專利名稱：含肌腱細胞的生物支架和使用該生物支架的治療方法
技術領域：
本發(fā)明涉及制備用于修復撕裂(tear)的生物支架的方法。具體而言，本發(fā)明涉及 使用接種有肌腱細胞的生物支架來修復肩袖撕裂(rotator cufftears)的方法。
背景技術：
肩袖腱撕裂是由于持續(xù)頭上活動(overhead activities)引起的損傷所造成的常 見后果(Briner et al. ， (1997) Sports Med. 24(1) :65-71)。大量研究描述了肌腱修復的不 同技術。包括縫合技術(Gerber et al. ， (1999) J. Bone Joint Surg. Am. 81 (9) :1281-90)、 腱骨固定技術(Burkhart et al. ， (2000) Arthroscopy. 16 (7) :82-90)、用于收縮撕裂的肌 腱移動和滑動技術(Tauro et al. ， (1999)Arthroscopy. 15(5) :527-30)和采用多種組織或 合成的肌腱移植物的技術(Amstutz et al. (1976) J. Biomed. Mater. Res. 10(1) :47-59)。
外科手術修復通?？色@得在術后前期高水平的功能改善和患者滿意度，但存 在明顯的與較大面積的慢性撕裂相關的發(fā)病率(Hattrup， (1995)J. Shoulder Elbow Surg.4(2) :95-100)。此外，對失敗的肩袖修復進行修正手術的成功率是非常低的 (Bigliani et al. (1992) J. Bone Joint Surg. Am. 74 (10) :1505-15)。因此，本領域需要發(fā) 展更好的用于治療肩袖撕裂的方法。 已提出在肩袖撕裂中試圖改善手術結果的生物支架和合成埋植物(參見US Patent No. 4，668，233、 US Patent No. 4，775，380、 US Patent No. 5，352，463、 US Patent No.4，902，508、以及EP 0 223 370)。這些裝置可促進埋植術中的組織入侵，希望組織與裝 置一起向內生長，這些裝置將獲得改善的傷口愈合和患者的功能改善。然而，用于治療肩 袖撕裂的裝置通常未能表現(xiàn)出成功的長期結果，并且經常發(fā)生由于非功能性脂肪組織的入 侵、腱鞘炎、松弛或植入物失效所導致的失敗。而且，所述裝置的持續(xù)負載和對關節(jié)組織的 磨損導致裝置的耗損(wear)、移位(cre印)和勞損，并最終造成裝置失效。
同樣地，在肩袖撕裂中使用裝置(如生物支架)的增補手術修復也未顯示出對患 者臨床結果的改善(Iannotti， (1994) J. Am. Acad. Orthop. Surg. 2 (2) :87-95)。如此，目前 的方法是欠佳的，需要發(fā)展更好的用于修復肩袖撕裂的療法。

發(fā)明內容
現(xiàn)在本發(fā)明發(fā)展了一種治療肩袖撕裂的基于細胞的組織工程學新方法，該方法包 括植入已接種有經體外擴大培養(yǎng)的肌腱細胞的生物支架。 因此，本發(fā)明的第一方面提供了治療哺乳動物患者的肩袖撕裂的方法，其中，該方 法包括(i)在含有胰島素或胰島素的功能性衍生物以及糖皮質激素或糖皮質激素類分子 的培養(yǎng)基中，在體外選擇性地擴大培養(yǎng)(e鄧anding)肌腱細胞，以制備經擴大培養(yǎng)的肌腱 細胞培養(yǎng)物；(ii)將所述經擴大培養(yǎng)的肌腱細胞接種至生物支架，以制備接種有肌腱細胞 的生物支架；和(iii)將所述接種有肌腱細胞的生物支架植入到鄰近肩袖撕裂的位置。
在一些實施方式中，將接種有肌腱細胞的生物支架在體外培養(yǎng)足夠時間，以在植入之前建立肌腱細胞。 在一些實施方式中，肩袖撕裂是大面積的肩袖撕裂。 令人贊賞的是，本文所述的用于該方法的肌腱細胞和本發(fā)明裝置可從任何含有肌 腱細胞的組織中分離得到。在一些實施方式中，所述組織是肌腱。肌腱可來自哺乳動物的 任何解剖位點，并且可以是肩袖肌腱(rotator cufftendon)、岡上肌腱(supraspinatus tendon)、肩月甲下月幾鍵(subcapularis tendon)、胸大月幾鍵(pectoralis major tendon)、 腓肌腱(peroneal tendon)、跟腱、脛前肌腱(tibialis anterior tendon)、前交叉韌帶 (anterior cruciate ligament)、后交叉韋刃帶(posterior cruciate ligament)、月國鍵 (hamstring tendon)、夕卜側頓帶(lateral ligament)、內側頓帶(medial ligament)、骨賓骨 肌腱(patella tendon) 、二頭肌腱(bic印s tendon)、以及三頭肌腱(tric印s tendon)。
在一些實施方式中，含肌腱細胞的組織可以是從任何哺乳動物中分離的，所述哺 乳動物包括但不限于羊、牛、豬或人。在其他實施方式中，含肌腱細胞的組織是從人身上分 離的。在另外的實施方式中含肌腱細胞的組織是從需要治療的患者身上分離的。
分離的肌腱細胞是在含有胰島素或胰島素的功能性衍生物的培養(yǎng)基中，通過體外 培養(yǎng)進行選擇性擴大培養(yǎng)的。在一些實施方式中該培養(yǎng)基含有約0. 00005-0. 1重量/體 積％的胰島素或胰島素的功能性衍生物。在其他實施方式中培養(yǎng)基含有約0. 0001-0. 001 重量/體積％的胰島素或胰島素的功能性衍生物。在另外的實施方式中培養(yǎng)基含有約 0. 0006重量/體積％的胰島素或胰島素的功能性衍生物。 所述培養(yǎng)基還可含有糖皮質激素，如合成的糖皮質激素，或糖皮質激素類分子 (glucocorticoid-like molecule)。在一些實施方式中糖皮質激素是倍他米松。培養(yǎng)基可 含有約0.00001-0. 1重量/體積％的糖皮質激素或糖皮質激素類分子。在一些實施方式中 培養(yǎng)基含有約0. 0001-0. 001重量/體積％的糖皮質激素或糖皮質激素類分子。在另外的 實施方式中培養(yǎng)基含有約0. 0002重量/體積％的糖皮質激素或糖皮質激素類分子。
在一些實施方式中，經擴大培養(yǎng)的肌腱細胞的培養(yǎng)物含有至少80%的肌腱細胞和 不多于20%的非肌腱細胞。在其他實施方式中，所述培養(yǎng)物中的至少90%的細胞是肌腱細 胞。在另外的實施方式中，選擇性擴大培養(yǎng)的肌腱細胞培養(yǎng)物中至少95%的細胞是肌腱細 胞。 在一些實施方式，經擴大培養(yǎng)的肌腱細胞培養(yǎng)物所含的細胞中至少80%的細胞表 達編碼以下因子的一種或多種基因I型膠原、III型膠原、EphA4、鞏膜(Scleraxis)、Sixl、 C0MP禾口 /或Cbf al 。 在第二方面，本發(fā)明提供了治療人患者大面積肩袖撕裂的方法，其中，該方法包 括(i)從所述患者身上提取的肌腱組織中分離肌腱細胞；(ii)在含有約0. 0006重量/體 積％的胰島素或胰島素的功能性衍生物以及約0. 0002重量/體積％的糖皮質激素或糖皮 質激素類分子的培養(yǎng)基中，在體外選擇性地擴大培養(yǎng)所述肌腱細胞，以制備含有至少80% 肌腱細胞的經擴大培養(yǎng)的肌腱細胞培養(yǎng)物；(iii)將所述經擴大培養(yǎng)的肌腱細胞接種至生 物支架并將所述生物支架和肌腱細胞培養(yǎng)不大于5天，以制備接種有肌腱細胞的生物支 架；和(iv)將所述接種有肌腱細胞的生物支架植入到肩袖撕裂處。 在第三方面，本發(fā)明提供了含有細胞的生物支架，其中，所述細胞中大于80%的細 胞是肌腱細胞。在一些實施方式中，所述生物支架含有至少90%、95%或99%的肌腱細胞。
