專利名稱：：免疫球蛋白變體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及抗-CD20抗體及其在治療B細(xì)胞相關(guān)疾病中的用途。
背景技術(shù)：
：淋巴細(xì)胞是白細(xì)胞的幾個(gè)群體之一；它們特異性地識(shí)別和對(duì)外部抗原作出反應(yīng)。淋巴細(xì)胞的三種主要類別是B淋巴細(xì)胞(B細(xì)胞)、T淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞)與自然殺傷(NK)細(xì)胞。B淋巴細(xì)胞是負(fù)責(zé)抗體產(chǎn)生與提供體液免疫的細(xì)胞。B細(xì)胞在骨髓內(nèi)部成熟并離開(kāi)骨髓，在它們的細(xì)胞表面表達(dá)與抗原結(jié)合的抗體。當(dāng)幼稚B細(xì)胞首次遇到其膜-結(jié)合抗體所特異的抗原時(shí)，細(xì)胞開(kāi)始迅速分裂，其后代分化成記憶B細(xì)胞與被稱為"漿細(xì)胞"的效應(yīng)細(xì)胞。記憶B細(xì)胞具有較長(zhǎng)壽命期限，并且繼續(xù)表達(dá)與最初的母細(xì)胞具有相同特異性的膜結(jié)合抗體。漿細(xì)胞不產(chǎn)生膜結(jié)合抗體，但是相反產(chǎn)生分泌形式的抗體。分泌的抗體是體液免疫的主要效應(yīng)物。CD20抗原(也被稱作人B淋巴細(xì)胞限制的分化抗原，Bp35)是位于前-B與成熟B淋巴細(xì)胞上的疏水跨膜蛋白質(zhì)，具有分子量大約35kD。/所o/.CTzew.264(19):11282-11287G989);與EinfeWda/.7(3):711-717(1988))。該抗原也在超過(guò)90%的B細(xì)胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)上表達(dá)萬(wàn)/oM63(6):1424-1433(1984))，但是在造血干細(xì)胞、原B細(xì)胞、正常漿細(xì)胞或者其它正常組織中沒(méi)有找到(Tedderd//ww""o/.135(2):973-979(1985))。CD20被認(rèn)為調(diào)節(jié)細(xì)胞周期起始與分化的激活過(guò)程中的一個(gè)早期步驟。(Tedderdfl/"，并且可能作為4丐離子通道發(fā)揮作用(Tedderda/.JCW/.所。c/z亂14D:195(1990))。由于CD20在B細(xì)胞淋巴瘤中的表達(dá)，這一抗原已被用作治療該淋巴瘤的有用的治療靶向。在美國(guó)有超過(guò)300,000人患有B細(xì)胞NHL，每年有超過(guò)56，000個(gè)新病例被診斷。例如，rituximab(RITUXAN)抗體被用來(lái)治療具有復(fù)發(fā)或難治療的低級(jí)或者濾泡的、CD20陽(yáng)性的B細(xì)胞非何杰金氏淋巴瘤，該抗體是遺傳改造的針對(duì)人CD20抗原的嵌合鼠/人單克隆抗體(可從Genentech,Inc.SouthSanFrancisco,California,U.S.購(gòu)得)。Rituximab是在1998年4月7日發(fā)布的美國(guó)專利號(hào)5，736，137(Andersonetal.)與在美國(guó)專利號(hào)5，776，456中被稱做"C2B8"的抗體。體外作用機(jī)理研究顯示RITUXAN與人補(bǔ)體結(jié)合，并且通過(guò)補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性(CDC)溶解淋巴樣B細(xì)胞系Blood83(2):435-445(1994))。另外，它在對(duì)抗體依賴的細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)的分析中具有顯著活性。體內(nèi)臨床前研究表明RITUXAN⑧消減來(lái)自獼猴周圍血液、淋巴結(jié)與骨髓的B細(xì)胞，推測(cè)是通過(guò)補(bǔ)體與細(xì)胞介導(dǎo)的過(guò)程83(2):435-445(1994))。其它指示NHL治療的抗CD20抗體包括鼠抗體ZevalinTM，其與放射性同位素釔90連接(IDECPharmaceuticals,SanDiego，CA)，和Bexxar,其是與I131偶聯(lián)的另一個(gè)完全的鼠的抗體(Corixa，WA)。鼠抗體在人類治療中的使用的一個(gè)主要限制之處在于人抗小鼠抗體(HAMA)反應(yīng)(參見(jiàn)，l列i口Miller,R.A.etal."MonoclonalantibodytherapeutictrialsinsevenpatientswithT-celllymphoma"Blood,62:988-995，1983;和Schroff,R.W"etal."Humananti-murineimmunoglobulinresponseinpatientsreceivingmonoclonalantibodytherapy"CancerRes.，45:879-885,1985)。艮卩4吏嚙齒類動(dòng)物抗體的可變(V)結(jié)構(gòu)域與人恒定(C)區(qū)域融合的嵌合分子仍然能引發(fā)顯著的免疫反應(yīng)(HACA,人抗嵌合抗體)Nature(Lond.)，314:268-270,1985)?？朔趩慰寺】贵w的臨床利用中的這些限制的一個(gè)有效手段是"人源化，，鼠抗體或者來(lái)自非人物種的抗體。(Jones^a/.Nature(Lond),321:522-525:1986;RiechmanNature(Lond),332:323-327,1988)。因此，生產(chǎn)針對(duì)CD20抗原的治療抗體是有利的，該抗體當(dāng)給藥給病人、特別是用于長(zhǎng)期治療時(shí)產(chǎn)生最低的或沒(méi)有抗原性。本發(fā)明滿足這一及其它需求。本發(fā)明提供克服目前治療性組合物限制性的抗CD20抗體，以及提供額外的好處，這些好處將從下面的詳細(xì)說(shuō)明中加以明了。發(fā)明概述本發(fā)明提供CD20結(jié)合抗體或其功能性片段，以及其在治療B細(xì)胞相關(guān)疾病中的用途。這些抗體是單克隆抗體。在特定的實(shí)施方式中，結(jié)合CD20的抗體是人源化的或者嵌合的。人源化的2H7變體包括在FR中具有氨基酸取代的變體，以及在移植的CDR中具有改變的親和力成熟變體。在CDR或者FR中取代的氨基酸不局限于在供體或者受體抗體中存在的那些氨基酸。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗-CD20抗體更進(jìn)一步地包含F(xiàn)c區(qū)域的氨基酸殘基改變，這些改變導(dǎo)致效應(yīng)子功能改善，包括增強(qiáng)CDC和/或ADCC功能與B細(xì)胞殺傷(在此也稱為B細(xì)胞耗盡)。本發(fā)明的其它抗-CD20抗體包括那些具有能改善穩(wěn)定性的改變的抗體。在一個(gè)特殊的具體實(shí)施方式中，穩(wěn)定性增加的人源化2H7變體在下面實(shí)施例6中加以描述。還提供在體內(nèi)具有改善的ADCC功能的巖藻糖缺陷的變體。在一個(gè)實(shí)施方式中，嵌合抗CD20抗體具有鼠可變區(qū)與人恒定區(qū)。一個(gè)像這樣的特殊嵌合抗CD20抗體是Rituxan(Rituximab;Genentech,Inc.)。在本發(fā)明的所有抗體組合物和使用方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，人源化的CD20結(jié)合抗體是2H7.vl6,具有分別如圖6和圖7所示的SEQIDNO.21和22的輕與重鏈氨基酸序列。當(dāng)提及在圖6、7和8中的多肽序列時(shí)，應(yīng)該理解，形成分泌信號(hào)序列的前19個(gè)左右氨基酸在成熟多肽中不存在。除了在說(shuō)明書中指示的氨基酸取代位置之外，基于version16的所有其它變體的可變區(qū)將具有v16的氨基酸序列。除非另外指明，2H7變體將具有與vl6相同的輕鏈。本發(fā)明提供與人CD20結(jié)合的人源化抗體或者其抗原結(jié)合片段，其中抗體對(duì)體內(nèi)消減靈長(zhǎng)類動(dòng)物B細(xì)胞是有效的，該抗體在H鏈可變區(qū)(VH)包含至少來(lái)自抗人CD20抗體的SEQIDNO.12的CDR3序列、和人重鏈亞群(subgroup)ni(VHlII)的基本上(substantially)的人共有框架(FR)殘基。在一個(gè)實(shí)施方式中，靈長(zhǎng)類動(dòng)物B細(xì)胞來(lái)自于人和獼猴。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體更進(jìn)一步包含SEQIDNO.10的H鏈CDR1序列與SEQIDNO.11的CDR2序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，前述抗體包含SEQIDNO.4的L鏈CDR1序列、SEQIDNO.5的CDR2序列、SEQIDNO.6的CDR3序列，具有人輕鏈K亞群I(VKl)的實(shí)質(zhì)上人共有框架(FR)殘基。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，Vl的FR區(qū)域在位置46具有供體抗體殘基；在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，Vl的FR2具有l(wèi)euL46pro的氛基酸取代(在人kI共有序列中的Leu換成在m2H7相應(yīng)位置存在的pro)。VH區(qū)域更進(jìn)一步在框架的至少氨基酸位置49、71與73上包含供體抗體殘基。在一個(gè)實(shí)施方式中，在Vh中，人重鏈亞群m的以下FR位置被取代FR2中的AlaH49Gly;FR3中的ArgH71Val與AsnH73Lys。在其它實(shí)施方式中，人源化抗體的CDR區(qū)域更進(jìn)一步包含氨基酸取代，其中殘基既不來(lái)自供體抗體也不來(lái)自受體抗體。前述實(shí)施方式的抗體可以包含v16的SEQIDNO8的Vh序列，如圖1B所示。在前面的更進(jìn)一步的實(shí)施方式中，抗體更進(jìn)一步包含v16的SEQIDN02的Vl序列，如圖1A所示。在其它實(shí)施方式中，人源化抗體是2H7.v31,具有SEQIDNO.21與23的輕與重鏈氨基酸序歹!J,分別如圖6與圖8所示；具有如圖8所示SEQIDNO.23的重鏈氨基酸序列的2H7.v31;具有v16的H鏈的D56A與N100A與L鏈的S92A的氨基酸取代的2H7.v96。在分開(kāi)的實(shí)施方式中，任何前述實(shí)施方式中的抗體更進(jìn)一步包含在Fc區(qū)域中的至少一個(gè)氨基酸取代，該取代與衍生它的原始或者親本抗體相比改善了ADCC和/或CDC活性，在大多數(shù)場(chǎng)合下被比較的親本抗體是v.16，在其它情況下是Rituxan。具有改善活性的一個(gè)象這樣的抗體在Fc區(qū)域包含S298A/E333A/K334A的三重丙氨酸取代。具有S298A/E333A/K334A取代的一個(gè)抗體是具有SEQIDNO.23的重鏈氨基酸序列的2H7.v31。