專利名稱：一種通過去除或滅活巨噬細胞抑制因子-1而治療惡病質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種治療惡病質(zhì)的方法，具體地說，本發(fā)明涉及一種通過去除或滅活 惡病質(zhì)患者血液、血漿或血清中的巨噬細胞抑制因子-1，而治療惡病質(zhì)的方法。參考文獻本申請以申請?zhí)枮锳U2007905524，發(fā)明名稱為〃 一種治療惡病質(zhì)的方法〃，申請 日為2007年10月9日的在先申請要求優(yōu)先權(quán)。該申請的所有內(nèi)容在此作為參考。另外， 本申請說明書參閱國際專利申請?zhí)枮镻CT/AU2005/000525 (W0 2005/099746)，該申請的所 有內(nèi)容在此作為參考。
背景技術(shù)：
正常的體重控制對健康和幸福都非常重要。盡管低于平均體重也有問題，但肥胖 尤其可能會使受試者的發(fā)病率和死亡率有很大增加。事實上，惡病質(zhì)(典型表現(xiàn)為減重、 肌萎縮、疲乏、虛弱、明顯喪失胃口)顯著促進患有一些慢性疾病(如癌癥、慢性腎病、慢性 發(fā)炎和通常說的神經(jīng)性厭食的飲食紊亂)患者的死亡率。例如，在癌癥末期，惡病質(zhì)很常 見(大多發(fā)生于身患絕癥的癌癥患者)，與四分之一的癌癥相關(guān)死亡有關(guān)。不幸的是，體重 控制是一個復雜的，目前沒有完全了解的過程。然而，眾所周知，這個過程是多因素的，且 尤其是受食欲、食物攝取、食物能量轉(zhuǎn)化、能量利用和消耗的影響。而且，普遍認為，在調(diào)節(jié) 這個過程的不同方面時，存在大量的可溶性介質(zhì)，包括激素和細胞因子，如細蛋白、生長素、 黑素腎上腺皮質(zhì)激素、刺鼠相關(guān)性肽和神經(jīng)肽Y(NPY)。在本發(fā)明的探討工作中發(fā)現(xiàn)人類 TGF-β總科細胞因子，通常稱為巨噬細胞抑制因子-I(MIC-I)H在人體中一般低水平表 達，而在上皮惡性腫瘤，炎癥或傷口處顯著增加H1，這導致血清MIC-I水平的上升。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，患有如上皮癌末期或慢性腎病的患者的血清MIC-I水平上升，與過 度表達MIC-I的轉(zhuǎn)基因鼠中觀察到的血清水平呈相關(guān)性，且表現(xiàn)出顯著的失重。因此，有人 提議，患有與MIC-I表達增加呈相關(guān)性的慢性疾病患者的惡病質(zhì)是由于MIC-I過度表達或 MIC-I清除減少，且通過去除或滅活這些病人血液、血漿或血清中的MIC-I (如通過利用抗 MIC-I抗體)，有可能逆轉(zhuǎn)或減少失重的嚴重度。

發(fā)明內(nèi)容
因此，第一方面，本發(fā)明提供了一種治療或預(yù)防惡病質(zhì)的方法，包括將表現(xiàn)為惡病 質(zhì)或傾向于發(fā)展成惡病質(zhì)的受試者的血液(如全血)、血漿或血清進行活體外處理，從而使 所述血液、血漿或血清中的巨噬細胞抑制因子-I(MIC-I)去除或失活，然后，將處理后的血 液、血漿或血清返回到所述受試者。在一個優(yōu)選實施例中，本發(fā)明一種治療或預(yù)防惡病質(zhì)的方法，包括以下步驟(i)準備結(jié)合MIC-I的合適底物；( )活體外使受試者中的血液、血漿或血清與所述底物接觸，從而，存在于血液、血漿或血清中的MIC-I結(jié)合到底物上；(iii)分離底物與處理后的血液、血漿或血清；(iv)將處理后的血液、血漿或血清返回到受試者。第二方面，本發(fā)明提供了一種診斷或預(yù)防受試者惡病質(zhì)的方法，所述方法包括測 定所述受試者的MIC-I的量(特別是血清MIC-I水平)。


圖1為MIC-I初期到成熟過程的結(jié)構(gòu)圖，112個氨基酸形式，放射自顯影法顯示前 肽從成熟結(jié)構(gòu)域的切割；圖2為裸鼠體重與最大的鼠腫瘤達到Icm直徑時的人類血液中MIC-I血清水平之 間的關(guān)系圖；裸鼠移植了過度表達的人類DU145細胞；或(i)人類MIC-I全長(包括前肽) (系列3) ； (ii)成熟人類MIC-I (沒有前肽)(系列1) ； (iii)人類MIC-I，包括前肽，但刪除 了類蛋白轉(zhuǎn)換酶前轉(zhuǎn)化酶位點(去除蛋白轉(zhuǎn)換酶)(系列2) ； (iv)僅陰性對照載體(系列 4)；圖3為裸鼠失重百分數(shù)(與試驗開始時的體重進行比較)與最大的鼠腫瘤達到 Icm直徑時的人類血液中MIC-I血清水平之間的關(guān)系圖；裸鼠移植了過度表達的人類DU145 細胞；⑴人類MIC-I全長(包括前肽)(系列3) ； (ii)成熟人類MIC-I (沒有前肽)(系列 1) ； (iii)人類MIC-1，包括前肽，但刪除了類蛋白轉(zhuǎn)換酶前轉(zhuǎn)化酶位點(去除蛋白轉(zhuǎn)換酶) (系列2) ； (iv)僅陰性對照載體(系列4)；圖4為羊抗人類MIC-I抗體對鼠重(g)的影響結(jié)果圖；(A)第27天，給予兩只鼠 IOmg(腹膜內(nèi)地)純化的羊IgG，該羊通過高純化重組MIC-I獲得免疫，而獲得高滴定量人 類MIC-I抗體；⑶第27天，給予兩只鼠IOmg(腹膜內(nèi)地)對照純化的正常羊血清IgG ；圖 A和圖B為兩組鼠中其中一只的代表性數(shù)據(jù)；圖5為利用過度表達MIC-I的轉(zhuǎn)基因(TG)鼠系28評估失重的結(jié)果圖；與同類系 的野生型(3窩，大小為59-61天)相比，公或母鼠28的體重都顯著降低(P<0.001)；圖6為利用MIC-I過度表達轉(zhuǎn)基因(TG)鼠系75評估失重的結(jié)果圖；與同類系的 野生型(WT) (3窩，大小是59-61天)相比，公或母鼠75的體重都顯著降低(P < 0. 