所述生物支架可含有細胞，其中，所述細胞中的至少80%的細胞表達編碼以下因 子的一種或多種基因1型膠原、III型膠原、EphA4、鞏膜、Sixl、 C0MP和/或Cbfal。
所述生物支架可含有骨架(matrix)、膜、微球、毛狀物(fleece)、線狀物 (thread)、或凝膠，和/或它們的組合。在一些實施方式中，所述生物支架含有I/III型膠 原骨架(ACI Matrix )或小腸粘膜下層(Vitrogen )。


圖1 :動物研究的實驗設計。
圖2 :兔大面積肩袖撕裂的模型。 圖3 :在培養(yǎng)的肌腱細胞和肌腱組織中表達I/III型膠原和EphA4。 圖4 :1型膠原在肌腱細胞體外培養(yǎng)物中的免疫染色。(A)試驗孔(100倍)；(B)
對照孔(100倍)。 圖5 : (A) ACI-Maix 生物支架中疏松多孔的膠原纖維排列(100倍)。(B) 72小時 之后整合到ACI-MaixTM膠原纖維內的肌腱細胞層(200倍)。(C)示例性ACI-Maix 生物支 架中兩類前突(泡黑色箭頭&層形足板(lamellipodia):白色箭頭)的單細胞形態(tài)(1500 倍)。(D)顯示Restore 小腸粘膜下層生物支架的平面形態(tài)和高度緊密的膠原結構的橫切 掃描電鏡檢查(400倍)。(E)肌腱細胞(箭頭)顯示了 Restore 生物支架中的單層生長模 式與體外所觀察到的模式類似，具有紡垂形的外觀和雙極或三極的層形足板細胞附著(200 倍)。(F) Restore 生物支架中的在細胞表面具有可見突起(泡黑色箭頭&層形足板白 色箭頭)的單細胞(650倍)。 圖6 :對照組；蘇木精和伊紅。(A) 4周對照樣品的特征在于細胞質的增加和新生成 血管和膠原纖維組織的變化(250倍)。(B)4周樣品的骨槽(BT)特征在于細胞數量的增加 和礦化區(qū)的缺乏(IOO倍)。(C)8周樣品顯示了具有更低細胞密度和不均勻排布平行膠原 纖維排列的更加有組織的結構(IOO倍)。(D)8周樣品的骨槽示范了典型的成熟4-區(qū)結構 (100倍)。MT :再生肌腱的中間質(Mid-substance)。 圖7 :ACI-MaixTM生物支架組；蘇木精和伊紅。(A)大部分的ACI-Maix 生物支架在 4周時不被吸收，在生物支架周圍具有明顯的淋巴細胞滲透(25倍)。(B)4周樣品的吸收區(qū) 域證實了以粗糙膠原排列、增加的細胞質、以及形成新生血管為特征的一期修復模式(100 倍)。(C)4周樣品的骨槽由軟骨組織形成，具有由骨槽邊緣延展出來的致密纖維組織(100 倍)。(D)8周樣品顯示了更加有組織的結構(IOO倍)。(E)骨槽形成也是成熟的。(F)再
生肌腱的中間質中脂肪組織(箭頭)的導入(100倍)U:未吸收的生物支架；L:淋巴細胞的 入侵；A :吸收區(qū)域；V :血管化組織。 圖8 -Restore 生物支架組；蘇木精和伊紅。(A) ReSt0reTMSIS生物支架的原始結 構看起來是紊亂的纖維。在植入物內部和周圍可觀察到大量炎癥細胞(25倍)。(B)吸收 區(qū)域證實了存在于富含血管化結締組織骨架中的具有雙圓和紡錘形形態(tài)的成纖維細胞數 量的增加(IOO倍)。(C)8周樣品不完全吸收并且存在明顯的淋巴細胞滲透(IOO倍)。(D)
骨骼肌腱結合處顯示了成熟的4區(qū)結構(100倍)。A :吸收區(qū)；U :未吸收的生物支架；L :淋 巴細胞；V:血管化組織。 圖9 :接種自體同源肌腱細胞的ACI-Maix 生物支架組；蘇木精和伊紅。(A)在4周，植入肌腱細胞的ACI-Maix 生物支架完全不被吸收并引起淋巴細胞的滲透(100倍)。 (B)幾乎未植入的自體同源肌腱細胞(箭頭)也被點染至剩余的生物支架中(200倍)。(C) 在8周，植入肌腱細胞的ACI-MaixTM生物支架顯示了與對照組一致的結果(IOO倍)。(D)
骨槽(BT)組織學不能與對照組顯示出區(qū)別(IOO倍)。A :吸收區(qū)；U :未吸收的生物支架；L : 淋巴細胞；MT :再生肌腱的中間質。 圖10 :RestoreTM生物支架+自體同源肌腱細胞組；蘇木精和伊紅。(A)在8周，植 入自體同源肌腱細胞的Restore 生物支架證實了具有與對照組類似的優(yōu)異肌腱結構(100 倍)。(B)肌腱骨骼結合處也是成熟的，顯示了典型的4區(qū)結構(IOO倍)。(C)將一些肉芽 組織與膠原纖維混合點染，類似慢性的肉芽反應(100倍)。(D)在植入Restore 生物支架 的所有的組中均發(fā)現(xiàn)異位骨的小病灶(100倍)。
圖11 :發(fā)炎率被炎癥細胞占有的修復肌腱的百分比。 圖12 :在4周和8周時，單獨植入的ACI-Maix 和Restore 生物支架或接種有自 體同源肌腱細胞的ACI-Maix 和Restore 生物支架的組織學評分。 圖13 :對ACI-MaixTM+肌腱細胞的I型膠原(A)的免疫染色試驗(藍色箭頭細胞 質區(qū)域；黑色箭頭細胞外基質)(400倍)。(B)陰性對照(400倍)。 圖14 :在4周和8周時，單獨植入的ACI-Maix 和Restore 生物支架或接種有自 體同源肌腱細胞的ACI-Maix 和Restore 生物支架內的I型膠原陽性細胞。
圖15 :操作條件和兔I/III型膠原蛋白、EphA4、以及GAPDH基因的引物序列。
圖16 :幾何測量由從未接受手術肩部收集的五十個標準兔肩袖肌腱中測量的正 常厚度，寬度和長度。所有測量是在室溫放松狀態(tài)下進行。
具體實施例方式
在具體描述本發(fā)明之前，應該理解的是本發(fā)明不限于具體例舉的方法，是可以變 化的。還應理解的是本文所用術語僅是為了描述本發(fā)明的具體實施方式
，并不會限制僅由 所附權利要求限制的那些。 本文所引用的所有出版物、專利和專利申請(無論是上文或下文中)都因此以參 照被整體并入。但是，本發(fā)明所述的出版物是為了描述與公開出版物中所述的可能用于接 連本發(fā)明的方案和試劑目的而引用的。但沒有證據表明由于這些先前的公開而能夠導致本 發(fā)明不能夠被授權。 除非另有說明，本發(fā)明的實踐將采用細胞培養(yǎng)、細胞生物學和矯形外科的常規(guī)技 術，這都是本領域技術人員所知的。在以下文獻中描述了這些技術，參見，例如Coligan et al. ， 1999 "Current protocols in Protein Science"Volume land II(John Wiley & Sons Inc.) ;Ross et al. ， 1995 "Histology :Text and Atlas ，，， 3rd Ed. ， (Williams & Wilkins) ;Kruse & Patterson (eds. ) 1977 "Tissue Culture，， (Academic Press); Canale (ed. ) 2003 "Campbell' s Operative Orthopaedics" 10thed. (St. Louis， Mo. :MD Consult LLC) ;and Alberts et al. 2000 "MolecularBiology of the Cell" (Garland Science)。 必須注意的是，除非上下文明顯指示否則本文和所附權利要求中使用的單數形式 "一個"，和"該"包括復數。因而，例如"一個細胞"包括這種細胞的復數，和"一種試劑"是指一種或多種試劑，等等。除非另有定義，本文所用的所有技術和科學術語具有與本發(fā)明所 屬的領域普通技術人員通常理解相同的含義。 盡管類似于或等同于本文所述的任何材料和方法可用于實踐或試驗本發(fā)明，現(xiàn)在 將描述優(yōu)選的材料和方法。 在一些實施方式中，本發(fā)明關注于治療肩袖撕裂的方法。 本文所用的術語"治療"或"處理"或其語法等同成分涵蓋了治療哺乳動物患者 (優(yōu)選人)的肩袖撕裂，包括(a)救護或改善肩袖撕裂癥狀，即使肩袖撕裂的癥狀恢復；或 (b)預防或抑制易發(fā)生肩袖撕裂但還未被診斷為患病的患者(例如之前治療過肩袖撕裂的 人)中肩袖撕裂的復發(fā)。治療的結果可以是鑒于部分或完全治愈肩袖撕裂的治療或鑒于完 全或部分預防發(fā)生肩袖撕裂的預防。 肩袖是指用于固定肩部的肌肉及肌腱群。肩袖肌肉是一組圍繞肩部的四塊肌肉 (岡上肌、岡下肌、小圓肌和肩胛下肌)。四個肩袖肌肉肌腱組合形成寬的連接肌腱，稱為肩 袖肌腱，并附在肩部肱頭的骨骼上。 術語"肩袖撕裂"是指四個肩袖肌肉肌腱中的一個或多個或肩袖的連接肌腱的撕 裂。肩袖肌腱的撕裂可以是局部厚度的撕裂，全部厚度的撕裂或全部厚度的撕裂且肌腱與 骨骼的完全解離。全部厚度的撕裂是指貫穿整個肌腱的創(chuàng)傷。其在尺寸上可以從很小或極 小向很大至包括大部分的肌腱變化。全部厚度的撕裂還可以包括肌腱從肱頭的完全解離。