同Rituxan比較起來(lái)抗體2H7.vl14與2H7.vl15顯示ADCC活性改善至少10倍。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抗體更進(jìn)一步包含在Fc區(qū)域的至少一個(gè)氨基酸取代，該取代同衍生它的親本抗體比較起來(lái)CDC活性降低，衍生它的親本抗體在大多數(shù)情況下是v16。同v16比較起來(lái)CDC活性降低的一個(gè)象這樣的抗體包含在H鏈中的至少K322A取代。ADCC與CDC活性的比較可以如實(shí)施例中所描述的進(jìn)行分析。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體是全長(zhǎng)抗體，其中Vh區(qū)域連接至人IgG重鏈恒定區(qū)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，IgG是人IgGl或者IgG3。在一個(gè)實(shí)施方式中，CD20結(jié)合抗體結(jié)合至細(xì)胞毒性劑。在優(yōu)選實(shí)施方式中，該細(xì)胞毒性劑是毒素或者放射性同位素。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的用于治療或者診斷用途的抗體在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生。還提供一種組合物，該組合物包含前述實(shí)施方式中的任何一個(gè)的抗體，以及載體。在一個(gè)實(shí)施方式中，載體是藥學(xué)上可以接受的載體。這些組合物可以以制品或者試劑盒提供。本發(fā)明也提供液體制劑，包含20mg/mL抗體的人源化2H7抗體，10mM硫酸組氨酸pH5.8,60mg/mL蔗糖(6%),0.2mg/mL聚山梨酸酯20(0.02%)。本發(fā)明也提供分離的核酸，該核酸編碼在此所披露的抗體中的任何一種，包括表達(dá)抗體的表達(dá)載體。本發(fā)明的另一個(gè)方面是包含前述核酸的宿主細(xì)胞與產(chǎn)生該抗體的宿主細(xì)胞。在后者的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞。提供了產(chǎn)生這些抗體的方法，該方法包含培養(yǎng)產(chǎn)生抗體的宿主細(xì)胞，并且從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收抗體。本發(fā)明的另一方面是一種制品，包括一個(gè)容器與包含在其中的組合物，其中組合物包含前述實(shí)施方式中的任何一個(gè)的抗體。為用來(lái)治療NHL,該制品更進(jìn)一步包含包裝說(shuō)明書，指示該組合物被用來(lái)治療非何杰金氏淋巴瘤。本發(fā)明的更進(jìn)一步的方面是體內(nèi)在B細(xì)胞中誘發(fā)程序性細(xì)胞死亡的方法，包含將B細(xì)胞與前述中的任何的抗體接觸，從而殺死B細(xì)胞。本發(fā)明也提供治療在此所披露的疾病的方法，該方法通過(guò)將CD20結(jié)合抗體或者其功能性片段給藥哺乳動(dòng)物，例如患該疾病的人類病人，而治療該疾病。在任何治療自身免疫病或者CD20陽(yáng)性癌癥的方法中，在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體是2H7.v16，分別具有SEQIDNO.21與22的輕與重鏈氨基酸序列，如圖6與圖7所示。因此，一個(gè)實(shí)施方式是治療CD20陽(yáng)性癌癥的方法，包含給予患該癌癥的病人治療有效量的本發(fā)明的人源化CD20結(jié)合抗體。在優(yōu)選實(shí)施方式中，CD20陽(yáng)性癌癥是B細(xì)胞淋巴瘤或者白血病包括非何杰金氏淋巴瘤(NHL)或者淋巴細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)的何杰金氏病(LPHD)、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)或者SLL。在治療B細(xì)胞淋巴瘤或者白血病的方法的實(shí)施方式中，抗體以劑量范圍大約275-375mg/n^給藥。在其它的實(shí)施方式中，治療方法更進(jìn)一步包含給予病人至少一種化療劑，在其中對(duì)于非何杰金氏淋巴瘤(NHL)而言，化療劑選自由阿霉素、環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春新堿與氫化潑尼^Kprednisolone)組成的組。也提供治療自身免疫病的方法，包含給予病人治療有效量的前述權(quán)利要求中任何一個(gè)的人源化CD20結(jié)合抗體，該病人患有自身免疫病。自身免疫病選自由下列組成的組類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、青少年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼^(SLE)、韋格內(nèi)氏病(Wegener'sdisease),炎癥性腸病、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板減少、多發(fā)性硬化、牛皮癬、IgA腎病、IgM多神經(jīng)病、重癥肌無(wú)力、血管炎、糖尿病、雷諾氏征(Reynaud，ssyndrome)、斯耶格侖氏綜合癥(sjorgen，ssyndrome)與腎小球腎炎。當(dāng)自身免疫病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎時(shí)，抗體可以與第二治療劑聯(lián)合給藥，該第二治療劑優(yōu)選地是氨曱喋呤。在這些治療方法中，CD20結(jié)合抗體可以單獨(dú)或者與第二治療劑結(jié)合給藥，第二治療劑例如第二抗體、或者化療劑或免疫抑制劑。第二抗體可以是結(jié)合CD20或者不同B細(xì)胞抗原、或者NK或T細(xì)胞抗原的抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，第二抗體是放射性同位素標(biāo)記的抗CD20抗體。在其它實(shí)施方式中，CD20結(jié)合抗體偶聯(lián)至細(xì)胞毒性劑，包括毒素或者放射性同位素。在另一方面，本發(fā)明提供治療自身免疫病的方法，自身免疫病選自由皮肌炎(Dermatomyositis)、韋格內(nèi)氏肉芽腫病、ANCA、再生障礙性貧血、自身免疫性溶血性貧血(AIHA)、凝血因子VIII缺乏、曱型血友病、自身免疫性中性白細(xì)胞減少、Castleman's綜合癥、古德帕斯徹氏綜合癥(Goodpasture'ssyndrome)、實(shí)體器官移植排斥、移植物抗宿主疾病(GVhD)、IgM介導(dǎo)的神經(jīng)病、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、橋本氏曱狀腺炎(Hashimoto'sThyroiditis)、自身免疫性肝炎、淋巴組織間質(zhì)肺炎(HIV)、閉塞NSIP)、格-巴二氏綜合癥(Guillain-Barresyndrome)、大血管血管炎、巨細(xì)月包(高安氏)動(dòng)脈炎(giantcell(Takayasu，s)ateritis)、中等血管血管炎(mediumvesselvasculitis)、川崎病(Kawasaki'sDisease)、結(jié)節(jié)性多動(dòng)&:K炎(polyateritisnodosa),包含給予患該疾病的患者治療有效量的CD20結(jié)合抗體。在該方法的一個(gè)實(shí)施方式中，CD20結(jié)合抗體是Rituxar^。本發(fā)明還提供分離的核酸，包含獼猴(Cynomolgusmonkey)CD20的SEQIDNO.:24的核苷酸序歹ll(如圖19所示)，或該序列的簡(jiǎn)并變體。一個(gè)實(shí)施方式是分離的核酸，包含一序列，該序列編碼具有SEQIDNO.25(如圖20所示)的氨基酸序列的多肽，或具有保守性氨基酸取代的SEQIDNO.25(圖20)。另一個(gè)實(shí)施方式是包含前述核酸的載體，包括用來(lái)在宿主細(xì)胞表達(dá)的表達(dá)載體。也包括包含該載體的宿主細(xì)胞。還提供分離的多肽，該多肽包含獼猴CD20的氨基S吏序列(SEQIDNO.25;圖20)。本發(fā)明涉及1.一種與人CD20結(jié)合的人源化抗體或者其抗原結(jié)合片段，其中抗體對(duì)體內(nèi)削減靈長(zhǎng)類動(dòng)物B細(xì)胞是有效的，該抗體在重鏈可變區(qū)(VH)至少包含來(lái)自抗人CD20抗體的SEQIDNO.12的CDR3序列、和人重鏈亞群III(VhIII)的基本上的人共有框架(FR)殘基。2.項(xiàng)1的抗體，所述抗體進(jìn)一步包含SEQIDNO.10的重鏈CDR1序列和SEQIDNO.11的CDR2序列3.項(xiàng)2的抗體，進(jìn)一步包含SEQIDN0.4的輕鏈CDR1序列、SEQIDNO.5的CDR2序列、SEQIDNO.6的CDR3序列、和人輕鏈k亞群I(VkI)的基本上的人共有框架(FR)殘基。4.前述項(xiàng)的抗體，包含SEQIDNO,8的Vh序歹'J(V16,如圖1B所示)。5.項(xiàng)4的抗體，進(jìn)一步包含SEQIDN0.2的V^序列(V16，如圖1A所示)。6.項(xiàng)3的抗體，其中VH區(qū)域連接至人IgG鏈恒定區(qū)。7.項(xiàng)6的抗體，其中人IgG是IgGl或lgG3。8.項(xiàng)1的抗體，其中抗體是具有分別為SEQIDNO.21和22的輕鏈與重鏈氨基酸序列的2H7.vl6。9.項(xiàng)1的抗體，其中抗體是具有分別為SEQIDN0.21和23的輕鏈與重鏈氨基酸序列的2H7.v31。10.項(xiàng)5的抗體，但是具有重鏈中D56A和N100A、以及輕鏈中S92A的氨基酸取代(v.96)。11.前述項(xiàng)中任一項(xiàng)的抗體，進(jìn)一步包含在Fc區(qū)域中的至少一個(gè)氨基酸取代，所述取代增進(jìn)ADCC和/或CDC活性。12.項(xiàng)11的抗體，其中氨基酸取代是S298A/E333A/K334A。13.項(xiàng)12的抗體，其中抗體是具有SEQIDN0.23的重鏈氨基酸序列的2H7.v31(如圖8所示)。14.項(xiàng)1-10中任一項(xiàng)的抗體，進(jìn)一步包含在Fc區(qū)域中的至少一個(gè)氨基酸取代，所述取代降低CDC活性。15.項(xiàng)14的抗體，至少包含取代K322A。16.項(xiàng)1-10任一項(xiàng)的抗體，其中抗體是2H7.vll4或2H7.vl15，所述抗體同Rituxan比較ADCC活性改善至少10倍。17.項(xiàng)1的抗體，其中靈長(zhǎng)類動(dòng)物B細(xì)胞來(lái)自于人類和獼猴。18.前述項(xiàng)中任一項(xiàng)的抗體，該抗體偶聯(lián)至細(xì)胞毒藥劑。19.項(xiàng)18的抗體，其中細(xì)胞毒藥劑是放射性同位素或毒素。20.