自體脂肪注射隆胸已開 展多年，但因其超過50 %的吸收率及可能存在脂肪液化、感染、血腫等并發(fā)癥，注射脂肪液 化所引起的囊腫亦可干擾乳腺腫瘤的診斷，限制了該技術(shù)的應(yīng)用。移植過程中脂肪細(xì)胞的 損傷，受區(qū)早期血液循環(huán)建立的狀況，移植的脂肪細(xì)胞因缺血、缺氧而液化，成熟的脂肪細(xì) 胞沒有增殖能力等，可能是造成脂肪注射隆胸后高吸收率的原因。(2)假體置入法隆乳。根 椐硅膠彈性膜內(nèi)的材料不同，可分為硅凝膠假體和鹽水充注式假體。由于假體是異物，植入 后導(dǎo)致各種并發(fā)癥的發(fā)生。隆乳術(shù)后假體包膜攣縮是術(shù)后最常見的并發(fā)癥，硅膠彈性膜做 為一種異物置入人體后引起局部組織反應(yīng)，形成纖維包膜。嚴(yán)重時發(fā)生乳房硬化，發(fā)生率高 達(dá) 4. 76% -6. 19%。組織工程為乳房填充和重建提供一種新的方法。組織工程的基本原理是從機體獲 取少量活組織，將功能細(xì)胞從組織中分離出來并在體外進(jìn)行培養(yǎng)、擴增，然后與可降解、吸 收的支架材料按一定比例混合，植入體內(nèi)病損部位，生物材料在體內(nèi)逐漸被降解和吸收，植 入的細(xì)胞在體內(nèi)增殖和分泌細(xì)胞外基質(zhì)，最后形成所需的組織或器官。乳房組織工程是利 用組織工程原理對乳房進(jìn)行填充或再造，其目的是改善其外觀。乳房的形狀和大小則主要 由脂肪組織維持。目前，乳房組織工程的主要難題在于脂肪組織的形成，應(yīng)用于乳房的組織 工程移植物尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)狀況，本發(fā)明提供一種組織工程乳房移植物，該組織工程乳房 移植物為可注射型材料負(fù)載自體脂肪干細(xì)胞構(gòu)成，制備簡便，通過實驗驗證可產(chǎn)生新生脂 肪組織。制備的組織工程乳房移植物，最終轉(zhuǎn)化為自體脂肪，不存在免疫排斥問題。脂肪干細(xì)胞(Adipose-Derived Stem Cells,ADSCs)具有易獲取、增殖快及成脂分 化能力的特點，可作為脂肪組織工程的種子細(xì)胞。I型膠原蛋白是成熟的產(chǎn)品，本實驗使用 的I型膠原蛋白(collagen type I，COL)是通過醋酸提取，氯化鈉沉淀、磷酸氫二鈉沉淀 等步驟制備的(參考文獻(xiàn) Birkedal-Hansen H. Catabolism and turnover of collagen Collagenases. Methods Enzymol, 1987，144 :140_171)。I 型膠原蛋白在酸性、低溫的狀態(tài) 下為液態(tài)，在中性、常溫的狀態(tài)下會迅速凝結(jié)，本發(fā)明利用這個特點，使用其作為可注射水 凝膠支架。I型膠原凝膠支架作為水凝膠類支架的一種，生物相容性好，可降解，可以實現(xiàn)與 種子細(xì)胞的良好的復(fù)合。本發(fā)明將I型膠原凝膠與脂肪干細(xì)胞復(fù)合后直接注射于大鼠乳腺 皮下，研究脂肪干細(xì)胞與I型膠原凝膠復(fù)合體在乳腺的分化情況，探討將其應(yīng)用于乳房缺 損修復(fù)的可行性。相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下特點和優(yōu)點(1)移植物最終轉(zhuǎn)化為自體脂肪組織，不存在免疫排斥問題。比較假體移植，不易 出現(xiàn)包膜攣縮等并發(fā)癥；比較脂肪游離移植，不易出現(xiàn)感染，脂肪液化等并發(fā)癥。