專利名稱：哈維氏弧菌重組外膜蛋白Ompk微球疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微球疫苗。本發(fā)明還涉及該微球疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
弧菌是一類革蘭氏陰性、具極生鞭毛、能運(yùn)動、無芽胞的短桿菌或弧形細(xì) 菌，是海洋環(huán)境中最常見的細(xì)菌類群之一，部分種類為海洋生物的病原菌。哈
維氏弧菌(f%Wo Aarvej;/， Vh)是常見的重要致病菌之一，可感染多種養(yǎng)殖動 物，帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來，海水魚弧菌疫苗在防治弧菌病方面發(fā)揮越 來越重要的作用。漁用疫苗的免疫接種途徑主要有四種注射法、噴霧法、浸 泡法和口服法，注射法具有用量少和免疫效果好的優(yōu)點(diǎn)，但較費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、操 作不便、易損傷魚體等缺陷，難以大規(guī)模推廣。噴霧法雖有較好的試驗(yàn)效果， 但需要疫苗噴射器、傳送帶等專用設(shè)備配置，也難以推廣使用；而浸泡法和口 服法是通過魚類的黏膜系統(tǒng)如體表、鰓、后腸等對抗原的攝取而進(jìn)行免疫，免 疫手段簡單、實(shí)用，適合養(yǎng)殖生產(chǎn)中的大規(guī)模免疫，其中浸泡法適合于魚種階 段的免疫，口服法適合于投喂配合飼料的大規(guī)模養(yǎng)殖魚群，不受魚的大小及時(shí) 間的限制，對魚也不產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，易于多次重復(fù)免疫。哈維氏弧菌重組外膜 蛋白Ompk具有良好的免疫原性，且與溶藻弧菌、副溶血弧菌19個(gè)分離株Ompk 基因序列及氨基酸同源性都較高(71% 100%)，有良好的交叉保護(hù)性。但蛋 白類亞單位疫苗口服使用時(shí)易受到免疫動物胃腸道蛋白酶的消化，需要有效的 投遞載體和制備方法將亞單位疫苗包裹制成粒徑在某一范圍的微球。將疫苗微球拌飼投喂免疫魚，既避免蛋白受胃腸道消化酶及酸性環(huán)境的影響降解，又使
其能夠在魚類后腸被有效吸收利用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有弧菌病疫苗注射或浸泡免疫存在的缺點(diǎn)，提供一 種可口服的弧菌微球疫苗及其制備方法，解決漁用疫苗在生產(chǎn)實(shí)踐中操作性難 的問題。
本發(fā)明將海水魚哈維氏弧菌重組外膜蛋白Ompk微球疫苗與生物可降解高 分子材料通過乳化、干燥制得可口服的微球疫苗，生物可降解高分子材料為殼 聚糖、海藻酸鈉。
微球疫苗的制備方法包括以下步驟
(1) 將攜帶Ompk基因的pBV220原核表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌工程菌株接種含 50pg/ml氨芐青霉素的LB平板，置28"C培養(yǎng)18—20h;挑取單菌落接種于LB液體 培養(yǎng)基，3(TC培養(yǎng)12h，然后按l: 100轉(zhuǎn)接于LB液體培養(yǎng)基，3(TC培養(yǎng)6h，將溫 度急劇升到42'C,誘導(dǎo)培養(yǎng)5-7h，離心收集誘導(dǎo)后菌體，超聲波破碎，提取包涵 體。包涵體溶解復(fù)性，過濾除菌，測定重組蛋白濃度，4。C保存?zhèn)溆谩?br> (2) 重組蛋白溶液與等體積的2%海藻酸鈉溶液混和，4000 6000r/min乳 化5 10min。
(3) 將上述乳液與等體積2%殼聚糖溶液混和，8000 11000r/min乳化5 10min。
(4) 將(3)所得乳液經(jīng)噴霧干燥儀脫水制成微球疫苗干粉。 本發(fā)明方法簡單合理，生產(chǎn)穩(wěn)定可靠，產(chǎn)品收率達(dá)80%以上。成品具有抗
原含量高、緩釋時(shí)間長、毒副作用小、便于大規(guī)模使用等優(yōu)點(diǎn)。制成的微球疫 苗口服免疫后可較長時(shí)間刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，對供試魚具有較高的相對保護(hù)率，可有效預(yù)防海7jC養(yǎng)殖魚類弧菌病。