前述項(xiàng)中任一項(xiàng)的抗體，所述抗體在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生。21.—種分離的核酸，其編碼前述項(xiàng)中任一項(xiàng)的抗體。22.—種表達(dá)載體，其編碼前述項(xiàng)中任一項(xiàng)的抗體。23.—種宿主細(xì)胞，其包含項(xiàng)21的核酸。24.項(xiàng)23的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生前述項(xiàng)中任一項(xiàng)的抗體。25.項(xiàng)24的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞。26.生產(chǎn)前述項(xiàng)中任一項(xiàng)的抗體的方法，包含培養(yǎng)生產(chǎn)項(xiàng)24的抗體的細(xì)胞，并從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收抗體。27.—種組合物，包含項(xiàng)1的抗體和載體。28.項(xiàng)27的組合物，其中抗體是2H7.vl6,并且載體是藥學(xué)上可接受的載體。29.—種制品，包含一種容器和包含在其中的組合物，其中該組合物包含前述項(xiàng)中任一項(xiàng)的抗體。30.項(xiàng)29的制品，進(jìn)一步包含包裝說(shuō)明書，所述包裝說(shuō)明書指示該組合物可用于治療非何杰金氏淋巴瘤。31.—種體內(nèi)在B細(xì)胞中誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的方法，包含將B細(xì)胞與前述項(xiàng)中任一項(xiàng)的抗體接觸，從而殺死B細(xì)胞。32.—種治療CD20陽(yáng)性癌癥的方法，包含^^予患該癌癥的病人治療有效量的前述項(xiàng)中任一項(xiàng)的人源化CD20結(jié)合抗體。33.項(xiàng)32的方法，其中CD20陽(yáng)性癌癥是B細(xì)胞淋巴瘤或白血病。34.項(xiàng)33的方法，其中CD20陽(yáng)性癌癥是非何杰金氏淋巴瘤(NHL)或淋巴細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)的何杰金氏病(LPHD)。35.項(xiàng)32的方法，其中癌癥是慢性淋巴細(xì)胞性白血病或SLL。36.項(xiàng)34或35的方法，其中抗體選自2H7.vl6、v31.v96、vll4或v115，所述抗體具有附圖和表中所示的各自氨基酸序列。37.項(xiàng)34或35的抗體，其中抗體是具有分別為圖6和圖7所示SEQIDN0.21和22的輕鏈與重鏈氨基酸序列的2H7.vl6。38.項(xiàng)33的方法，其中抗體以大約275-375mg/m2的劑量范圍給藥。39.項(xiàng)32的方法，進(jìn)一步包含給予病人至少一種化療劑。40.項(xiàng)39的方法，其中癌癥是非何杰金氏淋巴瘤(NHL)，并且化療劑選自阿霉素、環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春新堿或氫化潑尼松。41.一種治療自身免疫病的方法，包含給予患該自身免疫病的病人治療有效量的前述項(xiàng)中任何一項(xiàng)的人源化CD20結(jié)合抗體。42.項(xiàng)41的方法，其中該自身免疫病選自由下列疾病組成的組類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、青少年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、韋格內(nèi)氏病、炎癥性腸病、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板減少、多發(fā)性硬化、牛皮癬、IgA腎病、IgM多神經(jīng)病、重癥肌無(wú)力、血管炎、糖尿病、雷諾氏癥、斯耶格侖氏綜合癥與腎小球腎炎。43.項(xiàng)42的方法，其中自身免疫病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。44.項(xiàng)43的方法，進(jìn)一步包含給予病人第二種治療劑。45.項(xiàng)44的方法，其中第二種治療劑是免疫抑制劑。46.項(xiàng)45的方法，其中免疫抑制劑是氨曱喋呤。47.—種治療選自由下列組成的組中的自身免疫病的方法，包含給予患該疾病的患者治療有效量的CD20結(jié)合抗體或其功能性片段皮肌炎、韋格內(nèi)氏肉芽胂病、ANCA(包括在血管炎下的)、再生障礙性貧血、自身免疫性溶血性貧血(AIHA)、凝血因子VIII缺乏、曱型血友病、自身免疫性中性白細(xì)胞減少、Castleman氏綜合癥、古德帕斯徹氏綜合癥、實(shí)體器官移植排斥、移植物抗宿主疾病(GVhD)、IgM介導(dǎo)的血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、橋本氏曱狀腺炎、自身免疫性肝炎、淋巴間質(zhì)肺炎(HIV)、閉塞性細(xì)支氣管炎(非移植)對(duì)應(yīng)的NSIP、格-巴二氏綜合癥、大血管血管炎、巨細(xì)胞(高安氏)動(dòng)脈炎、中等血管血管炎、川崎病和結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎。48.項(xiàng)47的方法，其中CD20結(jié)合抗體是Rituxan。49.一種分離的核酸，所述核酸包含獼猴CD20的SEQIDNO.:24的核苷酸序列(如圖19所示)，或這一序列的簡(jiǎn)并性變體。50.—種分離的核酸，所述核酸包含編碼具有SEQIDNO,25(如圖20所示)、或帶有保守氨基酸取代的SEQIDNO.25(如圖20所示)的氨基酸序列的多肽。51.—種載體，包含項(xiàng)50的核酸。52.項(xiàng)51的載體，其為表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含與表達(dá)調(diào)控序列可操作連接的項(xiàng)49的核酸。53.—種宿主細(xì)^I包，包含項(xiàng)50的核酸。54.—種分離的多肽，包含獼猴CD20的SEQIDNO.25的氨基酸序列(如圖20所示)。55.—種液體制劑，包含20mg/mL的人源化2H7抗體、10mM組氨酸硫酸酯pH5.8、60mg/mL蔗糖、0.2mg/mL聚山梨酸酯20。圖1A是序列比對(duì)，比較小鼠2H7(SEQIDNO.1)、人源化2H7.vl6變體(SEQIDN0.2)、和人k輕鏈亞群I(SEQIDNO.3)中每一個(gè)的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)的氨基酸序列。2H7和hu2H7.vl6的Vl的CDR如下CDR1(SEQIDNO,4)、CDR2(SEQIDNO,5)、與CDR3(SEQIDNO.6)。圖1B是序列比對(duì)，比校如下來(lái)源的Vh序列鼠2H7(SEQIDNO,7)、人源化2H7.vl6變體(SEQIDN0.8)、和重鏈亞群III的人共有序列(SEQIDNO,9)。2H7和hu2H7.v16的VH的CDR如下CDRl(SEQIDNO.IO)、CDR2(SEQIDN0.11)、與CDR3(SEQIDNO.12)。在圖1A與圖IB中，每一鏈的CDR1、CDR2與CDR3用括號(hào)圍起來(lái)，其兩側(cè)為框架區(qū)FR1-FR4,如圖中所指示。2H7指鼠2H7抗體。兩行序列之間的星號(hào)表示在兩序列之間不同的位置。殘基編號(hào)根據(jù)Kabatetal.，SequencesofImmunologicalInterest.5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1991),插入物用a、b、c、d、與e表示。圖2A-E顯示用來(lái)構(gòu)建2H7Fab質(zhì)粒的噬菌粒pVX4的序列(SEQIDNO,13)以及CDR移植的抗IFN-ot人源化抗體的Fab的輕鏈(SEQIDNO.14)與重鏈(SEQIDNO.15)的氨基酸序列。圖3A-E顯示編碼嵌合2H7.v6.8Fab的表達(dá)質(zhì)粒的序列(SEQIDNO.16)。顯示輕鏈(SEQIDNO.17)與重鏈(SEQIDNO.18)的氨基酸序列。圖4A-B顯示如實(shí)施例1中所描述的用于表達(dá)免疫球蛋白輕鏈的質(zhì)粒pDRl的序列(SEQIDN019;5391bp)。pDRl包含編碼一無(wú)關(guān)抗體、人源化抗CD3抗體的輕鏈(Shalabyetal.,J.Exp.Med.175:217-225(1992))的序列，其起始和終止密碼子以粗體和下劃線指示。圖5A-B顯示如實(shí)施例1中描寫的用于表達(dá)免疫球蛋白重鏈的質(zhì)粒pDR2的序列(SEQIDNO.20;6135bp)。pDR2包含一編碼無(wú)關(guān)抗體、人源化抗CD3抗體的重鏈的序列(Shalabyetal.，上文)，其起始和終止密碼子以粗體與下劃線指示。圖6顯示2H7.vl6完整輕鏈的氨基酸序列(SEQIDN0.21)。DIQ以前的前19個(gè)氨基酸是在成熟多肽鏈中不存在的分泌性信號(hào)序列。圖7顯示2H7.vl6完整重鏈的氨基酸序列(SEQIDN0.22)。EVQ以前的前19個(gè)氨基酸是在成熟多肽鏈中不存在的分泌性信號(hào)序列。將圖1B的Vh序列(SEQIDNO.8)與完整重鏈序列比對(duì)，人yl恒定區(qū)來(lái)自于SEQIDNO.22中的氨基酸位置114-471。圖8顯示2H7.v31完整重鏈的氨基酸序列(SEQIDNO,23)。EVQ以前的前19個(gè)氨基酸是在成熟多肽鏈中不存在的分泌性信號(hào)序列。輕鏈與2H7.vl6相同(參見(jiàn)圖6)。圖9顯示如實(shí)施例中所描述的2H7.vl6與2H7.v73IgG變體的相對(duì)穩(wěn)定性。分析結(jié)果校正至孵育前數(shù)值，以孵育后的剩余百分比報(bào)告。圖10是一流程圖，總結(jié)從鼠2H7至直到v75的人源化型式的亞群的氨基酸改變。圖11是在所有組(結(jié)合2H7研究與Rituxan研究)中平均絕對(duì)B細(xì)胞計(jì)數(shù)『03-/0040+]的總結(jié)，如實(shí)施例10中所描述。圖12顯示如在實(shí)施例11中所描述的在巖藻糖缺陷的2H7變體上代表性ADCC試驗(yàn)的結(jié)果。圖13顯示將膜聯(lián)蛋白V染色以抗體濃度的函數(shù)作圖的結(jié)果。在交聯(lián)第二抗體存在下，將Ramos細(xì)胞用無(wú)關(guān)IgGl對(duì)照抗體(Herceptin;圓形)、Rituximab(方形)、或者rhuMAb2H7.vl6(三角形)處理，用FACS分析。圖13-15在實(shí)施例13中加以描述。圖14顯示膜聯(lián)蛋白V與碘丙錠雙染色作為抗體濃度的函數(shù)作圖的結(jié)果。在交聯(lián)第二抗體存在下，將Ramos細(xì)胞用無(wú)關(guān)IgGl對(duì)照抗體(Herceptin⑧;圓形)、Rituximab(方形)、或者rhuMAb2H7.vl6(三角形)處理，用FACS分析。圖15顯示活的、未染色細(xì)胞計(jì)數(shù)(每10個(gè))作為抗體濃度的函數(shù)作圖。