001)；圖7為7窩野生型鼠(WT)和雜合轉(zhuǎn)基因鼠(TG)的體重(g)比較；數(shù)據(jù)為每窩里 雜合轉(zhuǎn)基因鼠相比較于野生型鼠的平均重量；新生WT和TG鼠(鼠小于48h大)的體重沒 有顯著不同；圖8展示了施加人類MIC-I單克隆抗體(MAb26)可以逆轉(zhuǎn)移植了人類DU145細 胞的裸鼠的體重，人類DU145細胞通過構(gòu)建成熟人類MIC-I (沒有前肽)轉(zhuǎn)導了過度表達 的MIC-I ；注射了過度表達MIC-I的DU145細胞的鼠開始迅速失重；第11天，施藥單注射 劑0. I-Img的MAb26，使其體重增加，其惡性腫瘤和持續(xù)時間隨著MAb26量的增加而增加 (A-C) ；MAb26對惡性腫瘤的生長沒有影響(D-F)；未經(jīng)處理的鼠(G)和僅用PBS緩沖液處理 的鼠在試驗過程中快速且持續(xù)失重；垂直軸表示重量(g)；圖9展示了移植了人類DU145細胞的裸鼠和轉(zhuǎn)導了對照結(jié)構(gòu)的DU145細胞的對照 裸鼠連續(xù)三天的食物攝取比較，人類DU145細胞通過構(gòu)建成熟人類MIC-I (沒有前肽)轉(zhuǎn)導 了過度表達的MIC-I ；
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圖10展示了移植了人類DU145細胞的裸鼠和轉(zhuǎn)導了對照結(jié)構(gòu)的DU145細胞的對 照裸鼠脂肪墊和肌肉重的比較，人類DU145細胞通過構(gòu)建成熟人類MIC-I (沒有前肽)轉(zhuǎn)導 了過度表達的MIC-I ；承載了 DU145表達腫瘤的MIC-I用實心柱表示，空心柱表示承載了對 照腫瘤的鼠；用T試驗進行統(tǒng)計比較，*的數(shù)量表示統(tǒng)計學顯著性的增加(從ρ = 0. 003到 P = 0. 0001)；腹溝股脂肪、附睪脂肪、腹膜后脂肪的脂肪重顯著下降；兩組鼠的肌肉重沒有 顯著差異；NS 不顯著；**p < 0. 01 ；***p < 0. 001 ；圖11為MIC-I轉(zhuǎn)基因鼠與野生型對照的食物攝取量圖；5只野生型鼠(WT)和6 只轉(zhuǎn)基因鼠(TG)逐個于籠中放置48h，以適應(yīng)單個住所；放置于送料斗的食物在零時間點 稱重；每24小時，通過放入到送料斗的食物重減去剩余量和溢出量，來評估食物的消耗量； 測定四次以上的食物攝取量，每次24小時；WT組中每只鼠每天的食物攝取量明顯偏大(ρ <0.04) (A)；然而，當用鼠的體重校正后，食物攝取量之間的這種差異就消失了(B)；圖12為MIC-I轉(zhuǎn)基因鼠(TG)和野生型鼠(WT)的器官重；縮寫m =公，f =母， 印id =附睪，ut =子宮，retroperit =腹膜后；**p < 0. 01***p < 0. 001 ；圖13為MIC-I結(jié)合胎球蛋白的試驗結(jié)果圖；純化重組MIC-1 (溶于0. 1 % BSA) 用胎球蛋白包膜瓊脂糖微粒孵育；然后洗滌微粒，利用抗-MIC-I抗體Western雜交后 SDS-PAGE具體分析；帶1 純化重組MIC-I ；帶2 結(jié)合胎球蛋白微粒的MIC-I ；帶3 只有胎 球蛋白微粒；帶4 只用瓊脂粉微粒孵育的MIC-I ；箭頭表示MIC-I帶；圖14為正常成熟鼠腦視丘部下區(qū)域和第三腦室(V3)被切除的截面圖，A 利用 35S標記RNA探針進行MIC-I原位雜交和射線自顯跡法；B 利用純化多克隆抗體與重組鼠 MIC-I的親合力進行免疫組織化學；截面圖顯示了弓狀核(AN)區(qū)域和室旁區(qū)域mRNA和蛋 白質(zhì)的MIC-I表達。
具體實施例方式早前發(fā)現(xiàn)許多癌癥，尤其是上皮器官中，MIC-I過度表達，患有這些癌癥的患者中 血清MIC-I水平，與疾病期和嚴重度成比例地上升。尤其是在癌癥后期，血清水平可以達到 3. 7-5. Ong/ml以上，鼠的血清水平與顯著的失重有相關(guān)性。通過降低癌癥患者或其他顯示 惡病質(zhì)或可能發(fā)展成為惡病質(zhì)患者的MIC-I水平或MIC-I活性，可以預(yù)測到失重，且隨后 對病人安康和尊敬的不良影響可以被逆轉(zhuǎn)或減少。相應(yīng)地，這有助于患者對潛在的慢性疾 病(如癌癥或慢性腎病)的處理，對治療作出正面反應(yīng)，從而減少發(fā)病率和死亡率。因此，第一方面，本發(fā)明提供了一種治療或預(yù)防惡病質(zhì)的方法，包括將表現(xiàn)為惡病 質(zhì)或傾向于發(fā)展成惡病質(zhì)的受試者的血液(如全血)、血漿或血清進行活體外處理，從而使 所述血液、血漿或血清中的巨噬細胞抑制因子-I(MIC-I)去除或失活，然后，將處理后的血 液、血漿或血清返回到所述受試者。受試者可能患有慢性疾病如癌癥(尤其是上皮癌如乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、直 腸癌、膀胱癌和胰腺癌)、慢性腎病、慢性炎癥(如風濕性關(guān)節(jié)炎和克隆氏病)、慢性阻塞性 肺病(COPD)、心臟疾病如充血性心臟衰竭、飲食紊亂，通常稱為神經(jīng)性厭食癥、或某些傳染 病如肺結(jié)核、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)和瘧疾。這些疾病或紊亂通常與惡病質(zhì)相關(guān)。 受試者可能已經(jīng)表現(xiàn)出惡病質(zhì)或可能發(fā)展成為惡病質(zhì)。有代表性地，受試者會表現(xiàn)出其血 液、血漿或血清MIC-I水平上升(如觀察到血清水平為3 . 721-50ng/ml或5_50ng/ml，盡管一些疾病中，可觀察到血清MIC-I水平高達100-200ng/ml)，或者至少，血清MIC-I水平始終處 于正常范圍0. 2-1. 15ng/ml2°的高端。如果有必要，可以利用MIC-I試驗(如MIC-I ELISA4) 測定MIC-I水平上升來篩選這樣的受試者。除了患有上段提到的疾病或紊亂的受試者的治療，本發(fā)明的方法還適用于治療 或預(yù)防與MIC-I過度表達(如受傷、壓力、放射線療法和化學療法)或MIC-I清除減少 的狀況或治療呈相關(guān)性的惡病質(zhì)。