專(zhuān)利名稱：番石榴提取物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及分離和純化番石榴提取物和相關(guān)組合物的方法。
背景技術(shù)：
多酚廣泛地分布于植物和主要的植物副產(chǎn)品中。超過(guò)5000種不同的多酚已被識(shí) 別確定，并且自然界中多酚預(yù)計(jì)的數(shù)量很可能超過(guò)其化合物的復(fù)雜程度?？傊?，多酚在植物 中以游離態(tài)多酚單體被發(fā)現(xiàn)(例如黃烷醇類(lèi)，黃烷酮類(lèi)，黃酮，花色素類(lèi))或者以聚合態(tài)單 寧被發(fā)現(xiàn)，如可水解單寧，單寧衍生物，或縮合單寧和原花青素。茶，水果和蔬菜的許多健康益處都?xì)w因于多酚。例如，綠茶多酚受到重視，不僅是 因?yàn)榫G茶多酚在預(yù)防心腦血管疾病方面的能力，而且是因?yàn)槠浣?jīng)證實(shí)的抗氧化特性，抗誘 變特性，抗癌特性，降血脂作用。文獻(xiàn)資料中普遍對(duì)茶多酚有很好的描述。據(jù)報(bào)道，200mL 綠茶含有相當(dāng)于140mg(-)_表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)，65mg(-)_表沒(méi)食子兒茶素 (EGC)，28mg(-)_表兒茶素沒(méi)什子酸鹽(ECG)和17mg (-)-表兒茶素。高含量的3，4，5_三羥 苯甲酰單元已經(jīng)被證實(shí)與前列腺癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞中誘發(fā)的細(xì)胞凋亡，以及抑制脂肪酸 合成酶有聯(lián)系。對(duì)肥胖人和遭受糖尿病痛苦的病人的研究顯示，高甘油三酯血癥與碳水化合物的 攝入有強(qiáng)烈的關(guān)系，很可能是由于糖酵解的代謝物經(jīng)由再次脂肪形成過(guò)程，轉(zhuǎn)化為脂肪。肥胖是由能量攝取和消耗之間的一種不平衡的結(jié)果所導(dǎo)致。過(guò)剩能量被存儲(chǔ)在數(shù) 量擴(kuò)大或增加的脂細(xì)胞中。此外，肥胖對(duì)于各種各樣的疾病是一個(gè)很強(qiáng)烈的危險(xiǎn)因素，諸如 高血壓，高血脂，動(dòng)脈硬化，高血糖和糖尿病。因此，預(yù)防肥胖的有效方法是抑制腸內(nèi)的脂肪 吸收。近些年，人們發(fā)現(xiàn)與高血糖有關(guān)的有些疾病，特別是諸如I型和II型糖尿病，與二 肽基肽酶IV(DP-IV)的酶活性有關(guān)。DP-IV是一種具有766個(gè)氨基酸的膜_關(guān)聯(lián)肽酶，其廣泛地分布在各種各樣的組織 中。DP-IV也以一種在血漿中可溶解的循環(huán)形式存在。在人和嚙齒動(dòng)物的血漿中的有效的 DP-IV活性是可檢測(cè)的。膜關(guān)聯(lián)DP-IV的第一生物學(xué)原理涉及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳輸通道。DP-IV 的第二主要生物活性是其在血漿中的酶機(jī)能。DP-IV的2位傾向具有氨基末端的脯氨酸或 丙氨酸的肽酶基質(zhì)，但也可以在2位裂解具有非優(yōu)選氨基酸的酶作用物。來(lái)自眾多實(shí)驗(yàn)室 的觀測(cè)結(jié)果描繪了 DP-IV失活調(diào)節(jié)激素的重要性，諸如作為GLP-I生物活性的一種關(guān)鍵決 定因素的胰高血糖素樣肽_1( “GLP-1”)。個(gè)別DP-IV抑制劑已經(jīng)被表征，并且它們看來(lái)似乎通過(guò)延長(zhǎng)血漿中GLP-I和抑胃 肽(“GIP”)的作用，降低了糖尿病性的嚙齒動(dòng)物的血糖。通常這樣的抑制劑不是來(lái)自天 然來(lái)源，并具有某些不必要的副作用。所以，需要一種組合物，其能夠幫助減少一種或多種 普遍深入的條件，和/或一種方法，該方法可提供適合的組合物，尤其是來(lái)自天然存在的原 料。簡(jiǎn)要說(shuō)明
本發(fā)明意外地提供了分離和/或純化具有二肽基肽酶IV (DP-IV)抑制活性的番石 榴提取物。所述的番石榴提取物包括多酚，諸如黃酮醇。如今意外地發(fā)現(xiàn)，番石榴甙，黃酮 醇的化學(xué)分類(lèi)的一員，作為一種DP-IV抑制劑是很有效的，因此，由于適合于DP-IV有關(guān)疾 病的治療，本發(fā)明再現(xiàn)了這個(gè)化合物，也就是本發(fā)明所述的提取物。本發(fā)明也涉及制備所述番石榴提取物的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過(guò)服用治療有效量的在此所述的番石榴提取物以治療多種 疾病的方法。本發(fā)明也涉及一種藥用組合物，其包括本發(fā)明所述的番石榴提取物和一種藥劑學(xué) 上可接受的載體。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了來(lái)自所述番石榴提取物的，在治療學(xué)水平上可生物利 用的多酚衍生物。雖然披露了多種具體方案，但根據(jù)下列詳細(xì)描述內(nèi)容，其它具體方案對(duì)于本領(lǐng)域 技術(shù)人員而言將仍是顯而易見(jiàn)的。正因是顯而易見(jiàn)的，本發(fā)明能夠在不同方面進(jìn)行改良變 換，而所有這些并不脫離本發(fā)明的主旨與范圍。因此，詳細(xì)說(shuō)明部分應(yīng)被視為說(shuō)明性的而非 限制性的。


圖1是合成抑制劑P32/98的劑量/響應(yīng)抑制曲線。圖2是本發(fā)明經(jīng)分離的番石榴提取物的劑量/響應(yīng)抑制曲線。圖3表現(xiàn)了番石榴甙產(chǎn)生了 DP-IV的劑量依賴性抑制。圖4表現(xiàn)了番石榴甙產(chǎn)生了 DP-IV的劑量依賴性抑制。圖5提供了在經(jīng)分離的番石榴提取物中發(fā)現(xiàn)的主要的槲皮素糖甙。圖6表現(xiàn)了不同番石榴提取物成分的DP-IV抑制作用。詳細(xì)描述葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌是通過(guò)許多激素和神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)行調(diào)節(jié)的。具有特定影響 的是兩種胃腸激素，胰高血糖素樣肽-I(GLP-I)和抑胃肽(GIP)，兩者都是促胰島素分泌助 劑。促胰島素分泌助劑可以促進(jìn)胰島素的合成或表達(dá)，或者產(chǎn)生促進(jìn)胰島素的合成或表達(dá) 的刺激。GLP-I是一種有效的腸促胰島素分泌助劑，其加強(qiáng)了胰島素分泌并明顯降低了葡 萄糖水平，包括在I型和II型糖尿病中觀測(cè)到的水平。GLP-I是通過(guò)腸L細(xì)胞，內(nèi)分泌胰腺 的α-細(xì)胞，和大腦神經(jīng)細(xì)胞中有選擇性的組織-專(zhuān)門(mén)分裂形成的。GIP是在餐后的十二 指腸和最接近的空腸中合成并被釋放的。它的釋放依賴個(gè)別因素，包括膳食成分和在先存 在的健康狀況。它最初是由于它的胃酸抑制特性被發(fā)現(xiàn)和命名的。然而，當(dāng)對(duì)這個(gè)激素的 研究取得進(jìn)展之時(shí)，更加相關(guān)的生理學(xué)角色已被闡明。明確地，GIP是一種促胰島素分泌助 劑，對(duì)胰島素合成和釋放有刺激作用。二肽基肽酶IV (DP-IV，又名⑶26)是一種肽鏈端解酶，其有選擇地裂解倒數(shù)第二 個(gè)N-末端脯氨酸和丙氨酸殘基之后的肽。這種酶的內(nèi)生的底物包括腸促胰島素，諸如葡萄 糖依賴性促胰島素分泌多肽，類(lèi)似GIP和GLP-I。在有DP-IV存在下，這些激素被酶弱化至 非活性形式。GIP和GLP的非活性形式不能誘發(fā)胰島素分泌，從而血糖水平升高，特別是在高血糖狀態(tài)下。升高的血糖水平與許多不同的病理學(xué)相聯(lián)系，包括糖尿病(1和2型)和糖 尿病并發(fā)癥。DP-IV也被發(fā)現(xiàn)在T-細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用，例如，在移植中。DP-IV的抑 制已經(jīng)表現(xiàn)出延長(zhǎng)同種心臟移植時(shí)間。另外，DP-IV的抑制有助于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的抑制。 DP-IV也被認(rèn)為在HIV滲透進(jìn)入T-細(xì)胞(T-輔助細(xì)胞)中具有作用。疾病，其特征表現(xiàn)為高血糖的疾病，包括諸如糖尿病，I和II型。糖尿病通常表現(xiàn) 為，胰腺β-細(xì)胞不能產(chǎn)生足量的激素。通常地，這些細(xì)胞合成并分泌胰島素。在I型糖 尿病中，這種不足應(yīng)歸因于自身免疫處理過(guò)程對(duì)β-細(xì)胞的破壞。II型糖尿病主要是由于 β-細(xì)胞的不足和外圍的胰島素抗性的組合。糖尿病病人中，β-細(xì)胞數(shù)量減少，所以，不僅 存在關(guān)于β-細(xì)胞合成和釋放生理學(xué)上的胰島素的能力的關(guān)注，而且還有圍繞這些產(chǎn)生胰 島素的胰腺細(xì)胞的臨界質(zhì)量的關(guān)注。由于這些產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞的喪失，存在有一種涉及 胰腺的內(nèi)分泌功能的菌株，例如，該內(nèi)分泌功能產(chǎn)生胰島素。由于胰島素產(chǎn)量的衰減，起因 于高血糖癥的病理過(guò)程可能加劇。傳統(tǒng)的番石榴提取物，經(jīng)常只用水或醇與番石榴原料制備得到，包含倍半萜烯，丹 寧，及其他組分，他們與目前公開(kāi)的活性組分相聯(lián)合，干擾DP-IV活性的抑制。意外地，本發(fā) 明提取工藝所述的分離和純化，以及組分的濃度，以協(xié)同作用的方式，提高了 DP-IV抑制效 果，充分地去除了諸如倍半萜烯和丹寧這樣多余的物質(zhì)。通過(guò)術(shù)語(yǔ)“充分地去除”或“充分地分離”意指該提取物是通過(guò)自始至終詳細(xì)的工 藝過(guò)程之一被純化的。減弱DP-IV活性的污染物在處理過(guò)程期間從濃縮物中被方便地分 離，以提供一種提取組合物，其具有干擾DP-IV活性的番石榴原料的大多數(shù)組分。