專利名稱：：抗菌劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及抗菌組合物，該組合物尤其適用于對(duì)皮膚進(jìn)行滅菌。
背景技術(shù)：
：切開(kāi)人皮膚是臨床環(huán)境中常見(jiàn)的操作，例如在手術(shù)、采血或插入血管內(nèi)裝置例如導(dǎo)管的過(guò)程中。切開(kāi)皮膚后(特別是當(dāng)插入血管內(nèi)裝置時(shí))在醫(yī)院獲得的感染(hospitalacquiredinfection)通常是并發(fā)癥，通常與皮膚微生物例如表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)有關(guān)(Richards,etal.,2000；Pfaller,etal.,1999；RuppandArcher1994)。多種因素可導(dǎo)致形成感染，例如皮膚穿刺之前皮膚消毒不徹底(Lafforgue，etal.，1997；Traore,etal.，2000；Langgartner,etal.，2004)以及在臨床環(huán)境中出現(xiàn)抗性微生物，這經(jīng)常是由于大量使用包括抗生素、抗菌劑和其他殺生物劑在內(nèi)的抗微生物劑所致(Koljalq,etal.，2002；Fraise,2002；BlockandFurman,2002)。微生物可以微菌落形式存在于皮膚內(nèi)，或者以生物被膜的形式原位存在于血管內(nèi)裝置上例如在導(dǎo)管表面上，因此與懸液中的微生物相比對(duì)更高濃度的抗微生物劑更加耐受(RuppandArcher，1994；Gristina，etal.，1989；Saginur,etal.，2006)。已知許多抗微生物劑可用于治療皮膚感染。例如，氯己定已知具有大范圍的抗微生物劑活性，同時(shí)具有快速效果，適合用于侵入步驟(例如CVC插入)前的皮膚預(yù)處理(McDonnellandRussell，1999)。還已經(jīng)證明一些精油具有抗微生物活性，能有效地抵抗細(xì)菌、酵母和病毒(Cowan,1999；Karpanen,etal.,2006)還已經(jīng)證明茶樹(shù)油(TTO)在清除MRSA菌落化(Al-Shuneigat,atal.，2005；Dryden,etal.，2004；Caelli,etal.，2000)及減少手的微生物污染(Messager，etal.，2005)方面的效力。已經(jīng)研究了其他精油包括桉樹(shù)油(eucalyptus)和麝香草酚(thymol)的潛在臨床應(yīng)用；已經(jīng)證明麝香草酚具有抗炎癥性質(zhì)并且加速燒傷傷口的愈合(DUrsUn，etal.，2003)，并且發(fā)現(xiàn)桉樹(shù)油可改善壞死潰瘍的愈合(ffarnke,etal.，2006)。精油與氯己定二葡糖酸鹽的結(jié)合物是已知的。已經(jīng)研究了精油與氯己定二葡糖酸鹽的結(jié)合物對(duì)口腔病原體變形鏈球菌(Str印tococcusmutans)和植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)的抗微生物效果(Flioche，etal.,2005),目的是為了開(kāi)發(fā)新型防齲治療法。US2006/0105000描述了用于治療受感染皮膚和粘膜的組合物，含有抗微生物劑和精油。氯己定葡萄糖酸鹽在口腔粘膜炎漱口劑、肛裂凝膠劑和壓瘡洗劑中用作抗微生物劑。雖然有多種可用抗微生物劑，但是已知許多抗微生物劑(包括氯己定)呈現(xiàn)弱的皮膚滲透性，因此現(xiàn)有的皮膚消毒方法對(duì)皮膚深處或皮膚表面之下以及毛囊中的細(xì)菌經(jīng)常不起作用。因此，感染(特別是皮膚中的感染)仍是個(gè)問(wèn)題，原因是抗微生物劑無(wú)法穿透皮膚。已經(jīng)研究了用于遞送皮膚抗菌劑的新方法，例如脂質(zhì)體、微粒和納米顆粒，它們可提供抗微生物劑的靶向釋放及受控釋放(Constant，etal.，2006)。還已經(jīng)研究了精油作為皮膚滲透增強(qiáng)劑(Biruss,etal.，2007；Reichlich,etal.，2006；Fang，etal.,2004)然而，精油作為滲透增強(qiáng)劑的效果是有限的，這是因?yàn)榫吞岣咂つw滲透的能力是藥物特異性的。因此，仍然有改良抗微生物劑的一般需求，尤其是用于預(yù)防及治療皮下感染的方法和產(chǎn)品。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即氯己定在與至少一種精油結(jié)合使用的時(shí)候顯示出增強(qiáng)的抗微生物性質(zhì)和皮膚滲透性，并且皮膚滲透的增加令人驚訝。因此，精油和氯己定的具體結(jié)合物可用于預(yù)防和/或治療皮膚層(例如真皮)內(nèi)的感染，尤其是由侵入性醫(yī)學(xué)步驟例如插入導(dǎo)管引起的感染。本發(fā)明還基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即氯己定在與桉樹(shù)油結(jié)合使用的時(shí)候令人意外地表現(xiàn)出抗表皮葡萄球菌及表皮葡萄球菌生物被膜的良好抗微生物活性。因此，這種結(jié)合物可用于預(yù)防和/或治療表皮葡萄球菌感染，尤其是侵入性的醫(yī)學(xué)步驟例如插入導(dǎo)管的感染。因此，本發(fā)明的第一方面提供了氯己定和精油的結(jié)合物在制備用于預(yù)防和/或治療角質(zhì)層下皮膚中感染的藥劑中的用途。本發(fā)明的第二方面提供了氯己定和桉樹(shù)油的結(jié)合物在制備用于預(yù)防和/或治療表皮葡萄球菌感染的藥劑中的用途。本發(fā)明的另一方面涉及氯己定和精油的結(jié)合物用于預(yù)防和/或治療角質(zhì)層下皮膚中感染。本發(fā)明的另一方面涉及氯己定和桉樹(shù)油的結(jié)合物用于預(yù)防和/或治療表皮葡萄球菌感染。本發(fā)明的另一方面涉及一種用于預(yù)防和/或治療角質(zhì)層下皮膚中感染的方法，包括使皮膚與氯己定和精油的結(jié)合物相接觸。本發(fā)明的另一方面涉及一種用于預(yù)防和/或治療表皮葡萄球菌感染的方法，包括使表皮葡萄球菌與氯己定和桉樹(shù)油的結(jié)合物相接觸。參考以下附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，其中圖1的曲線圖顯示了在全厚度人皮膚(fullthicknesshumanskin)中進(jìn)行2%(w/v)CHG(有或無(wú)50%(v/v)桉樹(shù)油)的皮膚滲透研究后，從多個(gè)深度的皮膚提取的CHG濃度(μg)(根據(jù)皮膚樣品的重量對(duì)結(jié)果進(jìn)行了調(diào)整)；以及圖2顯示了暴露于70%(v/v)IPA和2%(w/v)CHG的結(jié)合物(有或無(wú)10%(ν/ν)桉樹(shù)油)2分鐘(Α圖)和30分鐘(B圖)后，從全厚度人皮膚的多個(gè)深度處每mg皮膚提取的CHG濃度(μg)，對(duì)于除2%CHG/70%IPA/10%桉樹(shù)油暴露2分鐘(此時(shí)η=10)之外的所有情況η=15。具體實(shí)施例方式根據(jù)需要，以下的優(yōu)選方案可相互結(jié)合。精油精油在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的，術(shù)語(yǔ)“精油”取其通常意義。為了避免歧義，精油為萜和經(jīng)氧化的化合物例如醇、醛、酮、酯和醚的揮發(fā)性混合物，這些化合物來(lái)源自植物材料。它們記載于例如Williams，etal.，2004中。精油可依照本領(lǐng)域中已知的任何技術(shù)來(lái)生產(chǎn)；最常見(jiàn)的技術(shù)有從植物原料蒸餾、冷壓或溶劑萃取精油。在本發(fā)明涉及使用氯己定和至少一種精油的實(shí)施方案中，可使用單獨(dú)一種精油或者不同精油的組合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用單獨(dú)一種精油。它更優(yōu)選地為桉樹(shù)油。精油的實(shí)例包括但不限于，桉樹(shù)油、麝香草酚、茶樹(shù)油、藜油(chenopodium)、依蘭油(ylangylang)、肉桂油、麥盧卡茶樹(shù)油(manukaoil)、薄荷醇、葡萄柚油、山金車油(arnicaoil)、小茴香油、天竺葵油、薰衣草油、檸檬油、留蘭香油、松油、薄荷油、羅勒油和迷迭香油。精油優(yōu)選地為麝香草酚、桉樹(shù)油或茶樹(shù)油。考慮到抗微生物性質(zhì)，當(dāng)與氯己定結(jié)合使用時(shí)，精油最優(yōu)選地為桉樹(shù)油。本發(fā)明的最優(yōu)選結(jié)合物是氯己定葡萄糖酸鹽(CHG)和桉樹(shù)油的結(jié)合物。氯己定氯己定(CAS第55-56-1號(hào))是現(xiàn)有技術(shù)中公知的化學(xué)抗菌劑?？墒褂糜坞x堿形式或者鹽形式的氯己定。所述鹽優(yōu)選地為可藥用的鹽，許多這樣的鹽是本領(lǐng)域中公知的，最優(yōu)選氯己定二葡糖酸鹽(CAS第18472-51-0號(hào))，本文中稱作“CHG”。