在交聯(lián)第二抗體存在下，將Ramos細(xì)胞用無(wú)關(guān)IgGl對(duì)照抗體(Herceptin⑧；圓形)、Rituximab(方形)、或者rhuMAb2HTvl6(三角形)處理，用FACS分析。圖16、17、18顯示如實(shí)施例14中所描述的在棵鼠中對(duì)Raji細(xì)胞腫瘤生長(zhǎng)的抑制。動(dòng)物用PBS(對(duì)照)或者用Rituxan⑧或rhuMAb2H7.vl6以5mg/kg(圖16)、0.5mg/kg(圖17)、或者0.05mg/kg(圖18)每周處理(如垂直箭頭指示的；！1=8只小鼠每組)，共6周。圖19顯示如實(shí)施例15中所描述的獼猴CD20的核苷酸(SEQIDNO.24)與氨基酸(SEQIDNO.25)序列。圖20顯示獼猴CD20的氨基酸序列(SEQIDN0.25)。與人CD20不同的殘基有下劃線，人殘基(SEQIDNO.26)直接在猴殘基下標(biāo)示。猴CD20的推定胞外結(jié)構(gòu)域以黑體字表示。圖21顯示如在實(shí)施例15中所描述的，表達(dá)CD20的獼猴細(xì)胞與hu2H7.v16、.v31與Rituxan的結(jié)合。分析抗體結(jié)合獼猴CD20并且取代FITC偶聯(lián)的鼠2H7與獼猴CD20結(jié)合的能力。圖22顯示類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎臨床試驗(yàn)階段I/II劑量漸增的方案。圖23顯示在CHO細(xì)胞中表達(dá)2H7.v16的載體。優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)說(shuō)明"CD20"抗原是一非糖基化的跨膜磷蛋白，具有分子量大約35kD,在來(lái)自外周血或淋巴器官的超過(guò)90%的B細(xì)胞的表面上發(fā)現(xiàn)。CD20在早期前B細(xì)胞發(fā)育期間表達(dá)，并且保持直到漿細(xì)胞分化。其在人干細(xì)胞、淋巴祖先細(xì)胞或者正常漿細(xì)胞上沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。CD20在正常B細(xì)胞以及惡性B細(xì)胞上存在。在文獻(xiàn)中CD20的其它名字包括"B淋巴細(xì)胞限制的分化抗原"和"Bp35"。CD20抗原在例如Clark與Ledbetter,Adv.Can.Res.52:81-149(1989)與Valentineetal.J.Biol.Chem.264(19):11282-112871989)中描述。術(shù)語(yǔ)"抗體，，以最寬泛的意義使用，并且特別地涵蓋單克隆抗體(包括全長(zhǎng)單克隆抗體)、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、與抗體片段，只要它們顯示出所需的生物活性或功能。抗體與人CD20的結(jié)合，更優(yōu)選與人及其它靈長(zhǎng)類動(dòng)物(包括獼猴、恒河猴、黑猩猩)CD20結(jié)合。抗體將以不高于lxlO-8的Kd值結(jié)合CD20，優(yōu)選地Kd值不高于大約lxl(T9，并且能體內(nèi)殺死或消減B細(xì)胞，優(yōu)選地當(dāng)與合適的負(fù)對(duì)照比較時(shí)殺死或者消減至少20°/。，所述負(fù)對(duì)照未用這樣的抗體處理。B細(xì)胞消減可以是ADCC、CDC、細(xì)胞程序死亡或者其它才幾制中一個(gè)或多個(gè)的結(jié)果。在這里的疾病治療的一些實(shí)施方式中，特定的效應(yīng)子功能或者機(jī)制與其它相比可能更需要，并且人源化2H7的某些變體對(duì)取得生物學(xué)功能例如ADCC是優(yōu)選的。"抗體片段，，包含全長(zhǎng)抗體的一部分，通常是其抗原結(jié)合或可變區(qū)。抗體片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2、與Fv片段；雙抗體；線狀抗體(linearantibody);單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體。"Fv"是包含完全抗原識(shí)別與結(jié)合部位的最小抗體片段。這個(gè)片段由一個(gè)重鏈與一個(gè)輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域以緊密、非共價(jià)聯(lián)合而形成的二聚物組成。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的折疊產(chǎn)生六個(gè)高變環(huán)(重鏈與輕鏈各三個(gè)環(huán))，提供抗原結(jié)合的氨基酸殘基并且賦予抗體抗原結(jié)合特異性。然而，即使單個(gè)的可變結(jié)構(gòu)域.(或者僅僅包含特定于抗原的三個(gè)CDR的Fv的一半)具有識(shí)別與結(jié)合抗原的能力，雖然親合力比整個(gè)結(jié)合部位低。術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"如在這里所使用的指獲得自實(shí)質(zhì)上均一的抗體群體的抗體，即構(gòu)成該群體的單獨(dú)抗體除了那些可能少量存在的自然發(fā)生的突變之外是同一的。單克隆抗體是高度特異性的，針對(duì)單一抗原位點(diǎn)。此外，與常規(guī)的(多克隆)抗體制備相反——所述常規(guī)抗體一般包括針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體——每個(gè)單克隆抗體針對(duì)抗原上的單一決定簇。修飾語(yǔ)"單克隆"指示抗體的特性為獲得自實(shí)質(zhì)上均一群體的抗體，不允許被解釋為要求經(jīng)過(guò)任何特定的方法生產(chǎn)抗體。例如，依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可能是通過(guò)Kohleretal.,Nature256:495(1975)首次描述的雜交瘤方法生產(chǎn)，或可通過(guò)重組DNA方法生產(chǎn)(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)4,816,567)。利用例如在Clacksonetal.,Nature352:624-628(1991)與Marksetal.,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)中描述的技術(shù)，"單克隆抗體，，也可以從噬菌體抗體文庫(kù)中分離。本發(fā)明的CD20結(jié)合抗體的"功能性片段"是這樣一些片段，其保有與其所衍生的完整全長(zhǎng)分子相比實(shí)質(zhì)上相同的親合力結(jié)合CD20的能力，并且在經(jīng)過(guò)例如在這里所描述的體外或體內(nèi)分析而進(jìn)行的測(cè)量中顯示生物活性，包4舌消減B細(xì)月包。術(shù)語(yǔ)"可變"指這一事實(shí)，即可變結(jié)構(gòu)域的某些片段在抗體序列中存在廣泛差別。V結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)抗原結(jié)合，并且定義特定的抗體對(duì)其特定抗原的特異性。然而，可變性在可變結(jié)構(gòu)域的110個(gè)氨基酸跨度內(nèi)不是均勻分布的。相反，可變區(qū)包括相對(duì)不變的幾段序列稱為框架區(qū)(FR)，為15-30氨基酸長(zhǎng)，其間被極端可變的較短區(qū)域分開(kāi)，稱為"高變區(qū)"，每個(gè)9-12氨基酸長(zhǎng)。天然重與輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域每個(gè)包含四個(gè)FR，基本上采取(3片層構(gòu)型，由三個(gè)高變區(qū)連接，高變區(qū)形成連接環(huán)，并且有時(shí)候形成P片層結(jié)構(gòu)的一部分。每個(gè)鏈的高變區(qū)由FR十分接近地維系在一起，并且與另一鏈的高變區(qū)一起參與抗體的抗原結(jié)合部位的形成(參見(jiàn)Kabatetal.,S叫uencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.1991))。恒定結(jié)構(gòu)域不直接涉及抗體與抗原的結(jié)合，但是顯示出各種效應(yīng)子功能，例如在抗體參與抗體依賴細(xì)胞細(xì)胞毒性(ADCC)中。術(shù)語(yǔ)"高變區(qū)"當(dāng)在這里使用時(shí)指抗體負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)通常包括來(lái)自"補(bǔ)體決定區(qū)"或"CDR"(例如Vl中大約殘基24-34(Ll)、50-56(L2)與89畫97(L3)周圍，與VH中大約31-35B(H1)、50-65(H2)與95畫102(H3)周圍(Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD,(1991))),禾口/或來(lái)自"高變環(huán)，，的殘基(例如Vl中殘基26-32(L1)、50-52(L2)與91-96(L3),與Vh中26-32(Hl)、52A-55(H2)與96-101(H3)(Chothia與Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。如在此所提到的，"共有序列，，或者共有V結(jié)構(gòu)域序列是人工序列，源自對(duì)已知人免疫球蛋白可變區(qū)序列的氨基酸序列的比較?；谶@些比較，制備編碼V結(jié)構(gòu)域氨基酸的重組核酸序列，該序列對(duì)于源自人和人H鏈亞群inv結(jié)構(gòu)域的序列是共有的。該共有v序列沒(méi)有任何已知抗體結(jié)合特異性或親合力。"嵌合抗體"(免疫球蛋白)重和/或輕鏈的一部分與來(lái)源于特定的物種或者屬于特定的抗體種類或者亞類的抗體的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的其余部分與來(lái)源于另一個(gè)物種或者屬于另一個(gè)抗體種類或者亞類的抗體的相應(yīng)序列相同或同源，只要它們顯示出該所需生物活性(美國(guó)專利號(hào)4，816,567;與Morrisonetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984))。在此所使用的人源化抗體是嵌合抗體的亞群。非人(例如，鼠的)抗體的"人源化，，形式是嵌合抗體，其包含來(lái)源于非人免疫球蛋白的最小序列。在極大程度上，人源化抗體是人免疫球蛋白(受者或受體抗體)，其中受者的高變區(qū)殘基被來(lái)自非人物種(供體抗體)例如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物的高變區(qū)殘基替代，該高變區(qū)殘基具有所需的特異性、親合力和能力。