這樣的組 分包括倍半萜烯和丹寧。通常，根據(jù)提取物的總重量，該濃縮物含有的倍半萜烯或丹寧中的 任何一個(gè)或兩個(gè)小于大約10 %，優(yōu)選倍半萜烯或丹寧中的任何一個(gè)或兩個(gè)小于大約5 %， 更優(yōu)選倍半萜烯或丹寧中的任何一個(gè)或兩個(gè)小于大約1%，以及最優(yōu)選倍半萜烯或丹寧中 的任何一個(gè)或兩個(gè)小于大約0. 5%。因而，本發(fā)明提供了一種合成的濃縮物(提取物)，其含有活性組分的特定成分 (標(biāo)準(zhǔn)化的)。就是說(shuō)，以1克該提取物(干物質(zhì))為基礎(chǔ)，該提取物含有大約5-25毫克的 槲皮素-3-阿拉伯葡萄糖甙，大約30-75毫克的槲皮素己糖甙，大約40-70毫克的甲基槲皮 素己糖甙，大約5-40毫克的異槲皮素甙，大約15-45毫克的桑色素戊糖甙，大約45-80毫克 的番石榴甙，和大約60-95毫克的槲皮素戊糖甙。更準(zhǔn)確地說(shuō)，以1克該提取物為基礎(chǔ)，該提取物具有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化成分，大約15-17 毫克槲皮素-3-阿拉伯葡萄糖甙，大約50-54毫克的槲皮素己糖甙，大約50-56毫克的甲基 槲皮素己糖甙，大約18-21毫克的異槲皮素甙，大約26-29毫克的桑色素戊糖甙，大約63-68 毫克的番石榴甙和大約75-79毫克的槲皮素戊糖甙。在說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中，術(shù)語(yǔ)"包括"和"包含"是開(kāi)放式術(shù)語(yǔ)并應(yīng)解釋為" 包括，但不限于...“。這些術(shù)語(yǔ)包含進(jìn)一步限制性的術(shù)語(yǔ)"實(shí)質(zhì)上由...組成"和" 由...組成〃。必須注意的是，除非上下文以另外方式明確規(guī)定，如在這里和附加的權(quán)利要求書(shū) 中使用的單數(shù)形式“a”、“an”和“the”包括復(fù)數(shù)內(nèi)涵。術(shù)語(yǔ)〃 a" (〃 an")、〃一個(gè)或多 個(gè)〃和"至少一個(gè)"在這里也可以互換使用。也要注意的是術(shù)語(yǔ)"包含"、“包括"、“以...為特征"和"具有"可以互換使用。除非以另外方式限定，在這里使用的所有技術(shù)和學(xué)術(shù)術(shù)語(yǔ)，與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員的普遍理解一樣，具有相同的含義。在這里明確提到的所有出版物和專(zhuān)利，通 過(guò)引證的方式，處于全部目的，被合并為一個(gè)整體；這些目的包括描述和披露在可能與本發(fā) 明有聯(lián)系的出版物上被報(bào)道的化學(xué)制品、儀器、統(tǒng)計(jì)分析和方法。本說(shuō)明書(shū)引用的所有參考 文獻(xiàn)都將被用作指示所述領(lǐng)域的技術(shù)水平。在這里沒(méi)有任何內(nèi)容被推論為承認(rèn)本發(fā)明沒(méi)有 資格預(yù)料由于在先發(fā)明公開(kāi)的所述內(nèi)容。不同來(lái)源的番石榴果實(shí)是可接受的。雖然不被以下限制，但番石榴原料理論上可 以從諸如 Psidiumcattleianum, Psidium cattleianum ssp. Lucidum, Psidium guajava， Psidium guineense，Psidium littorale，Psidium molle or Psidium schiedeanum 植物 中得到。所述的術(shù)語(yǔ)“提取物“意指為從植物來(lái)源獲得的番石榴提取組合物，比如葉片、嫩 枝、樹(shù)皮、根、莖、種子、花、漿果、果實(shí)，比如，通過(guò)本文描述的分離方法。意外地發(fā)現(xiàn)，同番石 榴原料本身或冷凍干燥產(chǎn)品相比，番石榴原料的提取物含有提高的重量百分比的多酚，諸 如番石榴甙和槲皮素。理論上，番石榴果實(shí)的果肉和果汁可以使用。當(dāng)使用葉片時(shí)，在提取 之前把葉片研磨成粉經(jīng)常是最佳的。在研磨之前，可選擇干燥葉片。番石榴甙被認(rèn)為是槲皮素-3-0- α -L-arabinopyranoside，槲皮素的阿拉伯糖甙。
番石榴甙具有結(jié)構(gòu)式 在其中，“Ara”是阿拉伯糖(0_ α -L-arabinopyranose)。更準(zhǔn)確地說(shuō)，番石榴甙具 有諸如(Ia)的結(jié)構(gòu) 槲皮素(II)是一種類(lèi)黃酮，更準(zhǔn)確地說(shuō)是一種黃酮! 槲皮素是許多其它的類(lèi)黃酮糖甙的糖甙配基形式，諸如柑桔類(lèi)水果中發(fā)現(xiàn)的蕓香 甙，番石榴甙和槲皮素甙。因?yàn)橹苯右种苽€(gè)別炎癥的初始過(guò)程，槲皮素表現(xiàn)出顯著的抗炎活 性。例如，它抑制了組胺和其它過(guò)敏/炎癥介質(zhì)的制造和釋放。另外，它發(fā)揮了有效的抗氧 化活性和維生素C防護(hù)作用。槲皮素分別形成了槲皮素糖甙和連有鼠李糖的蕓香甙(槲皮素-3-0-鼠李糖苷， IIa)和蕓香二糖。 同樣，槲皮素形成了帶有阿拉伯糖的番石榴甙。在其它方面，結(jié)構(gòu)式II中鄰近色 酮羰基的烯醇_羥基可以是0- β -D-吡喃葡萄糖基，0- β -D-吡喃半乳糖基，0- α -L-吡喃 阿拉伯糖基(番石榴甙)或者0-α-L-吡喃鼠李糖糖基。本發(fā)明涉及一種經(jīng)分離的番石榴提取物，其包括與槲皮素相關(guān)的黃酮醇糖甙，包 括槲皮素-3-阿拉伯葡萄糖甙，槲皮素己糖甙，甲基槲皮素己糖甙，異槲皮素甙，桑色素戊 糖甙，番石榴甙和槲皮素戊糖甙。一方面，以該提取物的總重量為基礎(chǔ)，該經(jīng)分離的番石榴 提取組合物含有至少大約30%重量份的黃酮醇糖甙。另一個(gè)方面，該經(jīng)分離的番石榴提取物中含有大約30%重量份的槲皮素黃酮醇糖 甙，大約95%重量份可歸因于槲皮素-3-阿拉伯葡萄糖甙，槲皮素己糖甙，甲基槲皮素己糖 甙，異槲皮素甙，桑色素戊糖甙，番石榴甙和槲皮素戊糖甙。因而，利用結(jié)構(gòu)式III
(III)
R依下列各項(xiàng)被定義
槲皮素-3-阿拉伯葡萄糖甙包括一個(gè)阿拉伯葡萄糖，對(duì)于R 槲皮素己糖甙包括一個(gè)己糖，對(duì)于R 番石榴甙包括一個(gè)阿拉伯糖，對(duì)于R 槲皮素戊糖甙包括一個(gè)戊糖，對(duì)于R 其中，術(shù)語(yǔ)己糖和戊糖不表示該糖甙的特定立體化學(xué)結(jié)構(gòu)[ 例如，槲皮素-3-阿拉伯葡萄糖甙具有結(jié)構(gòu)式(IIIa)
槲皮素己糖甙具有結(jié)構(gòu)式(IIIb)
槲皮素戊糖甙具有結(jié)構(gòu)式(IIIc)
9

甲基槲皮素己糖甙如結(jié)構(gòu)式IV所表示 在其中，R1是一未定義立體化學(xué)結(jié)構(gòu)的己糖，R2，R3，R5或R7中任何一個(gè)是一甲基 并且其它是氫原子。因?yàn)殡y以測(cè)定R2/R3/R5/R7的哪個(gè)羥基被甲基化，所以甲基槲皮素可能是異構(gòu)體的 混合物。例如，甲基槲皮素己糖甙具有結(jié)構(gòu)式(IVa)，其中R2是一甲基并且其余R基團(tuán)全部為氫。 異槲皮素甙如結(jié)構(gòu)式V所表示
其中，R是葡萄糖；因此槲皮素-3-0-葡萄糖甙。 異槲皮素甙具有結(jié)構(gòu)式(Va) 桑色素戊糖甙如結(jié)構(gòu)式VI所表示 其中，R是未定義立體化學(xué)結(jié)構(gòu)的戊糖。一方面，桑色素戊糖甙可以是(Via) 本發(fā)明所述的經(jīng)分離的番石榴提取物的另一方面，番石榴甙大于提取物的黃酮醇 糖甙的總量的大約5%重量份，并且槲皮素-3-阿拉伯葡萄糖甙大于提取物的黃酮醇糖甙的總量的大約10%重量份。本發(fā)明所述的經(jīng)分離的番石榴提取物的另一個(gè)方面，以提取物的總重量為準(zhǔn)，槲 皮素-3-阿拉伯葡萄糖甙為大約15-17%重量份，槲皮素己糖甙為大約50-54%重量份，甲 基槲皮素己糖甙為大約50-56%重量份，異槲皮素甙為大約18-21%重量份，桑色素戊糖甙 為大約26-29%重量份，番石榴甙為大約63-68%重量份以及槲皮素戊糖甙為大約75-79%
重量份。另一個(gè)方面，槲皮素戊糖甙或桑色素戊糖甙的百分比范圍有可能是相反的。該番 石榴提取物通常是由溶劑提取得到，溶劑選自脂族醇，例如，乙醇，甲醇，丙醇，丁醇，依此類(lèi) 推，丙酮，己烷，氯仿，乙酸乙酯，石油醚，它們的混合物和/或它們與水的混合物。尤其是， 番石榴原料的乙醇萃取物可以通過(guò)乙醇或乙醇與水的混合物制備。該醇/水比例可以在大 約99%至大約重量份之間，以其中所有可能的百分比變化。一方面，乙醇/水的比例大 約是80% -20%重量份。一方面，該活性組分的提取是在升高溫度條件下進(jìn)行，就是說(shuō)，高于室溫。通常， 該提取混合物在大約30°C -80°C之間被加熱，優(yōu)選在大約40°C -70°C之間，更優(yōu)選在大約 450C _65°C之間，也就是，在大約60°C _62°C之間。通常，該提取混合物在必需的溫度下加熱 大約1-5小時(shí)一段時(shí)期，優(yōu)選大約2-4小時(shí)，更優(yōu)選大約2小時(shí)。依照本發(fā)明，該經(jīng)分離的番石榴提取物含有至少一種多酚化合物，諸如番石榴甙， 和通常的槲皮素。一方面，本發(fā)明所述的經(jīng)分離的番石榴提取物提供了至少大約30 %，50 %，75 % 或以上，90%或以上，以及甚至95%或以上的多酚。依照本發(fā)明應(yīng)用的提取物可以含有大 約0. 5%重量計(jì)或更多的番石榴甙，優(yōu)選大約10-50%重量份。典型地，該提取物含有大約 2% -4%重量計(jì)的番石榴甙。另一個(gè)方面，本發(fā)明所述的經(jīng)分離的番石榴提取物可含有槲皮素。低聚態(tài)和聚合態(tài)多酚差別在于它們的穩(wěn)定性。在熱水中水解至基本結(jié)構(gòu)的多酚， 被稱為可水解丹寧。只在強(qiáng)酸存在下水解的多酚，被稱為衍生丹寧或縮合丹寧。多酚存在“游離的”(單體的)和“結(jié)合的”(低聚態(tài)/聚合態(tài))形式。本發(fā)明所述的番石榴提取物，相比來(lái)自果汁/葉片/莖干等等的番石榴汁或者番 石榴濃縮物，顯示了對(duì)DP-IV較高的抑制作用。