感染已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，氯己定和精油的結(jié)合物在滲透進(jìn)入皮膚方面有意想不到的效果，從而可在皮膚內(nèi)提供抗微生物效應(yīng)。因此，本發(fā)明的第一方面涉及氯己定和精油的結(jié)合物在制備用于預(yù)防和/或治療皮膚中感染的藥劑中的用途。術(shù)語(yǔ)“皮膚中”是指感染不是在皮膚表面，而是在皮膚器官內(nèi)，即在表層之下。因此，所述感染可以是任何形式出現(xiàn)于上層皮膚(被稱作角質(zhì)層)之下的皮膚感染。優(yōu)選地，皮膚中感染是由這樣的一種或多種微生物引起，所述微生物出現(xiàn)在皮膚之上及之中并由侵入性醫(yī)學(xué)步驟(例如向體內(nèi)插入導(dǎo)管)引入至角質(zhì)層下的更深皮膚層。可被本發(fā)明(的第一方面)靶向的皮膚中感染的實(shí)例包括但不限于，局部性皮膚感染(例如與插入血管內(nèi)裝置(如主靜脈導(dǎo)管、外周血管導(dǎo)管、PD導(dǎo)管、分流器)有關(guān)的感染)、痤瘡、皮膚癤、癰、疹、皮膚癬菌感染、手術(shù)部位感染、潰瘍和燒傷。優(yōu)選地，所述感染與插入血管內(nèi)裝置有關(guān)。這些感染起源于皮膚表面，但會(huì)擴(kuò)展以引起對(duì)更深層皮膚的損傷。引起皮膚中感染及可被本發(fā)明靶向的微生物包括但不限于，需氧及厭氧的革蘭氏陽(yáng)性球菌(例如葡萄球菌(staphylococci)、鏈球菌(streptococci)、腸球菌(enterococci))、需氧及厭氧的革蘭氏陽(yáng)性桿菌(例如梭菌(Clostridia)、桿狀菌(bacillus)、丙酸桿菌(propionibacteria))、需氧及厭氧的革蘭氏陰性球菌(例如奈瑟菌(neisseria)、韋榮球菌(veillonella))、好氧及厭氧的革蘭氏陰性球菌(例如腸細(xì)菌(entrobacteria)、假單胞菌(pseudomonad)、類桿菌(bacteroides))、真菌、酵母禾口霉菌(例如假絲酵母(Candida)、皮膚癬菌(dermatophyte))。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的第一方面，皮膚中感染為葡萄球菌感染。更優(yōu)選地，所述感染是由表皮葡萄球菌引起的感染。具體地，還已發(fā)現(xiàn)氯己定和桉樹(shù)油的結(jié)合物有作為抗表皮葡萄球菌的抗微生物劑的意外效果。因此，本發(fā)明的第二方面涉及氯己定和桉樹(shù)油的結(jié)合物在制備用于預(yù)防和/或治療表皮葡萄球菌(S.epidermidis)感染的藥劑中的用途。表皮葡萄球菌是一種在人和動(dòng)物皮膚上和皮膚中經(jīng)常出現(xiàn)的革蘭氏陽(yáng)性菌。表皮葡萄球菌的多個(gè)菌株可在皮膚內(nèi)形成微菌落并且可在裝置(例如靜脈內(nèi)導(dǎo)管)上形成保護(hù)性生物被膜。因此，氯己定和桉樹(shù)油的結(jié)合物可有效預(yù)防及治療表皮葡萄球菌生物被膜。術(shù)語(yǔ)“生物被膜”是本領(lǐng)域中公知的，并且取其通常意義。為了避免歧義，生物被膜是在活性表面或惰性表面上、無(wú)生命表面上，微生物(在本例中為表皮葡萄球菌)在自形成聚合基質(zhì)內(nèi)的結(jié)構(gòu)化群落。優(yōu)選地，所述表面是無(wú)生命的，它更優(yōu)選地為固體表面。最優(yōu)選地，所述固體表面為導(dǎo)管，更優(yōu)選地為靜脈內(nèi)導(dǎo)管例如主靜脈導(dǎo)管。防止或減少導(dǎo)管上的生物被膜可預(yù)防或治療患者體內(nèi)由生物被膜細(xì)菌引起的感染。本文描述的氯己定和桉樹(shù)油的結(jié)合物可用于預(yù)防和/或治療表皮葡萄球菌感染，這是通過(guò)使所述表皮葡萄球菌與氯己定和桉樹(shù)油相接觸實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選地，氯己定/桉樹(shù)油的結(jié)合物可用于預(yù)防和/或治療出現(xiàn)在皮膚之上和之內(nèi)并可引起感染的表皮葡萄球菌株。所述表皮葡萄球菌株優(yōu)選地為生物被膜形成菌株，例如RP62A。由表皮葡萄球菌引起的感染優(yōu)選地為皮膚感染。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，氯己定和桉樹(shù)油的結(jié)合物對(duì)表皮葡萄球菌生物被膜具有協(xié)同的抗微生物活性，該活性與僅氯己定或桉樹(shù)油的抗微生物活性相比有意料之外的提尚ο根據(jù)本發(fā)明的第一方面或者根據(jù)本發(fā)明的第二方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，皮膚感染為一種出現(xiàn)在因暴露而形成身體表表面的皮膚內(nèi)的感染。這種外部皮膚不包括例如內(nèi)膜，例如出現(xiàn)在例如口腔或鼻道中(例如頰膜、舌和齒齦)的皮膚和粘膜。為了避免歧義，術(shù)語(yǔ)皮膚不包括口腔上皮膜。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，與本發(fā)明的組合物接觸的皮膚是完整的，即未破、未割傷、未裂、未撕開(kāi)、未燒傷或未受其他傷。為了避免歧義，完整皮膚是指完整的角質(zhì)層，即皮膚是封閉的。應(yīng)指出的是，對(duì)于創(chuàng)傷或割傷的愈合過(guò)程中的皮膚，一旦該皮膚細(xì)胞封閉傷口，并藉此提供新的完整的角質(zhì)層，則認(rèn)為所述皮膚是“完整的”。還應(yīng)指出的是，當(dāng)插入導(dǎo)管通過(guò)皮膚的時(shí)候，皮膚經(jīng)常會(huì)生長(zhǎng)以將導(dǎo)管封閉在適當(dāng)位置。因此，皮膚是封閉的，這被涵蓋于術(shù)語(yǔ)“完整皮膚”的范圍內(nèi)。本發(fā)明的組合物可滲透通過(guò)皮膚上層，以治療或預(yù)防皮膚內(nèi)的感染。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物為僅用于外部、局部使用。本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解，預(yù)防或治療一個(gè)區(qū)域(即皮膚)內(nèi)的感染可防止(由該皮膚感染引起的)更嚴(yán)重的感染或其他區(qū)域的感染。這種繼發(fā)感染經(jīng)常是指醫(yī)院獲得的感染或醫(yī)院內(nèi)感染。例如，預(yù)防或治療局部感染例如皮膚感染將降低出現(xiàn)系統(tǒng)感染的可能性?？捎沙跏嫉木植扛腥疽鸬某Ｒ?jiàn)系統(tǒng)感染為血液感染，血管感染經(jīng)常是指血液中毒或血液敗血病。因此，根據(jù)本發(fā)明的預(yù)防局部感染還有利于降低更嚴(yán)重感染例如系統(tǒng)感染的發(fā)生率。一個(gè)實(shí)例為將導(dǎo)管插入至患者體內(nèi)；初始感染通常是皮膚感染，但除非經(jīng)過(guò)治療，否則這種感染會(huì)迅速變得更嚴(yán)重并且可引起血液中毒。本發(fā)明的組合物能有效地減少這些繼發(fā)感染的出現(xiàn)。皮膚結(jié)構(gòu)皮膚主要有兩層，表皮和真皮。這些層在不同身體部位的厚度是不同的。表皮是最外層并且是藥物吸收的主要屏障。表皮厚度大約50-100μm，其中角質(zhì)層(主要的屏障層)厚度大約10μm。表皮不含血管，主要包含角質(zhì)形成細(xì)胞。有不同的5個(gè)層角質(zhì)層、透明層、顆粒層、棘層和基底層。真皮層在表皮之下，厚度大約1000μm，但厚度隨身體部位不同可在100μm和3000μm之間變化。真皮主要由結(jié)締組織組成并含有血管、淋巴管和感覺(jué)受體。真皮還含有毛囊、皮脂腺和汗腺。有兩種類型的生汗腺體開(kāi)口至毛囊腔的頂質(zhì)分泌腺和直接開(kāi)口至皮膚表面的外分泌腺。真皮之下是包含脂肪組織的下皮層或皮下層。本文所述具有良好滲透性的氯己定和精油的結(jié)合物必須能夠滲透通過(guò)作為抗菌劑皮膚滲透主要屏障的角質(zhì)層，并且/或者能夠滲透至毛囊中。毛囊可能藏匿細(xì)菌，這些細(xì)菌不能通過(guò)現(xiàn)有的抗菌步驟清除，并且可能在侵入性步驟過(guò)程中引起感染。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，氯己定(優(yōu)選CHG)和至少一種精油(優(yōu)選桉樹(shù)油)的結(jié)合物呈現(xiàn)了以前未曾發(fā)現(xiàn)或研究過(guò)的優(yōu)良滲透性。因此，如上文所述，本發(fā)明的第一方面涉及氯己定和至少一種精油的結(jié)合物在制備用于預(yù)防皮膚層中一定深度處的皮膚感染的藥劑中的用途。根據(jù)本發(fā)明的第一方面待預(yù)防和/或治療的感染出現(xiàn)在角質(zhì)層之下。在一個(gè)實(shí)施方案中，待預(yù)防和/或治療的感染出現(xiàn)在皮膚層上最深至3000μπι的深度處，優(yōu)選上最深至2000μm的深度處，更優(yōu)選最深至1000μm的深度處。