(2)采用ADSCs作為組織工程的種子細(xì)胞，該細(xì)胞具有以下優(yōu)點首先，取材方便 是其最大的優(yōu)勢，脂肪組織分布廣泛，而且吸脂手術(shù)屬于技術(shù)成熟的常規(guī)手術(shù)，手術(shù)風(fēng)險 小。其次，ADSCs在脂肪組織中含量豐富，每250-500mL脂肪抽吸物中的細(xì)胞產(chǎn)量可達(dá)109 個。最后，ADSCs增殖快，成脂分化能力強，冷凍保存后增殖分化能力無明顯改變。由此可 見，ADSCs適合作為脂肪組織工程的種子細(xì)胞。(3)1型膠原凝膠作為種子細(xì)胞的支架。膠原是脊椎動物和人體的最主要結(jié)構(gòu)蛋 白，約占機體總蛋白的20% 30%。其中以I、II、III型最為常見，約占體內(nèi)總膠原蛋白的 80% 90%。膠原蛋白生物相容性好，作為支架可促進(jìn)細(xì)胞粘附，降解產(chǎn)物對人體無害。作 為美國FDA批準(zhǔn)的注射移植材料，膠原蛋白使用的長期安全性已經(jīng)在臨床上得到證實。本 發(fā)明經(jīng)實驗證明，I型膠原支架可完全降解，降解產(chǎn)物未引起周圍乳腺組織炎癥反應(yīng)。(4)可注射支架在骨、軟骨及脂肪組織工程已有開展，但應(yīng)用于乳房組織工程尚未 見報道。本發(fā)明采用可注射支架復(fù)合細(xì)胞的方法構(gòu)建組織工程乳房移植物，具有微創(chuàng)、美 觀、可重復(fù)的優(yōu)點，更符合整形外科的發(fā)展趨勢。(5)通過本發(fā)明的實驗發(fā)現(xiàn)，脂肪干細(xì)胞/I型膠原凝膠復(fù)合體(ADSCs-COL)注射 后，未見大鼠乳腺皮膚有明顯紅腫及感染等炎癥表現(xiàn)，病理切片顯示注射處乳腺組織未見 明顯炎癥反應(yīng)。說明其組織相容性好，無排斥反應(yīng)。實驗組見新生脂肪組織形成，而對照組 未見明顯新生脂肪組織，說明ADSCs在三維膠原支架內(nèi)能增殖分化為成熟脂肪組織。綜上所述，本發(fā)明所述的組織工程乳房移植物采用可注射型材料負(fù)載自體脂肪干 細(xì)胞構(gòu)成，制備簡便，通過實驗證實可產(chǎn)生新生脂肪組織，該組織工程乳房移植物最終轉(zhuǎn)化 為自體脂肪，不存在免疫排斥問題，從而為乳房填充和重建提供一種新的解決方案。


圖1為顯微鏡圖(100倍)，顯示經(jīng)分離培養(yǎng)至第三代的大鼠脂肪干細(xì)胞。圖2為脂肪干細(xì)胞經(jīng)成脂誘導(dǎo)2周后油紅0染色的顯微鏡圖(100倍)，圖中紅色 為脂滴。圖3為脂肪干細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)4周后von Kossa染色的顯微鏡圖(100倍)，圖中 黑色為鈣鹽沉積。圖4為大鼠注射脂肪干細(xì)胞/I型膠原凝膠復(fù)合體(ADSCs-COL)后的外觀照片。圖5為大鼠注射8周后的解剖照片。圖5a為實驗組，見ADSCs-COL注射處新生脂 肪樣組織形成；圖5b為對照組，見單純C0L注射未見明顯脂肪形成。
圖6為解剖后取出的脂肪組織的照片。圖6a為實驗組，顯示注射處的脂肪組織的 大小；圖6b為對照組，顯示注射處的脂肪組織的大小。圖7為新生組織HE染色的顯微鏡圖(100倍)，圖中見支架已完全降解，脂肪組織 形成，而無炎癥反應(yīng)表現(xiàn)。圖8為新生組織油紅0染色的顯微鏡圖(400倍)，紅色為脂滴，證明為成熟脂肪組
幺口