因此，含有增加數(shù)量多酚的番石榴提取物， 諸如番石榴甙和槲皮素，被發(fā)現(xiàn)具有一種很好的針對(duì)DP-IV的抑制活性。如貫穿本說(shuō)明書(shū) 所述，番石榴原料的獨(dú)特處理方法提供了具有這種特性的獨(dú)特的番石榴提取物。本發(fā)明所 述的經(jīng)分離的番石榴提取物可以用來(lái)治療包括葡萄糖代謝紊亂在內(nèi)的疾病，諸如肥胖，高 脂血癥，高血壓，動(dòng)脈硬化和多尿癥，糖尿病。這些疾病已經(jīng)被證明與DP-IV的活性有關(guān)系。此外，依照本發(fā)明使用的番石榴甙和/或番石榴提取物可以用作其它治療學(xué)目 的，例如降低低密度脂蛋白膽固醇，作為抗氧化劑，作為止痛劑，和作為止血?jiǎng)?，例如解除與 婦女月經(jīng)相聯(lián)系的疾病。DP-IV是二肽基蛋白酶IV，是一種具有766個(gè)氨基酸的膜關(guān)聯(lián)肽酶，其廣泛地分布 在許多組織中。作為現(xiàn)有技術(shù)，DP-IV在血漿中也作為一種可溶解的循環(huán)形式存在。DP-IV同類(lèi)酶包括那些對(duì)胰島素具有特效的酶。在一典型方法中，本發(fā)明的番石榴提取物可以通過(guò)大概包含以下步驟的過(guò)程工藝分離得到粉碎，例如，將Psidium guajava的葉片粉碎至細(xì)粉。葉片可以是新鮮的或是干燥 的。在某些情況下，優(yōu)選干燥的葉片，因?yàn)樗鼈兏子趦?chǔ)存。粉末狀的番石榴原料然后在高溫下用乙醇和水提取。提取溶劑的溫度保持在大約 50-80C之間該溶劑可以是乙醇和水的混合物，具有乙醇/水的百分比從大約0% (水)至 大約95%乙醇。通常，提取周期在高溫下為大約1小時(shí)到5小時(shí)之間，溶劑與粉末狀的番石 榴原料的比例在大約5至大約10(按重量計(jì))之間。有代表性的，該混合物被過(guò)濾以除去 固體。該過(guò)濾步驟可以伴隨有所屬領(lǐng)域內(nèi)的已知方法，包括重力過(guò)濾，使用微孔濾器，膜過(guò) 濾或超濾。該固體的提取可以重復(fù)若干次，濾液可以合并。最后，濾液在減壓下被濃縮直至除 去乙醇產(chǎn)生濃縮物。該濃縮物然后離心除去不溶解雜質(zhì)，以獲得澄清液體。該澄清液體被裝入用大孔樹(shù)脂填充的色譜柱。在某些方面，大孔樹(shù)脂是疏水的。通 過(guò)用水洗滌樹(shù)脂，雜質(zhì)被進(jìn)一步分離。然后，通過(guò)用乙醇處理樹(shù)脂并收集乙醇洗脫液，該活 性組分得以解吸。該洗脫液在減壓下被濃縮，以產(chǎn)生所述的番石榴提取物?？蛇x擇地，用樹(shù)脂處理并用水和乙醇洗滌后，收集到的該番石榴提取物，可以用聚 酰胺樹(shù)脂和水進(jìn)一步處理，以進(jìn)一步除去雜質(zhì)。在減壓下濃縮產(chǎn)生了番石榴提取濃縮物?？蛇x擇地，該番石榴提取濃縮物可以進(jìn)一步被純化，借助于將該濃縮物通過(guò)一種 具有大約0. 2-2微米之間孔徑的多孔的膜，或借助于超濾。上述一個(gè)或多個(gè)步驟被排除，重復(fù)，或被改變順序，應(yīng)該是可以理解的。典型地，該經(jīng)分離的番石榴提取物借助于不同的方法被濃縮，以提供一種富集活 性組分的溶液，諸如多酚。例如，借助于分子量隔斷，超濾可用于除去多余的組分。來(lái)自過(guò) 濾的保留物可以作為液體儲(chǔ)存，或者，例如，然后可進(jìn)一步被濃縮至粉末，借助于噴霧干燥， 冷凍干燥，氣流干燥，流化床干燥，環(huán)式干燥，盤(pán)式干燥，真空干燥，高頻干燥或微波干燥。最 后，該提取物應(yīng)該包含至少10%按重量計(jì)的多酚成分。因此，該提取物包含多酚衍生物和可 選擇的其它植物物質(zhì)，諸如其它類(lèi)黃酮，糖等等，其提供了具有抑制DP-IV活性的能力。該番石榴提取物可以進(jìn)一步純化，通過(guò)一種或多種所述領(lǐng)域已知方法，諸如色譜 法，凝膠色譜法，高效液相色譜法，結(jié)晶，親和色譜法，分配色譜法，諸如此類(lèi)。特定多酚的鑒 定可以通過(guò)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的方法實(shí)現(xiàn)，包括1H NMR,化學(xué)降解，色譜和光譜，尤其 是同核和異核二維NMR技術(shù)，用于表征該經(jīng)分離的多酚化合物。術(shù)語(yǔ)“純化的”或者“分離 的”被用于提及來(lái)自如上所述番石榴提取物的一種或多種多酚化合物的純化和/或分離。再 次應(yīng)用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法，該番石榴提取物的不同組分可被分離成為純化的物質(zhì)。本 發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)本領(lǐng)域已知技術(shù)，該提取物的多酚被充分地純化和分離。該純化 的化合物的純度按重量計(jì)算，通常是至少大約90 %，優(yōu)選至少大約95 %，最優(yōu)選至少大約 99%，并且甚至更加優(yōu)選至少大約99. 9% (例如，大約100% )。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了可生物利用的，經(jīng)分離的番石榴提取組合物，其被用于 治療在此記錄的各種各樣的痛苦。該番石榴提取物可以通過(guò)許多下文論述的方法服用。本發(fā)明所述的組合物可以加入不同的食物，飲料，小吃等等。一方面，該組合物可以在食用之前，被噴灑在食品上。如果噴灑在食品上，一種適合的載體，諸如淀粉，蔗糖或乳 糖，可用于幫助分散該番石榴提取物的濃度，使其更容易適用于該食品。本發(fā)明所述的組合物也可以在不同的預(yù)制食品中，作為添加劑被提供。針對(duì)本申 請(qǐng)的該目的，預(yù)制食品意指任何天然食品、加工食品、日常飲食或非日常飲食食品，其中已 經(jīng)添加了本發(fā)明所述的組合物。本發(fā)明所述的組合物可以直接被合并進(jìn)入許多預(yù)制好的日 常飲食食品，包括但不限于日常飲食飲料、飲食棒和預(yù)制好的冰凍食物。此外，本發(fā)明所述 的組合物可以被合并進(jìn)入許多預(yù)制好的非日常飲食產(chǎn)品中，包括但不限于糖果，快餐產(chǎn)品， 諸如炸馬鈴薯片，預(yù)制好的肉類(lèi)產(chǎn)品，乳制品，奶酪，酸奶，運(yùn)動(dòng)食品，蛋黃醬，色拉味調(diào)料， 面包和任何其它含有脂肪或油的食物。如本說(shuō)明書(shū)中使用的，術(shù)語(yǔ)“食品”指的是適于人或 動(dòng)物消費(fèi)的任何物質(zhì)。本發(fā)明所述的組合物可以被添加至不同的飲料，諸如果汁、奶昔、乳制品等等。此外，依照本發(fā)明所使用的番石榴甙和/或所述的番石榴提取物可以與其它植物 提取物混合，如同，例如，來(lái)自苦瓜，桑葉，和大花紫薇葉的提取物。優(yōu)選的服用方法是口服。本發(fā)明所述的組合物可以用適合的載體制成配方，適合 的載體如淀粉、藥片中的蔗糖或乳糖、膠囊、溶液、糖漿和乳劑。本發(fā)明所述的藥片或膠囊可 以用腸溶衣包覆，該腸溶衣溶解于PH值大約為6. 0-7. 0的環(huán)境。適合的腸溶衣是醋酸纖維 素，其在小腸溶解但不在胃里溶解。進(jìn)入軟膠囊中的，本發(fā)明所述組合物的配方可以通過(guò)許多本領(lǐng)域已知方法實(shí)現(xiàn)。 所述配方經(jīng)常包含一種可接受的載體，如油，或其它懸浮劑或乳化劑。適合的可選擇的載體包含但不限于，例如，脂肪酸，其來(lái)自任何來(lái)源的酯和鹽，不 受限地包括天然的或合成的油，脂肪，蠟或者它們的組合。此外，所述的脂肪酸可以不受限 地來(lái)自非氫化的油，部分氫化的油，完全氫化的油或者它們的組合。非限制性的脂肪酸(他 們的酯和鹽)的典型來(lái)源包含植物油，魚(yú)油或海洋生物油脂，加拿大低酸菜籽油，植物油， 紅花油，葵花油，旱金蓮種子油，芥菜籽油，橄欖油，芝麻油，豆油，玉米油，花生油，棉花子 油，米糠油，巴巴蘇棕櫚果油，棕櫚油，低芥酸菜籽油，棕櫚仁油，羽扇豆油，椰子油，亞麻籽 油，月見(jiàn)草油，荷荷巴油，小麥胚油，動(dòng)物脂，牛脂，黃油，雞油，豬油，乳品乳脂，牛油樹(shù)脂或 它們的。具體的非限制性典型的魚(yú)油或海洋生物油來(lái)源包含甲殼水生動(dòng)物油，金槍魚(yú)油， 鯖魚(yú)油，鮭魚(yú)油，鯡魚(yú)油，鳳尾魚(yú)油，青魚(yú)油，鱒魚(yú)油，沙丁魚(yú)油或者它們的組合。特別地，所 述脂肪酸的來(lái)源是魚(yú)油或海洋生物油(DHA或EPA)，豆油或亞麻籽油。另外，或與上述被確 定的載體之一結(jié)合，蜂蠟?zāi)鼙挥米鲞m合的載體，以及諸如硅石(二氧化硅)的懸浮劑。術(shù)語(yǔ)“保健食品”在所述的領(lǐng)域是公認(rèn)的并被用來(lái)描述食物中具體的化合物，其可 以預(yù)防疾病或改善不良狀況。本發(fā)明所述的配方可以進(jìn)一步包含不同的組分以幫助促使穩(wěn)定，或者幫助促進(jìn)本 發(fā)明有益組合物的組分的生物利用率，或者作為輔助營(yíng)養(yǎng)素進(jìn)入個(gè)人的日常飲食。適合的 添加劑可以包含維生素和生物學(xué)上可接受的礦物質(zhì)。維生素的非限制性實(shí)例包含維生素A， B族維生素，維生素C，維生素D，維生素E，維生素K和葉酸。礦物質(zhì)的非限制性實(shí)例包含鐵， f丐，鎂，鉀，銅，鉻，鋅，銷(xiāo)，碘，硼，硒，猛，它們的衍生物或者它們的組合。這些維生素和礦物 質(zhì)可以不受限制地來(lái)自于任何來(lái)源或者來(lái)源的組合。非限制性的B族維生素不受限制地包含硫胺，煙霧胺，吡哆醇，核黃素，氰鈷維生素，生物素，泛酸或它們的組合。不同的添加劑可以被合并進(jìn)入本發(fā)明組合物。本發(fā)明組合物的可選擇的添加劑不 受限制地包含，透明質(zhì)酸，磷脂，淀粉，糖，脂肪，抗氧化劑，氨基酸，蛋白質(zhì)，調(diào)味品，著色劑， 水解淀粉和它們的衍生物或它們的組合。如本說(shuō)明書(shū)中使用的，術(shù)語(yǔ)“抗氧化劑”在本領(lǐng)域中是公知的，指的是那些阻止或 延遲化合物的氧化變質(zhì)的合成或天然物質(zhì)。典型的抗氧化劑包含生育酚，類(lèi)黃酮，兒茶酚， 過(guò)氧化物歧化酶，卵磷脂，Y-谷維素；維生素，諸如維生素A、維生素C(抗壞血酸)和維生 素E和β-胡蘿卜素；天然組分，諸如在迷迭香和山楂提取物中發(fā)現(xiàn)的鼠尾草酚，鼠尾草酸 和迷迭香酚，諸如在葡萄籽或松樹(shù)皮提取物以及綠茶提取物中發(fā)現(xiàn)的原花色素。