在另一個(gè)實(shí)施方案中，待預(yù)防和/或治療的感染出現(xiàn)在皮膚層中超過(guò)100μm的深度處，優(yōu)選超過(guò)480μm的深度處。待預(yù)防和/或治療的感染優(yōu)選地出現(xiàn)在皮膚層中100μm至3000μm的深度處。在一個(gè)實(shí)施方案中，待預(yù)防和/或治療的感染出現(xiàn)在皮膚層中480μm至3000μm的深度處。在一個(gè)實(shí)施方案中，待預(yù)防和/或治療的感染出現(xiàn)在皮膚層中480μm至1000μm的深度處。本發(fā)明人還意外地發(fā)現(xiàn)，來(lái)自于CHG和至少一種精油的結(jié)合物的CHG濃度在深度超過(guò)480μm的皮膚層中隨深度增加而增大。CHG和至少一種精油的結(jié)合物在480μm以上深度處的滲透出乎意料地好。在另一個(gè)實(shí)施方案中，待預(yù)防和/或治療的感染出現(xiàn)在真皮中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，待預(yù)防和/或治療的感染出現(xiàn)在毛囊中。結(jié)合物在本發(fā)明的第一方面中，氯己定可與任何精油結(jié)合使用。所述精油可以是上文所述的任一種，優(yōu)選麝香草酚、桉樹(shù)油或茶樹(shù)油，最優(yōu)選桉樹(shù)油。氯己定可與任一種精油結(jié)合，或者與不同精油的組合結(jié)合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，氯己定與單獨(dú)一種精油結(jié)合。最優(yōu)選地，精油為桉樹(shù)油。在本發(fā)明的第二方面中，氯己定具體地與桉樹(shù)油結(jié)合。在本發(fā)明的兩個(gè)方面中，氯己定與精油的結(jié)合物均還可與另一種可藥用成分結(jié)合，如下文所述。一種優(yōu)選的額外成分是異丙醇(IPA)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，氯己定和精油以及任選地IPA是所使用的僅有的抗微生物劑，即在本發(fā)明的組合物中不需要其他抗微生物劑。優(yōu)選地，在本發(fā)明的第一方面的組合物中僅有的活性成分一即僅有的抗微生物成分一是氯己定和精油，以及任選地有IPA。類似地，根據(jù)本發(fā)明的第二方面，一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案提供了一種組合物，其中僅有的活性(即抗微生物)成分是氯己定和桉樹(shù)油，以及任選地IPA。治療和預(yù)防本發(fā)明的第一方面提供了氯己定和精油(優(yōu)選桉樹(shù)油)的結(jié)合物，所述結(jié)合物可用于制備用于預(yù)防和/或治療(優(yōu)選預(yù)防)皮膚中感染的藥劑。本發(fā)明的第二方面提供了氯己定和桉樹(shù)油在預(yù)防和/或治療表皮葡萄球菌感染中的用途。在本文預(yù)防感染的上下文中使用的術(shù)語(yǔ)“預(yù)防”是指用于尚未患有病癥但處于患有所述病癥風(fēng)險(xiǎn)中的患者，以防止所述病癥出現(xiàn)。例如，預(yù)防包括皮膚感染的預(yù)防、降低皮膚感染的發(fā)病率等。對(duì)感染的預(yù)防還包括滅菌。滅菌優(yōu)選地包括向皮膚區(qū)域施用氯己定和精油的結(jié)合物，以從該皮膚區(qū)域清除微生物；在本發(fā)明的第一方面中，(角質(zhì)層之下的)皮膚中的微生物被清除，而在本發(fā)明第二方面中，皮膚內(nèi)和皮膚上的表皮葡萄球菌都被清除。優(yōu)選地，本發(fā)明第一方面或第二方面的結(jié)合物在侵入性手術(shù)之前使用，以防止來(lái)自皮膚表面上的微生物的潛在感染，所述微生物包括存在于手術(shù)器械上、在手術(shù)過(guò)程中被引入皮膚表面之下的微生物。在本文治療病癥的上下文中使用的術(shù)語(yǔ)“治療”通常是指無(wú)論人或動(dòng)物(例如在獸醫(yī)應(yīng)用中)的治療和療法，其中達(dá)到一些需要的治療效果，例如抑制所述病癥發(fā)展，并且所述治療效果包括放緩發(fā)展速度、使發(fā)展速度停止、緩解所述病癥癥狀、改善所述病癥以及治愈所述病癥。優(yōu)選地，將氯己定和精油的結(jié)合物施用于皮膚外表面，并使其滲透至皮膚層內(nèi)。優(yōu)選地，氯己定和精油的結(jié)合物滲透至真皮和/或毛囊中。如果氯己定和精油的結(jié)合物用于在打算進(jìn)行侵入性醫(yī)學(xué)步驟(例如插入導(dǎo)管)的患者中預(yù)防皮膚感染，那么該結(jié)合物應(yīng)在所述步驟之前被施用于患者皮膚。本文使用的術(shù)語(yǔ)“治療有效量”所指的活性化合物的量或者含活性化合物的材料、組合物或劑型的量，所述量在依照所需治療方案被給予的時(shí)候，能有效地產(chǎn)生一些所需的、與合理的效益風(fēng)險(xiǎn)比相稱的治療效果(包括預(yù)防)。為了避免歧義，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，一種預(yù)防或治療皮膚中感染的方法包括使皮膚與氯己定和精油(優(yōu)選桉樹(shù)油)相接觸。在一個(gè)實(shí)施方案中，氯己定和精油被同時(shí)施用。在該實(shí)施方案中，氯己定和桉樹(shù)油可在織物材料或非織物材料中或其上被施用。例如，含氯己定和精油的敷料、海綿、繃帶、膏藥或類似材料可用于預(yù)防或治療皮膚中的感染。優(yōu)選地，使用一臺(tái)施用裝置施用所述組合物。合適的施用裝置一般包括用于保留所述組合物(直至需要施用時(shí))的工具以及將所述組合物施用于皮膚的工具。用于保留所述組合物的工具優(yōu)選為一種容器，例如管或安瓿。用于將所述組合物施用于皮膚的工具優(yōu)選地為海綿，更優(yōu)選地為泡沫海綿。合適的施用裝置可購(gòu)自InsightHealthLimited，UK。在另一個(gè)實(shí)施方案中，氯己定和精油被依次施用。優(yōu)選地，在依次施用的時(shí)候，將氯己定施用于皮膚，隨后施用精油。在該實(shí)施方案中，精油優(yōu)選地是通過(guò)含精油的材料施用，所述材料例如織物或非織物補(bǔ)片(patch)，例如敷料、海綿、繃帶、膏藥或類似物。如上文所述的施用裝置可用于施用所述氯己定和/或所述精油。本發(fā)明的第二方面涉及氯己定和桉樹(shù)油作為抗表皮葡萄球菌的殺生物劑的用途。一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案包括含氯己定和桉樹(shù)油的織物或非織物材料，例如海綿、毛巾、濕餐巾紙、抹布(wipe)、布或類似物。這種材料可用于使表皮葡萄球菌與氯己定和桉樹(shù)油相接觸，并提供殺生物效果。優(yōu)選地，所述織物或非織物材料為硬表面抹布，更優(yōu)選織物硬表面抹布。劑量本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，氯己定和精油組分的適合劑量會(huì)隨患者的不同而變化。確定最佳劑量通常包括治療效果水平與任何的有害副作用風(fēng)險(xiǎn)之間的平衡。所選的劑量水平將取決于多種因素，包括但不限于所述具體組合物的活性，給藥途徑，所述化合物的排出率，治療持續(xù)時(shí)間，結(jié)合使用的其他藥物、化合物和/或材料，病癥的嚴(yán)重程度，患者的種(species)、性別、年齡、體重、狀態(tài)、健康狀況和既往治療史。所述化合物的量及給藥途徑將最終將由內(nèi)科醫(yī)生、獸醫(yī)或臨床醫(yī)生確定，但通常所選擇的劑量可在作用部位達(dá)到局部濃度，該局部濃度可達(dá)到所需效果而不引起實(shí)質(zhì)的傷害性副作用或有害副作用。給藥可以一個(gè)劑量、連續(xù)地或間歇地(例如以適當(dāng)間隔的分開(kāi)劑量)在整個(gè)治療或預(yù)防過(guò)程中發(fā)揮效應(yīng)。確定最有效給藥方式和劑量的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且將隨用于治療的制劑、治療的目的、待治療的靶感染及待治療的受試者的不同而有變化。可用治療醫(yī)生、獸醫(yī)或臨床醫(yī)生所選的劑量水平和模式進(jìn)行單次給藥或多次給藥。將氯己定和精油的結(jié)合物以治療有效量給藥。氯己定(優(yōu)選CHG)的量?jī)?yōu)選地在以重量(w/v)計(jì)0.-5%的區(qū)間內(nèi)，更優(yōu)選以重量計(jì)0.5%-4%，還更優(yōu)選以重量計(jì)0.5%-2.5%，最優(yōu)選以重量計(jì)2%。精油的量?jī)?yōu)選地在以所述組合物的體積(ν/ν)計(jì)5%-60%的區(qū)間內(nèi)，更優(yōu)選以體積計(jì)10%-50%，還更優(yōu)選以體積計(jì)10%-30%，最優(yōu)選以體積計(jì)10%-16%，例如以體積計(jì)10%。實(shí)驗(yàn)已表明，在增強(qiáng)CHG遞送通過(guò)皮膚的能力方面，10%(ν/ν)的桉樹(shù)油與50%(ν/ν)的桉樹(shù)油相當(dāng)。