通過活體體外處理受試者的血液、血漿或血清，以使 MIC-I去除或失活，然后將處理后的血液、血漿或血清返回到受試者，血清MIC-I水平可有 效地降低，相應(yīng)地，可導致食欲增強和/或體重增加，或者至少減少受試者體重的損失。理 想的是，受試者血液、血漿或血清被處理后，血清MIC-I水平處于血清MIC-I水平正常范 圍0. 2-1. 15ng/ml的低端，血液或血漿MIC-I水平處于對應(yīng)于血清MIC-I水平正常范圍 0. 2-1. 15ng/ml的低端的量(血漿血液粘度的對應(yīng)的量與血清完全相等，由于血漿的主成 分是血清，區(qū)別僅在于血漿還包括纖維蛋白原和其他凝血因子，而血液對應(yīng)的量約為血清 的量的兩倍)。有必要定期處理受試者的血液、血漿或血清，以維持MIC-I降低的水平，來達 到預(yù)期的結(jié)果(如食欲增加)。血液、血漿或血清中的MIC-I利用如結(jié)合MIC-I的分子和/或底物可被去除或失活。結(jié)合MIC-I的合適分子包括MIC-I受體和其片段(如MIC-I受體的可溶性細胞質(zhì) 外受體結(jié)構(gòu)域)，以及結(jié)合成熟MIC-I的其他可溶性分子或核骨架結(jié)合蛋白。用于本發(fā)明 的結(jié)合成熟MIC-I的可溶性分子的一個例子是胎球蛋白。胎球蛋白22是胎血中富含的一種 糖蛋白，在胎血中參與多種物質(zhì)的轉(zhuǎn)運。胎球蛋白的MIC-I結(jié)合片段也適用于本發(fā)明。用 于使血液、血漿或血清中MIC-I去除或失活的合適的物質(zhì)包括如結(jié)合成熟MIC-I的天然或 人工物質(zhì)，大多為類似細胞外基質(zhì)(ECM)的物質(zhì)。這些物質(zhì)可以以顆粒、纖維、膜或其他表 面的形式存在，可以容易地與血液、血漿或血清接觸而捕獲MIC-I (即使MIC-I結(jié)合到底物 上)，從而從處理后的血液、血漿或血清中去除MIC-1。優(yōu)選地，血液、血漿或血清的活體外處理包括使用抗體或其功能性片段(如Fab片 段或重組scFv片段12)，其特異性結(jié)合MIC-1(即抗MIC-I抗體或其片段)。用于本發(fā)明的抗 MIC-I抗體或其片段(還有其他結(jié)合MIC-I的分子如MIC-I受體或其片段)優(yōu)選包括在合適 的底物表面提供MIC-I結(jié)合分子，其可以容易地與血液、血漿或血清接觸而捕獲MIC-I (即 通過所述MIC-I結(jié)合分子使MIC-I結(jié)合到底物上)，從而從處理后的血液、血漿或血清中去 除MIC-1。在這種情況下，底物包括惰性顆粒(如聚苯乙烯或瓊脂糖顆粒)、纖維、膜(如高 滲透膜如聚丙烯腈或聚砜膜)或其他表面。優(yōu)選地，MIC-I結(jié)合分子通過共價鍵結(jié)合到底 物上，然而，其他的結(jié)合形式(如靜電結(jié)合)也是適用的。使MIC-I結(jié)合分子結(jié)合到底物表 面的常規(guī)方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。在一個優(yōu)選實施例中，本發(fā)明治療或預(yù)防惡病質(zhì)的方法包括以下步驟(i)準備結(jié)合MIC-I的合適底物(即具有MIC-I結(jié)合分子的底物)；(ii)將活體外的血液、血漿或血清與所述底物接觸來處理從受試者中取得的血 液、血漿或血清，這樣，血液、血漿或血清中的MIC-I結(jié)合到底物上；(iii)分離底物與處理后的血液、血漿或血清；(iv)將處理后的血液、血漿或血清返回到受試者中(如通過灌輸)。
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該優(yōu)選實施例中的方法包括使用或改良任何一種或多種體外處理血液、血漿或血 清的方法(如血液透析、血紅素除去法、血漿凈化和血漿除去法)。因此，例如，當受試者患 有慢性腎病，需要血液透析(例如，連續(xù)動靜脈血液濾過(CAVH)、連續(xù)靜脈-靜脈血液濾過 (CVVH)或連續(xù)性單純超濾(SCUF))，血液透析可以適宜地改良以適于本發(fā)明的方法(即血 液在返回到受試者前，也與結(jié)合MIC-I的底物接觸，通過與底物結(jié)合，血液中的MIC-I被去 除)。本發(fā)明治療或預(yù)防惡病質(zhì)的方法可與其他如腸道或非腸道營養(yǎng)法的惡病質(zhì)治療 法或預(yù)防法結(jié)合使用。非腸道營養(yǎng)法可以方便施加給受試者，這通過在去除或失活MIC-I 之前、之時或之后，活體外將適當?shù)臓I養(yǎng)物質(zhì)混合到血液、血漿或血清中而實現(xiàn)的。更進一步地，第二方面，本發(fā)明提供了一種診斷或預(yù)防受試者惡病質(zhì)的方法，所述 方法包括測定所述受試者MIC-I的量(尤其是血清MIC-I水平)。第二方面的方法可以結(jié)合其他惡病質(zhì)分析法如失重觀察和/或測量，檢測惡病質(zhì) 標記物(如血液、血漿或血清中IL-6或生長素惡病質(zhì)相關(guān)水平)一起使用。優(yōu)選地，該方法包括測定受試者是否有與惡病質(zhì)相關(guān)的MIC-I水平上升(如血 清水平3. 7-50ng/ml以上，或至少血清MIC-I水平一直處于正常范圍0. 2-1. 2ng/ml的高 端)。這可以利用MIC-I分析(如MIC-I ELISA4)來測定。MIC-I水平的上升也表明特殊 惡病質(zhì)患者可以通過本發(fā)明第一方面的方法，或?qū)κ茉囌呤┘覯IC-I抑制劑而可治療/預(yù) 防，這些MIC-I抑制劑和方法如本發(fā)明申請人的國際專利申請?zhí)朠CT/AU2005/000525 (TO 2005/099746)中所描述。優(yōu)選的MIC-I抑制劑包括以上提及的MIC-I結(jié)合分子。為了更好地理解本發(fā)明的本質(zhì)，以下以非限制的實施例來詳細說明本發(fā)明的優(yōu)選 形式。實施例1血清MIC-I水平的調(diào)節(jié)MIC-I，像TGF-β總科蛋白的其他成員一樣，被合成為具有N端前肽和C端成熟 MIC-I結(jié)構(gòu)域的前體。