包含本發(fā)明所述的番石榴提取組合物可以通過(guò)傳統(tǒng)方法制得，如混合，溶解，造 粒，糖衣丸制造，研磨成粉，乳化，制成膠囊，包埋或升華干燥過(guò)程。所述組合物可以使用傳 統(tǒng)方法配制，利用一種或多種生理學(xué)上可接受的載體，稀釋劑，賦形劑或輔助劑，以便于將 該番石榴提取組合物制成能被使用的配制品。本發(fā)明所述的組合物可以采取適于任何有效服用方式的形式，包括，例如，口服， 口腔用藥，內(nèi)吸收，注射，透過(guò)皮膚起作用，直腸吸收，陰道吸收等等，或者適于通過(guò)吸入或 者注氣服用的形式。內(nèi)吸收的配方包含那些用于注射給藥的設(shè)計(jì)，例如，皮下注射，靜脈注射，肌肉注 射，鞘內(nèi)注射或腹腔內(nèi)注射，以及那些設(shè)計(jì)用于透過(guò)皮膚起作用的用藥方式，經(jīng)粘膜吸收， 口服或肺部吸收的用藥方式。有效的注射用配制品包含含水媒介或油性媒介中的所述的番石榴提取組合物的 無(wú)菌的懸浮液，溶液或乳劑。所述的組合物也可以包含復(fù)配助劑，諸如懸浮劑，促穩(wěn)定劑和/ 或分散劑。所述用于注射的配方可以單位劑量形式存在，例如，安瓿或multidose容器，并 可包含添加的防腐劑。另外，所述注射用配方可以粉末形式提供，用于在使用前和適合的媒介物一起恢 復(fù)原狀，包括但不限于，無(wú)菌無(wú)熱原的水，緩沖溶液，葡萄糖溶液等等。最后，所述的番石榴 提取組合物可以通過(guò)任何的已知的技術(shù)被干燥，諸如凍干法，并在使用前恢復(fù)原狀。對(duì)于經(jīng)粘膜吸收用藥，適于透過(guò)屏障的滲透劑被用于所述的配方。這樣的滲透劑 在所屬技術(shù)領(lǐng)域中是已知的。對(duì)于口服，本發(fā)明的組合物可以采取錠劑，片劑或膠囊的形式，例如，通過(guò)傳統(tǒng)方 法和藥學(xué)上可接受的賦形劑進(jìn)行制備，所述的賦形劑諸如粘合劑(例如，預(yù)糊化玉米淀粉， 聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)；裝填物(例如，乳糖，微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤(rùn) 滑劑(例如，硬脂酸鎂，滑石或硅石)；分解質(zhì)(例如，馬鈴薯淀粉或羥基淀粉乙酸鈉)；或者 潤(rùn)濕劑(例如，十二烷基硫酸鈉)。所述片劑可以通過(guò)所屬領(lǐng)域眾所周知的方法，例如，用 糖，薄膜或腸溶衣包覆。用于口服的液體藥劑可以采取例如酏劑，溶液，糖漿或懸浮液的形式，或者它們可 以作為一種干燥的產(chǎn)品存在，在使用前與水或其它適合的媒介物還原配制。這樣的液體藥 劑可以通過(guò)傳統(tǒng)方法與藥學(xué)上可接受的添加劑制備得到，所述的添加劑如懸浮劑(例如， 山梨糖醇糖漿，纖維素衍生物或氫化食用脂肪)；乳化劑(例如，卵磷脂或阿拉伯樹(shù)膠)；非 水媒介物(例如，杏仁油，油酯，乙醇，或精餾植物油)；以及防腐劑(例如，甲基或丙基P-羥基安息香酸鹽或山梨酸)。所述的配制品也可以酌情包含緩沖鹽，防腐劑，調(diào)味品，著色劑和 甜味劑。用于口服的配制品可以按照眾所周知的方式，適當(dāng)?shù)嘏渲?，以?shí)現(xiàn)番石榴提取組 合物的受控釋放。對(duì)于口腔用藥，所述的組合物可以采取片劑或錠劑的形式，以傳統(tǒng)方法配制而成。對(duì)于直腸和陰道途徑的用藥，番石榴提取組合物可被配制為溶液(用于保留灌腸 法)，栓劑或膏劑，其含有傳統(tǒng)的栓劑基質(zhì)，諸如可可脂或其它甘油酯。對(duì)于鼻部給藥或者通過(guò)吸入或吹入的給藥，所述的番石榴提取組合物可以借助于 適合的拋射劑，例如，二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，碳氟化合物，二氧化碳或 其它適合的氣體，從密封容器或噴霧器中以氣溶膠噴射的形式，被方便地傳遞。就加壓氣霧 劑而言，所述的劑量單位，可以通過(guò)提供一個(gè)閥來(lái)決定所釋放的計(jì)量數(shù)量。供吸入器或吹藥 器(例如由凝膠組成的膠囊和藥盒)用的膠囊和藥盒可以復(fù)配含有粉末混合物，該粉末混 合物由所述化合物和適合的粉末基料組成，諸如乳糖或淀粉。為了持續(xù)傳遞，所述的番石榴提取組合物可以作為用于植入給藥或肌肉注射給藥 的儲(chǔ)存制品被配制。所述的番石榴提取組合物可以與適合的聚合材料或者疏水材料(例 如，在可接受的油中作為乳劑)或離子交換樹(shù)脂，或者作為微溶的衍生物，例如，作為一種 微溶的鹽，進(jìn)行配制。另外，作為一種吸盤(pán)或膜片制造的透過(guò)皮膚起作用的輸送系統(tǒng)能被使 用，其緩慢釋放所述番石榴提取組合物用于經(jīng)皮吸收。至此，滲透增強(qiáng)劑可用于促進(jìn)所述 番石榴提取組合物的皮膚滲透。適合的皮膚膜片被描述在例如美國(guó)專(zhuān)利5，407，713 ；美國(guó) 專(zhuān)利5，352，456 ；美國(guó)專(zhuān)利5，332，213 ；美國(guó)專(zhuān)利5，336，168 ；美國(guó)專(zhuān)利5，290，561 ；美國(guó)專(zhuān) 利5，254，346 ；美國(guó)專(zhuān)利5，164，189 ；美國(guó)專(zhuān)利5，163，899 ；美國(guó)專(zhuān)利5，088，977 ；美國(guó)專(zhuān)利 5，087，240 ；美國(guó)專(zhuān)利 5，008，110 ；和美國(guó)專(zhuān)利 4，921，475。另外，可以采用其它的傳遞系統(tǒng)。脂質(zhì)體和乳劑是被熟知的傳遞載體，其可用于傳 遞番石榴提取組合物。確定的有機(jī)溶劑，諸如二甲亞砜(DMSO)，也可以被采用，雖然通常以 較大的毒性為代價(jià)。所述的組合物，如果需要，可以存在于一種包裝或者分配器裝置中，其可以包含一 種或多種含有所述番石榴提取組合物的單位劑量型式。所述的包裝可以，例如，含有金屬或 者塑料薄片，諸如泡罩包裝。所述的包裝或分配器裝置可以附有藥的服用說(shuō)明。軟凝膠或軟膠膠囊可以被制備，例如，不受限制地，通過(guò)在適當(dāng)?shù)拿浇槲?例如， 米糠油和/或蜂蠟)中分散所述成分，以形成一種高粘度混合物。然后這些混合物與凝 膠一同被做成膠囊，基于軟凝膠工業(yè)技術(shù)人員所知的薄膜應(yīng)用技術(shù)和機(jī)械設(shè)備。所述膠囊 成型后被干燥至恒重。典型地，所述膠囊的重量大約在100-2500毫克之間，優(yōu)選在大約 1500-1900毫克之間，更準(zhǔn)確地說(shuō)在大約1500-2000毫克之間。例如，當(dāng)制備軟凝膠殼時(shí)，所述的殼可以包含大約20-70%的凝膠，通常還有增塑 劑和大約5-60%按重量計(jì)算的山梨醇。所述軟膠膠囊的充填料是液體(主要是載體，諸如 米糠油或者小麥胚油和/或蜂蠟，如果需要的話)并可以包含除所述穩(wěn)定化花色素甙組合 物以外的親水性的基質(zhì)。所述親水性基質(zhì)，如果存在的話，是具有大約200-1000平均分子 量的聚乙二醇。進(jìn)一步的組分可選擇的是增稠劑和/或乳化劑。在一個(gè)實(shí)施例中，所述的 親水性基質(zhì)包括具有大約200-1000平均分子量的聚乙二醇，5-15%的甘油，和5-15%按重量計(jì)算的水。所述聚乙二醇也可以攙雜丙二醇和/或碳酸丙烯。在另外實(shí)施例中，所述的軟凝膠膠囊是從凝膠、甘油、水和不同添加劑制備得到 的。典型地，所述凝膠的百分比(按重量計(jì)算)在大約30-50%之間，優(yōu)選為大約35-15之 間，更優(yōu)選大約42%。所述配方包括大約15-25%重量百分?jǐn)?shù)之間的甘油，更優(yōu)選的在大約 17-23%重量百分?jǐn)?shù)之間，以及最優(yōu)選的為大約20%重量百分?jǐn)?shù)甘油。所述膠囊的剩余部分典型地是水。該數(shù)量在大約2 5-40%重量百分?jǐn)?shù)之間變化， 更優(yōu)選在30-35%重量百分?jǐn)?shù)之間，最優(yōu)選為大約35%重量百分?jǐn)?shù)。該膠囊的其他部分通 常可以在大約2-10%重量百分?jǐn)?shù)之間變化，由調(diào)味劑、糖、著色劑、等等或它們的組合組成。 在該膠囊加工之后，最終膠囊的含水率經(jīng)常是在大約5-10重量百分?jǐn)?shù)之間，更具體的在大 約7-12重量百分?jǐn)?shù)，更準(zhǔn)確地說(shuō)在大約9-10重量百分?jǐn)?shù)之間。至于制造，標(biāo)準(zhǔn)軟殼膠囊制造技術(shù)可用于制備該軟殼產(chǎn)品是可預(yù)期的。有效的制 造技術(shù)的實(shí)例是平板法，R. P. Scherer開(kāi)創(chuàng)的旋轉(zhuǎn)沖模過(guò)程工藝，應(yīng)用Norton膠囊設(shè)備的 過(guò)程工藝，以及Accogel設(shè)備和Lederle開(kāi)發(fā)的過(guò)程工藝。這些過(guò)程工藝每個(gè)都是成熟技 術(shù)，并對(duì)任何一個(gè)希望制備軟膠膠囊的人，都可廣泛得到。所述乳化劑可用于促進(jìn)溶解軟膠囊內(nèi)的組分。表面活性劑、乳化劑、或泡騰劑的特 定例子包括D-山梨醇、乙醇、角叉菜膠、聚羧乙烯、羧甲基纖維素鈉、瓜耳豆膠、甘油、脂肪 酸甘油酯、膽固醇、白蜂蠟、丁二酸二辛基磺酸鈉、蔗糖脂肪酸酯、十八醇、硬脂酸、聚氧乙烯 (40)硬脂酸鹽、失水山梨醇倍半油酸酯、鯨蠟醇、明膠、失水山梨醇脂肪酸酯、滑石、失水山 梨醇三油酸酯、石蠟、馬鈴薯淀粉、羥丙基纖維素、丙二醇、丙二醇脂肪酸酯、果膠、聚氧乙烯 (105)聚氧丙烯(5)乙二醇、聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)乙二醇、聚氧乙烯氫化蓖麻油、 聚氧乙烯氫化蓖麻油40、聚氧乙烯氫化蓖麻油60、聚氧乙烯(35)蓖麻油、聚山梨酸酯20、聚 山梨酸酯60、聚山梨醇酯80、聚乙二醇400、辛基十二醇肉豆蔻酸酯、甲基纖維素、失水山梨 醇單油酸酯、單硬脂酸甘油酯、失水山梨醇單棕櫚酸酯、失水山梨醇單月桂酸酯、十二烷基 二甲胺氧化物溶液、十二烷基硫酸鈉、聚桂醇、干燥碳酸鈉、酒石酸、氫氧化鈉、精制大豆卵 磷脂、大豆卵磷脂、碳酸鉀、碳酸氫鈉、中鏈甘油三酸酯、檸檬酸酐、棉籽油-大豆油混合物， 和液體石蠟。