在有些情況下，人免疫球蛋白的Fv框架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人殘基替代。此外，人源化抗體可以包含受者抗體或供體抗體中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的殘基。這些修飾被用來(lái)更進(jìn)一步地改善抗體性能例如結(jié)合親合力。一般地，人源化抗體將基本上包含所有至少一個(gè)、并且典型地兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其中相當(dāng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)的所有或者基本上所有高變環(huán)、以及所有或者基本上所有FR區(qū)域是人免疫球蛋白序列的，雖然FR區(qū)域可以包括改善結(jié)合親合力的一或多個(gè)氨基酸取代。在FR中的這些氨基酸取代的數(shù)目在重鏈中典型地不超過(guò)6個(gè)，在輕鏈中不超過(guò)3個(gè)。人源化抗體任意地也包括免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫J求蛋白恒定區(qū)的至少一部分。詳細(xì)內(nèi)容參見(jiàn)Jonesetal.，Nature321:522-525(1986);Reichmannetal"Nature332:323-329(1988);與Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)?？贵w"效應(yīng)子功能"指可歸因于抗體Fc區(qū)域(天然序列Fc區(qū)域或者氨基酸序列變體Fc區(qū)域)的那些生物活性，并且隨抗體同種型而變化?？贵w效應(yīng)子功能的例子包括Clq結(jié)合與補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒；Fc受體結(jié)合；抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC);吞噬作用；細(xì)胞表面受體(例如B細(xì)胞受體)的下調(diào)；與B細(xì)胞活化。"抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，，或"ADCC"指一種細(xì)胞毒性形式，其中與存在于某些細(xì)胞毒細(xì)胞(例如自然殺傷(NK)細(xì)胞、嗜中性白細(xì)胞與巨噬細(xì)胞)上的Fc受體結(jié)合的分泌Ig使得這些細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞特定地與攜帶抗原的靶細(xì)胞結(jié)合，并且接著用細(xì)胞毒素殺死該靶細(xì)胞?？贵w"武裝"細(xì)胞毒細(xì)胞，并且對(duì)這樣的殺傷是絕對(duì)需要的。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞一NK細(xì)胞一僅僅表達(dá)FcyRin,而單核細(xì)胞表達(dá)FcYRI、FcyRII與FcyRIII。在造血細(xì)胞上的FcR表達(dá)在Ravetch與Kinet,Annu.Rev.Immunol9:457-92(1991)第464頁(yè)表3中概括。為評(píng)估目的分子的ADCC活性，可進(jìn)行體外ADCC試驗(yàn)，例如在美國(guó)專利號(hào)5，500,362或5,821,337中描述的。對(duì)這樣的試驗(yàn)有用的地，目的分子的ADCC活性可以體內(nèi)評(píng)估，例如，在例如Clynesetal.PNAS(USA)95:652-656(1998)中所披露的動(dòng)物模型中。"Fc受體"或者"FcR"描述與抗體Fc區(qū)域結(jié)合的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列人FcR。此外，優(yōu)選的FcR是結(jié)合IgG抗體的FcR(—個(gè)y受體)，并且包括FcyRI、FcyRII、與FcyRIII亞類的受體，包括等位基因變體和這些受體的不同拼接形式。FcyRII受體包括FcyRIIA("激活受體")與Fc丫RIIB("抑制受體，，)，其具有類似氨基酸序列，該氨基酸序列的主要不同在于其細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。激活受體FcyRIIA在它的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域包含免疫受體酪氨酸為基礎(chǔ)的激活基序(ITAM)。抑制受體FcyRIIB在它的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域包含免疫受體酪氨酸為基礎(chǔ)的抑制基序(ITIM)。(參見(jiàn)綜述M.inDagron，Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997》。FcR在Ravetch與Kinet，Annu.Rev.Immunol9:457-92(1991);Capeletal"Imm畫methods4:25-34(1994);與deHaasetal.丄Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中綜述。其它的FcR,包括那些將來(lái)要被鑒別的FcR，在此包括在術(shù)語(yǔ)"FcR"內(nèi)。該術(shù)語(yǔ)也包括新生兒受體FcRn，其負(fù)責(zé)將母體igG轉(zhuǎn)移給胎兒(Guyeretal.J.Immunol.117:587(1976)與Kimetal.，J.Immunol.24:249(1994))。WO00/42072(Presta)描述抗體變體，其具有改善的或者降低的與FcR結(jié)合能力。該專利出版物的內(nèi)容在這里特別地引入作為參考。也參見(jiàn)，Shieldsetal,J.Biol.Chem,9(2):6591畫6604(2001)。"人效應(yīng)細(xì)胞"是表達(dá)一或多個(gè)FcR并且行使效應(yīng)子功能的白細(xì)胞。優(yōu)選地，細(xì)胞至少表達(dá)FcYRIII并且行使ADCC效應(yīng)子功能。介導(dǎo)ADCC的人白細(xì)胞的例子包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)、自然殺傷(NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞與中性粒細(xì)胞，以PBMC與自然殺傷細(xì)胞為優(yōu)選。效應(yīng)細(xì)胞可能從天然來(lái)源，例如從血中分離。"依賴于補(bǔ)體的細(xì)胞毒性"或"CDC"指補(bǔ)體存在下靶細(xì)胞的溶解。通過(guò)補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(Clq)與合適亞類的抗體結(jié)合而啟動(dòng)經(jīng)典補(bǔ)體途徑的激活，所述抗體是與其相關(guān)抗原結(jié)合的。為評(píng)估補(bǔ)體激活，可進(jìn)行CDC試驗(yàn),例如如Gazzano-Santoroetal.，J.Immunol.Methods202:163(1996)中描寫的。在美國(guó)專利號(hào)6，194，551B1與W099/51642中描述了多肽變體，具有改變的Fc區(qū)域氨基酸序列與增加或降低的Clq結(jié)合能力。那些專利出版物的內(nèi)容在此特另'J地引入作為參考。也參見(jiàn)Idusogieetal.J.Immunol.164:4178-4184(2000)。IgG中N-糖基化位點(diǎn)在CH2結(jié)構(gòu)域的Asn297。本發(fā)明也提供CD20結(jié)合的、人源化抗體組合物，該抗體具有Fc區(qū)域，其中組合物中抗體的大約80-100%(并且優(yōu)選地大約90-99%)包含成熟核心糖結(jié)構(gòu)，該糖結(jié)構(gòu)缺乏巖藻糖，附著于糖蛋白的Fc區(qū)域。象這樣的組合物在此被證明顯示出在與F(7RIIIA(F158)結(jié)合上的驚人改善，該結(jié)合不如FcyRIIIA(V158)與人IgG相互作用有效。因此，在這里的組合物預(yù)計(jì)優(yōu)于以前描迷的抗CD20抗體組合物，特別是對(duì)于治療表達(dá)FcyRIIIA(F158)的病人而言。在正常、健康的非洲裔美國(guó)人與白種人中，F(xiàn)cyRIIIA(F158)比FcyRIIIA(V158)更常見(jiàn)。參見(jiàn)Lehrnbecheretal.Blood94:4220(1999)。本申請(qǐng)更進(jìn)一步顯示FcyRIII結(jié)合和/或ADCC功能的協(xié)同增加，該協(xié)同增加源自在此的糖基化作用變異與糖蛋白Fc區(qū)域的氨基酸序列修飾的聯(lián)合。"分離的"抗體是已經(jīng)從它的自然環(huán)境的組分中鑒別與分離和/或回收的抗體。其自然環(huán)境的污染物組分是將干擾抗體的診斷或治療使用的物質(zhì)，并且可包括酶、激素及其它蛋白的或者非蛋白的溶解物。在優(yōu)選實(shí)施方式中，抗體將被純化至(l)如經(jīng)過(guò)Lowry方法確定的，按重量計(jì)算大于抗體的95%，并且最優(yōu)選按重量計(jì)算超過(guò)99°/。，(2)足夠獲得通過(guò)利用轉(zhuǎn)杯測(cè)序儀(spinningcupsequenator)N末端或者內(nèi)部氨基酸序列的至少l5個(gè)殘基的程SDS-PAGE下達(dá)到均一。分離的抗體包括在重組細(xì)胞內(nèi)部的原位抗體，因?yàn)榭贵w自然環(huán)境中的至少一個(gè)組分將不存在。然而，一般地，分離的抗體將通過(guò)至少一個(gè)純化步驟制備。"分離的"核酸分子是從至少一個(gè)污染物核酸分子中鑒別與分離的核酸分子，在抗體核酸的天然來(lái)源中其一般地與該污染物核酸分子有聯(lián)系。分離的核酸分子在其形式或環(huán)境上與其在自然界中發(fā)現(xiàn)時(shí)不同。分離的核酸分子因此不同于其在自然細(xì)胞中存在的核酸分子。然而，分離的核酸分子包括在通常表達(dá)抗體的細(xì)胞中加以包含的核酸分子，在該細(xì)胞中例如核酸分子位于與自然細(xì)胞不同的染色體位置上。表示法"控制序列，，指在一特定宿主有機(jī)體中表達(dá)可操作連接的編碼序列所需的DNA序列。適于原核生物的控制序列例如包括啟動(dòng)子，任選操縱子序列，以及核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知真核細(xì)胞利用啟動(dòng)子、聚腺苷酸化信號(hào)與增強(qiáng)子。當(dāng)核酸被置于與另一核酸序列的功能性關(guān)系時(shí)其是"可操作連接的"。例如，如果前序列或分泌性前導(dǎo)序列的DNA作為參與多肽分泌的前蛋白質(zhì)加以表達(dá)，其與多肽的DNA是可操作連接的。如果啟動(dòng)子或者增強(qiáng)子影響序列的轉(zhuǎn)錄，其與編碼序列是可操作地連接的。