氯己定和精油的結(jié)合物的合適劑量?jī)?yōu)選地為以重量計(jì)2%的氯己定和以體積計(jì)50%的精油，更優(yōu)選以重量計(jì)2%的氯己定和以體積計(jì)30%的精油，并且優(yōu)選以重量計(jì)2%的氯己定和以體積計(jì)10%或16%的精油。如果所使用的氯己定二葡糖酸鹽為鹽、酯、酰胺、前藥等形式，那么給藥量是基于母體化合物計(jì)算，因此實(shí)際使用重量按比例增加。所述結(jié)合物的組分可同時(shí)加入或依次加入。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述化合物的結(jié)合物被以單個(gè)制劑的形式施用。一種優(yōu)選的單個(gè)制劑組合物含有CHG、桉樹(shù)油和異丙醇。在一個(gè)分開(kāi)的實(shí)施方案中，氯己定和精油被單獨(dú)給藥。更優(yōu)選地，將氯己定直接施用于皮膚，然后使含精油的材料與經(jīng)氯己定涂覆的皮膚相接觸。所述含精油的材料可以是織物或非織物，例如補(bǔ)片、膏藥、繃帶或敷料。異丙醇可任選地在加入氯己定之前、之后或與之同時(shí)加至皮膚上。為了避免歧義，根據(jù)本發(fā)明的兩方面之一的一種預(yù)防或治療感染的方法包括使患者皮膚與氯己定和精油的結(jié)合物相接觸。如本文中所詳述的，使皮膚與氯己定和精油相接觸可治療或預(yù)防感染。在一個(gè)實(shí)施方案中，使皮膚同時(shí)與氯己定和精油(優(yōu)選桉樹(shù)油)相接觸。更優(yōu)選地，施用含氯己定和精油的單個(gè)制劑。在一個(gè)分開(kāi)的實(shí)施方案中，所述預(yù)防或治療感染的方法包括使患者皮膚與氯己定相接觸，并單獨(dú)地使所述經(jīng)氯己定涂覆的皮膚與精油(優(yōu)選桉樹(shù)油)相接觸。在該實(shí)施方案中，優(yōu)選地將液體形式的氯己定施用于皮膚，精油優(yōu)選在含所述精油的織物或非織物材料上被施用，所述織物或非織物材料例如補(bǔ)片、膏藥、繃帶或傷口敷料。因此，在氯己定之后施用精油的兩步施用過(guò)程是本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案。制劑雖然氯己定和精油的結(jié)合物可以單獨(dú)給藥，但它優(yōu)選地采用藥物制劑(例如組合物、制品、藥劑)的形式，所述藥物制劑至少含有如上文定義的氯己定與至少一種精油的結(jié)合物，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的一種或多種其他可藥用成分，所述可藥用成分包括但不限于可藥用的載體、稀釋劑、賦形劑、佐劑、填充劑、緩沖劑、防腐劑、抗氧化劑、潤(rùn)滑劑、穩(wěn)定齊、助溶劑、表面活性劑(例如濕潤(rùn)劑)、掩蔽劑、著色劑、矯味劑和增甜劑。所述制劑還可含有其他活性劑，例如其他治療劑或預(yù)防劑。用于被包括在根據(jù)本發(fā)明的第一和第二方面的組合物中的一種優(yōu)選活性劑為異丙醇(IUPACg丙-2-醇)。因此，一種最優(yōu)選的組合物含有CHG、桉樹(shù)油和異丙醇，并任選地基本上僅由CHG、桉樹(shù)油和異丙醇組成。IPA可以任何有效水平存在，即以可有效作為抗微生物劑的任何水平。一個(gè)優(yōu)選的量為所述組合物中含有50%-90%(ν/ν)的ΙΡΑ，更優(yōu)選60%-80%(ν/ν)的ΙΡΑ，最優(yōu)選70%(ν/ν)的ΙΡΑ。因此，一種優(yōu)選的組合物含有2%(w/ν)的CHG、70%(ν/ν)的IPA和10%(ν/ν)的桉樹(shù)油。一種含異丙醇的組合物是特別優(yōu)選的，這是因?yàn)樗鼋M合物可提供一種速效抗微生物效果(歸因于異丙醇)以及一種延長(zhǎng)的、持續(xù)的抗微生物效應(yīng)(歸因于氯己定和精油)。已發(fā)現(xiàn)該結(jié)合物是有效的；這一點(diǎn)是特別出乎意料的，因?yàn)橐郧霸J(rèn)為異丙醇會(huì)抑制氯己定(尤其是CHG)向皮膚內(nèi)的滲透。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，如實(shí)施例和圖2中詳述的，精油(尤其是桉樹(shù)油)的存在可消除這種對(duì)滲透的抑制。本文使用的術(shù)語(yǔ)“可藥用的”是指這樣的化合物、成分、材料、組合物、劑型等，即在合理的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)，它們適合用于與待研究受試者(例如人)的組織相接觸，而無(wú)過(guò)度毒性、刺激性、過(guò)敏反應(yīng)或者其他問(wèn)題或并發(fā)癥，同時(shí)具有合理的效益風(fēng)險(xiǎn)比。在與所述制劑的其他成分相溶方面，每種載體、稀釋劑、賦形劑等也必須是“可用的”。合適的載體、稀釋劑、賦形劑等可參見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)的藥物教科書(shū)，例如Remington’sPharmaceuticalSciences,18thedition,MackPublishingCompany,Easton,Pa.,1990；L^i,Μ.HandbookofPharmaceuticalExcipients,2ndedition，1994。所述制劑可通過(guò)藥學(xué)領(lǐng)域中公知的任何方法制備。這樣的方法包括將所述活性化合物與載體混合在一起的步驟，所述載體構(gòu)成一種或多種輔助成分。通常，所述制劑是通過(guò)以下方式制備的將所述活性化合物與載體(例如液體載體、細(xì)分的固體載體等)均勻且緊密地混合在一起，然后根據(jù)需要對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行定形?？芍苽渌鲋苿蕴峁┛焖倩蚵籴尫?；立即、延遲、定時(shí)或持續(xù)釋放；或者它們的結(jié)合。本發(fā)明的制劑優(yōu)選地為局部制劑。制劑可合適地為以下形式液體、溶液(例如水性、非水性)、懸液(例如水性、非水性)、乳劑(例如水包油型、油包水型)、凝膠劑、糊劑、軟膏劑、乳膏、洗劑、油劑、泡沫劑、噴霧劑、霧劑或氣溶膠。優(yōu)選地，所述制劑為乳劑。更優(yōu)選地，所述制劑為乳劑并以單個(gè)制劑形式提供。所提供的制劑可合適地為以下形式補(bǔ)片、粘附性膏藥、繃帶、敷料等，它們浸有一種或多種活性化合物及任選的一種或多種其他可藥用成分，所述可藥用成分包括例如除精油以外的穿透、滲透和吸收促進(jìn)劑。所提供的制劑還可以合適地為藥庫(kù)或儲(chǔ)庫(kù)形式。優(yōu)選地，將氯己定局部施用于皮膚，然后施用含至少一種精油的材料，優(yōu)選補(bǔ)片，更優(yōu)選生物補(bǔ)片。氯己定和精油的結(jié)合物可溶解、懸浮于一種或多種其他可藥用成分中或者與之混I=IO適合于透真皮給藥的制劑除了包括補(bǔ)片、粘附性膏藥、繃帶、敷料、藥庫(kù)和儲(chǔ)庫(kù)外，還包括凝膠劑、糊劑、軟膏劑、乳膏、洗劑和油劑。軟膏劑通常是由氯己定和精油的結(jié)合物與石蠟軟膏基質(zhì)或水可混溶性軟膏基質(zhì)制備。霜?jiǎng)┩ǔＪ怯陕燃憾ê途偷慕Y(jié)合物與水包油型霜?jiǎng)┗|(zhì)制備。根據(jù)需要，霜?jiǎng)┗|(zhì)的水相可包括例如至少約30%w/w的多元醇，即具有兩個(gè)或多個(gè)羥基的醇，例如丙二醇、丁-1，3-二醇、甘露醇、山梨糖醇、甘油和聚乙二醇以及它們的混合物。局部制劑可以被希望包括除精油外的增強(qiáng)活性化合物吸收或穿透通過(guò)皮膚或其他感染區(qū)域的化合物。這樣的皮膚穿透增強(qiáng)劑的實(shí)例包括二甲基亞砜及相關(guān)類似物。乳劑通常是由氯己定(優(yōu)選CHG)和一種油相制備，所述油相可任選地僅包含乳化劑(或者稱為乳化試劑)或者它可以包含至少一種乳化劑與脂肪和/或油的混合物。優(yōu)選地，所述油相包含至少一種精油。優(yōu)選地包括親水性乳化劑以及充當(dāng)穩(wěn)定劑的親脂性乳化齊U。還優(yōu)選地同時(shí)包括油和脂肪兩者?？傊?，具有或不具有穩(wěn)定劑的乳化劑構(gòu)成所謂的乳化蠟，而該蠟與油和/或脂肪一起構(gòu)成所謂的乳化軟膏基質(zhì)，所述軟膏基質(zhì)又形成乳膏制劑的油性分散相。合適的乳化劑和乳劑穩(wěn)定劑包括吐溫60、司盤80、十八醇十六醇混合物、肉豆蔻醇、單硬脂酸甘油酯和月桂硫酸鈉。對(duì)適合用于所述制劑的油或脂肪的選擇是基于所需獲得的外觀特性，因?yàn)榛钚曰衔镌诖蠖鄶?shù)可能用于藥物乳劑制劑的油中的溶解度可能非常低。因此，乳膏應(yīng)優(yōu)選地為非油脂性、非染色和可洗的產(chǎn)品，該產(chǎn)品具有合適的稠度以避免從管或其他容器中泄漏?？墒褂弥辨溁蛑ф?、一元或二元烷基酯，例如二異己二酸酯、硬脂酸異十六烷基酯、椰子脂肪酸的丙二醇二酯、肉豆蔻酸異丙脂、油酸癸酯、棕櫚酸異丙酯、硬脂酸丁酯、棕櫚酸2-乙基己酯或被稱為CrodamolCAP(辛酸鯨蠟硬脂酯和肉豆蔻酸異丙酯)的支鏈酯混合物，優(yōu)選后三種酯。這些酯可被單獨(dú)使用或者結(jié)合使用，這取決于所需的特性。