本發(fā)明也提供了已包裝制劑，其包括本發(fā)明所述組合物以及該產(chǎn)品在適當(dāng)條件下 的使用說(shuō)明書(shū)。典型情況下，無(wú)論其以什么形式，該已包裝制劑是用于有使用需要的個(gè)體。 典型情況下，其劑量要求為一天大約1到大約4次用量。雖然本發(fā)明描述了本發(fā)明所述組合物用于治療不同的癥狀的軟膠囊制劑、使用、 制造和包裝，但不應(yīng)認(rèn)為其僅限于軟膠囊。本發(fā)明可吸收的組合物可以以如上所述的傳統(tǒng) 的片劑、丸劑、錠劑、酏劑、乳液、硬膠囊、液體、懸浮液等劑型傳遞。本發(fā)明所述的番石榴提取組合物，或者它們的組合物，通常以一定有效劑量用于 完成所述的預(yù)期結(jié)果，例如以一定有效劑量治療或者預(yù)防與發(fā)炎有關(guān)的癥狀。所述的組合 物可以有療效地服用以實(shí)現(xiàn)治療學(xué)目的，或者預(yù)防性地實(shí)現(xiàn)預(yù)防疾病的目的。依據(jù)治療目 的，是指被處理的潛的紊亂的根除或者改善，和/或一個(gè)或多個(gè)與潛在紊亂有聯(lián)系的癥狀 的根除或者改善，以使該病人報(bào)告在感受或癥狀上的改善，盡管該病人仍可能經(jīng)受該潛在 紊亂的折磨。例如，不僅當(dāng)該潛在癥狀被根除或改善時(shí)，而且當(dāng)該病人報(bào)告與病痛有關(guān)的身 體不適的嚴(yán)重程度或持續(xù)時(shí)間減小時(shí)，本發(fā)明組合物的服用，對(duì)遭受病痛折磨的病人提供了治療學(xué)的效益。對(duì)于預(yù)防性用藥，該組合物可用于處于發(fā)展為前述癥狀之一的風(fēng)險(xiǎn)中的病人。該組合物服用的劑量將依賴多種因素，包括，例如，接受治療的特定征兆，給藥方式，無(wú)論所期望的效果是預(yù)防性的還是治療性的，接受治療的征兆的嚴(yán)重程度以及病人的 年齡和體重等等。有效劑量的確定處于所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。番石榴提取組合物的總劑量將代表性地處于0. 0001mg/kg/天或0. OOlmg/kg/天 或0. 01mg/kg/天到100mg/kg/天范圍之內(nèi)，但是，根據(jù)其它因素中的組分活性、其生物利用 率、給藥方式以及上述討論過(guò)的多種因素，其可以更高或更低。用藥劑量和間隔可單獨(dú)調(diào) 整，以使所述化合物的血藥濃度足以維持治療性或預(yù)防性效果。例如，根據(jù)其他情況中的 給藥方式、被治療的特定適應(yīng)癥和醫(yī)囑，所述化合物可以每周服用一次，每周服用數(shù)次(例 如，每隔一天)，每日服用一次或每日服用多次。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員不需要非常規(guī)實(shí)驗(yàn)就可 以優(yōu)化有效局部用量。下列從1至56連續(xù)計(jì)數(shù)的段落規(guī)定本發(fā)明的各個(gè)方面。在一個(gè)實(shí)施例中，在起 始段落(1)，本發(fā)明提供了一種經(jīng)分離的番石榴提取物，含有至少大約30%重量份的槲皮 素相關(guān)的黃酮醇糖甙，以該提取物總重量計(jì)，含有槲皮素-3-阿拉伯葡萄糖甙，槲皮素己糖 甙，甲基槲皮素己糖甙，異槲皮素甙，桑色素戊糖甙，和槲皮素戊糖甙。2.段落1所述的經(jīng)分離的番石榴提取物，其中所述的槲皮素黃酮醇糖甙構(gòu)成了所 述提取物總重量的95%重量份。3.段落1所述的經(jīng)分離的番石榴提取物，其中番石榴甙大于該提取物黃酮醇糖甙 的總量的大約5%重量份，槲皮素-3-阿拉伯葡萄糖甙大于該提取物黃酮醇糖甙的總量的 大約10%重量份。4. 一種經(jīng)分離的番石榴提取物，以1克提取物的總重量為準(zhǔn)，含有槲皮素-3-阿 拉伯葡萄糖甙為大約15-17毫克，槲皮素己糖甙為大約50-54毫克，甲基槲皮素己糖甙為大 約50-56毫克，異槲皮素甙為大約18-21毫克，桑色素戊糖甙為大約26-29毫克，番石榴甙 為大約63-68毫克以及槲皮素戊糖甙為大約75-79毫克。5. 一種經(jīng)分離的番石榴提取物的制備方法，包含在升高溫度條件下用醇和水提取 番石榴葉和/或番石榴果實(shí)，以獲得粗提物；將粗提物減壓處理以生成含水濃縮物；將濃縮 物離心以分離固體物質(zhì)；將澄清液柱層析并用水繼之以醇洗提該柱，得到流出物；將流出 物減壓處理以生成第二個(gè)含水濃縮物；將該含水濃縮物通過(guò)聚酰胺樹(shù)脂以除去雜質(zhì)，然后 用醇解吸活性組分；減壓下濃縮該活性組分以生產(chǎn)所述的經(jīng)分離的提取物。6.根據(jù)段落1-5中任何一段所述的經(jīng)分離的番石榴提取物，其能夠抑制DP-IV活 性或抑制與DP-IV相似的酶活性。7. 一種含有段落1-5中任何一段所述的經(jīng)分離的番石榴提取物的食品或飲料。8. 一種用于生產(chǎn)食品或飲料的方法，其包含將段落1-5中任何一段所述的經(jīng)分離 的番石榴提取物添加進(jìn)入食品或飲料。9. 一種飲食方法，包含攝入段落8中敘述的食品，飲料，或者食品和飲料。10. 一種二肽基肽酶IV(DP-IV)抑制劑的制備方法，包含這些步驟在升高溫度條 件下用醇和水接觸由番石榴葉和/或番石榴果實(shí)構(gòu)成的番石榴原料，以獲得粗提物；將粗 提物減壓處理以生成含水濃縮物；將濃縮物離心以分離固體物質(zhì)；將澄清液柱層析并用水繼之以醇洗提該柱，得到流出物；將流出物減壓處理以生成第二個(gè)含水濃縮物；將該含水 濃縮物通過(guò)聚酰胺樹(shù)脂以除去雜質(zhì)，然后用醇解吸活性組分；減壓下濃縮該活性組分以生 成所述的DP-IV抑制劑。11.根據(jù)段落10所述的DP-IV抑制劑，其能夠抑制DP-IV活性或抑制與DP-IV相 似的酶活性。
12. 一種含有段落10或11中任何一段所述的DP-IV抑制劑的食品或飲料。13. 一種用于生產(chǎn)食品或飲料的方法，其包含將段落10或11中任何一段所述的 DP-IV抑制劑添加進(jìn)入食品或飲料。14. 一種飲食方法，包含攝入段落13中敘述的食品，飲料，或者食品和飲料。15. 一種制備具有抑制二肽基肽酶IV活性的番石榴提取物的方法，包含這些步 驟在升高溫度條件下用醇和水接觸由番石榴葉和/或番石榴果實(shí)構(gòu)成的番石榴原 料，以獲得粗提物；將粗提物減壓處理以生成含水濃縮物；將濃縮物離心以分離固體物質(zhì)；將澄清液柱層析并用水繼之以醇洗提該柱，得到流出物；將流出物減壓處理以生成第二個(gè)含水濃縮物；將該含水濃縮物通過(guò)聚酰胺樹(shù)脂以除去雜質(zhì)，然后用醇解吸活性組分；減壓下濃 縮該活性組分以生成一種濃縮物。16.段落15所述的方法，其中的番石榴原料是番石榴葉片。17.段落15或16中任何一段所述的方法，其中的醇是乙醇。18.段落15-17中任何一段所述的方法，其中的醇的濃度是大約80%體積比。19.段落15-18中任何一段所述的方法，其中的醇的體積與番石榴原料重量的比 例為大約8 1。20.段落15-19中任何一段所述的方法，其中的番石榴原料來(lái)自Psidium cattleianum,Psidium cattleianumssp. Lucidum, Psidium guajava, Psidium guineense, Psidium littorale, Psidium molle or Psidium schiedeanum 中一禾中植物。21.段落15-20中任何一段所述的方法，其中的高溫在大約40_70°C之間。22.段落15-21中任何一段所述的方法，其中的疏水柱由交聯(lián)聚苯乙烯/二乙烯基 苯共聚物組成。23.段落15-22中任何一段所述的方法，其中的醇是乙醇。24.段落15-23中任何一段所述的方法，其中的濃縮物通過(guò)膜濾法進(jìn)一步處理。25.段落15-24中任何一段所述的方法，其中的濃縮物在升高溫度條件下用水進(jìn) 一步提取，以產(chǎn)生水溶液；將該水溶液離心，以提供澄清液；并過(guò)濾該澄清液。26.段落25所述的方法，其中的澄清液在減壓下被濃縮。27.段落15-26中任何一段所述的提取物。28. 一種治療葡萄糖代謝紊亂，糖尿病，肥胖，動(dòng)脈硬化，降低低密度脂蛋白膽固 醇，或解除與女性月經(jīng)有關(guān)的疾病或癥狀的方法，包括給需要的個(gè)體服用治療有效量的段 落1-27中任何一段所述的組合物的步驟，以使所述的疾病或癥狀得到治療。
29. 一種藥物，含有段落1-27中任何一段所述的組合物和其在藥學(xué)上可接受的鹽 或酯；以及藥學(xué)上可接受的載體。30. 一種包裝后的藥物，適于治療葡萄糖代謝紊亂，糖尿病，肥胖，動(dòng)脈硬化，降低 低密度脂蛋白膽固醇，或解除與女性月經(jīng)有關(guān)的疾病或癥狀，含有段落1-27中任何一段所 述的組合物，和用于治療所述疾病或癥狀的用法說(shuō)明。31. 一種含有槲皮素相關(guān)的黃酮醇糖甙的經(jīng)分離的番石榴提取物，含有槲皮 素-3-阿拉伯葡萄糖甙與番石榴甙。32.段落31所述的經(jīng)分離的番石榴提取物，進(jìn)一步含有異槲皮素。

33.段落31所述的經(jīng)分離的番石榴提取物，其中的倍半萜烯和丹寧被充分去除。34.段落33所述的經(jīng)分離的番石榴提取物，其中的倍半萜烯和丹寧小于該提取物 總重量的大約5%重量份。35.段落34所述的經(jīng)分離的番石榴提取物，其中的倍半萜烯和丹寧小于該提取物 總重量的大約重量份。36.段落31所述的經(jīng)分離的番石榴提取物，其中的槲皮素相關(guān)的黃酮醇糖甙構(gòu)成 了所述提取物總重量的至少30%重量份。37.段落32所述的經(jīng)分離的番石榴提取物，其中的倍半萜烯和丹寧被充分地去 除。38.段落37所述的經(jīng)分離的番石榴提取物，其中的倍半萜烯和丹寧小于該提取物 總重量的大約5%重量份。39.段落38所述的經(jīng)分離的番石榴提取物，其中的倍半萜烯和丹寧小于該提取物 總重量的大約重量份。40.段落32所述的經(jīng)分離的番石榴提取物，其中的槲皮素相關(guān)的黃酮醇糖甙構(gòu)成 了所述提取物總重量的至少30%重量份。41.段落31所述的經(jīng)分離的番石榴提取物，進(jìn)一步包含槲皮素己糖甙，甲基槲皮 素己糖甙，異槲皮素甙，桑色素戊糖甙，或者槲皮素戊糖甙中的至少一種。42.段落41所述的經(jīng)分離的番石榴提取物，其中的倍半萜烯和丹寧被充分地去 除。43.段落42所述的經(jīng)分離的番石榴提取物，其中的倍半萜烯和丹寧小于該提取物 總重量的大約5%重量份。44.段落43所述的經(jīng)分離的番石榴提取物，其中的倍半萜烯和丹寧小于該提取物 總重量的大約重量份。45.段落41所述的經(jīng)分離的番石榴提取物，其中的槲皮素相關(guān)的黃酮醇糖甙構(gòu)成 了所述提取物總重量的至少30%重量份。46.段落32所述的經(jīng)分離的番石榴提取物，進(jìn)一步包含槲皮素己糖甙，甲基槲皮 素己糖甙，異槲皮素甙，桑色素戊糖甙，或者槲皮素戊糖甙中的至少一種。47.段落46所述的經(jīng)分離的番石榴提取物，其中的倍半萜烯和丹寧被充分地去 除。48.段落47所述的經(jīng)分離的番石榴提取物，其中的倍半萜烯和丹寧小于該提取物 總重量的大約5%重量份。