或如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于促進(jìn)翻譯的位置，則其與編碼序列是可操作地連接的。一般地，"可操作地連接，，指被連接的DNA序列是鄰近的，并且在分泌性前導(dǎo)序列的情況下，是鄰近的和在閱讀狀態(tài)下。然而，增強(qiáng)子不必是鄰近的。連接通過(guò)在適宜限制性位點(diǎn)的連接而完成。如果這樣的位點(diǎn)不存在，根據(jù)通常的做法使用合成寡核苷酸連接物或接頭。"載體，，包括穿梭與表達(dá)載體。典型地，質(zhì)粒構(gòu)建物包括復(fù)制起始點(diǎn)(例如ColEl復(fù)制起始點(diǎn))與選擇性標(biāo)記(例如氨千青霉素或四環(huán)素抗性)，分別用于質(zhì)粒在細(xì)菌中的復(fù)制與選擇。"表達(dá)載體"指一種載體，其包含在細(xì)菌或真核細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的抗體、包括抗體片段所需的控制序列或調(diào)控元件。合適的載體在下面披露。產(chǎn)生本發(fā)明的人源化CD20結(jié)合抗體的細(xì)胞包括細(xì)菌與真核宿主細(xì)胞，其中已經(jīng)引入編碼抗體的核酸。合適的宿主細(xì)胞在下面4皮露。用詞"標(biāo)記"當(dāng)在這里使用時(shí)指可4全測(cè)的化合物或組合物，其直接或間接地與抗體接合。標(biāo)記可本身是可4企測(cè)的(例如放射性同位素標(biāo)記或熒光的標(biāo)記)或者，在酶促標(biāo)記的情況下，可以催化可檢測(cè)的底物化合物或組合物的化學(xué)改變。"自身免疫病，，在此是來(lái)自并針對(duì)個(gè)體自身(自己的)抗原和/或組織的非惡性疾病或紊亂。如同在這里使用的，"B細(xì)胞消減"指在藥物或者抗體處理之后同像這樣的處理以前的水平比較起來(lái)在動(dòng)物或者人中B細(xì)胞水平的減少。利用眾所周知的試驗(yàn)，例如在實(shí)驗(yàn)實(shí)施例中描述的試驗(yàn)，測(cè)量B細(xì)胞水平。B細(xì)胞消減可以完全的或者部分的。在一個(gè)實(shí)施方式中，表達(dá)CD20的B細(xì)胞消減至少25%。不受任何機(jī)制的限制，B細(xì)胞消減的可能機(jī)制包括ADCC、CDC、細(xì)胞程序死亡、鈣流的調(diào)制或者在前機(jī)制中兩個(gè)或更多的組合。術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞毒性劑"如同在此使用的指一種物質(zhì)，該物質(zhì)抑制或防礙細(xì)胞功能和/或?qū)е录?xì)胞破壞。術(shù)語(yǔ)意圖包括放射性同位素(例如I131、I125、Y9G與Re186)、化療劑和毒素例如細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來(lái)源的酶促活性毒素或其片段。"化療劑"是在癌癥治療中有用的化合物?；焺?shí)例包括烷化劑，如噻替哌(thiotepa);環(huán)膦酰胺(cyclosphamide)(CYTOXANTM);烷基磺酸酯如白消安(busulfan),英丙舒凡(improsulfan)和派泊舒凡(piposulfan);氮丙咬如千替艱(benzodopa),卡波醌(carboquone)，美妥替艱(meturedopa)和尿烷亞胺(uredopa);氮丙咬和methylamelamine包括六曱蜜胺(altretamine)，三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)，三亞乙基磷酰胺，三亞乙基硫代磷酰胺和三羥曱基蜜胺(trimethylolomelamine);氮芥(nitrogenmustards)如苯丁酸氮芥,萘氮芥，膽磷酰胺(cholophosphamide),雌氮芥(estramustine),異環(huán)磷酰胺(ifosfamide),氮芥(mechlorethamine),鹽酸氧氮芥；左旋苯丙氨酸氮芥(melphalan),新氮芥(novembichin)，膽甾醇苯乙酸氮芥，松龍苯芥(prednimustine),曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧咬氮芥；亞硝基脲(nitrosureas)如亞硝基脲氮芥(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine),尼莫司汀(nimustine),雷莫司汀(ranimustine);抗生素如阿克4立霉素，放線菌素，authramycin,重氮絲氨酸，博來(lái)霉素，放線菌素C(cactinomycin)，力口利車審素(calicheamicin),carabicin,洋纟工審素,嗜癌素(carzinophilin)，色霉素(chromomycin),放線菌素D,道諾紅菌素(daunorubicin),地托比星(detorubicin)，6-重氮-S-氧-L-正亮氨酸，阿霉素(doxorubicin,Adriamycin),表阿霉素(epirubicin),依索比星(esombicin)，伊達(dá)比星(idambicin),發(fā)波霉素(marcellomycin)，絲裂霉素，霉酚酸，諾加霉素(nogalamycin),橄欖霉素(olivomycin),培洛霉素(peplomycin)，potfiromycin，噪呤霉素，三鐵阿霉素(quelamycin)，羅多比星(rodorubicin),鏈黑菌素；鏈脲霉素(streptozocin),殺結(jié)核菌素，烏苯美司(ubenimex)，凈司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin);抗代謝藥如氨曱蝶呤，5-氟尿嗜啶(5-FU);葉酸類似物如二曱葉酸(denopterin)，氨曱蝶呤，丁蝶翼素(pteropterin),三曱曲沙(trimetrexate);噪呤類似物氟達(dá)拉濱(fludarabine)，6-巰基。票呤，硫咪噤呤，硫鳥嘌呤；嘧啶類似物如安西他濱(ancitabine),阿扎胞苷(azacitidine),6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞普，雙脫氧尿普，多西氟尿啶，依諾他濱(enocitabine)，氟尿苷，5-FU;雄激素類如二曱睪酮，丙酸曱力#烷酉同(dromostanolongpropionate)，環(huán)好J,醇(epitiostanol),美力,氨(mepitiostane),睪內(nèi)酉旨(testolactone);抗腎上腺類如氨魯米特(aminoglutethimide),鄰氯苯對(duì)氯苯二氯乙烷(mitotane)，曲洛司坦(trilostane);葉酸補(bǔ)充劑如frolinicacid;醋葡內(nèi)酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside);氨基乙酰丙酸(aminolevulinicacid);安吖。定(amsacrine);bestrabucil;比生群(biasntrene);依達(dá)曲沙(edatraxate);磷氛氮芥(defofamine);秋水仙胺；地吖醌(diaziquone);依洛尼塞(elfornithine);醋酸羥吡呻唑(emptiniumacetate);依托格魯(etoglucid);硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖(lentinan);氯尼達(dá)明(lonidamine);米4乇胍腙(mitoguazone);米4乇蒽酉昆(mitoxantrone);莫派達(dá)醇(mopidamol);二胺》肖吖口定(nitracrine);噴司他丁(pintostatin);phenamet;p比柔t(yī)匕星(pirarubicin);鬼臼沖對(duì)酸(podophyllinicacid);2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine);PSK;雷佐生(razoxane);西索菲蘭(sizofiran);鍺螺胺(spirogermanium);細(xì)交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺(trichlorrotriethylamine);烏拉坦(urethan);長(zhǎng)春堿酰胺；達(dá)卡巴。秦(dacarbazine);甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol);二溴衛(wèi)矛醇；溴丙p底卩秦(pipobroman);gacytosine;阿4i伯3f唐普("Ara畫C");塞替卩底(thiotepa);紫杉烷(taxoid)，如紫杉醇(TAXOL③，Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,NJ)和doxetaxel(TAXOTERE,Rhone畫PoulencRorer，Antony,France);苯丁酸氮芥；吉西他濱(gemcitabine);6-石克代鳥嘌呤；巰基嘌呤；氨曱蝶呤；鉑類似物如順鉑和卡鉑；鉑；鬼臼乙叉甙(etoposide)(VP-16);異環(huán)磷酰胺；絲裂霉素C;米托蒽醌；長(zhǎng)春新堿；長(zhǎng)春花堿；長(zhǎng)春瑞賓(vinordbine);l斤霉酰氨(navelbine);二#至基蒽酮(novantrone);替尼泊戒(teniposide);柔紅霉素；氨基蝶呤；xdoda;伊拜膦酸鹽(ibandronate);CPT-11;拓樸異構(gòu)酶抑制劑RFS2000;二氟曱基鳥氨酸(DMFO);維曱酸；esperamicins;capecitabine;以及上述4壬4可物質(zhì)的可藥用鹽，酉交或書亍生物。此定義還包括能調(diào)節(jié)或抑制激素對(duì)肺瘤的作用的抗激素制劑，如抗雌激素制劑包括他莫昔芬(tamoxifen),雷洛昔芬(mloxifene)，芳香酶抑制劑4(5)-咪唑，4-羥基他莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene),keoxifene,LY117018,奧那司酮(onapristone),和托瑞米芬(Fareston);和抗雄激素制劑如氟他氨(flutamide),尼魯米特(nilutamide),bicalutamide，亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin);和上述任何物質(zhì)的可藥用鹽，酸或衍生物。"治療，，或"處理，，或"緩和"既指治療性處理也指預(yù)防性或者預(yù)防性措施，其中目的是防止或減慢(減弱)所針對(duì)的病理情況或紊亂。如果個(gè)體根據(jù)本發(fā)明的方法接受治療量的本發(fā)明的CD20結(jié)合抗體后，顯示該特定疾病的一或多個(gè)體征和癥狀的可M^測(cè)的和/或可度量的減少，該個(gè)體4皮成功地"治療，，CD20陽(yáng)性癌癥或自身免疫病。例如，對(duì)于癌癥來(lái)說(shuō)，癌細(xì)胞數(shù)目減少或者癌細(xì)胞消失；腫瘤體積減??