在一些實施方式中，肩袖撕裂是大面積的肩袖撕裂。 術語"大面積肩袖撕裂"是指大于約5cm的撕裂和包括大于一個肌腱的撕裂。
令人欣喜的是，大部分哺乳動物含有肌腱且所有的這些肌腱含有內含在富含糖蛋 白的骨架中的膠原纖維。從而，在本說明書中術語"哺乳動物患者"是指任何哺乳動物，如人 或對人具有經濟重要性和/或社會重要性的哺乳動物，例如除人之外的食肉動物(如貓和 狗)。還提供了修復家畜類的肩袖損傷，所述家畜包括但不限于馴養(yǎng)豬(豬(pigs)和肥豬 (hogs))、反芻動物、馬等等。所述術語不指定特定年齡。從而，包括成年的和新生的患者。
在一些實施方式中，第一步包括從來源處分離一組肌腱細胞。本文所用術語"肌腱 細胞"是指可在所有哺乳動物肌腱中發(fā)現(xiàn)的紡垂形的成纖維樣細胞。肌腱細胞通常具有狹 長的細胞核和濃稠細胞質，且通常被發(fā)現(xiàn)位于肌腱的膠原纖維中。在它們產生I型膠原和 表達標記"鞏膜"的方面，肌腱細胞通常是一致的。因此，在一些方面本發(fā)明的肌腱細胞是 表達鞏膜的細胞或能夠表達I型膠原或鞏膜的細胞。 本文所用術語"來源"是指在任何哺乳動物中任何含有肌腱細胞的組織。在一些 實施方式中，含肌腱細胞的組織是肌腱。肌腱是哺乳動物中連接肌肉和骨骼的組織。肌腱 可來自哺乳動物的任意解剖位點且可以是肩袖肌腱、岡下肌腱、岡上肌腱、肩胛下肌腱、胸 大肌腱、腓肌腱、跟腱、脛前肌腱、前交叉韌帶、后交叉韌帶、胭腱、外側韌帶、內側韌帶、髕骨 肌腱、二頭肌腱、以及三頭肌腱。 肌腱細胞可通過本領域技術人員已知的多種方式從來源處分離到。在一些實施方 式中，肌腱細胞可通過常規(guī)方法從活組織材料分離。如以下具體描述的，在一些實施方式 中，通過酶促消化來分離肌腱細胞。 在一些實施方式中，含肌腱細胞的組織可從任何哺乳動物中分離得到，包括但不 限于羊、牛、豬或人。在其他實施方式中，含肌腱細胞的組織是從人身上分離的。
在一些實施方式中，含肌腱細胞的組織是"自體同源的"，即從需要治療肩袖撕 裂的患者身上分離的。例如，患肩袖撕裂的哺乳動物患者可具有從它們身體中任何肌腱 提取的活組織。這些肌腱包括但不限于，橈側腕屈肌的肌腱(tendon of flexor carpi radial is)和跟骨肌腱。 可通過對作為肌腱細胞來源的組織做適當處理，而從活組織材料中獲取肌腱細 胞。為獲取肌腱細胞的組織處理技術是本領域技術人員已知的，參見例如"Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique" 2nd ed. (A. R. Lisslnc.)。例如，組織或器 官可被機械地解離和/或，以消化酶處理或螯合劑以減弱細胞之間的作用以便獲取單個細 胞的懸浮液。典型的方法可包括機械解離、酶處理和螯合劑的組合。在一個技術中組織是 剁碎的并以消化酶單獨或組合地進行同時或依次的處理?？捎糜诜蛛x細胞的酶的實例包 括但不限于胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、膠原酶、彈性蛋白酶、玻璃酸酶(hyaluronidase)、 DNA酶、鏈霉蛋白酶、中性蛋白酶等等。在一些實施方式中，采用含有具有約43nkat/ml至約 51nkat/ml膠原酶活性和約0. 22nkat/ml至約0. 44nkat/ml木瓜凝乳蛋白酶活性的水性混 合液的酶組合物來分離細胞，例如US PatentNo. 5， 422， 261所述。機械解離也可通過例如 采用攪拌器、篩、均質器、壓敏元件(pressure cell)等等完成。 制得的細胞和細胞簇的懸浮液還可分成實質同源的細胞類型的組。這可采用細胞 分離的標準技術完成，包括例如陽性篩選法(例如克隆性增殖和特定細胞類型的篩選)； 陰性篩選(例如不期望細胞的裂解)；基于在密度溶液中的特定重力、混合的細胞群中細胞 的不同粘附特性的分離；熒光活化細胞分類術(FACS)，等等。本領域已知的其他篩選和分 離方法參見例如Freshney，，Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique"2nd ed. (A. R. Liss Inc.)。 在一些實施方式中，將通過活組織切片分離的肌腱組織進行清洗、切分和消化，以 形成可在細胞培養(yǎng)液中生長以產生游離肌腱細胞的外植體。在一些實施方式中，對活組織 切片組織進行酶促消化和/或加入可結合或螯合細胞相互粘附所依賴的Ca2+的試劑，如乙 二胺四乙酸(EDTA)。適宜使用的酶實例包括膠原酶、胰蛋白酶、以及蛋白酶中的一種或多 種。 在一些實施方式中，將剁碎至不大于1mm的肌腱組織在含有約2. 5重量/體積％ 胰蛋白酶和約5. 5重量/體積％膠原酶且不含酚紅的標準組織培養(yǎng)基中約37t:約5% C02 下溫育至少3小時。 在一些實施方式中，在酶促消化后，通過離心活組織溶液和以細胞生長培養(yǎng)基清 洗所得小片，從活組織中回收肌腱細胞?？蛇x地，通過例如篩網如無菌150微米尼龍網的 過濾，可從活組織溶液中回收肌腱細胞。另一方式是基于一些細胞類型牢固地粘附在塑料 或玻璃的趨向，可實現(xiàn)它們與粘附不牢固的肌腱成分的分離?？蛇x地，采用能夠與所述細 胞特異性結合的抗體可將所述細胞與肌腱的其他成分分離，例如采用結合骨架的抗體或偶 聯(lián)熒光染料，然后可通過熒光活化細胞分類術(FACS)進行分離。在一些實施方式中，通過 0. 22 i！ m過濾器過濾活組織溶液以去除骨架碎片，并離心濾過液以形成細胞沉淀物來分離 肌腱細胞。然后以細胞生長培養(yǎng)基對所述細胞沉淀物進行清洗。 在體外選擇性擴大培養(yǎng)分離出的肌腱細胞。本文所用術語"選擇性擴大培養(yǎng)"是 指培養(yǎng)分離的肌腱細胞，通過這種方式使肌腱細胞生長并增加肌腱細胞數量，而不要其他細胞類型。 在一些實施方式中，在含有胰島素或胰島素的功能性衍生物的培養(yǎng)基中，在體外 擴大培養(yǎng)分離的肌腱細胞。胰島素是由胰腺產生的以其天然形式存在的激素。但是，用于 選擇性擴大培養(yǎng)肌腱細胞的培養(yǎng)基中的胰島素可以是合成的，例如重組胰島素，或天然存 在的。 胰島素的"功能性衍生物"是如Chan et al. ， 2000，" Insulin-through the ages: Phylogeny of a growth promoting and metabolic regulatory hormone，，(美國動物 學家；可登錄http://www. findarticles. com/p/articles/mi_qa3746/is_200004/ai_ n8899929)中描述的那些分子，其具有胰島素活性(即培養(yǎng)肌腱細胞能力)，并且包括胰島 素的生物活性片段、變體和衍生物。 在一些實施方式中，胰島素的"功能性衍生物"或其片段或變體的一個或幾個氨基 酸殘基被天然存在的20個標準氨基酸或合成的氨基酸同源物取代。這種同源物的實例是 4_羥基脯氨酸、5-羥基賴氨酸、3-甲基組氨酸、高絲氨酸、鳥氨酸、P-丙氨酸和4-氨基丁