前體在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中經(jīng)過二硫化物連接的二聚作用，且一旦二聚化， 離開內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進入高爾基體，在高爾基體內(nèi)被類蛋白轉(zhuǎn)換酶在保守RXXR位點切割(氨基酸 196) (SEQ ID NO :1)。這種切割從成熟C端結(jié)構(gòu)域去除了前肽，因此，MIC-I釋放一條24. 5kD 二硫化物聚合的成熟的112個氨基酸多肽1 (圖1)。之前發(fā)現(xiàn)，大量MIC-I以未加工形式分泌。例如，內(nèi)生未加工蛋白MIC-I從包括滋 養(yǎng)層細胞系BeWo4、前列腺癌細胞系LnCAP和PC3、胰腺細胞系Pane 1和單核細胞樣細胞系 U937在內(nèi)的多種細胞中分泌。在前列腺癌細胞系LnCAP中發(fā)現(xiàn)未加工的蛋白MIC-I與胞外 基質(zhì)(ECM)呈相關(guān)性，而成熟MIC-I定位于條件培養(yǎng)基13。對轉(zhuǎn)染的犬腎細胞(MDCK)的初 步研究也表明ECM的相關(guān)性也由前肽的C端區(qū)域在氨基酸144-195處介導。另外，純化重 組前肽和蛋白MIC-I通過相同的前肽C端與肝磷脂相互作用。蛋白MIC-I和ECM的相關(guān)性表明ECM相關(guān)性可以提供潛在的MIC-I的局部儲存 量，其中對儲存的蛋白MIC-I的加工會導致成熟MIC-I (對ECM幾乎沒有親合力)快速釋放 到循環(huán)中。為檢驗這種觀點，建立了異種轉(zhuǎn)植腫瘤裸鼠模型14。材料與方法使用DU145人類前列腺癌細胞系，沒有內(nèi)生MIC-I (主要是因為細胞不產(chǎn)生功能性 P53)，因此，可以作為表達不同人類MIC-I構(gòu)建的載體，得到永久轉(zhuǎn)染、亞克隆的DU145細胞
7系(轉(zhuǎn)導了真核表達載體(IRES II EGFP 載體，Clontech Laboratories, Inc.，Mountain View, CA，美國))，其包含編碼以下任一種的序列(i)人類蛋白MIC-I全長(除利用FSH 前導序列，而非天然前導序列V，( )成熟人類MIC-I (沒有前肽，但包括FSH前導序列)，
(iii)人類蛋白MIC-I(包括FSH前導序列)，缺失包含類弗林蛋白轉(zhuǎn)移酶位點(用粗體表 示)的氨基酸序列RGRRRAR(SEQ ID NO :2)，從而阻止加工和隨后成熟MIC-I從前肽中釋放，
(iv)僅陰性對照載體5。高表達亞克隆基于EGFP表達而篩選出來。這些細胞經(jīng)皮下注射到免疫不全BALB/ cnu/nu裸鼠的側(cè)面。定期監(jiān)測鼠，每2-3天測定其體重。注射2個月后或當腫瘤直徑達到 1.1cm時處死鼠。在處死之前取得鼠的血清，通過ELISA4’14_16評估人類MIC-I的水平。用 于人類MIC-I的ELISA不會與鼠MIC-I交叉反應(yīng)，且之前成功地、專用地用于測量鼠的人類 腫瘤MIC-I水平140結(jié)果結(jié)果如圖2和3。表達成熟MIC-I的腫瘤鼠顯示血清MIC-I顯著地提高。與此 相反，表達MIC-1FURIN DEL突變體(其不能正常加工，因此保留了前肽)的腫瘤鼠的血清 MIC-I水平明顯較低。通過體外和體內(nèi)數(shù)據(jù)的外推法，顯示這個結(jié)果是由于FURIN DEL突變 體和ECM之間的緊密的相關(guān)性。討論該實施例結(jié)果表明MIC-I前肽對調(diào)節(jié)MIC-I在血液和組織間的分配是很重要的。 這樣，任何結(jié)合MIC-I前肽的底物或競爭前肽的基質(zhì)結(jié)合位點(如重組純化前肽自身)的 底物(如肝磷脂和乙酰肝素硫化物)，可以預(yù)期增加循環(huán)中的MIC-I水平。因此，血清MIC-I 介導的功能可被調(diào)控。實施例2通過MIC-I調(diào)節(jié)食欲在實施例1的研究過程中，注意承載過度表達MIC-I的腫瘤異種移植模型鼠，與對 照鼠相比，或者失重，或者不會增加那么多重量。因此，這引導了對鼠重影響程度和原因的 研究。材料和方法將鼠處死前稱重，失重(重)與測定的血清MIC-I水平進行相比(即如實施 例1的通過ELISA測定)。為評估血清MIC-I水平是否與觀察到的失重有關(guān)，進行了第二項研究，其中裸鼠 經(jīng)皮下注射過度表達成熟人類MIC-I (之前與最高血清MIC-I水平呈相關(guān))的DU145克 隆，第27天，鼠減少大量體重后，經(jīng)腹膜注射Img或IOmg對照純化羊IgG或從羊(之前用 重組人類MIC-I獲得免疫，對人類MIC-I有高滴定量的抗體)血清純化的IgG。羊抗人類 MIC-IIgG與高粘附人類MIC-I產(chǎn)生反應(yīng)，之前用于MIC-I ELISA中。為了進一步證明觀察到的失重由MIC-I介導，沒有其他的腫瘤獲得性產(chǎn)物，利用 兩個轉(zhuǎn)基因鼠系(min28和min75，均由C57B16鼠獲得)來評估失重，其在巨噬細胞特異性 c-fms啟動子的調(diào)控下過度表達鼠MIC-I。結(jié)果羊抗人類MIC-I IgG的研究中，發(fā)現(xiàn)Img羊抗人類MIC-I IgG對鼠的體重沒有差 異(數(shù)據(jù)沒有表示)，然而，IOmg羊抗人類MIC-IIgG(圖4A)誘導每個承載腫瘤的裸鼠體重快速增加(cf.圖4B為IOmg對照IgG的結(jié)果)。施加抗體后5_6天體重增加達到最高，然 后在接下來第7-10天開始逐漸失重。轉(zhuǎn)基因鼠系min28和min75失重評估結(jié)果如圖5_7所示，表明這些鼠也比它們的 野生型同窩小很多。這些鼠出生時的體重是相同的，在生命剛開始的幾個星期體重開始出 現(xiàn)差異。討論可以觀察到一些鼠失重很嚴重，且發(fā)現(xiàn)失重與腫瘤獲得性人類MIC-I的血清水平 相關(guān)。