49.段落48所述的經(jīng)分離的番石榴提取物，其中的倍半萜烯和丹寧小于該提取物 總重量的大約重量份。50.段落46所述的經(jīng)分離的番石榴提取物，其中的槲皮素相關(guān)的黃酮醇糖甙構(gòu)成 了所述提取物總重量的至少30%重量份。51.根據(jù)段落1-50 中任何一段所述的經(jīng)分離的番石榴提取物，其能夠抑制DP-IV 活性或抑制與DP-IV相似的酶活性。52.段落28所述的方法，其中所述的組合物進(jìn)一步包含異槲皮素，槲皮素己糖甙， 甲基槲皮素己糖甙，桑色素戊糖甙，或者槲皮素戊糖甙中的一個(gè)或多個(gè)。53.段落52所述的方法，其中的倍半萜烯和丹寧從提取物中被充分地去除。54.段落53所述的方法，其中的倍半萜烯和丹寧小于該提取物總重量的大約5%
重量份。55.段落52所述的方法，其中的倍半萜烯和丹寧從提取物中被充分地去除。56.段落55所述的方法，其中的倍半萜烯和丹寧小于該提取物總重量的大約5% 重量份。下列實(shí)施例的存在，提供了支持本發(fā)明的補(bǔ)充信息，不意謂是對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例實(shí)施例1——制備來(lái)自Psidium guajava的乙醇提取物的概述-以下工序描述了制備來(lái)自Psidiumguajava葉片的提取物的生產(chǎn)過(guò)程-將Psidiumguajava的葉片研磨成粉；-用乙醇提?。?將提取液減壓濃縮至乙醇蒸發(fā)；_通過(guò)離心除去不溶性雜質(zhì)并獲得澄清液體；-將澄清液體裝入大孔樹(shù)脂填充的色譜柱，用水進(jìn)一步除去雜質(zhì)，然后用乙醇解吸 活性組分，并收集乙醇洗脫液；-干燥乙醇洗脫液，產(chǎn)生Psidiumguajava提取物。提取過(guò)程詳細(xì)描述1.提取粉末狀的Psidium guajava葉片在60士2°C下，用80%乙醇提取兩次。提 取持續(xù)時(shí)間為每次2小時(shí)。乙醇體積與原料粉末重量的比例為8 1。2.濃縮乙醇/水提取物在60士2°C減壓并濃縮直至乙醇被除去，得到含水液體。 真空度為小于-0. 08MPa。3.色譜分離該含水液體被離心，以除去所有的固體。通過(guò)離心得到的澄清液體 被裝入大孔樹(shù)脂。用水沖洗樹(shù)脂。用95%乙醇洗脫活性組分，直至液體澄清并且顏色為淡 黃色。流速被控制為15-20mL/分。收集乙醇部分。4.干燥合并后乙醇部分減壓處理，洗脫液被濃縮/干燥。真空度小于-O.OSMPa。 得到粉末。實(shí)施例2——Psidium guajava提取物的生產(chǎn)500g研磨后的原料(新鮮的Psidium guajava果實(shí))經(jīng)稱重并被轉(zhuǎn)移至含有 2000mL的80%乙醇的三頸燒瓶中。混合物在60°C被溫和地?cái)嚢?小時(shí)。過(guò)濾提取液。收 集濾液，并在相同條件下，用2000mL80%乙醇再次提取濾渣。再次過(guò)濾提取液，并合并兩次濾液。合并后的濾液在60°C減壓下濃縮，直至沒(méi)有乙醇剩余。真空度大約為-0. 09MPao無(wú)乙醇的濃縮液經(jīng)離心除去固體顆粒。液體與固體顆粒分離。200mL水被添加至來(lái)自離心 分離的顆粒，并再次離心處理混合物。合并兩次離心產(chǎn)生的上層清液。該澄清液體被裝入 大孔樹(shù)脂(Amberlite XAD 4型)并首先用SOOmL水以17mL/分的流速?zèng)_洗，以洗掉水溶性 組分。該樹(shù)脂然后用1000mL95%乙醇以8.5mL/分的流速處理，以使活性組分脫附，并收集 2小時(shí)內(nèi)的洗脫液。該洗脫液在60°C減壓下濃縮，繼之以干燥5小時(shí)。得到1. 4gPsidium guajava提取物。通過(guò)HPLC，槲皮素含量經(jīng)測(cè)定為0. 10%重量 份，番石榴甙含量經(jīng)測(cè)定為0. 657%重量份。實(shí)施例3——Psidium guajava提取物的生產(chǎn)20Kg研磨后的Psidium guajava葉片的粉末被稱重并被投入250L蒸煮鍋，然后加 入160L80%乙醇，混合物在60C攪拌2小時(shí)。過(guò)濾混合液并收集濾液。160L80%乙醇被添 加與濾渣混合?；旌衔镌?0C提取2小時(shí)，過(guò)濾，并合并濾液。合并后的濾液在60C減壓下 濃縮，直至乙醇?xì)埩魹楹哿?。濃縮期間的真空度大約為-0. 09MPao將仍含水的濃縮混合物離心。將得到的上層清液與離心分離期間形成的固體顆粒 分離。將顆粒破碎，添加40L水混合并離心。來(lái)自第一次和第二次提取的上層清液被合并。 合并后的液體通過(guò)大孔交聯(lián)樹(shù)脂(Amberlite XAD 4型)。首先，160L水用來(lái)洗滌該吸收后 的樹(shù)脂，通過(guò)該操作去除部分雜質(zhì)。然后，350L80 %乙醇通過(guò)該樹(shù)脂，將活性組分從樹(shù)脂中 洗提出來(lái)。收集黃褐色液體。該液體在60°C減壓下被濃縮。然后，濃縮物在真空干燥機(jī)中 干燥5小時(shí)。得到1.8Kg Psidium guajava提取物。通過(guò)HPLC分析測(cè)定，番石榴甙的含量是 12. 44%，帶有1.02%槲皮素。(色譜柱C180DS (十八烷基硅烷酯)；流動(dòng)相甲醇冰 醋酸(32 68，體積比)在360nm波長(zhǎng)檢測(cè))步驟B 上述產(chǎn)物進(jìn)一步濃縮。該產(chǎn)物溶解于200L水中。溶液通過(guò)聚酰胺樹(shù)脂進(jìn) 行分離(聚酰胺6樹(shù)脂，來(lái)自Messrs. Sorbent Technologies, Inc.)首先，40L水用來(lái)洗滌 該樹(shù)脂以除去雜質(zhì)。然后，60L80%乙醇用來(lái)解吸需要的活性組分。收集黃褐色液體作為洗 脫液。該洗脫液在60°C減壓在下濃縮，然后在真空干燥機(jī)中干燥5小時(shí)。得到0. 45Kg Psidium guajava提取物。通過(guò)HPLC分析(同上)測(cè)定，番石榴甙 的含量是42. 09%，帶有0. 96%槲皮素。實(shí)施例4——Psidium guajava提取物的DP-IV抑制作用的研究方法通過(guò)比色分析法測(cè)定DP-IV活性。Gly-Pro-4-NA (G0513, Sigma, St. Louis,MO)，一種 DP-IV (合成的)顯色底物，通過(guò) DP-IV被水解為二肽甘氨酸_脯氨酸和4-硝基苯胺，其出現(xiàn)比率在405nm被定量地跟隨。400 μ L分析緩沖液(9. 5g HEPES/L蒸餾水，pH值被調(diào)節(jié)為7. 0，產(chǎn)品號(hào)碼H4034， Sigma, St. Louis, MO) ,150 μ L人血漿和100 μ L抑制劑溶液(或溶劑)被轉(zhuǎn)移進(jìn)入光度計(jì) 樣品池，溫和地?cái)嚢璨⒃?7°C預(yù)培養(yǎng)3分鐘。然后開(kāi)始分析，通過(guò)添加70 μ L酶底物溶液 (8. 6mg Gly-Pro-4-NA/10mL分析緩沖液中含有)。記錄在405nm處20分鐘內(nèi)的吸收變化。DP-IV活性可以表示為在20分鐘內(nèi)的光密度的線性變化(AAbs/分鐘)。
樣品制備根據(jù)實(shí)施 例2得到的Psidium gujava提取物，在45°C，攪拌條件下，溶解于蒸餾 水中，保持24小時(shí)。此后，該提取物通過(guò)離心分離(15，OOOrpm, 15分鐘)，過(guò)濾(針筒式濾 器，0.45 μ M)去除雜質(zhì)，適當(dāng)被稀釋并提交測(cè)試分析。該提取物的濃度為5g粉末/IOOmL水。通過(guò)向除雜后的提取物添加水制備稀釋液。為了對(duì)比目的，P32/98 {3N-[ (2S，3S) _2_氨_3_甲基-戊?；鵠_1，3_噻唑-半延 胡索酸鹽}，一種人工合成酶抑制劑，抑制DP-IV。制備濃度為1. 60mg P32/98/mL分析緩沖液的儲(chǔ)備溶液，并用分析緩沖液稀釋?zhuān)?得到0. 50mg/mL-0. 05mg/mL之間的濃縮溶液。100 μ L的這些溶液作為“抑制劑”溶液，被添