酸、e-丙氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、羥脯氨酸、甲狀腺素、Y-氨酪酸、高絲氨酸、瓜氨酸等等。 胰島素的功能性衍生物的制備可使用聚乙二醇(PEG)并按照Sehon和合作者 (Wie et al.， supra)的方法來制備偶聯(lián)PEG的胰島素分子。此外，可在化學合成胰島素 的過程中加入PEG。制備胰島素的衍生物或其片段的其他方法包括還原/烷化(Tarr， Methods of Protein Micro_characterisation，J. E. Silver ed. ，Humana Press, Clifton N. J. 155-194(1986));酰化(Tarr， supra);化學偶聯(lián)適宜的載體(Mishell and Shiigi， eds， Selected Methods in Cellular Immunology, WH Freeman, San Francisco, Calif. (1980) ，U. S. Pat. No. 4， 939， 239 ;或 益和福爾馬林處理(Marsh， 1971， Int. Arch, of Allergy and Appl. Immunol. ，41 :199-215)。 應該注意的是，術語"功能性衍生物"不包括如胰島素類生長因子I或II在內的 分子。 胰島素或胰島素的功能性衍生物可在添加待培養(yǎng)的肌腱細胞之前，被引入到培養(yǎng) 基中。可選地，胰島素或胰島素的功能性衍生物可在整個培養(yǎng)期間被添加到培養(yǎng)基中，例如 通過在細胞滋養(yǎng)層(cell feeder layer)的存在下培養(yǎng)細胞(如P細胞)，這些細胞能夠 分泌胰島素或胰島素的功能性衍生物。 本文所用的"片段"是指胰島素蛋白的一部分，其保持了胰島素的功能尤其是對培 養(yǎng)物中肌腱細胞生長的支持能力。胰島素片段可以是至少約io個氨基酸殘基的長度，優(yōu)選 10-16個氨基酸殘基的長度，更優(yōu)選約10-20個氨基酸殘基的長度。 胰島素的"變體"是指具有一個或多個取代基而其二級結構保持不變的胰島素分 子。這種保守性取代的實例包括與原始氨基酸殘基具有實質相同的疏水性、大小和電荷的 氨基酸。這種取代通常是蛋白或肽化學領域技術人員公知的。例如，保守性取代包括脯氨 酸對甘氨酸的取代和甘氨酸對脯氨酸的取代；丙氨酸或纈氨酸對甘氨酸的取代和甘氨酸對 丙氨酸或纈氨酸的取代；異亮氨酸對亮氨酸的取代和亮氨酸對異亮氨酸的取代；組氨酸對 賴氨酸的取代和賴氨酸對組氨酸的取代；蘇氨酸對半胱氨酸的取代和半胱氨酸對蘇氨酸的 取代；谷胺酰胺對天冬酰胺的取代和天冬氨酸對谷胺酰胺的取代；和精氨酸對谷胺酰胺的取代和谷胺酰胺對精氨酸的取代。 胰島素變體的其他實例是半胱氨酸殘基被取代以通過雙硫連接而使二聚化作用 最小化的變體。優(yōu)選地，半胱氨酸殘基是被丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸或谷氨酸殘基取 代。此外，胰島素或其片段或衍生物的氨基酸側鏈可以被化學修飾。另一種修飾是胰島素 的環(huán)化。 在一些實施方式中，所述培養(yǎng)基含有約O. 00005重量/體積％至0. 1重量/體積％ 的胰島素或胰島素的功能性衍生物。在其他實施方式中，所述培養(yǎng)基含有約0. 0001重量/ 體積％至0. 001重量/體積％的胰島素或胰島素的功能性衍生物。在另外的實施方式中培 養(yǎng)基含有約0. 0006重量/體積％的胰島素或胰島素的功能性衍生物。 所述培養(yǎng)基還可含有糖皮質激素(如合成的糖皮質激素)、或糖皮質激素類分 子。糖皮質激素是一類類固醇激素，其特征在于具有與皮質醇受體結合的能力和與觸發(fā)器 (trigger)類似的作用，例如影響代謝或抗炎癥或免疫抑制的效果。糖皮質激素可以是天然 存在的(激素)或合成的(藥物)。 適宜用于選擇性擴大培養(yǎng)肌腱細胞的培養(yǎng)基的合成糖皮質激素實例包括氫化可 的松(hydrocortisone)、醋酸可的松(cortisone acetate)、潑尼松(predisone)、潑尼松 龍(prednisolone)、甲潑尼龍(methylprednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、倍他米 松(betamethasone)、曲安西龍(triamcinolone)、倍氯米松(beclometasone)、醋酸氟氫可 的松(fludrocortisones acetate)、醋酸脫氧皮質固酮(D0CA)、以及醛固酮。
"糖皮質激素類"分子可以是具有糖皮質激素活性的任何分子，即培養(yǎng)肌腱細胞 的能力。用于本發(fā)明的糖皮質激素類分子實例包括抗肝癌物，魚藤酮(Youssef et al.， 2003， J. Carcinogenesis 2:2)、利福平(Calleja et al. ， 1998， Nat. Med. ，4 :92-96)、甘 草皂苷( 一種甘草成分)(Kuroyanagi & Sato， 1966， Allergy, 15 :67-75)、以及睡茄交 酉旨(來自herb Withanthia somnifera)(Grandhi etal. ，1994， J. Ethnopharmacol. ，44 : 131-135)。 在一些實施方式中，糖皮質激素是13 -倍他米松。|3 -倍他米松是具有式C22H29F05 的合成糖皮質激素。 所述培養(yǎng)基可含有約0. 00001重量/體積％至0. 1重量/體積％的糖皮質激素或 糖皮質激素類分子。在一些實施方式中，所述培養(yǎng)基含有約0. 0001重量/體積％至0. 001 重量/體積％的糖皮質激素或糖皮質激素類分子。在另外的實施方式中，所述培養(yǎng)基含有 約0. 0002重量/體積％的糖皮質激素或糖皮質激素類分子。 在一些實施方式中，將分離肌腱細胞在約37t:約5% C02氣氛中培養(yǎng)約3天至約5 周。當然，細胞培養(yǎng)的時間是可以改變的。 制得的"擴大培養(yǎng)的肌腱細胞"培養(yǎng)物可以作為表示基本純的肌腱細胞培養(yǎng)物的 術語。本文所用的術語"基本純的"是指培養(yǎng)物中主要的細胞是肌腱細胞且其他雜質細胞 (如成纖維細胞，軟骨細胞等等)是少量的。在一些實施方式中，擴大培養(yǎng)的肌腱細胞中至 少80%的細胞是肌腱細胞和不大于20%的細胞是非肌腱細胞。在其他實施方式中，至少 90%的細胞是肌腱細胞。在另外的實施方式中，擴大培養(yǎng)的肌腱細胞培養(yǎng)物中存在的至少 95%的細胞是肌腱細胞。 在一些實施方式中，擴大培養(yǎng)的肌腱細胞培養(yǎng)物含有細胞，其中至少80%的所述細胞表達編碼以下因子的一種或多種基因1型膠原、III型膠原、EphA4、鞏膜、Sixl、 C0MP 和/或Cbf al 。 選擇性擴大培養(yǎng)的肌腱細胞可接種在生物支架上。術語"生物支架"是指用或不 用粘合劑的適宜于肌腱細胞或細胞粘附的任何骨架或支架。通過例舉的方式但不限制，所 述生物支架可以是以下形式膜、微球、毛狀物(fleece)、線狀物(thread)、或凝膠，和/或 它們的混合物。所述生物支架可以是由具有植入所要求的物理或機械屬性的任何材料所制 備的，例如充當止血屏障。止血屏障抑制附屬細胞和組織向治療缺陷區(qū)的滲透。