到目前為止，轉(zhuǎn)導了過度表達成熟人類MIC-I的DU145克隆的鼠具有最高血清MIC-I 水平，這些鼠以非?？斓乃俣仁е?。對動物行為的觀察表明其主要原因是這些鼠的食物攝 取顯著降低。通過施加羊抗-MIC-I IgG(不是對照IgG)可以逆轉(zhuǎn)失重的發(fā)現(xiàn)證實了失重 歸因于MIC-I。這通過轉(zhuǎn)基因鼠系min28和min75的失重評估得到確證。盡管MIC-I表達 是巨噬細胞特異性的，血清MIC-I水平顯著上升的鼠，與同類系野生型鼠相比，可以觀察到 體重有顯著的差異。由于轉(zhuǎn)基因鼠系和同類系野生型具有相同的出生重量(即出生后24h 測得)，這種失重效應(yīng)出生后開始出現(xiàn)。實施例3與分泌腫瘤MIC-I相關(guān)的失重通過施加抗MIC-I單克隆抗體而逆轉(zhuǎn)結(jié)果和討論利用裸鼠建立異種移植鼠模型(如前所述)，裸鼠側(cè)面注射了過度表達成熟MIC-I 的DU145細胞。注射了過度表達成熟MIC-I的DU145細胞的鼠開始迅速失重。僅施加MIC-I 單克隆抗體(MAb26) 0. 1-lmg,第11天，使體重開始增加，量值和持續(xù)時間隨著MAb26的增加 而增加(圖8A-C)。最高劑量約Img時，體重上升至異種移植前水平，17天后又下降到首先 施加抗體時的體重。MAb26對腫瘤生長(圖8D-F)、未處理鼠(圖8G)和僅用磷酸鹽緩沖液 (PBS)處理鼠(圖8F)沒有影響，在試驗期間快速不斷地失重。實施例4異種移植鼠模型食物攝取結(jié)果材料與方法利用裸鼠建立異種移植鼠模型(如前所述)，裸鼠側(cè)面注射了過度表達成熟MIC-I 的DU145細胞或承載對照質(zhì)粒。注射了過度表達成熟MIC-I的DU145細胞后8天，當平均 腫瘤體積為56mm3且平均失重7%時，連續(xù)測定3個24小時時間周期的食物攝取。鼠放置 于5個籠子分組。食物放置于送料斗，在時間點0稱量體重。24小時后，通過放入到送料斗 的食物重減去剩余量和溢出量，來評估食物的消耗量。對照鼠的食物攝取也以相同的方式 測定，但是在腫瘤注射第21天，當平均腫瘤體積達到70mm3時測定。結(jié)果注射了過度表達MIC-I 的 DU145 的鼠在第 1 (ρ = 0. 01)、第 2 (ρ = 0.0001)、第 3 天(P = 0. 02)比對照鼠攝食明顯要少(約30% )(圖9)。這些鼠脂肪量的直接測定表明 過度表達的MIC-I與附睪的、腹股溝的、腹膜后區(qū)域脂肪量顯著下降呈相關(guān)，而在兩塊代表 性肌肉中脂肪量沒有下降(圖10)。實施例5異種移植鼠模型血清新陳代謝標記物的確定材料與方法利用裸鼠建立異種移植鼠模型(如前所述)，裸鼠側(cè)面注射了過度表達成熟MIC-I 的DU145細胞或?qū)φ誅U145細胞。注射過度表達MIC-I的DU145腫瘤細胞后第11_16天，注射對照腫瘤第21-30天，當腫瘤體積達到100-200mm3，和/或鼠失重約18%時，將鼠處死。 從之前的實驗，可以知道腫瘤獲得性人類MIC-I的血清水平在15-58ng/ml之間。心臟穿刺 收集血清，商業(yè)化免疫分析來化驗新陳代謝標記物。T檢驗進行統(tǒng)計比較。結(jié)果和討論鼠的一系列新陳代謝標記物的測定表明MIC-I過度表達腫瘤鼠的甘油三酸酯、自 由脂肪酸、胰高血糖素和IGF-I呈統(tǒng)計學顯著下降(數(shù)據(jù)沒有顯示)。瘦素水平也有下降與 脂肪量下降相一致，表明MIC-I降低食物攝取不太可能由MIC-I刺激物瘦素來介導。葡萄 糖的差異低于統(tǒng)計學顯著性，為P = · 053。這些發(fā)現(xiàn)很大程度上是與饑餓和減少脂肪量相
一致的。實施例6異種移植鼠模型脂肪墊和肌肉重的測定材料與方法利用裸鼠建立異種移植鼠模型(如前所述)。20只鼠側(cè)面注射過度表達成熟MIC-I 的DU145細胞，20只鼠側(cè)面注射轉(zhuǎn)導對照質(zhì)粒的DU145細胞。注射過度表達MIC-I的DU145 腫瘤細胞后第11-16天，注射對照腫瘤第21-30天，當腫瘤體積達到100-200mm3，和/或鼠 失重約18%時，將鼠處死。仔細切割、去除并稱重肩胛間棕色脂肪組織、腹股溝、附睪、腹膜 后脂肪、脛骨、腓腸肌，并用體重校正重量。結(jié)論與討論棕色脂肪沒有減少，但是腹股溝、附睪、腹膜后脂肪的身體脂肪(即白色脂肪)顯 著減少(圖10)。兩組鼠的肌肉重之間沒有顯著差異(圖10)。然而，PIXImus成像儀(GE Lunar)進行更靈敏的總瘦體重分析表明瘦體重全面下降。這也證實了總脂肪量和腹部脂肪 量減少更多。實施例7MIC-1轉(zhuǎn)基因鼠結(jié)果與討論轉(zhuǎn)基因鼠單核細胞在c-fms啟動子的調(diào)控下過度表達MIC-1。這些鼠自身升高 MIC-I水平，看起來良好，且正常繁殖。它們不能區(qū)別于野生型鼠，但是從3周開始生長明顯 延遲，且進入成熟期(圖5-7)。這些效應(yīng)在兩個獨立的轉(zhuǎn)基因系min75和min28中都有觀察到。如腫瘤異種移植鼠，過度表達MIC-I轉(zhuǎn)基因鼠比其野生型同伴進食明顯要少，但 是如果食物攝取量經(jīng)鼠重校正后，這種差異就沒有了(圖11)。人們相信出生后Mic-I水平 上升導致食物攝取的下降和達到平衡，食物攝取下降導致大小減小，達到平衡時它們的大 小與其減少的食物攝取量是相稱的。如腫瘤異種移植鼠一樣，測定轉(zhuǎn)基因動物中相同的新 陳代謝標記物，顯示MIC-I轉(zhuǎn)基因鼠中僅IGF-I水平有顯著的差異，其水平降低了。腹股溝、附睪/子宮和腹膜后區(qū)域脂肪量的測定顯示過度表達轉(zhuǎn)基因鼠中脂肪 量的下降，相比于公鼠，母鼠表現(xiàn)更為突出(圖12)。除了脾稍小，胸腺稍大外，所有三個分 析的脂肪墊在大小上都有所減小。按絕對值計算，WT和TG胸腺重之間沒有差異。實施例8胎球蛋白對血清MIC-I水平的調(diào)控可能像一些其他TGF-β總科細胞因子一樣，血清MIC-I (所有受試者中的中值濃 度為450pg/ml)可以結(jié)合一種或多種循環(huán)調(diào)節(jié)劑。糖蛋白，胎球蛋白在細胞和組織里廣泛