加至試樣。在相同測(cè)試分析系統(tǒng)中進(jìn)行比較試驗(yàn)，其在下列“結(jié)果”部分進(jìn)一步描述。數(shù)據(jù)評(píng)估結(jié)果以％ -抑制來(lái)表示，該抑制來(lái)自沒(méi)有添加抑制劑的樣品與添加抑制劑的 樣品或Psidium guajava提取物(實(shí)施例2)(兩者具有不同濃度)的測(cè)試結(jié)果的比較。試樣中的無(wú)抑制(0% )表示與沒(méi)有添加抑制劑的樣品相比具有相同的吸收增加。 完全抑制(100% )表示沒(méi)有明顯的吸收增加。全部測(cè)試結(jié)果為2個(gè)樣品的平均值。這些重復(fù)取樣的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差總小于7%。結(jié)果該分析應(yīng)用公知的常規(guī)程序進(jìn)行校準(zhǔn)該測(cè)試分析系統(tǒng)的最佳pH值顯示為處于pH值=6.0和？!1值=8.0之間的范圍。 32-42°C之間的分析溫度范圍沒(méi)有顯著影響酶活性。5-10μ g/10mL之間的任何酶底物濃度 產(chǎn)生了最大的酶活性。在選定的酶底物濃度上，吸收的增加顯示為線性的，直至45分鐘。在 選定的分析條件下，100-200 μ L之間的血漿體積顯示吸收增加產(chǎn)生了劑量依賴性的平行移動(dòng)。在最終的測(cè)試分析條件下的重復(fù)試驗(yàn)產(chǎn)生小于7%的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。通過(guò)公知的非特異性酶抑制劑產(chǎn)生的酶的抑制，和各個(gè)溶劑產(chǎn)生的結(jié)果顯示在表 1中。表1，非特異性酶抑制劑對(duì)DP-IV活性的作用 可見(jiàn)，該酶DP-IV沒(méi)有充分地被選定的非特異性的酶抑制劑所阻塞。明顯的抑制 通過(guò)有機(jī)溶劑實(shí)現(xiàn)。由于這些結(jié)果，該提取物溶解于水，因?yàn)橛袡C(jī)溶劑顯示出阻塞了該酶活 性；因此那些溶劑的采用將導(dǎo)致無(wú)法解釋的結(jié)果。圖1和圖2顯示了用合成抑制劑P32/98和Psidium guajava提取物進(jìn)行測(cè)試的 結(jié)果，橫坐標(biāo)標(biāo)繪了各個(gè)抑制劑濃度，縱坐標(biāo)標(biāo)繪了各個(gè)觀測(cè)到的DP-IV的抑制程度。如圖1所示，合成抑制劑P32/98產(chǎn)生了一條平滑的劑量/響應(yīng)抑制曲線。在選定 的測(cè)試分析系統(tǒng)中，大約0. IOyg/試樣體積的濃度產(chǎn)生了大約50%的DP-IV抑制。如圖2所示，Psidium guajava提取物也產(chǎn)生了一條平滑的劑量/響應(yīng)抑制曲線。 在該選定的測(cè)試分析系統(tǒng)中，100-1000 μ g/試樣體積之間的濃度產(chǎn)生了大約50%的DP-IV 抑制。因此，Psidium guajava提取物顯示出對(duì)DP-IV充分的抑制。Psidium guajava和 合成抑制劑P32/98之間在效力上的差異大約等于1000。實(shí)施例5——番石榴甙的DP-IV抑制作用的研究除非在下文中以另外方式表明，所應(yīng)用的原料和方法與實(shí)施例4相同。樣品制備番石榴甙溶解于HEPES [N- (2_羥乙基)哌嗪-N' _2_乙烷磺酸]緩沖液(20分鐘 超聲處理，繼之以在室溫下振蕩2小時(shí))，適當(dāng)稀釋并提交測(cè)試。通過(guò)添加HEPES緩沖液制 備稀釋液。測(cè)試濃度在70-280 μ g/mL測(cè)試試樣之間。數(shù)據(jù)評(píng)估結(jié)果用活性來(lái)表示，其來(lái)自陽(yáng)性對(duì)照樣品(無(wú)抑制劑添加)中得到的測(cè)試結(jié) 果與以添加不同濃度番石榴甙的樣品中得到的結(jié)果的比較。試樣中100%活性表明，與沒(méi)有添加抑制劑的樣品相比較，具有相同吸收增量。零 活性(0% )表明沒(méi)有明顯的吸收增量。全部測(cè)試結(jié)果以2個(gè)樣品的平均值表示。這些重復(fù)取樣的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差總是小于5%。結(jié)果如圖3和圖4所示，番石榴甙產(chǎn)生了一種明確的DP-IV劑量依賴性抑制。在該選 定的測(cè)試分析系統(tǒng)中，在140-210 μ g/mL測(cè)試試樣(100-150 μ g/試樣體積)之間的濃度產(chǎn)生了大約50 %的DP-IV抑制。番石榴提取物的測(cè)試1.該提取組合物的定量數(shù)據(jù)分析2g提取物/IOOmL (如實(shí)施例2所制備)甲醇/水溶液(甲醇/水，50 50， 體積比)中的槲皮素糖甙組合物。如圖5所示，在該提取物中發(fā)現(xiàn)了 7個(gè)主要的槲皮素糖 甙。這些峰的結(jié)構(gòu)被推薦用質(zhì)譜研究。為了定量評(píng)價(jià)，單獨(dú)的黃酮醇糖甙的峰面積％與相 同樣品酸性水解后得到的槲皮素的數(shù)量有關(guān)系(折算為相應(yīng)推薦結(jié)構(gòu)中的槲皮素的質(zhì)量 比例)。下列各項(xiàng)是定量分析用的HPLC條件三元梯度泵被調(diào)整到1. OOmL/分鐘流動(dòng)相A 0. 1 %磷酸水溶液流動(dòng)相B 0. 1 %磷酸乙腈溶液梯度00-15分鐘0-8% B ；15-70 分鐘8~24% B ；70-85 分鐘24-35% B波長(zhǎng)360nm溫度30°C注射體積25 μ L柱Spheri sorb ODS 250X4. 6mm來(lái)自HPLC/MS研究的番石榴提取組合物 整個(gè)地，每克番石榴提取物包含313. 8mg黃酮醇糖甙[等于31. 4% (質(zhì)量比)槲 皮素相關(guān)糖甙]。主要化合物番石榴甙的含量是65. 7mg/g提取物[相當(dāng)于6. 57% (質(zhì)量 比)]。2.在培養(yǎng)條件下個(gè)體的黃酮醇糖甙的穩(wěn)定性在測(cè)試條件下，采用CaCo-2細(xì)胞吸收試驗(yàn)，以2g提取物(來(lái)自實(shí)施例2)/IOOmL
培養(yǎng)介質(zhì)的濃度，來(lái)研究選定的黃酮醇糖甙的穩(wěn)定性。
可見(jiàn)，全部黃酮醇糖甙在回腸條件下是穩(wěn)定的。3. CaCo-2細(xì)胞中槲皮素糖甙的吸收的研究樣品濃度2g番石榴提取物(來(lái)自實(shí)施例2)/IOOmL培養(yǎng)基培養(yǎng)條件37°C下60分鐘(5個(gè)平行測(cè)定培養(yǎng))數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)由HPLC分析培養(yǎng)基(在制備和培養(yǎng)60分鐘之后，立即分析)和細(xì)胞內(nèi) 容物得到的，單獨(dú)的黃酮醇糖甙的峰面積的比例。結(jié)果是5個(gè)培養(yǎng)的平均值。吸收(存在于培養(yǎng)基中的黃酮醇糖甙的％ ) 可見(jiàn)，黃酮醇糖甙的絕對(duì)吸收被判斷在2. 3和5. 3%之間。最佳吸收被發(fā)現(xiàn)是槲皮 素阿拉伯糖甙，緊接著是槲皮素葡萄糖甙和甲基槲皮素己糖甙。當(dāng)定量考慮組合物時(shí)，槲皮素糖甙的吸收數(shù)量合計(jì)為12mg/g提取物。CaCo-2細(xì)胞的培養(yǎng)CaCo-2細(xì)胞在37°C含有5% 二氧化碳和95%空氣的環(huán)境中，于Dulbeccos' sModified Eagle培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基含有20 %胎兒牛血清，1. 2 %非必需氨基酸， 0. 83mM的L-谷酰胺，1. 2%青霉素-鏈霉素和0. 巰基乙醇。細(xì)胞生長(zhǎng)在75cm2培養(yǎng)瓶(T75)中，一周后再次培養(yǎng)(每隔一天用PBS緩沖液沖 洗，用胰蛋白酶去除并轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的培養(yǎng)瓶中)。CaCo-2 試驗(yàn) 為了實(shí)驗(yàn)，在37°C并含有5%二氧化碳和95%空氣的環(huán)境中，以3X 105個(gè)細(xì)胞每 孔的細(xì)胞密度，在6個(gè)點(diǎn)板中種入細(xì)胞，生長(zhǎng)7到8天，直至融合。細(xì)胞用PBS緩沖液沖洗 并與黃酮醇一起培養(yǎng)60分鐘。在相應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間之后，每孔取900 μ L培養(yǎng)基并與100 μ L蟻酸混合。細(xì)胞用PBS 緩沖液沖洗并用ImL的10%蟻酸去除。細(xì)胞超聲處理3次，每次30秒，離心10分鐘并丟棄 顆粒。上層清液用作HPLC分析樣品。4.選定的槲皮素糖甙的DP-IV試驗(yàn)與番石榴甙和含有存在于番石榴提取物中的全部黃酮醇糖甙的純化部分相比，番 石榴提取物(來(lái)自實(shí)施例2)對(duì)于DP-IV抑制的活性。該純化部分通過(guò)HPLC制備，其中包 含活性組分的所有部分被合并然后減壓濃縮，以產(chǎn)生純化的提取物。該純化的提取物然后 溶解于培養(yǎng)基至一優(yōu)選的濃度。全部三個(gè)樣品被調(diào)至含有180 μ g番石榴甙/mL測(cè)試試樣，該濃度表示在人血漿中 抑制了 50% 的 DP-IV。圖6表示該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。180 μ g番石榴甙/mL的測(cè)試產(chǎn)生了 50%的DP-IV抑制。該番石榴提取物被調(diào)至 含有180 μ g番石榴甙/mL測(cè)試試樣，然后發(fā)現(xiàn)略微超過(guò)70%的DP-IV抑制。該番石榴提取 物純化的部分被調(diào)至含有180 μ g番石榴甙/mL測(cè)試試樣，其含有全部黃酮醇糖甙部分，然 后發(fā)現(xiàn)略微超過(guò)70%的DP-IV抑制。這些結(jié)果表明(a)就DP-IV抑制活性而言，番石榴甙是活性組分之一。(b)存在于番石榴提取物中的其它黃酮醇葡萄糖甙也產(chǎn)生了 DP-IV抑制活性，并 加強(qiáng)了番石榴甙的作用。(c)以番石榴甙內(nèi)容物為基礎(chǔ)，番石榴提取物表現(xiàn)出強(qiáng)于純番石榴甙50%的作 用，支持了全部黃酮醇糖甙的協(xié)同作用的活性。(d)該DP-IV抑制活性顯示出存在于黃酮醇糖甙部分。在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，該番石榴提取物(Ig含有65. 7mg番石榴甙)被稀釋至含有 180 μ g番石榴甙/mL測(cè)試分析溶液，用于DP-IV測(cè)試。番石榴甙(標(biāo)準(zhǔn)品)的這個(gè)濃度顯 示出，在選定的測(cè)試條件下，抑制了 50%的DP-IV。提取物在這個(gè)濃度(2. 7mg/mL測(cè)試分析溶液)下的測(cè)試產(chǎn)生了 73. 2%的抑制，表 明該提取物含有除番石榴甙之外的協(xié)同作用化合物。以這些結(jié)果為基礎(chǔ)，含有主要槲皮素相關(guān)糖甙的色譜餾分，以制備規(guī)模進(jìn)行精餾。 含有主要槲皮素相關(guān)糖甙的被收集的部分，被真空(旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器)濃縮，并被調(diào)至等同于大 約相同數(shù)量的槲皮素相關(guān)糖甙，作為起始提取物。當(dāng)槲皮素相關(guān)糖甙的純化部分以其存在 于番石榴提取物中的相同濃度被提交時(shí)，DP-IV的抑制結(jié)果通過(guò)計(jì)算為72. 5%。