或者，可使用高熔點(diǎn)脂質(zhì)，例如白色軟石蠟和/或液體石蠟或者其他礦物油。下文將以如下的非限制性實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述。生物學(xué)實(shí)施例(1)抗微生物研究生物以及細(xì)菌生物被膜的制備因其形成生物被膜的能力而使用表皮葡萄球菌RP62A(SadOVSkaya，etal.,2005)。細(xì)菌在使用前于_70°C下保存在珠子(MicroBank，Pro-LabDiagnostics,Cheshire,UK)上。通過(guò)在CongoRed瓊脂(Freeman，etal.,1989)上培養(yǎng)來(lái)確認(rèn)所述菌株形成粘泥(slime)的能力。為了形成所述微生物生物被膜，首先將菌株接種至Muller-Hinton瓊脂(MHA)(Oxoid,Basingstoke,UK)上，并于37°C下在空氣中孵育18-20小時(shí)。將來(lái)自該培養(yǎng)板的10個(gè)菌落懸浮于無(wú)菌的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，Sigma，Dorset，UK)中。通過(guò)以無(wú)菌的PBS稀釋該培養(yǎng)物并在570nm下測(cè)量OD(在研究之前繪制表皮葡萄球菌cfu相對(duì)于570nm下OD的校正曲線，數(shù)據(jù)未顯示)，將細(xì)菌濃度調(diào)整至IX108cfu/mL。將該懸液進(jìn)一步用補(bǔ)充2%(w/v)葡萄糖(FisherScientific,Leicester,UK)^Muller-Hinton肉湯(MHB)稀釋，以得到含1X10^5cfu/mL的接種物。將200μL等分的細(xì)菌懸液加至白色壁、透明底、經(jīng)組織培養(yǎng)物處理的96-孔微滴定板(CorningIncorporated,NY,USA)的孔中。將所述板最后一列的孔作為對(duì)照，僅含200μL補(bǔ)充2%(w/v)葡萄糖的MHB。將微滴定板于37°C下在空氣中孵育48小時(shí)。用于通過(guò)懸浮測(cè)定法評(píng)價(jià)抗微生物效率的測(cè)試接種物的制備用于懸浮測(cè)定法的測(cè)試接種物是通過(guò)以下方式制備的將來(lái)自在MHA上過(guò)夜培養(yǎng)的10個(gè)表皮葡萄球菌RP62A菌落懸浮于無(wú)菌的PBS中。通過(guò)以無(wú)菌的PBS稀釋該培養(yǎng)物并在570nm下測(cè)量OD(在研究之前繪制表皮葡萄球菌cfu相對(duì)于570nm下OD的校正曲線，數(shù)據(jù)未顯示)，將細(xì)菌濃度調(diào)整至IX108cfu/mL。將該懸液進(jìn)一步以MHB稀釋，以得到含1X10*7cfu/mL的接種物，用于進(jìn)行協(xié)同測(cè)定；或者含1X10*6cfu/mL的接種物，用于測(cè)試單獨(dú)的CHG和油在懸液中的抗微生物活性?？刮⑸飫┑闹苽湟訫HB稀釋水性氯己定二葡糖酸鹽(CHG)、茶樹(shù)油(TTO)、桉樹(shù)油(EO)和麝香草酚(都來(lái)自Sigma-Aldrich)，以得到512mg/mL的精油儲(chǔ)備溶液以及512μg/mL的CHG儲(chǔ)備溶液。將5%(ν/ν)二甲基亞砜(DMSO)(Sigma-Aldrich)添加至精油儲(chǔ)液中，以增大精油在懸液中的溶解度。ATP生物發(fā)光的校正曲線和細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)在進(jìn)行抗微生物敏感性研究之前，繪制了相對(duì)光單位(RLU)相對(duì)于細(xì)菌cfu/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線。如上文所述，在96-孔微滴定板中以補(bǔ)充2%(w/v)葡萄糖的MHB培養(yǎng)表皮葡萄球菌，以得到細(xì)菌生物被膜。將已形成細(xì)菌生物被膜的微滴定板的孔以無(wú)菌PBS洗滌3次，并且使用“刮洗法(scrapeandwashmethod)”(Adams，2006)從這些孔上移出生物被膜。簡(jiǎn)而言之，每個(gè)孔中加入200μL無(wú)菌PBS，用無(wú)菌的吸量管尖對(duì)每個(gè)孔的壁刮大約10次，并在水平、豎直和交叉每個(gè)方向上都對(duì)底部刮大約10次。將懸液移出并收集于無(wú)菌的Eppendorf管中，再重復(fù)該步驟4次以得到每管1000μL的終體積。在3個(gè)孔上分別進(jìn)行該步驟。通過(guò)旋轉(zhuǎn)混合所述懸液，并以無(wú)菌的PBS進(jìn)行連續(xù)稀釋。將100μL等分的稀釋前懸液和KT1-IiT5稀釋液加至白色壁、透明底微滴定板的孔中。向每個(gè)孔加入100μLbactolyse。然后將所述板漂浮于水浴超聲儀中，以50Hz對(duì)所述板進(jìn)行超聲處理30分鐘以裂解細(xì)胞并釋放細(xì)菌ATP。將20μL螢光素酶加入每個(gè)孔中，并且通過(guò)發(fā)光計(jì)讀取發(fā)光值。通過(guò)滴計(jì)數(shù)方法(dropcountmethod)確定每種懸液和稀釋液中的細(xì)菌cfu。結(jié)果表示為cfu相對(duì)于RLU。ΤΤ0,E0、麝香草酚和CHG對(duì)懸液中表皮葡萄球菌的抗微生物活性水性CHG、ΤΤ0,EO和麝香草酚的最小抑制濃度(MIC)和最小細(xì)菌濃度(MBC)是通過(guò)微量肉湯稀釋測(cè)定法(NCCLS，1997)確定的。簡(jiǎn)言之，將等分的抗微生物劑加至透明、圓底96-孔微滴定板(SerowellBibby-Sterlin,Staffordshire,UK)的第一列中，在接下來(lái)的列中以MHB進(jìn)行連續(xù)2倍稀釋。最后一列作為對(duì)照，含MHB但不含抗微生物劑。在進(jìn)行該測(cè)定的同時(shí)，在另外的微滴定板上測(cè)試5%(ν/ν)-0.6%(v/v)DMSO的抗微生物活性。將所有孔以100μ1含1X10*6cfu/mL的表皮葡萄球菌懸液接種，并將這些板于37°C下在空氣中孵育20小時(shí)。最小殺菌濃度是通過(guò)以下方式確定將所述澄清孔的懸液取出放至MHA中，以無(wú)菌涂布器進(jìn)行涂板并將這些板于37°C下在空氣中孵育18-20小時(shí)。重復(fù)進(jìn)行3次測(cè)定。CHG、ΤΤ0,EO和麝香草酚對(duì)表皮葡萄球菌生物被膜的抗微生物活性將含表皮葡萄球菌RP62A生物被膜的微滴定板用無(wú)菌的PBS洗滌一次，以除去任何未結(jié)合的細(xì)菌。將抗微生物劑以MHB稀釋，以得到濃度為128μg/mL-0.25μg/mL的CHG和濃度為256mg/mL-0.5mg/mL的精油。將250μ1抗微生物化合物分別添加至各孔中，各重復(fù)三次。第11和12列作為僅有生物被膜和鹽水的對(duì)照和僅有MHB而無(wú)細(xì)菌生物被膜的空白孔。在進(jìn)行該測(cè)試的同時(shí)，在另一個(gè)板上測(cè)試了5%(v/v)DMSO對(duì)細(xì)菌生物被膜的抗微生物活性。在將所述細(xì)菌生物被膜與抗微生物劑于37°C下在空氣中孵育20小時(shí)后，將這些孔以無(wú)菌的PBS洗滌一次并通過(guò)ATP生物發(fā)光(ViaLightMDA生物測(cè)定試劑盒，Cambrex,Berkshire,UK)確定微生物的殺死情況。簡(jiǎn)言之，將100μL的Bactolyse(ViaLightMDA)和100μ1鹽水添加至每個(gè)孔中，將這些板用50Hz超聲波處理30分鐘，以釋放并裂解細(xì)菌生物被膜中的細(xì)胞。將50μ1的ATP監(jiān)測(cè)劑(ViaLightMDA生物測(cè)定試劑盒)添加至每個(gè)孔中并測(cè)定發(fā)光值。重復(fù)進(jìn)行2次測(cè)定。ΤΤ0,EO和麝香草酚與CHG的結(jié)合物對(duì)表皮葡萄球菌懸液的抗微生物敏感性ΤΤ0、EO和麝香草酚與CHG水溶液的結(jié)合物的抗微生物活性是通過(guò)棋盤法(checkerboardmethod,ShinandLim，2004)以懸浮測(cè)定法評(píng)價(jià)的。簡(jiǎn)言之，制備抗微生物化合物的連續(xù)2倍稀釋液(對(duì)于精油為128mg/mL-lmg/mL，對(duì)于CHG為64μg/mL-0.5μg/mL)。將50μ1的CHG稀釋液用吸管以逐漸減小的濃度轉(zhuǎn)移至96-孔微滴定板的各列中，并將50μ1等分的精油以逐漸減小的濃度加至各行中。然后將這些孔以10μ1含10*5cfu的細(xì)菌懸液接種。第10、11和12列作為對(duì)照，分別僅含營(yíng)養(yǎng)肉湯和接種物，以及含與所述接種物分隔開(kāi)的抗微生物化合物。將微滴定板于37°C下在空氣中孵育24小時(shí)，檢查這些板的微生物生長(zhǎng)情況，以確定這些化合物單獨(dú)的MIC或者這些化合物的結(jié)合物的MIC。為了確定抗微生物結(jié)合物的協(xié)同活性或拮抗活性，使用下式確定分級(jí)抑制濃度(FIC)和FIC指數(shù)(FICI)抗微生物的結(jié)合物的最低MIC抗微生物劑單獨(dú)的MICFICI=油的FIC+CHG的FICFICI低于0.5被認(rèn)為有協(xié)同效應(yīng)，0.5和4.0之間的值被認(rèn)為無(wú)差別，高于4.0被認(rèn)為有拮抗活性。