；抑制(即在某種程度上減慢并且優(yōu)選地停止)腫瘤轉(zhuǎn)移；在某種程度上抑制腫瘤生長(zhǎng)；延長(zhǎng)癥狀緩解的時(shí)間，和/或在某種程度上減輕與該特定的癌癥有聯(lián)系的一個(gè)或多個(gè)癥狀；減低發(fā)病率與死亡率，與生命質(zhì)量的改進(jìn)等事宜。病人也可以感到疾病征候或癥狀的減低。治療可以取得完全響應(yīng)，定義為所有癌癥跡象的消失，或者部分響應(yīng)，其中腫瘤尺寸減小，優(yōu)選地超過(guò)50%,更優(yōu)選地超過(guò)75%。如果病人病情平穩(wěn)，也被認(rèn)為是已治療的。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，在一年之后癌癥病人的癌癥仍然沒(méi)有進(jìn)展，優(yōu)選地在15個(gè)月之后。評(píng)估疾病成功治療與改善的這些參數(shù)通過(guò)為本領(lǐng)域醫(yī)師所熟悉的常規(guī)程序是容易度量的。"治療有效量"指在個(gè)體中有效"治療"疾病或紊亂的抗體或藥物的量。對(duì)于癌癥，藥物治療有效量可減少癌細(xì)胞的數(shù)量；減小腫瘤體積；抑制(即在一定程度上減慢并優(yōu)選停止)癌細(xì)胞對(duì)周圍器官的浸潤(rùn)；抑制(即在一定程度上減慢到并優(yōu)選停止)腫瘤轉(zhuǎn)移；在一定程度上抑制腫瘤生長(zhǎng)；和/或在一定程度上減輕與癌癥相關(guān)的一種或多種癥狀。參見(jiàn)前述對(duì)"治療"的定義。"慢性"給藥指以與急性方式相反的連續(xù)方式給藥所述藥劑，從而在更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)維持最初的治療效果(活性)。"間歇性"給藥是并非不間斷地連續(xù)進(jìn)行、而實(shí)際上是周期性的治療。本發(fā)明的方法與組合物本發(fā)明提供結(jié)合人CD20、并且優(yōu)選地也結(jié)合其它靈長(zhǎng)類動(dòng)物CD20的人源化抗體，包含一個(gè)重鏈，該重鏈包含非人物種抗人CD20抗體(供體抗體)的至少一個(gè)、優(yōu)選地兩個(gè)或者所有H鏈CDR,和作為受者抗體的人共有抗體的基本上所有框架殘基。供體抗體可以來(lái)自于各種的非人物種，包括小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、兔、馬、靈長(zhǎng)類動(dòng)物，但是最經(jīng)常地是小鼠抗體。在這里"基本上所有的，，指人源化抗體的受者FR區(qū)域可以包括在人共有FR序列中原來(lái)不存在的一或多個(gè)氨基酸取代。這些FR改變可以包含在受者或供體抗體中未找到的殘基。在一個(gè)實(shí)施方式中，供體抗體是鼠抗體，可變區(qū)包括圖1A與1B所示的H與L鏈的每一個(gè)的CDR與FR序歹L在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，人Fab框架的殘基相應(yīng)于人VK亞群I和VH亞群III的共有序列，這些共有序列^別地如圖1A與圖1B所示。本發(fā)明的人源化2H7抗體具有小鼠供體抗體的H鏈的至少一個(gè)CDR。在一個(gè)實(shí)施方式中，結(jié)合人CD20的人源化2H7抗體包含供體抗體H與L鏈兩者的CDR。在一個(gè)全長(zhǎng)抗體中，本發(fā)明的人源化CD20結(jié)合抗體將包含人源化的可變結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域與人免疫球蛋白的恒定結(jié)構(gòu)域連接。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，重鏈恒定區(qū)來(lái)自人IgQ優(yōu)選地IgGl或者IgG3。輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域優(yōu)選地來(lái)自人K鏈。除非另外指示，除了在下面的實(shí)驗(yàn)實(shí)施例中指示的氨基酸取代或改變位置之夕卜，在這里的人源化2H7抗體型式將具有2H7.vl6輕鏈(圖6，SEQIDNO.21)與H鏈(圖7，SEQIDNO.22)的V與C結(jié)構(gòu)域序列。該人源化CD20結(jié)合抗體將至少結(jié)合人CD20,并且優(yōu)選地結(jié)合其它靈長(zhǎng)類動(dòng)物CD20，例如猿猴(monkey)包括獼猴和恒河猴，與黑猩猩的CD20。獼猴CD20的序列在實(shí)施例15與圖19中披露。體與人CD20的結(jié)合，更優(yōu)選與人和靈長(zhǎng)類動(dòng)物(包括獼猴、恒河猴、黑猩猩)CD20結(jié)合，其Kd值不高于lxlO-8，優(yōu)選地Kd值不高于大約lxl(T9，甚至更優(yōu)選地Kd值不高于大約lxl0"0,并且能體外或體內(nèi)殺死或者消減B細(xì)胞，優(yōu)選地當(dāng)與基線水平或未用這樣的抗體處理過(guò)的恰當(dāng)?shù)呢?fù)對(duì)照相比殺死或者消減至少20%。B細(xì)胞消減的所需水平將取決于疾病。對(duì)于治療CD20陽(yáng)性癌癥來(lái)說(shuō)，也許需要最大限度消減作為本發(fā)明的抗CD20抗體目標(biāo)的B細(xì)胞。因此，對(duì)于治療CD20陽(yáng)性B細(xì)胞腫瘤而言，最好對(duì)B細(xì)胞的消減是足夠的，以至少防止疾病的進(jìn)展，而疾病的進(jìn)展是本領(lǐng)域熟練醫(yī)師可以評(píng)估的，例如通過(guò)監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)(大小)、癌細(xì)胞類型的增殖、轉(zhuǎn)移、及該特定癌癥的其它體征和癥狀。優(yōu)選地，B細(xì)胞消減足以防止疾病的進(jìn)展至少2個(gè)月，更優(yōu)選3個(gè)月，甚至更優(yōu)選4個(gè)月，更優(yōu)選5個(gè)月，甚至更優(yōu)選6或更多個(gè)月。在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方式中，B細(xì)胞消減足以提高癥狀緩解時(shí)間至少6個(gè)月，更優(yōu)選9個(gè)月，更優(yōu)選一年，更優(yōu)選2年，更優(yōu)選3年，甚至更優(yōu)選5年或更多年。在一個(gè)最優(yōu)選實(shí)施方式中，B細(xì)胞消減足以治療疾病。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在癌癥病人中的B細(xì)胞消減是治療以前基線水平的至少大約75和優(yōu)選地80%、85%、90%、95%、99。/。并且甚至100%。對(duì)于治療自身免疫病，也許需要依賴個(gè)體病人的疾病和/或病癥的嚴(yán)重程度，通過(guò)調(diào)整CD20結(jié)合抗體的劑量，調(diào)制B細(xì)胞消減的程度。因此，可以消減B細(xì)胞、但不必是完全的?；蛘?，在起始治療中可能需要總B細(xì)胞消減，但在隨后治療中，可能調(diào)整劑量以達(dá)到僅部分消減。在一個(gè)實(shí)施方式中，與治療前的基線水平相比，B細(xì)胞消減至少20°/。，即余留80%或者更少的CD20陽(yáng)性B細(xì)胞。在其它實(shí)施方式中，B細(xì)胞消減25%、30°/。、40%、50%、60%、70%或者更多。優(yōu)選地，B細(xì)胞消減足以-使疾病進(jìn)展停頓，更優(yōu)選緩和在治療下的特定疾病的體征和癥狀，甚至更優(yōu)選治愈疾病。本發(fā)明還提供雙特異性CD20結(jié)合抗體，其中抗體的一個(gè)臂具有本發(fā)明的人源化CD20結(jié)合抗體的人源化重與輕鏈，并且另一個(gè)臂具有針對(duì)第二抗原的結(jié)合特異性的可變區(qū)。在特定的實(shí)施方式中，第二抗原選自由CD3、CD64、CD32A、CD16、NKG2D或者其它NK激活配體組成的組。同Rituxan(rituximab)比較起來(lái))，v16顯示出ADCC效力增加大約2至5倍，CDC比Rituxan降低3-4倍?？贵w產(chǎn)生卓^i發(fā)戎傳單克隆抗體可用Kohleretal,Nature,256:495(1975)首先描述的雜交瘤法制備或通過(guò)重組DNA法(美國(guó)專利4,816,567)制備。在雜交瘤方法中，如上述免疫小鼠或其它適宜的宿主動(dòng)物，例如倉(cāng)鼠，來(lái)激發(fā)產(chǎn)生或能產(chǎn)生特異結(jié)合免疫所用蛋白的抗體的淋巴細(xì)胞?？蛇x地，所述淋巴細(xì)胞可被體外免疫。免疫后，淋巴細(xì)胞可被分離并隨后使用適宜的融合劑例如聚乙二醇與骨髓瘤細(xì)胞系融合，以形成雜交瘤細(xì)胞(Goding,卓義發(fā)戎來(lái)./V,w—am/尸rac"ce，59-103頁(yè)(AcademicPress,1986》。由此制備的雜交瘤細(xì)胞被接種于適宜的培養(yǎng)基并在其中生長(zhǎng)，該培養(yǎng)基優(yōu)選包含一種或多種抑制未融合親代骨髓瘤細(xì)胞(也稱為融合伴估)的生長(zhǎng)或存活的物質(zhì)。例如，如果親代骨髓瘤細(xì)胞缺乏次黃噤呤烏噤呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，雜交瘤的選擇培養(yǎng)基通常包括次黃嘌呤，氨基蝶呤，和胸腺嘧啶("HAT培養(yǎng)基")這些抑制HGPRT-缺陷細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)。優(yōu)選融合伴佔(zhàn)骨髓瘤細(xì)胞為那些能有效融合、支持所選抗體生成細(xì)胞以穩(wěn)定的高水平產(chǎn)生抗體、并對(duì)選擇未融合親代的選擇培養(yǎng)基敏感的那些融合伴侶骨髓瘤細(xì)胞系。優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞系是鼠骨髓瘤系，如由SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego,CaliforniaUSA提供的MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤，和由美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville,MarylandUSA提供的SP-2或其衍生物，如X63-Ag8-653細(xì)胞。也描述了人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細(xì)胞系可用于產(chǎn)生人單克隆抗體[Kozbor,J,Immunol.,133:3001(1984);和Brodeur等，單克隆抗體的制備技術(shù)和應(yīng)用(MarcelDekker,Inc.，NewYork紐約，(1987))51-63頁(yè))?？稍诤猩L(zhǎng)的雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基中分析抗所述抗原的單克隆抗體的產(chǎn)生。