圖1誘導(dǎo)后的菌體及純化的重組蛋白Ompk 圖2光學(xué)顯微鏡下的微球疫苗圖片(400x) 圖3掃描電鏡下的微球疫苗圖片(1000x) 圖4 口服微球疫苗后斜帶石斑魚血清抗體效價(jià)
具體實(shí)施例方式
以下就本發(fā)明的制造、試驗(yàn)例舉例說明。 制造例制備哈維氏弧菌重組外膜蛋白Ompk微球疫苗 將攜帶Ompk基因的pBV220原核表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌工程菌株接種含 50pg/ml氨芐青霉素的LB平板，置2fC培養(yǎng)18—20h;挑取單菌落接種于LB 液體培養(yǎng)基，3(TC培養(yǎng)12h，然后按h 100轉(zhuǎn)接于LB液體培養(yǎng)基，30'C培養(yǎng) 6h，將溫度急劇升到42"C，誘導(dǎo)培養(yǎng)7h，離心收集誘導(dǎo)后菌體，超聲波破碎， 提取包涵體，包涵體經(jīng)2—4M的脲素溶液洗滌后，用8M脲素溶液溶解，經(jīng)切 向流超濾系統(tǒng)透析濃縮，得到純度較高的重組蛋白(圖l)。測定重組蛋白濃度， 過濾除菌后，(C保存?zhèn)溆?。在室溫下將重組蛋白溶液與等體積的2%海藻酸鈉 溶液混和，4000 6000r/min乳化5 10min，將得到的乳液與等體積的2%殼聚 糖溶液混和，8000 11000r/min再乳化5 10miri，再將所得乳液經(jīng)噴霧干燥器 脫水制成微球疫苗干粉。每克微球疫苗含重組蛋白16.7mg，微球疫苗粒徑范圍 0—10^im，見圖2、圖3。
試驗(yàn)例哈維氏弧菌重組外膜蛋白Ompk微球疫苗免疫效果 試驗(yàn)l.微球疫苗安全性試驗(yàn)經(jīng)口灌喂10尾健康石斑魚(體重約50g)殼聚糖一海藻酸鈉一哈維氏弧菌 重組外膜蛋白Ompk微球疫苗，每尾魚灌喂0,2g，連續(xù)觀察7d，石斑魚均無中 毒癥狀及死亡情況發(fā)生。
試驗(yàn)2.對照試驗(yàn)
將健康石斑魚隨機(jī)分成三組，每組90尾，第一組為口服微球疫苗組，第二 組為口服Ompk蛋白組，第三組為對照組。分別將微球疫苗和Ompk蛋白疫苗 拌在詞料中，每天按體重的1%投喂飼料，微球疫苗按1.0g/kg魚體重投喂連續(xù) 投喂3d， 1周后加強(qiáng)免疫一次(連續(xù)投喂3d)，劑量與首次免疫相同，對照組投喂 不含疫苗的飼料。水溫為22-26 °C。
試驗(yàn)3.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測石斑魚血清抗體效價(jià) 首次免疫后的第7d、 14d、 21d、 28d、 35d、 42d、 49d、 56d，每組取3尾， 每尾靜脈取血0.2ml，室溫靜置2h， 4。C過夜，4000r/min離心10min收集血清， -20 。C保存?zhèn)溆谩?6孔ELISA板用含0.05 %多聚賴氨酸100|il包被液室溫處理 lh，低鹽洗液洗2次；用PBS調(diào)整抗原Ompk濃度，每孔加lOO)ilOmpk,包板 4。C過夜，低鹽洗液洗3次；加350pl 5%脫脂奶粉，22。C包被2h，用低鹽洗液 洗三次；用PBS兩倍稀釋血清，22。C包被2h或者4。C過夜，高鹽洗液洗五次； 加lOOpl鼠抗斜帶石斑魚IgM單抗室溫2h,高鹽洗液洗5次；加10(^1辣根過 氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG室溫2h，高鹽洗液洗5次；加OPD (鄰 苯二胺)顯色10min; 2mol/L硫酸終止。酶標(biāo)儀于波長450nm讀數(shù)。在加樣 品同時(shí)設(shè)PBS為陰性對照，結(jié)果S/P22.1判為陽性(S表示樣品OD值，P表 示陰性對照的OD值)。從圖4可以看出，首次免疫后微球疫苗組14d抗體效價(jià) 達(dá)27， 35d達(dá)到峰值21、可維持到42d，至56d效價(jià)仍達(dá)2 Ompk蛋白組抗 體效價(jià)不高(峰值24)。微球疫苗組抗體效價(jià)(峰值21())顯著高于Ompk蛋白溶液組(峰值24)與對照組。 試驗(yàn)4.免疫保護(hù)試驗(yàn)