重復(fù)進(jìn)行2次測(cè)定。ΤΤ0,EO和麝香草酚與CHG的結(jié)合物對(duì)表皮葡萄球菌生物被膜的抗微生物敏感性將含表皮葡萄球菌RP62A生物被膜的微滴定板以無(wú)菌的PBS洗滌一次，以除去任何未結(jié)合的細(xì)菌。如上文所述將抗微生物劑以MHB稀釋，將125μ1等分的每種稀釋液以逐步減小的濃度加至微滴定板的孔中，每個(gè)孔的總體積為250μ1以確保細(xì)菌生物被膜被完全覆蓋，以前文所述的棋盤進(jìn)行測(cè)定。第10、11和12列作為對(duì)照，僅含抗微生物化合物，以及僅含生物被膜和鹽水。將微滴定板于37°C下在空氣中孵育24小時(shí)，之后將孔倒空，如上述通過(guò)ATP生物發(fā)光確定FIC值和FICI值。重復(fù)進(jìn)行2次測(cè)定。結(jié)果通過(guò)在CongoRed瓊脂上形成特征性的黑色有殼菌落，確認(rèn)表皮葡萄球菌RP62A為形成粘泥的菌株。將表皮葡萄球菌RP62A在補(bǔ)充2%(w/v)葡萄糖的MHB中孵育48小時(shí)后，每個(gè)孔中的細(xì)菌生物被膜平均含5.53X10女6cfu。對(duì)于CHG、茶樹(shù)油和桉樹(shù)油而言，與對(duì)浮游細(xì)胞(planktoniccell)的最小抑制濃度(MIC分別為2yg/mL、2mg/mL和4mg/mL)相比，其對(duì)生長(zhǎng)于生物被膜中的細(xì)菌的最小抑制濃度(MIC分別為8μg/mL、16mg/mL和128mg/mL)分別高2倍、3倍和5倍。與對(duì)浮游細(xì)胞相比，麝香草酚對(duì)生物被膜的MIC值低2倍(分別為4mg/mL和lmg/mL)。所述細(xì)菌生物被膜被CHG和所有3種精油消除，這時(shí)CHG、麝香草酚、TTO和桉樹(shù)油的MBC/生物被膜消除濃度分別為32μg/mL、2mg/mL、64mg/mL和256mg/mL(表1和2)。已發(fā)現(xiàn)，CHG與ΤΤ0、桉樹(shù)油或麝香草酚的結(jié)合不會(huì)妨礙CHG或油的抗微生物活性。還已發(fā)現(xiàn)，CHG與EO的結(jié)合協(xié)同地增加了它們對(duì)抗生長(zhǎng)在生物被膜中的表皮葡萄球菌的活性(表2)。另外，當(dāng)在結(jié)合物中使用的時(shí)候，抑制生物被膜生長(zhǎng)所需的TTO濃度和CHG濃度分別降低了2倍和1倍(ΤΤ0從16mg/mL降低至4mg/mL，CHG從8μg/mL降低至4μg/mL)，但麝香草酚與CHG的結(jié)合不影響用于抑制生長(zhǎng)于生物被膜或懸液中的細(xì)菌所需的濃度(ΤΤ0為0.5mg/mL,CHG為8μg/mL)。在油懸液中作為乳化劑使用的5%(v/v)DMSO未顯示對(duì)生物被膜或懸液中表皮葡萄球菌的抗微生物活性。表1和表2示出桉樹(shù)油、茶樹(shù)油和麝香草酚與氯己定二葡糖酸鹽水溶液的結(jié)合物對(duì)生長(zhǎng)在懸液中及生物被膜中的表皮葡萄球菌RP62A的抗微生物活性。表1:懸液<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表2:生物被膜<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>(2)皮膚滲誘研究-CHG+桉樹(shù)油人皮膚樣品全厚度人皮膚樣品獲自進(jìn)行縮乳手術(shù)的患者(TheStephenKirbySkinBank,QueenMary’sHospital,London,UK)0在進(jìn)行研究之前，得到了倫理委員會(huì)的完全批準(zhǔn)以及捐組織患者的書(shū)面同意。全厚度人皮膚在切下當(dāng)天即冷凍，于-70°C下保存至研究日。Franz擴(kuò)散池平均擴(kuò)散表面積為1.65cm2的垂直擴(kuò)散池(Franz擴(kuò)散池)用于進(jìn)行皮膚滲透研究。磷酸緩沖鹽水(PBS)用作接受液，在帶有設(shè)定為37°C的循環(huán)水套的接收室(體積大約29ml)內(nèi)放置過(guò)夜。在研究當(dāng)天，將所述切下的皮膚在PBS中解凍并切成與Franz擴(kuò)散池相適合的大小(直徑(circleacross)為2.9cm)。將皮膚樣品裝載至Franz分散池中并在所述擴(kuò)散池中放置1小時(shí)，以在開(kāi)始研究之前用接受液進(jìn)行平衡。抗微生物劑通過(guò)以無(wú)菌的蒸餾水和0.001%(ν/ν)吐溫80稀釋20%(w/v)氯己定二葡糖酸鹽(CHG)，制備了2%(w/v)的CHG溶液。桉樹(shù)油和CHG的懸液通過(guò)以下方式制備以蒸餾水稀釋這些試劑，以得到終濃度為50%(ν/ν)的桉樹(shù)油、終濃度為2%(w/v)的CHG和終濃度為0.001%(ν/ν)的吐溫80。皮膚滲透研究將IOOml等分的CHG溶液或CHG/桉樹(shù)油懸液加至放置在Franz擴(kuò)散池供給室上的經(jīng)切割的人皮膚表面，重復(fù)3次。通過(guò)設(shè)定為37°C的循環(huán)水套保持溫度恒定，并通過(guò)磁力攪拌棒不斷攪動(dòng)接受液。通過(guò)以下方式對(duì)接受液進(jìn)行取樣第1小時(shí)每10分鐘吸取Iml流體，接下來(lái)7小時(shí)每30分鐘吸取Iml流體，并在第12和第24小時(shí)后吸取Iml流體。在每次取樣后補(bǔ)充接受液。過(guò)濾并通過(guò)HPLC分析這些樣品。皮膚樣品的切片在皮膚滲透研究后將所述經(jīng)切割的人皮膚從Franz擴(kuò)散池取下，以PBS沖洗。將這些皮膚以紙巾干燥，切成3個(gè)直徑(circleacross)為0.5cm的樣品，冷凍并于_70°C下保存直至進(jìn)行進(jìn)一步研究。使用切片機(jī)對(duì)冷凍的皮膚樣品切片，從皮膚表面至600μm的深度切成20μm的切片，從600μm至1050μm的深度切成30μm的切片。對(duì)皮膚層中CHG的分析將用于HPLC分析的流動(dòng)相溶液用作皮膚層的CHG萃取劑。將每個(gè)20μm或30μm皮膚切片分別置于Eppendorf管中，通過(guò)在加入皮膚樣品之前和之后稱管的重量確定皮膚切片的重量。通過(guò)將Iml等分的提取劑加至裝有皮膚切片的管中而從皮膚樣品中提取CHG，將其在60°C的水浴中加熱1小時(shí)，通過(guò)攪拌進(jìn)行混合并在6000g下離心10分鐘。過(guò)濾并通過(guò)HPLC分析這些樣品。高效液相色譜(HPLC)通過(guò)HPLC定量分析氯己定二葡糖酸鹽。HPLC分析的流動(dòng)相溶液含7525的甲醇雙蒸水、0.005M庚烷磺酸鈉、0.1%(ν/ν)二乙胺，以冰醋酸調(diào)節(jié)至ρΗ4。過(guò)濾并通過(guò)配有0DS-2Hypersil柱(粒徑5μ)(ThermoElectronCorporation,UK)的HPLC(Agilent1100)分析這些樣品，流速1.2ml/分鐘、檢測(cè)器波長(zhǎng)254nm。結(jié)果在用與50%(ν/ν)的桉樹(shù)油結(jié)合或不與之結(jié)合的2%(w/v)CHG并使用全厚度的人皮膚進(jìn)行皮膚滲透研究24小時(shí)后，在接受液中沒(méi)有出現(xiàn)可檢測(cè)水平的CHG。與僅CHG相比，桉樹(shù)油滲透至皮膚更深處，濃度更高(圖1)。在皮膚層中大于約480μm的深度處，圖1顯示在與桉樹(shù)油結(jié)合使用時(shí)，CHG濃度隨深度增加而意外地增加，直至約1000μm的皮膚深度。CHG與桉樹(shù)油和醇的皮膚滲誘該研究的目標(biāo)是為了評(píng)價(jià)在暴露于溶于70%(v/v)IPA中的2%(w/v)CHG和桉樹(shù)油(“E0”)的結(jié)合物后，在經(jīng)切割的人皮膚中隨深度不斷增加CHG的皮膚滲透和CHG的保持。材料化學(xué)試劑庚烷磺酸鈉、二乙胺(二者均HPLC級(jí))、磷酸緩沖鹽水(PBS),20%(w/v)CHG水溶液、桉樹(shù)油(EO)(82.9%桉油素)和異丙醇(IPA)購(gòu)自Sigma-Aldrich(Dorset,UK)。甲醇和冰醋酸(二者均HPLC級(jí))購(gòu)自FisherScientific(Leicestershire,UK)。設(shè)備Agilent1200系列高效液相色譜儀(HPLC)購(gòu)自AgilentTechnologies(UK),CPS-2Hypersil反相色譜柱(150X4.6mm，粒度5μ)購(gòu)自ThermoElectronCorporation(UK)。Cryotome購(gòu)自BrightInstruments(Cambs,UK)。皮膚樣品全厚度人皮膚樣品獲自進(jìn)行縮乳手術(shù)的患者(TheStephenKirbySkinBank,QueenMary’sHospital,London,UK)0在進(jìn)行這項(xiàng)研究之前，得到了倫理委員會(huì)的完全批準(zhǔn)(REC2002/169)。全厚度人皮膚在切下當(dāng)天即冷凍，于-70°C下保存至需要時(shí)。