該黃酮醇糖甙通過(guò)制備色譜被分離。在收集含有單獨(dú)黃酮醇糖甙部分之后，每 個(gè)部分被蒸發(fā)至干燥。收集干燥殘余物并通過(guò)色譜法檢驗(yàn)純度。每個(gè)單獨(dú)黃酮醇糖甙在 100-500 μ g黃酮醇糖甙/mL濃度之間，被提交DP-IV測(cè)試。根據(jù)測(cè)試結(jié)果，以下估算了對(duì)應(yīng)DP-IV的50%抑制的濃度。 雖然本發(fā)明已經(jīng)以優(yōu)選實(shí)施例為基準(zhǔn)進(jìn)行了描述，但是本領(lǐng)技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到產(chǎn) 生于形式和細(xì)節(jié)上的變化并不離開(kāi)本發(fā)明的主旨和范圍。本說(shuō)明書(shū)自始至終引用的所有參 考資料，包括背景技術(shù)中的那些參考資料，均以其完整形式合并于此。通過(guò)只是運(yùn)用常規(guī)試驗(yàn)方法，那些本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，或能夠探知很多等 同于本發(fā)明于此明確描述的具體的實(shí)施例的內(nèi)容。這些等同方案被規(guī)定包含于下述權(quán)利要 求書(shū)的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
一種含有槲皮素相關(guān)的黃酮醇糖甙的經(jīng)分離的番石榴提取物，含有槲皮素-3-阿拉伯葡萄糖甙與番石榴甙。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)分離的番石榴提取物，進(jìn)一步包含異槲皮素。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)分離的番石榴提取物，其中倍半萜烯和丹寧被實(shí)質(zhì)上去除。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的經(jīng)分離的番石榴提取物，其中所述提取物中的倍半萜烯和丹寧小于5%重量份。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的經(jīng)分離的番石榴提取物，其中所述提取物中的倍半萜烯和丹寧小于重量份。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)分離的番石榴提取物，其中所述的提取物包含至少30%重 量份的槲皮素相關(guān)的黃酮醇糖甙。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的經(jīng)分離的番石榴提取物，其中倍半萜烯和丹寧被實(shí)質(zhì)上去除。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的經(jīng)分離的番石榴提取物，其中所述提取物中的倍半萜烯和丹寧小于5%重量份。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的經(jīng)分離的番石榴提取物，其中所述提取物中的倍半萜烯和丹寧小于重量份
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的經(jīng)分離的番石榴提取物，其中所述的提取物包含至少30% 重量份的槲皮素相關(guān)的黃酮醇糖甙。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)分離的番石榴提取物，進(jìn)一步包含槲皮素己糖甙，甲基槲 皮素己糖甙，異槲皮素甙，桑色素戊糖甙，或者槲皮素戊糖甙中的至少一種。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的經(jīng)分離的番石榴提取物，其中倍半萜烯和丹寧被實(shí)質(zhì)上去除。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的經(jīng)分離的番石榴提取物，其中所述提取物中的倍半萜烯和丹寧小于5%重量份。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的經(jīng)分離的番石榴提取物，其中所述提取物中的倍半萜烯和丹寧小于重量份。
15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的經(jīng)分離的番石榴提取物，其中所述的提取物包含至少30% 重量份的槲皮素相關(guān)的黃酮醇糖甙。
16.根據(jù)權(quán)利要求2所述的經(jīng)分離的番石榴提取物，進(jìn)一步包含槲皮素己糖甙，甲基槲 皮素己糖甙，異槲皮素甙，桑色素戊糖甙，或者槲皮素戊糖甙中的至少一種。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的經(jīng)分離的番石榴提取物，其中倍半萜烯和丹寧被實(shí)質(zhì)上去除。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的經(jīng)分離的番石榴提取物，其中所述提取物中的倍半萜烯和丹寧小于5%重量份。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的經(jīng)分離的番石榴提取物，其中所述提取物中的倍半萜烯和丹寧小于重量份。
20.根據(jù)權(quán)利要求16所述的經(jīng)分離的番石榴提取物，其中所述的提取物包含至少30%重量份的槲皮素相關(guān)的黃酮醇糖甙。
21.根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)分離的番石榴提取物，其具有DP-IV抑制活性或抑制與 DP-IV相似的酶活性。
22.經(jīng)分離的番石榴提取物的制備方法，包含在升高溫度條件下用醇和水提取番石榴 葉和/或番石榴果實(shí)，以獲得粗提物；將粗提物減壓處理以生成含水濃縮物；將濃縮物離心 以分離固體物質(zhì)；將澄清液柱層析并用水繼之以醇洗提該柱，得到流出物；將流出物減壓 處理以生成第二個(gè)含水濃縮物；將該含水濃縮物通過(guò)聚酰胺樹(shù)脂以除去雜質(zhì)，然后用醇解 吸活性組分；減壓下濃縮該活性組分以生產(chǎn)所述的經(jīng)分離的提取物。
23.—種二肽基肽酶IV(DP-IV)抑制劑的制備方法，包含在升高溫度條件下用醇和水 提取番石榴葉和/或番石榴果實(shí)，以獲得粗提物；將粗提物減壓處理以生成含水濃縮物；將 濃縮物離心以分離固體物質(zhì)；將澄清液柱層析并用水繼之以醇洗提該柱，得到流出物；將 流出物減壓處理以生成第二個(gè)含水濃縮物；將該含水濃縮物通過(guò)聚酰胺樹(shù)脂以除去雜質(zhì)， 然后用醇解吸活性組分；減壓下濃縮該活性組分以生產(chǎn)所述的DP-IV抑制劑。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的DP-IV抑制劑，其具有DP-IV抑制活性或抑制與DP-IV相 似的酶活性。
25.一種制備具有抑制二肽基肽酶IV活性的番石榴提取物的方法，包含這些步驟在 升高溫度條件下用醇和水接觸由番石榴葉和/或番石榴果實(shí)構(gòu)成的番石榴原料，以獲得粗 提物；將粗提物減壓處理以生成含水濃縮物；將濃縮物離心以分離固體物質(zhì)；將澄清液柱 層析并用水繼之以醇洗提該柱，得到流出物；將流出物減壓處理以生成第二個(gè)含水濃縮物； 將該含水濃縮物通過(guò)聚酰胺樹(shù)脂以除去雜質(zhì)，然后用醇解吸活性組分；減壓下濃縮該活性 組分以生成一種濃縮物。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其所述的番石榴原料是來(lái)源于選自Psidium cattleianum，Psidiumcattleianum ssp. Lucidum, Psidium guajava，Psidium guineense， Psidium littorale，Psidium molle or Psidiumschiedeanum 的一禾中植物。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述的疏水柱由交聯(lián)聚苯乙烯/二乙烯基苯共 聚物構(gòu)成。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的濃縮物通過(guò)薄膜過(guò)濾做進(jìn)一步處理。
29.一種治療葡萄糖代謝紊亂，糖尿病，肥胖，動(dòng)脈硬化，降低低密度脂蛋白膽固醇，或 解除與女性月經(jīng)有關(guān)的疾病或癥狀的方法，包括給需要的個(gè)體服用治療有效量的權(quán)利要求 1所述的組合物的步驟，以使所述的疾病或癥狀得到治療。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其所述組合物進(jìn)一步包含異槲皮素，槲皮素己糖甙， 甲基槲皮素己糖甙，桑色素戊糖甙，或槲皮素戊糖甙中的一種或多種。
31.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中倍半萜烯和丹寧從提取物中被實(shí)質(zhì)上去除。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述提取物中的倍半萜烯和丹寧小于5%重量份。
33.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中倍半萜烯和丹寧從提取物中被實(shí)質(zhì)上去除。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述提取物中的倍半萜烯和丹寧小于5%重量份。
全文摘要
本發(fā)明描述了番石榴果實(shí)的提取物的制備、分離和應(yīng)用，其用于治療與二肽基肽酶IV有關(guān)、由二肽基肽酶IV產(chǎn)生或介導(dǎo)的疾病或癥狀。
文檔編號(hào)A61P3/10GK101883575SQ200880013754
公開(kāi)日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2008年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月27日
發(fā)明者托馬斯·愛(ài)丁伯格 申請(qǐng)人:歐博康有限公司