具體實施例方式以下結(jié)合實驗來說明本發(fā)明的技術(shù)方案和技術(shù)效果。實驗動物和主要材料、儀器實驗動物成年雌性Sprague Dawley大鼠10只，清潔級，體重160 200g，9 10 周齡。購自中山大學(xué)實驗動物中心。主要材料胎牛血清FBS、DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco公司，美國)；吲哚美辛、3_異丁 基-1-甲基黃嘌呤、地塞米松、牛胰島素、抗壞血酸、II型膠原酶(Sigma公司，美國)；甘 油磷酸鈉(Fluka公司，美國)；油紅0(AmresCO公司，美國)；I型膠原蛋白(生友生物技術(shù) 有限公司)。主要儀器倒置相差顯微鏡(Nikon公司，日本)；C02培養(yǎng)箱(Heraeus公司，德 國)。實施例一大鼠脂肪干細(xì)胞(ADSCs)的制備大鼠ADSCs的分離培養(yǎng)以10%水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，無菌條件下取雙側(cè)腹股溝脂肪墊 于PBS液中。用PBS液將脂肪墊洗3次，去除可見血管及纖維，將其剪碎。0.075% II型膠 原酶37°C消化30min (每lOmin吹打1次)。等體積含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液中和膠 原酶，1100r/min離心5min，去除上清和脂肪組織。DMEM/F12完全培養(yǎng)液重懸，400目細(xì)胞 篩(孔徑60iim)過濾。以lX105/ml接種，37°0、5%0)2和95%濕度的條件下培養(yǎng)，24小時 后換液，去除未貼壁細(xì)胞、脂滴及殘渣。之后每72小時換液一次。貼壁細(xì)胞融合達(dá)80% 90%后，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，按1 3傳代接種。 大鼠ADDSCs的形態(tài)觀察倒置相差顯微鏡下觀察，剛接種的原代細(xì)胞呈圓形，與脂滴一起懸浮于培養(yǎng)液中， 24h換液后貼壁細(xì)胞呈圓形、多角形或梭形。此后細(xì)胞不斷增殖，以梭形細(xì)胞為主。6 7 天細(xì)胞融合成單層，排列有一定的方向性，可消化后傳代。傳代后的ADSCs增殖生長迅速， 3 4天后細(xì)胞完全融合。連續(xù)傳10代，細(xì)胞的形態(tài)無明顯變化。圖1顯示大鼠第三代脂 肪干細(xì)胞的形態(tài)。大鼠ADDSCs的成脂、成骨誘導(dǎo)分化成脂誘導(dǎo)劑10_6moL/L地塞米松，10mg/L胰島素，0. 5mmol/L 3-異丁基-1-甲基 黃嘌呤(IBMX)禾P 0. 2mmol/L吲哚美辛。成骨誘導(dǎo)劑10_7moL/L地塞米松，50mg/L抗壞血酸，lOmmol/L0-甘油磷酸鈉。采用第3代ADSCs細(xì)胞，以105/孔接種于6孔板，待其生長融合后，于普通培養(yǎng)液
5中分別加入上述成脂誘導(dǎo)劑和成骨誘導(dǎo)劑進(jìn)行培養(yǎng)。實驗組、對照組均含有4例樣本。成脂誘導(dǎo)2周后進(jìn)行油紅0染色檢測(油紅0，Amresco公司，美國)。PBS洗滌 三次，10%甲醛鈣液固定10分鐘，油紅0工作液密閉染15分鐘，蒸餾水沖洗，蘇木精復(fù)染， 立即在顯微鏡下觀察。成骨誘導(dǎo)4周后進(jìn)行von Kossa染色檢測(硝酸銀，上海精細(xì)化工材料研究所； 硫代硫酸鈉，廣州化學(xué)試劑廠)。von Kossa染色法PBS洗滌三次，10%甲醛室溫固定30分 鐘。蒸餾水沖洗，加入5% (wt/vol)硝酸銀溶液，避光30分鐘，然后置紫外線下照射60分 鐘，加入5% (wt/vol)硫代硫酸鈉30分鐘，蒸餾水沖洗，立即在顯微鏡下觀察。大鼠ADSCs的成脂、成骨誘導(dǎo)分化的鑒定經(jīng)成脂誘導(dǎo)2周后，如圖2所示，油紅0染色顯示細(xì)胞胞漿內(nèi)布滿大小不一的紅色 脂滴顆；而非誘導(dǎo)組未見明顯脂滴形成。