10表達，存在于血液血清中。接下來的研究是用于確定MIC-I是否與這些糖蛋白發(fā)生反應(yīng)。材料與方法純化重組細胞，成熟MIC-I (溶于0. 1 % BSA)用胎球蛋白包膜瓊脂糖顆粒進行孵 育；然后洗滌微粒，利用抗-MIC-I抗體Western雜交后SDS-PAGE具體分析帶1 純化重組 MIC-I ；帶2 結(jié)合胎球蛋白顆粒的MIC-I ；帶3 僅胎球蛋白顆粒；帶4 僅用瓊脂糖顆粒孵 育的MIC-I。結(jié)果與討論結(jié)果如圖13所示，清楚地表明成熟MIC-I與胎球蛋白反應(yīng)且結(jié)合胎球蛋白。胎球 蛋白從而提供一個選擇一使用抗MIC-I抗體從患者血液中去除MIC-I來調(diào)節(jié)體重。實施例9正常鼠腦MIC-I表達分析結(jié)果與討論食物攝取與胃口由一系列復雜機制來調(diào)控，其中很多位于中央神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)。調(diào)控 許多基本身體功能如胃口和體溫的神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的區(qū)域局限于視丘下部區(qū)域內(nèi)。就胃口來 說，調(diào)節(jié)這個過程的許多復雜的因子位于視丘下部的弓狀核，調(diào)控的許多介質(zhì)或受體如神 經(jīng)肽Y位于這個區(qū)域。這個區(qū)域的血腦阻塞也是有漏洞的，且血腦阻塞是腦部一個非常有 限的區(qū)域，這個區(qū)域使自身分子有機會跨過血腦阻塞，在腦部直接反應(yīng)。人們認為Mic-I可 以通過這種機制在弓狀核和視丘下部發(fā)揮直接作用。然而，MIC-I也在正常鼠腦的這些區(qū) 域內(nèi)表達(圖14)。這并不代表如原位雜交研究中所指出的循環(huán)Mic-I的擴散，原位雜交研究表明弓 狀核、腦室周和視旁視丘下部區(qū)域的MIC-ImRNA和蛋白質(zhì)的協(xié)同局部化。正常腦部那些區(qū) 域的MIC-I局部化，與如胃口控制等功能非常相關(guān)，這引起了關(guān)于來自末梢循環(huán)和腦內(nèi)自 生的MIC-I在調(diào)控這種重要功能中扮演的角色的強烈爭議。實施例10血清Mic-I水平與前列腺癌晚期患者失重程度呈相關(guān)結(jié)果與討論為測定MIC-I與人類惡病質(zhì)的關(guān)聯(lián)，測定了表現(xiàn)良好的前列腺癌晚期患者(PCa) 的血清MIC-I水平，其中血清IL-6水平與惡病質(zhì)呈相關(guān)性17。與沒有患前列腺癌晚期惡病質(zhì) 的病人相比，患前列腺癌晚期惡病質(zhì)的病人的血清MIC-I水平顯著上升(12416士 10235pg/ mlVS 3265 士 6370pg/ml (平均值士SD) ；ρ = 0. 0001 ；非參數(shù)檢驗方法-秩和檢驗 (Mann-Whitney-U檢驗))。相似地，惡病質(zhì)患者中血清IL-6水平也上升了(33. 8 士 64. 2pg/ ml VS 7. 8 士 3. 4pg/ml，p < 0. 002 ；非參數(shù)檢驗方法-秩和檢驗(Marm-Whitney-U 檢驗))。 而且，血清MIC-I很弱但顯著地與血清IL-6水平正相關(guān)(r = 0. 2949，ρ < 0. 04 ；線性回 歸)。此外，在單變量和多變量回歸分析中，血清MIC-I和IL-6水平是癌癥惡病質(zhì)存在的單 獨的預(yù)測因子(分別為P = O. 0002，ρ < 0. 0001 ；單變量回歸分析，分別為ρ = 0. 0017，ρ =0.0005;多變量回歸分析)。然而，最客觀，可計量測定惡病質(zhì)的是失重。血清MIC-I水 平和與失重關(guān)聯(lián)的前列腺癌級別顯著相關(guān)(P = 0. 0002,r = 0. 4899 ；線性回歸)，而和血清 IL-6之間沒有這樣的相關(guān)性(ρ = 0. 6303 ；線性回歸)。實施例11血清MIC-I水平與慢性腎衰竭患者BMI呈相關(guān)性結(jié)果與討論慢性腎衰竭，就像癌癥晚期一樣，也是一般與失重和惡病質(zhì)相關(guān)。這個過程的標志
11如厭食、失重和BMI在腎衰竭末期是死亡率的有力的預(yù)測因子18。由于BMI是死亡率有力 的預(yù)測因子，且上升的血清MIC-I水平與動物相似的變化呈相關(guān)性，因而研究了腎衰竭末 期血清MIC-I水平和BMI之間的相關(guān)性。因此，檢測了 381個腎衰竭末期患者的血清樣本， 這些血清樣本在這之前沒有用來研究惡病質(zhì)或其他新陳代謝過程19。在研究期間(長達三年)死亡的患者的BMI顯著要低(26. 17士5. 63 ；266 (平均值 士 SD ；η), 23. 15 士 4. 92 ；104 :ρ < 0. 0001 ；不配對t檢驗)。在研究開始獲取透析血清樣本， 測定MIC-I血清水平。血清MIC-I水平與BMI相互關(guān)聯(lián)，漸增的血清MIC-I水平與降低的 BMI相互關(guān)聯(lián)(ρ = 0. 0003 ；r = 0. 189 ；線性回歸)。在說明書中，詞語"包含"意思是為整體的包含物，而不是排除在整體以外。在該說明書里所有公開內(nèi)容都以參考文獻作為參考。本說明書中關(guān)于文件、法規(guī)、 原料、裝置、文章等等的討論僅用來提供本發(fā)明的背景條件。在本申請權(quán)利要求的優(yōu)先權(quán)日 之前，與本發(fā)明相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)或本領(lǐng)域普通技術(shù)即已經(jīng)在澳大利亞或其他地方存在，因 此，不在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明進行沒有脫離本發(fā)明范圍的多種變化和/或修飾， 因此，本發(fā)明的實施例為說明性的，而非限制性的。