在一些實施方式中，所述生物支架是由半滲透性材料制成的，所述半滲透性材料 包括交聯(lián)或不交聯(lián)的膠原，優(yōu)選I型與III型或II型的組合。所述生物支架也可包括從天 然來源或通過合成獲取的多肽或蛋白，例如透明質酸、小腸黏膜下層(SIS)、腹膜、心囊、聚 乳酸和相關的酸、血(即它是一種循環(huán)組織包括流體部分(血漿)和懸浮的有形成分(紅 血球，白血球，血小板))、或生物可吸收的其它材料。生物可吸收的聚合物，如彈性蛋白、纖 維蛋白、層粘連蛋白和纖連蛋白也可用于本發(fā)明。US Publication No. 20020173806中描述 的制成骨架或支架的材料也可用于本發(fā)明，其全文引入作為參照。 最初，所述生物支架優(yōu)選(即與待移植細胞接觸之前)不含完整的細胞，并且是哺 乳動物患者可吸收的。所述生物支架可具有一個或多個表面，例如多孔表面、致密表面、或 兩者的組合。所述生物支架也可包括半滲透性的、不滲透性的、或滲全透性的表面。
具有多孔表面的支撐骨架如US Pat. No. 6， 569， 172中所描述，其被全文引入作為 參照。 所述生物支架可以是自體同源的或異源的。在一些實施方式中，適宜的自體同 源支撐骨架是從血液中形成的，如Berretta， et al.于2002年4月9日提出的US Pat. No. 6， 368， 298所例舉的，其被全文引入作為參照。 適宜的生物支架可以是固體的、半固體的、凝膠的、或凝膠的支架，其特征在于可 以長時間保持穩(wěn)定形式，以在移植之前和移植之后使其中的細胞粘附和/或生長，并提供 類似于細胞天然環(huán)境的體系以優(yōu)化細胞生長。適宜支撐骨架的實例如US Publication No. 20020173806所描述，其被全文引入作為參照。 適宜于肌腱細胞生長的生物支架的其他實例包括Nitrogen ,這是一種 含膠原溶液，該溶液可凝膠形成用于組裝細胞的骨架；以及Hwang的結締組織支架 (US patent application no.20040267362) ， Kladaki et al(US patentapplication no.20050177249)， Giannetti(US patent application no.20040037812)和Binette et al(US patent即plication no. 20040078077);所有都被引入作為參照。
所述生物支架可被切制或形成為任何規(guī)則的或不規(guī)則的形狀。在一些實施方式 中，所述生物支架可切成符合撕裂的形狀。所述生物支架的形狀可以是平的、圓的和/或圓 柱。所述生物支架的形狀也可以被鑄成配合特定撕裂的形狀。如果所述生物支架是纖維材 料或具有纖維的特性，則支撐骨架可被織成所需的形狀?？蛇x地，所述生物支架可以是凝 膠、凝膠類、或非紡織材料。 在一些實施方式中，所述生物支架由豬源I/III型膠原構成，例如ACIMatrixTM。在
其他實施方式中，所述生物支架是由小腸粘膜下層構成，例如Restore1, 術語"接種"是指在移植之前引入肌腱細胞并 生物支架接觸足夠時間以使它們粘附到生物支架上(用或不用粘合劑)。在一些實施方式中，將細胞與生物支架培養(yǎng)過夜或 超過一周。在一些實施方式中，使用之前可將選擇性擴大培養(yǎng)的肌腱細胞在體外與生物支 架共培養(yǎng)約5天。 在一些實施方式中，優(yōu)選不均勻地接種。相信接種的肌腱細胞的數量不對最終產 生的組織產生限制；然而優(yōu)化的接種可增加產生率。優(yōu)化的接種量取決于特定的培養(yǎng)條件。 在一些實施方式中，生物支架被接種約0. 05倍至約5倍的天然組織類型(即肌腱)的生理 細胞密度。在其他實施方式中，細胞密度可小于每平方厘米約1 X 106個至1 X 107個細胞或 更多，通常每平方厘米約4X 106個細胞。在一些實施方式中，生物支架被接入每平方厘米 約3. 5X 106個選擇性擴大培養(yǎng)的肌腱細胞。 令人欣喜的是，接種有選擇性擴大培養(yǎng)的肌腱細胞的生物支架可被包裝并作為裝 置出售。因此，在一些實施方式中，本發(fā)明提供了一種接種有肌腱細胞的生物支架。這樣的 裝置包裝可包括由無菌粘合膜層密封的塑料板，如US Pat. No. 5， 842， 573所例舉的，其被引 入作為參考。 在一些實施方式中，在最鄰近肩袖撕裂的位點植入該裝置。 本文所用的術語"植入"或"埋植"或其語法同等成分涵蓋了將含肌腱細胞的生物 支架導入到患者肩袖撕裂中的任何操作。 術語"鄰近的"是指肩袖之內的位點以便在該位點的治療可使肩袖撕裂癥狀恢復。
在一些實施方式中，接種有肌腱細胞的生物支架被植入到面向撕裂的撕裂單元 (tear cells)中。在一些實施方式中，蓋片(covering patch)可用于覆蓋缺陷，以進一步 防止不期望的物質從周圍環(huán)境中滲入，例如成纖維細胞或巨噬細胞。在一些實施方式中，所 述蓋片可以是本文所述的任意支撐骨架，和/或所述蓋片可包括膠原(I/III型)、透明質 酸、纖維蛋白和聚乳酸。優(yōu)選地，所述蓋片不含細胞且是可吸收的，并可以是半滲透性的。
接種有肌腱細胞的生物支架可通過本領域技術人員已知的任何常規(guī)手段被固定 在適當位置，例如縫合、縫合錨、骨固定裝置和骨螺絲。在一些實施方式中，接種有肌腱細胞 的生物支架被縫合到位置中。 本發(fā)明也提供了含有細胞的生物支架，其中大于80%的所述細胞是肌腱細胞。在 一些實施方式中，所述生物支架中至少90%的細胞是肌腱細胞。在另外的實施方式中，所述 生物支架中至少95%的細胞是肌腱細胞。 可選地，所述生物支架可含有細胞，其中至少80%的所述細胞表達編碼以下因子
的一種或多種基因1型膠原、III型膠原、EphA4、鞏膜、Sixl、 C0MP和/或Cbfal。 現(xiàn)在將通過僅參照以下非限制實施例的方式進一步描述本發(fā)明。但應該理解的是
以下實施例僅是示例性的，不應以任何方式當作對上述本發(fā)明普遍性的限制。尤其是，將本
發(fā)明與大面積肩袖撕裂進行關聯(lián)描述時，應清楚地明確本文的發(fā)現(xiàn)本身不限于大面積肩袖
撕裂，還包括之前描述的更小的肩袖肌腱損傷。 實施例1動物和生物支架 本研究中采用五十只12-20周齡的，體重在3-5kg之間的白化種新西蘭白兔 (Oryctolagus cuniculus)。所有兔子都由在西澳大利亞大學(Nedlands，澳大利亞)動物 房所飼養(yǎng)的外養(yǎng)兔群中繁殖而來。隨意地給兔子喂食兔/豚鼠飼料、干草，并隨意提供水。 兔子被置于寬1.5m、長0.75m和高0.75m且?guī)鸥竦装宓幕\子中以防止足部皮炎。所有操作程序和籠內活動都按照由國家健康和醫(yī)學研究委員會(NHMRC，堪培拉，澳大利亞)編撰 的詳細指南進行操作。 豬源類型的I/III型膠原生物支架(ACI Maix )是由Matricel (Herzogenrath， 德國)供應和制造。膠原生物支架是具有兩個不同面的白色復合物粗糙面和光滑面。粗 糙面看似是孔徑接近200ym的交聯(lián)纖維而光滑面表現(xiàn)為緊密排列的纖維(Willers et al. 2005)。在斷點的機械特性是約14. 6+2. 4N/mm2(Chen J. M.未公開數據來自之前研究)。 小腸粘膜下層(Restore )的生物支架是由D印uy (USA)制造。小腸粘膜下層(SIS)生物支 架為lmm厚，是具有半透明外觀的高度緊密材料，其是由IO層單獨的小腸粘膜下層通過真 空干燥層壓在一起而構成的。生物支架的兩面都非常光滑(Zheng et al. 2005) 。 SIS生物 支架的高度緊密結構使其具有很強的抗拉強度，斷點接近75.6+6.3N/mm2(Chen J. M.未公
開數據來自之前研究)。