說明該細(xì)胞具備向脂肪細(xì)胞方向分化的能力。經(jīng)成骨誘導(dǎo)4周后，如圖3所示，Von Kossa染色可見由于細(xì)胞及其周圍附著的鈣 鹽與硝酸銀發(fā)生置換反應(yīng)而被染成黑色，證明此時細(xì)胞已發(fā)生礦化；而非誘導(dǎo)組未見明顯 鈣鹽沉積。Von Kossa染色說明該細(xì)胞具備向成骨細(xì)胞方向分化的能力。實施例二 組織工程化乳房移植物的構(gòu)建脂肪干細(xì)胞/I型膠原凝膠復(fù)合體(ADSCs-COL)的構(gòu)建在構(gòu)建組織工程化乳房移植物之前24小時使用上述成脂誘導(dǎo)劑培養(yǎng)細(xì)胞。注射 前將10瓶(25cm2培養(yǎng)瓶)生長融合的第3代ADSCs細(xì)胞消化離心后，加入培養(yǎng)液至540 yl 中，含細(xì)胞數(shù)量約2 X107個。I型膠原蛋白溶液1型膠原蛋白濃度5mg/ml，融解于0. 006mol/L乙酸。于冰浴 條件下，將400 ill I型膠原蛋白溶液加入到24iU 0. lmmol/L NaOH中，立刻混勻，再加入 461!110\ 83，混勻后測定？11值為7。再加入上述540 yl的細(xì)胞懸液，形成脂肪干細(xì)胞/ I型膠原凝膠復(fù)合體(膠原終濃度為2mg/ml，細(xì)胞密度為2X107ml)。室溫(20-25°C )下 放置30分鐘溶液可凝固。大鼠自體注射用10%水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，術(shù)區(qū)消毒。注射器抽取 lmlADSCs-COL凝膠，距乳頭1cm處皮下進(jìn)針，潛行至乳頭下方，注射平面位于乳腺與胸肌之 間，將ADSCs-COL凝膠注射入右上側(cè)乳腺(實驗組)，拔針，進(jìn)針點壓迫10秒。同法在左上 側(cè)乳腺注射C0L凝膠1ml (對照組)。共注射10例。注射后定期觀測大鼠乳腺皮膚情況。8周后，麻醉并解剖大鼠，觀測有無新生組織 形成，測量新生組織濕重，新生組織分別切片，進(jìn)行油紅0染色及HE染色。統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 16. 0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用 t檢驗，P值< 0. 05為有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果膠原凝膠注射后，可見乳腺區(qū)域局部隆起，如圖4所示。定期觀察，未見大鼠乳腺 皮膚有明顯紅腫及感染等炎癥表現(xiàn)。8周后解剖大鼠，實驗組可見乳腺與胸肌之間有脂肪樣新生組織形成，如圖5a所 示，注射處脂肪組織大小如圖6a所示，平均濕重為(123+/-18)mg ；對照組未見明顯新生組織形成，如圖5b所示，注射處脂肪組織大小如圖6b所示，平均濕重為(19+/-7)mg。兩組間 存在統(tǒng)計學(xué)差異，P< 0.01。新生組織HE染色結(jié)果表明，支架已完全降解，有脂肪組織形成，而無炎癥反應(yīng)表 現(xiàn)。如圖7所示。新生組織油紅0染色結(jié)果表明，新生組織為成熟脂肪組織。如圖8所示。
權(quán)利要求