參考文獻I. Bootcov MR et al, MIC-I, a novel macrophage inhibitory cytokine, is a divergent member ofthe TGF-β superfamily cluster. Proc Natl Acad Sci USA 1997 94 :11514-11519.2. Breit SN & MR Bootcov, " Novel TGF-beta like cytokine" ,International Patent ApplicationNo PCT/AU96/00386 (WO 97/00958).3. Fairlie WD et al. , Expression of a TGF-β superfamily protein, Macrophage InhibitoryCytokine-I, in the yeast Pichia pastoris. Gene 2000254 67-76.4. Moore AG et al, TGF-β superfamily cytokine MIC-I is present in high concentrations in theserum of pregnant women. J Clin Endocrinol Metab 2000 85 4781-4788.5.Fairlie WD et al,Epitope mapping ofthe Transforming Growth Factor-13 superfamily protein, MIC-I identification of at least five distinct epitope specificities. Biochemistry 2001 40:65-73.6.Breit SN et al.，" Diagnostic assay and method of treatment involving macrophage inhibitorycytokine-1(MIC-I)" , International Patent Application No PCT/AU01/00456(WO 01/81928).7. Fairie WD et ah, MIC-I is a novel TGF-β superfamily cytokine associated with macrophageactivation. J Leukocyte Biol 1999 65 :2_5.8. Koniaris LG, Induction ofMIC-1/growth differentiation factor-15 following bile duct injury.JGastrointest Surg 20037(7) :901_905·9. Welsh JB et al, Analysis of Gene Expression Identifies Candidate Markers andPharmacological Targets in Prostate Cancer. Cancer Res 2001 61
125974-5978.10. Buckhaults P et al, Secreted and cell surface genes expressed in benign and malignantcolorectal tumors. Cancer Res 2001 61 :6996_700LI1.Welsh JB et al. ， Large-Scale Delineation of Secreted Protein Biomarkers Overexpressed inCancer Tissue and Serum. Proc Natl Acad Sci USA 2003 100 :3410-3415.12.Pluckthun A，Antibody engineering :advances from the use of Escherichia coli expressionsysterns. Bio/Technology 19919 :545_55L13.Bauskin AR et ah,The propeptide mediates formation of stromal stores of PROMIC-I :rolein determining prostate cancer outcome. Cancer Res 200565(6) 2330-2336.14. Brown DA et ah,An antibody based approach to high volume genotyping for MIC-Ipolymorphism. Biotechniques 200233(1) :118_120，122，124 passim.15.Liu T et ah, MIC-I reduces cell adhesion and induces apoptosis in prostate cancer cells. Cancer Res 2003 63:5034-504016. Koopmann J et ah，Serum macrophage inhibitory cytokine 1 as a marker of pancreatic andother periampullary cancers.Clin Cancer Res 2004 10(7) 2386-2392.17.Pfitzenmaier, J et ah, Elevation of cytokine levels in cachectic patients with prostatecarcinoma. Cancer 2003 97:1211—1216·18. Kovesdy, CP et ah, Inverse association between lipid levels and mortality in men