實施例2實驗設計 五十只兔子被隨機分配成5個組，每組10只(圖1)。左肩袖被完全切開并通過 以下五種方法之一進行重構(l)組A(對照處理)將在形成創(chuàng)傷期間切離的肌腱在原處 立即再植入創(chuàng)口內并使用5-0可吸收縫線縫合到骨槽；(2)組B(ACI-MaixTM):通過將作為 內置移植物的ACI-MaixTM膠原生物支架縫合到天然肌腱和骨槽邊緣以修復創(chuàng)口 ；(3)組 C(ACI-MaixTM和自體同源肌腱細胞)按照與組B相同的方式采用細胞生物支架組合物修復 撕裂創(chuàng)口 ；(4)組D(RestoreTM):按照與組B相同的方式修復撕裂創(chuàng)口 ，但采用Restore 作 為內置移植物；和(5)組E(Restore 和自體同源肌腱細胞)按照與組C相同的方式采用 接種肌腱細胞的Restore 組合物修復撕裂創(chuàng)口。在每組中，對10只兔中的五只在4周實 施安樂死，其他的在8周實施安樂死。 所有統(tǒng)計數據以平均值±標準差來表示，并采用統(tǒng)計軟件SPSS (SPSS inc. USA) 通過ANONA進行比較。P值小于O. 05即認為顯著。
實施例3肌腱細胞的收集和培養(yǎng) 如圖2所示3mm直徑的肌腱組織是通過活檢穿孔器從兔髕腱上獲取的，并在添加 了 10%胎牛血清(FBS)、100ii g/ml青霉素和lOOii g/ml鏈霉素(下文中的培養(yǎng)基表示相同 成分)的DMEM F-12培養(yǎng)基(GIBCO，Invitrogen，USA)清洗。然后將肌腱組織切分成0. 5mm 的直徑，并以膠原酶(誦I/ml Gibco， Invitrogen， USA)在37"消化過夜。消化之后，通 過0. 22 ii m過濾器過濾溶液以去除骨架碎片，并將組織中釋放出的細胞2000rpm離心8分 鐘成細胞層。排出含酶的上清液，將細胞層重懸在新培養(yǎng)基中。將該清洗步驟重復三次。
然后將制得的肌腱細胞層重懸在5ml培養(yǎng)基中并置于含密度在l(f-l(^個細胞/ml 之間培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中。該培養(yǎng)基含有達爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM) (Invitrogen)、 15體積/體積％胎牛血清、0. 0006重量/體積％胰島素、0. 0002重量/體積％的倍他米松、 0. 5重量/體積％的青霉素、0. 5重量/體積％的鏈霉素、以及0. 6% L-脯氨酸，且pH 7. 0。 然后將細胞在5% C02下37t:進行溫育。應該在3-5周內每三天更換培養(yǎng)基直到細胞在第五 代達到最大細胞數，通常是20 X 107個細胞。對于移植，將第二代肌腱細胞按接近3. 5 X 106/ cm2的密度裝負在ACI MaixTM(粗糙面)或Restore 生物支架，并培養(yǎng)5天以在植入前得到 接種有細胞的生物支架。 實施例4體內和體外肌腱細胞mRNA表達的比較
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為證實肌腱細胞是否在培養(yǎng)期間保持其表型，檢查了 I/III型膠原和EphA4mRNA 的表達。使用RNeasy迷你試劑盒(QIAGEN澳大利亞)，從肌腱組織和體外培養(yǎng)的肌腱細胞 中提取總RNA樣品。使用RETROscriptTM第一鏈合成試劑盒(Ambion USA)將RNA逆轉錄成 cDNA。進行半定量RT-PCR以產生和擴增I/III型膠原和EphA4 cDNA。通過1. 2%瓊脂糖 凝膠電泳分析最終PCR產物，并通過UV透射儀(IBI)和偏振膜進行顯示。將實驗重復四次 以確保結果的統(tǒng)一性。按照圖15所列條件進行PCR擴增。
實施例5肌腱細胞體外培養(yǎng)物中的I型膠原蛋白的免疫染色
為證實肌腱細胞在培養(yǎng)中保持了產生I型膠原的能力，按以下順序進行了免疫染 色將第二代肌腱細胞培養(yǎng)物置于6孔板中；按50%配合度以4%低聚甲醛在室溫下固定 10分鐘；以3% H202封閉內源過氧化物酶5分鐘；更換3次Tris緩沖鹽水(TBS)進行清洗； 以O. 1^TritonX100對細胞進行可滲透化處理5分鐘；以O. 2%牛血清白蛋白(BSA Sigma， USA)/磷酸緩沖鹽水(PBS)清洗兩次；以稀釋在O. 2% BSA/PBS中的膠原I (1 : 3000abcam， cat :106017， UK)第一抗體在室溫下溫育1小時(該步驟中陰性對照以PBS進行處理)；以 0. 2% BSA/PBS清洗4次，PBS洗4次和0. 2% BSA/PBS洗4次；采用LSAB系統(tǒng)(Dako， cat : K0675Denmark)以第二抗體溫育；重復清洗步驟；以DAB試劑盒(Dako，cat :K3468Denmark) 使蛋白呈褐色實現(xiàn)顯色。 實施例6接種有肌腱細胞的生物支架的形態(tài)學特征 為確定生物支架上肌腱細胞的行為特征，通過掃描電鏡術(SEM)在第1、3、和5天 研究了接種有肌腱細胞的生物支架的形態(tài)學。以2.5%戊二醛(TAAB，Reading,UK)將樣品 在室溫下固定7天，然后以單寧酸(tannic acid)進行處理。用0. 2M 二甲基砷酸鹽緩沖 液洗滌樣品；在1%四氧化鋨的二甲基砷酸鹽緩沖液在室溫下固定60分鐘；更換3次二甲 基砷酸鹽緩沖液進行清洗；在室溫下1%單寧酸的0. 05M 二甲基砷酸鹽緩沖液中放置60分 鐘；以鹽水溶液清洗；在雙蒸餾水中以0. 5%乙酸雙氧鈾染色60分鐘；以鹽水溶液進行洗 滌；在室溫下依次在25%、50%、70%、95%和純乙醇中放置30分鐘；然后在室溫下以超干 乙醇清洗兩次，每次30分鐘。臨界點干燥后，包埋樣品并使用Phillips XL30掃描電鏡進 行觀察。 實施例7操作技術 通過肌肉注射氯胺酮(Parke-Davis，奧克蘭，新西蘭)和塞拉嗪(特洛伊實驗室澳 大利亞)麻醉五十只兔子。在左肩上造成縱切口 (右肩不作操作)并通過從肩峰釋放一部 分斜方肌和三角肌，實現(xiàn)肩袖肌腱的手術顯露。將整個肩袖肌腱從肌腱骨骼插入處到肌肉 肌腱結合處，完全切離以形成面積約為7X8mm2的長方形創(chuàng)口 (圖2)。使用牙鉆，在肱骨大 結節(jié)垂直于肌腱纖維方向上制造一個長10mm、寬2mm、深2mm的骨槽。從肱部側面到骨槽中 制造兩個直徑0.5mm的小鉆洞。然后采用對應各組的方法修復創(chuàng)口。根據肌腱重建，傷口 被包在層板中并包扎，但上肢并未被夾住。
實施例8樣品收集和幾何評價 在4和8周，通過靜脈注射戊巴比妥，麻醉并處死兔子。從雙肩(操作的和未操作 的)上收集肱頭、肩袖肌腱和部分肌肉。在松弛狀態(tài)下，以游標卡尺測量操作的和未操作 的肌腱的長度和寬度，并以測微尺測量厚度。然后以4%低聚甲醛固定樣品。固定之后，以 10%甲酸對樣本進行脫鈣，脫水，石蠟包埋，并切成5 ii m片段，并以蘇木精和曙紅和阿辛藍進行染色。 實施例9組織學檢查 通過發(fā)炎率評估對埋植物的炎癥反應，所述發(fā)炎率是指由炎癥細胞占有的修復肌 腱的面積百分比。使用繪圖軟件Image Pro Plus 4. 5 (Mediacybernetics，USA)測量整個肌 腱面積和由炎癥細胞占有的面積。以蘇木精和曙紅和阿辛藍染色進行普通的組織學檢查。 半定量地評估了八個參數(Movinet al. 1997 ;Shalabi et al. 2002) : (1)顯微結構;(2)纖
維排列；(3)核的圓度；(4)炎癥；(5)增加的血管分布；(6)骨骼肌腱結合；(7)生物相容性
(植入材料的吸收率)；和(8)糖胺聚糖的含量(在阿辛藍片段中藍色的強度)。對這些變 量的每個進行0-3分的打分，O是正常而3是最大異常。因此，最正常的肌腱會得0分，最異 常得肌腱會得24分。 炎癥參數由發(fā)炎率轉化而來，其小于10 %為0分，10-20 %為1分，20-30 %為2分， 而大于30%炎癥細胞滲透則為3分。骨骼肌腱結合的釋義以骨槽形成為基礎。如果骨槽存 在典型的4區(qū)構成的肌腱組合處組織學，(骨皮質，礦化纖維軟骨，纖維軟骨和肌腱)則為 0分。缺少這些區(qū)中的一個就在得分中加1，結合處完全解離則為3分。這個評分體系是改 良的Likert， s分級(Movin et al. 1997 ;Shalabi et al. 2002)。