在首次免疫28d和56d各攻毒一批。從各組隨機(jī)選30尾，用1.0xl08 CFU/ml 的EcGS020802菌株，以O(shè).lml /尾的劑量腹腔注射感染各組試驗(yàn)魚。水溫22— 26'C飼養(yǎng)觀察15d，記錄各組試驗(yàn)魚的發(fā)病和死亡情況?？诜⑶蛞呙缃M在首次 免疫28d后相對保護(hù)率為69.0%(表1 )，免疫56d后相對保護(hù)率為42.8%(表2)。
表1 首次免疫28d后各組的相對保護(hù)率
^活菌攻擊數(shù)存活數(shù) 存活率相對保護(hù)率 組別
(尾) (尾) (％) (%)
30 21 70.0 69.0
30 2 6.7 3.4
30 1 3.3 —
口月艮微 球疫苗組
口 服 Ompk蛋白組
對照組
表2首次免疫56d后各組的相對保護(hù)率
組別
口月艮微 球疫苗組
□ 月艮 Ompk蛋白組
對照組
活菌攻擊數(shù)存活數(shù) (尾) (尾)
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存活率相對保護(hù)率 (%) (%)
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權(quán)利要求
1. 一種哈維氏弧菌重組外膜蛋白Ompk微球疫苗，其特征在于其是由大腸桿菌表達(dá)的哈維氏弧菌重組外膜蛋白Ompk與生物可降解高分子材料通過乳化、干燥制得的微球疫苗。
2. 權(quán)利要求l所述的一種哈維氏弧菌重組外膜蛋白Ompk微球疫苗，其特征在 于生物可降解高分子材料優(yōu)選殼聚糖、海藻酸鈉。
3. —種哈維氏弧菌重組外膜蛋白Ompk微球疫苗的制備方法，其特征是包括以下步驟(1) 將攜帶Ompk基因的pBV220原核表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌工程菌株接種含 50jLig/m慮節(jié)青霉素的LB平板，置28t:培養(yǎng)18—20h，挑取單菌落接種于LB液體 培養(yǎng)基，30。C培養(yǎng)12h，然后按l: IOO轉(zhuǎn)接于LB液體培養(yǎng)基，30。C培養(yǎng)6h，將溫 度急劇升到42'C，誘導(dǎo)培養(yǎng)5-7h，離心收集誘導(dǎo)后菌體，超聲波破碎，提取包涵 體，包涵體溶解復(fù)性，過濾除菌，測定重組蛋白濃度，4'C保存?zhèn)溆茫?2) 重組蛋白溶液與等體積的2%海藻酸鈉溶液混和，4 000 6 000r/min 乳化5 10min;(3) 將(2)所得乳液與等體積2%殼聚糖溶液混和，8 000 11 000r/min 乳化5 10min;(4) 將(3)所得乳液經(jīng)噴霧干燥脫水制成微球疫苗干粉。
4. 權(quán)利要求3所述的一種哈維氏弧菌重組外膜蛋白0mpk微球疫苗的制備方法， 其特征是包涵體經(jīng)2—4M的脲素溶液洗滌后，用8M脲素溶液溶解，經(jīng)切向流超 濾系統(tǒng)透析濃縮，得到純度較高的重組蛋白。
5. 權(quán)利要求3所述的一種哈維氏弧菌重組外膜蛋白Ompk微球疫苗的制備方法，其特征在于所述干燥采用噴霧干燥儀。
6.根據(jù)權(quán)利3所述的哈維氏弧菌重組外膜蛋白Ompk微球疫苗的制備方法，其 特征在于制得的微球疫苗粒徑范圍為0 10pm。
全文摘要
本發(fā)明公開一種微球疫苗及其制備方法。該疫苗是將海水養(yǎng)殖魚類常見病原哈維氏弧菌的重組外膜蛋白Ompk與生物可降解高分子材料通過乳化、干燥制得的微球疫苗。本發(fā)明的微球疫苗制備工藝簡單，便于工廠化生產(chǎn)，生產(chǎn)穩(wěn)定可靠，使用安全、方便，產(chǎn)品收率達(dá)80％以上。成品具有抗原含量高、緩釋時(shí)間長、毒副作用小、便于大規(guī)模使用等優(yōu)點(diǎn)。制成的微球疫苗口服免疫后可較長時(shí)間刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，對供試魚具有較高的相對保護(hù)率，可有效預(yù)防海水養(yǎng)殖魚類弧菌病。
文檔編號A61K47/36GK101507815SQ20091003778
公開日2009年8月19日 申請日期2009年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月11日
發(fā)明者燕 任, 吳淑勤, 常藕琴, 李寧求, 石存斌 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所