方法CHG與EO和IPA的皮膚滲透皮膚滲透研究以垂直Franz擴(kuò)散池進(jìn)行。以29mL的PBS裝滿接收室，并且通過(guò)循環(huán)水套保持在37°C，并通過(guò)磁力棒進(jìn)行攪拌。將皮膚樣品于室溫下在PBS中解凍，以吸收巾干燥并裝載于Franz擴(kuò)散池上，角質(zhì)層(SC)最外層面向供給室。暴露于測(cè)試化合物的表面積為3.14cm2(直徑2cm)。排空皮膚和接受液之間殘留的氣體，使皮膚平衡30分鐘以達(dá)到32°C的皮膚表面溫度。將20%(w/v)CHG水溶液以蒸餾水、IPA和EO稀釋，以得到溶于70%(v/v)IPA中的終濃度為2%(w/v)的CHG，以及2%(八)0與5%、10%、20%和50%(v/v)EO的結(jié)合物。將吐溫80W.(v/v)]添加至這些測(cè)試溶液中，以增加EO在載體中的溶解度。將1ml測(cè)試溶液涂于供給室中的皮膚表面上，并以防潮膜密封該室以防止蒸發(fā)。在以下時(shí)間取出Iml的接受液前2小時(shí)內(nèi)每30分鐘、2-6小時(shí)內(nèi)每小時(shí)以及在第8、12和24小時(shí)。從接收室取出的流體立即以等體積的新鮮PBS溶液替換。將所有樣品過(guò)濾通過(guò)0.45μm尼龍濾紙(Kinesis，UK)，并通過(guò)HPLC進(jìn)行分析。重復(fù)進(jìn)行3次測(cè)定。利用HPLC的CHG定量在室溫下，將所述樣品以1.2mL/分鐘的流速歷時(shí)9分鐘通過(guò)反相色譜柱(CPS-2Hypersil)，在254nm下進(jìn)行紫外線檢測(cè)。無(wú)梯度洗脫流動(dòng)相由甲醇水混合物(7525)與0.005M庚烷磺酸鈉和0.(v/v)二乙胺組成，用冰醋酸調(diào)整至pH4(在研究之前確認(rèn)用HPLC定量CHG的方法可行，并且確定檢測(cè)水平(LOD)和定量水平(LOQ)——數(shù)據(jù)未顯示)°CHG同EO和IPA的穿透情況研究將裝載于Franz擴(kuò)散池上的經(jīng)切割的全厚度人皮膚樣品暴露于溶于70%(v/v)IPA中的2%(w/v)CHG以及2%(w/v)CHG和50%(v/v)EO(二者均含0.1%(v/v)吐溫80)2分鐘、30分鐘和24小時(shí)。在24小時(shí)暴露后，評(píng)價(jià)2%(w/v)CHG和20%、10%和5%(v/v)EO的結(jié)合物(含0.(v/v)吐溫80)的CHG穿透。在暴露后，取下皮膚樣品，以PBS洗滌并以吸收巾干燥。將這些皮膚樣品迅速以冷凍噴霧器(BrightInstruments)噴射并于-20°C下冷凍。從每個(gè)冷凍樣品切下穿孔生檢樣品(直徑7mm，三個(gè)重復(fù))并置于包埋化合物(BrightInstruments，Cambs，UK)中的軟木盤上。將這些冷凍樣品用切片機(jī)(BrightInstruments)水平切成20μm的切片(從表面至600μm深度)和30μm的切片(從600至1500μπι深度)。將每個(gè)切片均置于Eppendorf管中，并確定每個(gè)皮膚樣品的總重量。通過(guò)以下方式從皮膚提取氯己定將ImL等分的流動(dòng)相溶液(75%甲醇、25%蒸餾水、0.庚烷磺酸鈉、0.二乙胺，PH4)加至皮膚樣品中，于60°C下在水浴中孵育1小時(shí)。將這些樣品通過(guò)旋轉(zhuǎn)混合并過(guò)濾，然后進(jìn)行HPLC分析。計(jì)算結(jié)果表示為每mg皮膚中CHG的yg數(shù)。對(duì)照皮膚(未處理的皮膚)與測(cè)試樣品平行分析。重復(fù)進(jìn)行3次測(cè)定。統(tǒng)計(jì)分析所獲得的數(shù)據(jù)使用INSTAT3軟件(Graphpadsoftwareversion3.06)以studentt-檢驗(yàn)進(jìn)行分析，顯著性水平為<0.05。結(jié)果皮膚滲透研究使用來(lái)自兩個(gè)供體的皮膚時(shí)，在24小時(shí)滲透研究過(guò)程中在接收室中沒(méi)有檢測(cè)到氯己定(L0D0.0157μg/mL)。在對(duì)暴露于溶于70%(v/v)IPA中的2%(w/v)CHG以及2%(w/v)CHG和50%(v/v)EO達(dá)24小時(shí)后的第三個(gè)供體皮膚上進(jìn)行滲透研究過(guò)程中，檢測(cè)到了可忽略的CHG水平(低于施用劑量的0.0016%)。CHG皮膚穿透情況研究暴露2分鐘和30分鐘后的CHG皮膚穿透情況與水溶液中的CHG或者70%(v/v)IPA中的CHG相比，在以CHG和50%(w/v)EO的結(jié)合物處理后，穿透并保持于皮膚中的CHG量顯著更大；在2分鐘暴露后，與暴露于CHG水溶液相比，暴露于CHG和50%(v/v)EO的結(jié)合物時(shí)皮膚更深層的CHG平均濃度有顯著差異(深度300-1500ym;p<0.05)，該深度的組織在以CHG/E0結(jié)合物滅菌后的CHG平均濃度(帶SEM)為0.0270μg/mg組織(士0.0021μg/mg組織)，在僅以CHG抗菌后的CHG平均濃度(帶SEM)為0.0048μg/mg組織(士0.0008μg/mg組織)。CHG/E0和溶于70%(ν/ν)IPA中的CHG之間的差異在所有皮膚深度下都是顯著的，CHG/E0和CHG/IPA在上部100μm中的CHG平均濃度(帶SEM)分別為0.1167(士0.0313)和0.0226(士0.007)。在30分鐘時(shí)，與僅CHG或CHG/IPA相比，CHG/E0在所有皮膚深度的CHG濃度均顯著更高(P<0.05)；在300μm-1500μm的深度處，與CHG或CHG/IPA相比，CHG/E0的CHG濃度增加超過(guò)9.5倍，CHG/EO、CHG和CHG/IPA的CHG平均濃度(帶SEM)分別為0.0190(士0.0015)μg/mg組織、0.0021(士0.0004)μg/mg組織和0.0022(士0.0018)μg/mg組織。在上部層(0-300μm)中，與僅CHG相比，CHG/E0的CHG平均濃度高4.8-6.4倍；而與CHG/IPA相比，CHG/E0的CHG平均濃度高2.7-20倍。24小時(shí)暴露后的CHG皮膚穿透與僅存在CHG時(shí)相比，在存在50%(v/v)EO的情況下，在滲透24小時(shí)后從所有皮膚層(0-1500μm)提取的CHG濃度都明顯更高(ρ<0.05)；上部100μm層的CHG濃度有超過(guò)2倍的增加(對(duì)于CHG和CHG/E0處理，分別為每mg組織7.880μg和16.841μg)，深度300-1500μm的更深層皮膚中差異增加超過(guò)5倍[對(duì)于CHG和CHG/E0，分別為每mg組織0.581(士0.0466)μg和3.123(士0.16470)μg]。該保持研究的數(shù)據(jù)是通過(guò)匯總來(lái)自5個(gè)連續(xù)的20μm和30μm皮膚切片的數(shù)據(jù)得到(即來(lái)自上部至600μm深度的100μm切片和來(lái)自600-1500μm深度的150μm切片)。暴露于IPA和多種濃度EO24小時(shí)后的CHG皮膚穿透對(duì)增強(qiáng)CHG向皮膚內(nèi)穿透的最佳EO濃度進(jìn)行了評(píng)估。與僅CHG相比5%(v/v)EO能夠使得在皮膚更深層(300μm以下)處CHG皮膚穿透明顯更高(ρ<0.05)，10%(ν/ν)EO顯著增強(qiáng)上層900μm中的CHG皮膚穿透(ρ<0.05)。2%(w/v)CHG水溶液以及2%(w/v)CHG和70%(v/v)IPA的CHG皮膚穿透無(wú)顯著差異(ρ>0.05)。將增強(qiáng)CHG向全厚度人皮膚內(nèi)穿透的最佳EO濃度與溶于70%(v/v)IPA中的2%(w/v)CHG結(jié)合以進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)價(jià)。在暴露2分鐘和30分鐘后，與僅2%(w/v)CHG/70%(ν/ν)IPA相比，10%(v/v)EO與溶于70%(v/v)IPA中的2%(w/v)CHG的結(jié)合物增強(qiáng)了CHG皮膚穿透(P<0.05；圖2)。參考文獻(xiàn)上文所引用的下述參考文獻(xiàn)全部通過(guò)引用的方式納入本文。Adams,D.H.,Anevaluationofthreestrategiestoreducedevicerelatedinfectionassociatedwithhypodermicneedlesandperipheralvascularcatheters，2006,PhDthesis,AstonUniversity.Al-Shuneigat，J.，Cox,S.D.，Markham,J.L，Effectsofatopicalessentialoilcontainingformulationonbiofilm-formingcoagulase-negativestaphylococci,LettersinAppliedMicrobiology，2005，41，52-55.Biruss，B.，KahliglH.，Valenta，C.，Evaluationofaneucalyptusoilcontainingtopicaldrugdeliverysystemforselectedsteriodhormones，InternationalJournalofPharmaceutics,2007,328,142-151.Block，C.