實施例10修復肌腱中的I型膠原的免疫染色 為測定合成I型膠原蛋白的細胞比率，按以下順序進行免疫染色脫蠟和再水合 之后，將載玻片在O. 1%胰島素中消化20分鐘以尋找抗原；用水清洗；以3%11202將內源 過氧化物酶封閉5分鐘；以TBS清洗3次每次5分鐘；以20 %胎牛血清(FBS)封閉30分 鐘；以I型膠原第一抗體(1 : 3000abcam， cat :106017， UK)在室溫下溫育3小時(該步 驟中陰性對照以PBS進行處理)；以TBS清洗3次每次5分鐘；采用LSAB系統(tǒng)(Dako， cat : K0675Denmark)以第二抗體溫育；重復清洗步驟；以DAB試劑盒(Dako，cat :K3468Denmark) 使陽性蛋白呈褐色實現(xiàn)顯色；和以蘇木精進行對比染色。 隨機選擇每個載玻片的五個高倍視圖(400倍)。對每個視圖中的總細胞和I型膠 原陽性細胞數量進行計數。通過以I型膠原陽性蛋白數量除以總細胞數量計算比率。5個 視圖的平均值是該載玻片的最終比率。
實施例11實驗設計 五十只兔子被隨機分配成5個組，每組10只(圖l)。左肩袖被完全切開并通過五 種方法之一進行重構。在原處再植入切離肩袖肌腱的作為對照。每組中的5只兔子在操作 后的4-8周被處死。 本研究所采用的兔大面積肩袖撕裂模型的示意圖如圖2所描繪。體外培養(yǎng)從由 髕腱收集的活組織中酶消化的自體同源肌腱細胞，并將其接種至兩種生物支架(細胞密 度3.5X107cm2)。當準備好細胞生物支架時，將肩袖肌腱從肱骨大結節(jié)的插入部到肌肉 肌腱結合部，完全切離以形成約7X8mm2的創(chuàng)口。在對照組中，其將被重新植入切離位點。 在其他四組中，切離的肌腱部分被丟棄，并以帶或不帶自體同源肌腱細胞的ACI-MaixTM和 Restore 生物支架置換。 實施例12肌腱細胞中I/III型和EphA4的蛋白和mRNA表達 使用RT-PCR分析，我們比較了在肌腱組織和培養(yǎng)肌腱細胞中I/III型膠原
和EphA4的基因表達特征。如圖3所示，肌腱細胞在體外保持了表達I/ni型膠原和EphA4mRNA的能力。當比較管家基因GAPDH時，表達水平體現(xiàn)為從體外培養(yǎng)的肌腱細胞中提 取的mRNA樣品高于從肌腱組織提取的。 為進一步證實肌腱細胞是否在體外產生I型膠原蛋白，在培養(yǎng)肌腱細胞中進行了 I型蛋白的免疫組織化學染色。結果顯示了體外培養(yǎng)的肌腱細胞的細胞質中觀察到了 I型 膠原蛋白(圖4的A)，而在對照孔中沒有陽性染色(圖4的B)。
實施例13接種有肌腱細胞的生物支架的形態(tài)學分析 對ACI-Maix 膠原生物支架的掃描電鏡分析表明了疏松多孔的膠原纖維排列，且 孔徑大約為200 m(圖5的A)。在24小時肌腱細胞已粘附到膠原骨架上并形成了層狀 排列。到72小時，肌腱細胞進行了大量復制細胞覆蓋了生物支架的大部分表面(圖5的 B)。單個細胞形態(tài)學的高倍放大(圖5的C)證實了從細胞表面伸出了兩種類型的突起泡 (blebs)和層形足板(lamellipodia)。 ReSt0reTMSIS生物支架的特征在于平表面拓撲學和 高度緊密的結構(圖5的D)。在Restore 生物支架上肌腱細胞的生長模式類似于在培養(yǎng) 瓶中的，顯示出平的成纖維細胞樣外表。肌腱細胞復制與單層生長模式相關緩慢(圖5的 E)。高倍放大揭示了 Restore 接種的肌腱細胞(圖5的F)也在細胞表面伸出了突起，該 突起類似于ACI-Maix 生物支架的突起。
實施例14肉眼檢查 手術之后，所有兔子存活直至預定的安樂死。沒有觀察到傷口感染或任何其他并 發(fā)癥。在手術后的頭一周內觀察到操作前肢的瘸形步態(tài)，然后在第2周恢復正常步態(tài)。肉 眼檢查顯示了在任何樣品任何時間點都觀察不到撕脫或失敗。從五十只正常兔未操作肩部 收集的肩袖肌腱的平均厚度，寬度和長度分別是2. 5+0. 3mm，6. 6+0. 5mm和8. 8+0. 5mm(圖 16)。通常地，在4周樣品的平均厚度明顯(p<0.01)厚于正常肌腱，而8周樣品明顯(p <0.01)薄于正常肌腱。正常和修復肌腱在寬度上沒有區(qū)別。4和8周修復肌腱與正常肌 腱相比明顯伸長了 (圖16)(長4-5.5mm，p <0.01)。
實施例15對照處理組的組織學分析 在手術后4周修復的自體同源肌腱特征在于細胞質的增加、新生血管形成、以及 膠原纖維正?？v向排列的改變(圖6的A)。膠原變得比具有一些紊亂區(qū)和略圓的肌腱細胞 核的正常肌腱具有更大波浪。骨槽上的肌腱骨骼結合部是被軟骨纖維樣的大球形軟骨細胞 所充滿的空間。類似于正常肌腱骨骼結合部，除了致密的細胞群和缺乏礦化的類骨質骨架 (圖6的B) 。 8周時，樣品顯示出具有正常細胞密度和形狀的更有組織的結構，并顯示出修 復膠原纖維的健康平行排列(圖6的C) 。 8周樣品的骨槽顯示出更為成熟的4區(qū)構成，并 與骨髓具有更好的結合(圖6的D)。 實施例16不帶自體同源性肌腱細胞的生物支架的組織學分析
ACI-Maix 組在手術后4周，所有不帶自體同源肌腱細胞的ACI-Maix 移植物表 現(xiàn)出生物支架的大部分不被吸收。在保持生物支架原始結構的區(qū)域中，可在保留生物支架 內和周圍看到大量的淋巴細胞(圖7的A)。移植物被吸收的區(qū)域體現(xiàn)了具有粗糙平行膠原 排列，增加的細胞質和新生血管形成特征的一期修復(圖7的B)。由修復軟骨組織包圍的 骨槽，具有從骨槽邊緣延伸出的致密纖維組織(圖7的C)。在8周，植入位點顯示了更多的 平行膠原纖維束；含有低密度成纖維細胞和減少的新生血管形成(圖7的D)。也如膠原纖 維結構一樣成熟的骨槽構成被改造，并與皮層和松質骨形成了更好的結合度(圖7的E)。但是，五個樣品中的兩個仍包含未被吸收的生物支架片段且有明顯的淋巴細胞滲透。此外， 在5個8周樣品中都發(fā)現(xiàn)了在再生肌腱的中間質中誘生了脂肪組織(圖7的F)。
Restore 組在所有5個4周樣品中，不帶自體同源肌腱細胞的Restore 移植物 僅部分被吸收。Restore 的原始結構呈現(xiàn)為沿著肌腱結構的紊亂的生物支架。在移植物 邊緣觀察到許多炎癥細胞，主要是淋巴細胞(圖8的A)。少數巨噬細胞、血槳、嗜酸性粒細 胞和多形細胞偶爾點染在生物支架纖維內部。在RestoreTM被吸收的區(qū)域，大量成纖維細胞 和淋巴細胞存在于富含新生血管結締組織骨架類似肉芽組織內(圖8的B)。骨槽被與軟骨 細胞混合的纖維組織占據在所有樣品中實質沒有礦化區(qū)。 在8周，5個RestoreTM生物支架中的4個已被完全吸收。未被完全吸收的那個類 似于4周樣品存在明顯的淋巴細胞滲透(圖8的C)。在吸收區(qū)域，膠原纖維按更少波狀模 式排列，且血管生成的強度更小。肌腱骨骼結合部顯示了成熟的4區(qū)結構包括骨皮質，礦化 纖維軟骨；纖維軟骨和肌腱(圖8的D)。在膠原纖維的空隙之間點染了一些肉芽組織，類 似慢性肉芽反應。預料不到的是，在兩個樣品的中間質中發(fā)現(xiàn)了一些異位骨的形成。