一種組織工程化乳房移植物，其特征在于以可注射性材料I型膠原凝膠作為載體支架，以脂肪干細(xì)胞為種子細(xì)胞，所述種子細(xì)胞附著于載體支架上，形成脂肪干細(xì)胞/I型膠原凝膠復(fù)合體，膠原終濃度為2mg/ml，細(xì)胞密度為2×107/ml。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程化乳房移植物，其特征在于所述脂肪干細(xì)胞是采 用培養(yǎng)至第3代，構(gòu)建組織工程化乳房移植物之前24小時加入成脂誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)后的脂 肪干細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組織工程化乳房移植物，其特征在于所述的成脂誘導(dǎo)劑包 括以下成分10_6moL/L地塞米松，10mg/L胰島素，0. 5mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤和 0. 2mmol/L吲哚美辛。
4.如權(quán)利要求1所述的組織工程化乳房移植物的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟A.常規(guī)方法分離和培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞，培養(yǎng)至第3代；B.在構(gòu)建組織工程化乳房移植物之前24小時使用成脂誘導(dǎo)劑培養(yǎng)上述脂肪干細(xì)胞；C.將步驟B所得的脂肪干細(xì)胞消化、離心后，加入培養(yǎng)液，調(diào)整為含細(xì)胞數(shù)量約2X107個；D.配制I型膠原蛋白溶液于冰浴條件下，通過加入氫氧化鈉溶液及磷酸鹽緩沖液，將 酸性的I型膠原蛋白溶液PH值調(diào)為7 ；E.在上述I型膠原蛋白溶液中加入步驟C所得的脂肪干細(xì)胞懸液，20-25°C放置30分 鐘，凝固形成脂肪干細(xì)胞/I型膠原凝膠復(fù)合體，膠原終濃度為2mg/ml，細(xì)胞密度為2X107/ ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的組織工程化乳房移植物的構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟 B中的成脂誘導(dǎo)劑包括以下成分10_6moL/L地塞米松，10mg/L胰島素，0. 5mmol/L3-異丁 基-1-甲基黃嘌呤和0. 2mmol/L吲哚美辛。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)工程中用組織工程方法構(gòu)建人工器官技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種組織工程化乳房移植物及其構(gòu)建方法。木發(fā)明所述的組織工程化乳房移植物，以可注射性材料I型膠原凝膠作為載體支架，以脂肪干細(xì)胞為種子細(xì)胞，所述種子細(xì)胞附著于載體支架上，形成脂肪干細(xì)胞/I型膠原凝膠復(fù)合體，膠原終濃度為2mg/ml，細(xì)胞密度為2×107/ml。本發(fā)明所述的組織工程乳房移植物采用可注射型材料負(fù)載自體脂肪干細(xì)胞構(gòu)成，制備簡便，通過實驗證實可產(chǎn)生新生脂肪組織，該組織工程乳房移植物最終轉(zhuǎn)化為自體脂肪，不存在免疫排斥問題，從而為乳房填充和重建提供一種新的解決方案。
文檔編號A61F2/12GK101850132SQ20091003834
公開日2010年10月6日 申請日期2009年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月31日
發(fā)明者劉祥廈, 唐慶, 張毅, 曾瑞曦, 朱家愷, 程鋼, 蘇愛云, 許揚濱, 許澍洽, 黎志明 申請人:中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院