withchronic kidney disease who are not yet on dialysis :effects of case mix and themalnutrition-inflammation-cachexia syndrome. JAm Soc Nephrol 2007 18:304-311.19. Apple, FS et ah, Predictive value of cardiac troponin I and T for subsequent death inend-stage renal disease. Circulation 2002 106 :2941-2945.20.Brown, DA et ah, MIC-I serum level and genotype !associations with progress and prognosisof colorectal carcinoma. Clin Cancer Res 2003 9: 2642-2650.21. Kempf,T et ah，Prognostic utility of growth differentiation factor-15 in patients with chronicheart failure. JAm Coll Cardiol 200750 (11) :1054_1060·22. Demetriou, M et ah, Fetuin/α 2-HS glycoprotein is a transforming growth factor-18 type IIreceptor mimic and cytokine antagonist. J Biol Chem 1996 271 (22) :12755-12761.
權(quán)利要求
一種治療或預(yù)防惡病質(zhì)的方法，其特征在于，包括抽取表現(xiàn)為惡病質(zhì)或傾向于發(fā)展成惡病質(zhì)的受試者的血液、血漿或血清進行活體外處理，從而去除或滅活所述血液、血漿或血清中的巨噬細胞抑制因子 1(MIC 1)，然后，將處理后的血液、血漿或血清返回到所述受試者。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述受試者患有癌癥、慢性腎病或慢性炎癥。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述受試者的血清MIC-I水平上升至 3. 7-50ng/ml 以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于，包括以下步驟 (i)準備結(jié)合MIC-I的合適底物；( )活體外使受試者中的血液、血漿或血清與所述底物接觸，從而，血液、血漿或血清 中的MIC-I結(jié)合到底物上；(iii)分離底物與處理后的血液、血漿或血清；(iv)將處理后的血液、血漿或血清返回到受試者中。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于，利用MIC-I結(jié)合分子，血液、血漿 或血清中的MIC-I被去除或滅活。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步驟 (i)準備可結(jié)合合適底物的MIC-I結(jié)合分子；( )活體外使受試者中的血液、血漿或血清與所述可結(jié)合合適底物的MIC-I結(jié)合分子 接觸，從而，血液、血漿或血清中的MIC-I通過MIC-I結(jié)合分子結(jié)合到底物上；(iii)分離底物與處理后的血液、血漿或血清；(iv)將處理后的血液、血漿或血清返回到受試者中。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述MIC-I結(jié)合分子為抗MIC-I抗體 或其功能性片段。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述MIC-I結(jié)合分子為胎球蛋白或其 MIC-I結(jié)合片段。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項所述的方法，其特征在于，所述受試者患有慢性腎病，且所 述方法被納入所述受試者的血液透析療法中。
10.一種診斷或預(yù)防受試者惡病質(zhì)的方法，其特征在于，所述方法包括測定所述受試者 的MIC-I的量。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述方法包括檢測受試者的血清MIC-I 水平是否上升至3. 7-5. Ong/ml或以上。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的方法，其特征在于，通過權(quán)利要求1-9任一項所述的 方法或，通過對受試者施加MIC-I抑制劑，可識別可治療/可預(yù)防的惡病質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種通過去除或滅活惡病質(zhì)受試者血液、血漿或血清中的巨噬細胞抑制因子-1(MIC-1)而治療惡病質(zhì)的方法。該方法包括準備結(jié)合MIC-1的合適底物(如具有MIC-1結(jié)合分子的底物)；活體外使受試者中的血液、血漿或血清與所述底物接觸，從而，血液、血漿或血清中的MIC-1結(jié)合到底物上；分離底物與處理后的血液、血漿或血清；將處理后的血液、血漿或血清返回到受試者中。本發(fā)明還公開了一種診斷或預(yù)防受試者惡病質(zhì)的方法，該方法包括測定所述受試者的MIC-1的量。
文檔編號A61P3/04GK101896192SQ200880120824
公開日2010年11月24日 申請日期2008年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月9日
發(fā)明者塞繆爾·諾伯特·布賴特 申請人:圣文森特醫(yī)院悉尼有限公司