實施例17帶自體同源肌腱細胞的生物支架的組織學分析 ACI-MaixTM組在手術后的4周，與自體同源肌腱細胞一起植入的ACI-Maix 生物 支架的新生肌腱和骨槽都類似于4周不帶肌腱細胞植入的生物支架。 一部分生物支架仍保 持且在生物支架內和周圍再次觀察到淋巴細胞(圖9的A)。在未被吸收生物支架的表面也 觀察到植入的自體同源肌腱細胞(圖9的B)。在生物支架吸收的區(qū)域，可觀察到類似于其 他實驗組的粗糙纖維排列和血管床(vascular beds)。 有趣的是，在植入后的8周，類似于對照處理的肌腱組織學證實了良好修復結果 (p > 0. 05)(圖9的C)。在8周所有植入生物支架都被完全吸收并被肌腱組織取代。膠原 束縱向排列骨槽組織學外觀無異于對照組織學(圖9的D)。略微增加成纖維細胞數量以典 型的平、薄和波狀模式，均勻地分布在各束之間。五個樣品中僅有一個在新生肌腱中間含有 脂肪組織。 Restore 組帶自體同源肌腱細胞植入的Restore 在4周表現(xiàn)出與其他組類似 的修復模式。在8周可觀察到與對照肌腱修復具有類似的組織學形態(tài)的良好的修復效果， 這證明形成了縱向排列的膠原束(圖10的A)和成熟的骨槽(圖10的B)，在各膠原束之 間以紡錘形模式均勻地分布有成纖維細胞。在所有五個樣品中沒有發(fā)現(xiàn)未被吸收的生物支 架，且大部分骨槽結構顯示出典型的四區(qū)結構。但是，仍在所有5個樣品觀察到肉芽組織 (圖10的C)且在2個樣品中發(fā)現(xiàn)異位骨(圖10的D)。
實施例18修復肌腱組織學的半定量分析 對生物支架的發(fā)炎率分析顯示了在生物支架細胞構造組中炎癥反應強度小于僅 有生物支架的炎癥反應強度(圖ll)。在4周，ACI-MaixTM的平均發(fā)炎率是56X (炎癥細胞 占有的修復肌腱面積百分比)，而ACI-MaixTM+細胞組明顯地(p < 0. 01)減少至26%。在 采用Restore 生物支架的組中觀察到類似現(xiàn)象，自體同源肌腱細胞植入的發(fā)炎率從46% 減少至27% (p<0.05)。但是，與對照相比時，無論帶有或不帶細胞，四個實驗組的發(fā)炎率 明顯提高(p<0.05)。在8周，生物支架被吸收，所有組的炎癥反應與4周相比明顯降低 (p < 0. 05)。在自體同源肌腱細胞被植入的組中，發(fā)炎率與對照組非常類似(p > 0. 05)，而 在僅有生物支架的組觀察到的發(fā)炎率仍明顯高于對照(P < 0. 05)。
普通的組織學檢測顯示了在4周時所有實驗組與陽性對照相比(p < 0. 01)都具 有較差的組織學得分(圖12)。在8周，單獨植入的ACI-MaixTM生物支架表現(xiàn)出比對照明 顯更差的組織學得分(P <0. 05)，而與自體同源肌腱細胞植入的表現(xiàn)出與對照相同的更好 得分(P > 0. 05)。然而，這兩組(帶有和不帶肌腱細胞的ACI-Maix )之間的區(qū)別不明顯 (p > 0. 05)。盡管不帶肌腱細胞的ACI-Maix 的組織學得分比植入肌腱細胞的組和對照要 差，但其仍實現(xiàn)了統(tǒng)計學上明顯不同于它們任何一個的結果(P > 0. 05)。
免疫染色顯示了細胞質和細胞外基質對I型膠原為陽性染色(圖13的A)而在陰 性對照中沒有陽性染色(圖13的B)。在4周，對照組的I型膠原陽性細胞的平均比率是 53. 4% ， ACI-Maix 是38. 4% ，接種有肌腱細胞的ACI-Maix 是58 % ， Restore 是36. 2 % ， 接種有肌腱細胞的Restore 是48. 8%。在8周，所有組中的I型膠原陽性細胞的比率略 微增加，對照組達到63. 2% ， ACI-Maix 達到50. 60% ，接種有肌腱細胞的ACI-Maix 達到 61. 2%， Restore 達到51. 80%，接種有肌腱細胞的Restore 達到65%。在兩個時間點， 接種有肌腱細胞的生物支架的陽性比率明顯高于不帶肌腱細胞的那些(P < 0. 05，圖14)， 但與對照類似(P > 0. 05)。
權利要求
一種治療哺乳動物患者肩袖撕裂的方法，其中，該方法包括以下步驟(i)在含有胰島素或胰島素的功能性衍生物以及糖皮質激素或糖皮質激素類分子的培養(yǎng)基中，在體外選擇性地擴大培養(yǎng)肌腱細胞，以制備經擴大培養(yǎng)的肌腱細胞培養(yǎng)物；(ii)將所述經擴大培養(yǎng)的肌腱細胞接種至生物支架，以制備接種有肌腱細胞的生物支架；和(iii)將所述接種有肌腱細胞的生物支架植入到鄰近肩袖撕裂的位置。
2. 如權利要求1所述的方法，其中，所述肩袖撕裂是大面積肩袖撕裂。
3. 如權利要求1或2所述的方法，其中，所述肌腱細胞是在選擇性擴大培養(yǎng)之前從含肌 腱細胞的組織中分離的。
4. 如權利要求3所述的方法，其中，所述含肌腱細胞的組織是肌腱。
5. 如權利要求1-4中的任意一項所述的方法，其中，所述肌腱細胞來自哺乳動物，該哺 乳動物選自由羊、牛、豬和人所組成的組中。
6. 如權利要求5所述的方法，其中，所述哺乳動物是人。
7. 如權利要求1-6中的任意一項所述的方法，其中，所述肌腱細胞是自體同源的。
8. 如權利要求1-7中的任意一項所述的方法，其中，所述肌腱細胞在含有0. 0006重量 /體積％的胰島素和0. 0002重量/體積％的糖皮質激素的培養(yǎng)基中，在體外被選擇性地擴 大培養(yǎng)。
9. 如權利要求1-8中的任意一項所述的方法，其中，所述經擴大培養(yǎng)的肌腱細胞培養(yǎng) 物含有至少80%的肌腱細胞。
10. 如權利要求1-9中的任意一項所述的方法，其中，所述經擴大培養(yǎng)的肌腱細胞培養(yǎng) 物中至少80%的細胞表達編碼以下因子的一種或多種基因1型膠原、III型膠原、EphA4、 鞏膜、Sixl、 C0MP和/或Cbfal。
11. 如權利要求i-io中的任意一項所述的方法，其中，將所述接種有肌腱細胞的生物 支架在體外培養(yǎng)足夠時間，以在植入之前建立肌腱細胞。
12. 如權利要求l-ll中的任意一項所述的方法，其中，所述哺乳動物患者是人。
13. —種治療人患者大面積肩袖撕裂的方法，其中，該方法包括以下步驟(i) 從在所述患者體內提取的肌腱組織中分離肌腱細胞；(ii) 在含有約0. 0006重量/體積％的胰島素或胰島素的功能性衍生物以及約0. 0002 重量/體積％的糖皮質激素或糖皮質激素類分子的培養(yǎng)基中，在體外選擇性地擴大培養(yǎng)所 分離的肌腱細胞，以制備含有至少80%肌腱細胞的經擴大培養(yǎng)的肌腱細胞培養(yǎng)物；(iii) 將所述經擴大培養(yǎng)的肌腱細胞接種至生物支架，并將該生物支架和肌腱細胞培 養(yǎng)不大于5天，以制備接種有肌腱細胞的生物支架；禾口(iv) 將所述接種有肌腱細胞的生物支架植入到肩袖撕裂處，并以縫合線來固定。
14. 如權利要求1-13中的任意一項所述的方法，其中，所述生物支架含有骨架、膜、微 球、毛狀物、線狀物、或凝膠，和/或它們的組合。
15. 如權利要求1-14中的任意一項所述的方法，其中，所述生物支架含有I/III型膠原 骨架(ACI Matrix )或小腸粘膜下層(Vitrogen )。
16. —種含有細胞的生物支架，其中，所述細胞中大于80%的細胞是肌腱細胞。
17. 如權利要求16所述的生物支架，其中，所述細胞中至少80%的細胞表達編碼以下因子的一種或多種基因1型膠原、ni型膠原、EphA4、鞏膜、Sixl、C0MP和/或Cbfal。
18.如權利要求1所述的方法，其實質上如本文任一實施例所描述的。
全文摘要
本申請涉及制備用于修復撕裂的生物支架的方法。具體而言，本發(fā)明涉及治療哺乳動物患者肩袖撕裂的方法，其中，該方法包括以下步驟(i)在含有胰島素或胰島素的功能性衍生物以及糖皮質激素或糖皮質激素類分子的培養(yǎng)基中，在體外選擇性地擴大培養(yǎng)肌腱細胞，以制備經擴大培養(yǎng)的肌腱細胞培養(yǎng)物；(ii)將所述經擴大培養(yǎng)的肌腱細胞接種至生物支架，以制備接種有肌腱細胞的生物支架；和(iii)將所述接種有肌腱細胞的生物支架植入到鄰近肩袖撕裂的位置。本發(fā)明還涉及含有細胞的生物支架，其中，所述細胞中大于80％的細胞是肌腱細胞。
文檔編號A61L27/36GK101795718SQ200880021481
公開日2010年8月4日 申請日期2008年4月24日 優(yōu)先權日2007年4月24日
發(fā)明者鄭銘豪 申請人:西澳大利亞大學