，F(xiàn)urman，M.，Associationbetweenintensityofchlorhexidineuseandmicro-organismsofreducedsusceptibilityinahospitalenvironment,JournalofHospitalInfection，2002，51，201—206.Caelli，M.，Porteous，J.，Carson，C.F.，Heller，R.，Riley,Τ.V.，Teatreeoilasanalternativetopicaldecolonizationagentformethici11in-resistantStaphylococcusaureus,JournalofHospitalInfection，2000，46，236-237.Constant，H.，F(xiàn)alson，F(xiàn).，Pirot，F(xiàn).，Currentandnewstrategiesforthedeliveryofantisepticagents,CurrentDrugdelivery,2006,3(3),315-323.Cowan,Μ.M.，PlantProductsasAntimicrobialAgents，ClinicalMicrobiologyReviews,1999，12，564—582.Dryden,M.S.，Dailly，S.，Crouch,M.，Arandomized,controlledtrialofteatreetopicalpreparationsversusastandardtopicalregimenfortheclearanceofMRSAcolonization，JournalofHospitalInfection，2004，56，283—286.Dursun,N.，Liman,N.，OzyazganI.，Gunes,I.，Saraymen,R.，Roleofthymusoilinburnhealing，JournalofBurnCareRehabilitation，2003，24(6)，395-399.Elliott，T.S.，Moss，H.A.，Tebbs，S.E.，Wilson,I.C.，Bonser,R.S.，Graham，Τ.R.，Burke,L.P.，F(xiàn)aroqui,Μ.H.，Novelapproachtoinvestigateasourceofmicrobialcontaminationofcentralvenouscatheters,EuropeanJournalofClinicalMicrobiology,1997，16，210-213.Fang，J.，Leu,Y.L.，Hwang,T.L.，Cheng，H.C.，Essentialoilsformsweetbasil(Ocimumbasilicum)asnovelenhancerstoacceleratetransdermaldrugdelivery,BiologicalandPharmaceuticalBulletin，2004，27，1819-1825.Filoche，S.K.，Soma，K.，Sissons，C.H.，Antimicrobialeffectsofessentialoilsincombinationwithchlorhexidinedigluconate，OralMicrobiologyandImmunology,2005，20，221-225.Fraise，A.P.，Susceptibilityofanticiotic-resistantcoccitobiocides，JournalofAppliedMicrobiology,2002,92,Suppl158S-162S(Review).Freeman，D.J.，F(xiàn)alkiner，F(xiàn).R.，Keane，C.T，.Newmethodfordetectingslimeproductionbycoagulasenegativestaphylococci,JournalofClinicalPathology,1989，42(8)，872-874.Gristina,A.G.，Jennings,R.A.，Naylor,P.Τ.，Myrvik,Q.N.，Webb,L.X.,ComparativeInVitroAntibioticResistanceofSurface—ColonizingCoagulase-NegativeStaphylococci,AntimicrobialAgentsandChemotherapy，1989，33，813-816.HandbookofPharmaceuticalExcipients，2ndedition,1994.Karpanen，Τ.J.，Worthington,Τ.，Conway,B.，Lambert，P.Α.，2006(POSTER).KSIjalq,S.，Naaber，P.andMikelsaarmM.，Antibioticresistanceasanindicatorofbacterialchlorhexidinesusceptibility,JournalofHospitalInfection，2002，51，106-113.Lafforgue，C.，Carret,L.，F(xiàn)alson,F.，Reverdy,Μ.Ε.，F(xiàn)reney,J.，Percutaneousabsorptionofachlorhexidinedigluconatesolution,InternationalJournalofPharmaceutics,1997，147，243-246.Langgartner，K.，Linde，H.J.，Lehn,N.，Reng,Μ.，SchSlmerich,J.，Gliick，Τ.，Combinedskindisinfectionwithchlorhexidine/propanolandaqueouspovidone-iodinereducesbacteriacolonisationofcentralvenouscatheters.IntensiveCareMedicine,2004，30，1081—1088.McDonnell，G.，Russell，A.D.，AntisepticsandDisinfectants:Activity，ActionandResistance，ClinicalMicrobiologyReviews，1999，12，147—179.Messager,S.，Hammer，K.A.，Carson，S.F.，Riley,Τ.V.，Effectivenessofhand-cleansingformulationscontainingteatreeoilassessedexvivoonhumanskinandininvivowithvolunteersusingEuropeanStandardEN1499，JournalofHospitallnfection，2005，59，220-228.NCCLS(NationalCommitteeforClinicalLaboratoryStandards)，Performancestandardsforantimicrobialdisksusceptibilitytest，(6thedition)，ApprovedStandard，M2-A6，WaynePA，1997.Pfaller,M.A.，Jones，R.N.，Doern,G.V.，Sader,H.D.，Kugler,K.C.，Beach，Μ.L.，Surveyofbloodstreaminfectionsattributedtogram-positivecoccifrequencyofoccurrenceandantimicrobialsusceptibilityofisolatescollectedin1997intheUnitedStates，Canada，andLatinAmericafromtheSENTRYAntimicrobialSurveillanceProgram，SENTRYParticipantsGroup，DiagnMicrobiolInfectDis，1999，33，283-297.Reichling，J.，Landvatter，U.，Wagner,H.，Kostka，K_H，Schaefer，U.F.，InvitrostudiesonreleaseandhumanskinpermeationofAutralianteetreeoil(TTO)fromtopicalformulations,EuropeanJournalofPharmaceuticalsandBiopharmaceutics，2006，64，222—228.Remington'sPharmaceuticalSciences，18thedition，MackPublishingCompany,Easton,Pa.，1990.Richards，M.J.，Edwards,J.R.，Culver,D.H.，Gaynes，R.P.，Nosocomialinfectionsincombinedmedical-surgicalintensivecareunitsintheUnitesStates，InfectControlHospEpidemiol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