優(yōu)選地，雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性通過(guò)免疫沉淀或通過(guò)體外結(jié)合試驗(yàn)，如放射免疫分析(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)來(lái)分析。單克隆才元體的結(jié)合親合力可通過(guò)，例如Muson等，5/oc/zew.，107:220(1980)所述Scatchard分析來(lái)測(cè)定。一旦鑒定出產(chǎn)生具有所需特異性、親合力和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞，這些細(xì)胞克隆可通過(guò)有限稀釋進(jìn)行亞克隆，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法(Goding,卓2發(fā)TV/"")/"awd尸rac"ce，59-103頁(yè)(AcademicPress,1986))使其生長(zhǎng)。適合此目的的培養(yǎng)基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。此外，通過(guò)例如將細(xì)胞腹膜內(nèi)注射入小鼠中，可以使雜交瘤細(xì)胞以動(dòng)物腹水腫瘤的形式在體內(nèi)生長(zhǎng)。上述亞克隆所分泌的單克隆抗體可用經(jīng)典抗體純化方法如，例如，親和層析(例如使用蛋白A或蛋白G瓊脂糖)或離子交換層析，羥基磷灰石層析，凝膠電泳，透析等從培養(yǎng)基，腹水或血清中分離。使用傳統(tǒng)方法(例如通過(guò)使用能與編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因特異結(jié)合的寡核芬酸探針)可輕易分離并測(cè)序編碼單克隆抗體的DNA。雜交瘤細(xì)胞是此DNA的優(yōu)選來(lái)源。一旦分離出該DNA,可以將它置入表達(dá)載體中，該載體隨后被轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞中例如大腸桿菌細(xì)胞，猴COS細(xì)胞，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，或不另外生成抗體蛋白的骨髓瘤細(xì)胞，從而在重組宿主細(xì)胞中合成單克隆抗體。關(guān)于在細(xì)菌中重組表達(dá)編碼抗體的DNA的綜述文字包括Skerraa/"Cwr.C^z'm'o"/"/w應(yīng)wo/"5:256-262(1993)和Pliickthun,/mm畫/.130:151-188(1992)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可從使用McCafferty等，A^/ww，348:552-554(1990)描述的技術(shù)產(chǎn)生的抗體噬菌體文庫(kù)中分離單克隆抗體或抗體片段。Clackson等，A^wre，352:624-628(1991)和Marks等，JMo/.所o/.，222:581-597(1991)分別描述了使用噬菌體文庫(kù)分離鼠和人抗體。隨后的文章描述了通過(guò)鏈改組產(chǎn)生高親和性(納米級(jí))人抗體(Marks等，川o/rec/7"o/og);，10:779-783(1992))，以及將組合感染和體內(nèi)重組作為策略構(gòu)建非常大的噬菌體文庫(kù)(Waterhouse等，7Vwc.^c/血i"，21:2265-2266(1993))。因此，這些技術(shù)是用于分離單克隆抗體的傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的可行(viable)選擇。也可采用以下方法對(duì)編碼抗體的DNA進(jìn)行{奮飾以產(chǎn)生嵌合或融合抗體多肽例如，以人重鏈和輕鏈恒定區(qū)(CH和CO的序列代替同源小鼠序列(美國(guó)專利4，816,567;和Morrison等，脂"cd6W.固,81:6851(1984))，或?qū)⒚庖咔虻鞍拙幋a序列與非免疫球蛋白多肽(異源多肽)的完整或部分編碼序列融合。非免疫球蛋白多肽序列可取代抗體的恒定區(qū)，或它們可取代抗體的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變區(qū)以產(chǎn)生嵌合二價(jià)抗體，該抗體包含針對(duì)一個(gè)抗原的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，和具有對(duì)不同抗原的特異性的另一抗原結(jié)合位點(diǎn)。人源化拔伴使非人抗體人源化的方法已在本領(lǐng)域中描述。優(yōu)選地，人源化抗體具有一或多個(gè)從非人來(lái)源引入它的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常稱為"引進(jìn)的，，殘基，它們通常來(lái)自"引進(jìn)的"可變區(qū)。人源化過(guò)程基本是按照Winter及其同事(Jones等，7Va^，321:522-525(1986);Riechmann等，Atowre,332:323-327(1988);Verhoeyen等，5We"ce，239:1534-1536(1988))所述，通過(guò)高度可變區(qū)序列替換人抗體的對(duì)應(yīng)序列來(lái)進(jìn)行。因此，這樣的"人源化，，抗體是嵌合抗體(美國(guó)專利4,816,567),其中完整人類可變區(qū)的^(艮少一部分^f皮非人物種的相應(yīng)序列取代。實(shí)踐中，人源化抗體通常是人的抗體，其中有些高變區(qū)殘基且可能有些FR殘基被嚙齒動(dòng)物抗體中類似位點(diǎn)的殘基取代。當(dāng)抗體用于人類治療用途時(shí)，選擇人源化抗體制備所用的人輕鏈和重鏈可變區(qū)，對(duì)于降低抗原性和HAMA反應(yīng)(人抗鼠抗體)非常重要。根據(jù)所謂的"最適，，方法，針對(duì)已知人可變區(qū)序列的整個(gè)文庫(kù)篩選嚙齒類抗體的可變區(qū)序列。鑒定與嚙齒類V區(qū)序列最接近的人V區(qū)序列，并且其中的人框架區(qū)(FR)作為人源化抗體被接受(Sims"a/"http://畫圃/"151:2296(1993);Chothiaefa/.,/M/.Si'o/.,196:901(1987))。另一種方法使用從具有輕鏈或重鏈特定亞群的所有人抗體的共有序列衍生的特定框架區(qū)。同樣的框架區(qū)可被用于幾種不同的人源化抗體(Carter等，尸rac.Ato/.^cad"M,89:4285(1992);Presta等，J/m薩o/"151:2623(1993))。重要的是，將抗體人源化后保留了對(duì)抗原的高結(jié)合親和力和其它有利的生物特性。為達(dá)到此目的，在一種優(yōu)選方法中，通過(guò)用親本序列和人源源化抗體。免疫球蛋白三維模型已有商品，是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。還有用于描述和展示所選候選免疫球蛋白序列可能的三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)程序。通過(guò)檢查這些展示結(jié)果可分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中可能發(fā)揮的作用，即分析能影響候選免疫球蛋白與其抗原結(jié)合的能力的殘基。通過(guò)這種方法，可從受體序列和引進(jìn)序列中選出FR殘基并組合，從而得到所需抗體性質(zhì)，如對(duì)靶抗原的親和力增加。總之，高變區(qū)殘基直接并且最主要涉及對(duì)抗原結(jié)合的影響。人源化抗體可以是抗體片段，例如Fab,其可選地與一種或多種細(xì)月包毒性制劑偶聯(lián)以產(chǎn)生免疫偶聯(lián)物。可選地，人源化抗體可以是全長(zhǎng)的抗體，例如全長(zhǎng)IgGl抗體。入拔雄^噬,#肩^才法作為人源化的備選，可制備人抗體。例如，現(xiàn)在可以制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(如小鼠)，它經(jīng)過(guò)免疫能在缺乏內(nèi)源性免疫球蛋白生成的情況下產(chǎn)生全套人抗體。例如，已指出在嵌合和胚系(germ-line)突變小鼠中，抗體重鏈連接區(qū)(^)基因的純合缺失導(dǎo)致內(nèi)源性抗體生成的完全抑制。將人胚系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移到此胚系突變小鼠中，將導(dǎo)致在抗原攻擊的情況下產(chǎn)生人抗體。見(jiàn)例如，Jakobovits等尸rac.扁.園,90:2551(1993);Jakobovits等，A^we，362:255-258(1993);Bruggemann等，/"/mmw"o.，7:33(1993);美國(guó)專利5,545,806，5,569,825,5,591,669(所有均授予GenPharm);5,545,807;和WO97/17852.或者，可用噬菌體展示技術(shù)(McCafferty等，自然348:552-553(1990))從未免疫供體的免疫球蛋白可變(V)區(qū)基因庫(kù)體外產(chǎn)生人類抗體和抗體片段。依據(jù)此技術(shù)，抗體V區(qū)基因在框架內(nèi)(in-frame)克隆入絲狀噬菌體(如M13或fd)主要或次要衣殼蛋白基因，并在噬菌體顆粒的表面展示為功能性抗體片段。因?yàn)榻z狀顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，根據(jù)抗體的因此，噬菌體模仿了B細(xì)胞的部分特點(diǎn)。噬菌體展示可以以多種形式進(jìn)行；這些纟宗述見(jiàn)如Ji口Johnson,KevinS.和Chiswell，DavidJ.,CurrentOpinioninStructuralBiology3，564-571(1993)?？墒褂肰基因節(jié)段的多個(gè)來(lái)源進(jìn)行噬菌體展示。Clackson等，Nature352,624-628(1991)從免疫小鼠脾臟來(lái)源的V基因小隨機(jī)組合文庫(kù)中分離出一批多樣的抗-噁唑酮抗體。可基本如Marks等，JMo/.廳.222:581-597(1991),或Griffith等，五MBOJ:12:725-734(1993)所述，構(gòu)建未免疫的人類供體的V基因庫(kù)，并分離針對(duì)多種多樣抗原(包括自身抗原)的抗體。也見(jiàn)美國(guó)專利5，565，332和5,573,905。如上討i侖，人抗體也可通過(guò)體外活化的B細(xì)胞產(chǎn)生(見(jiàn)美國(guó)專利5，567，610和5,229,275)。在特定的情況下，使用抗體片段比整個(gè)抗體更有優(yōu)勢(shì)。片段的較小體積允許快速清除，并可導(dǎo)致更好地接近實(shí)體腫瘤。已開(kāi)發(fā)了多種技術(shù)用于生產(chǎn)抗體片段。傳統(tǒng)上，這些片段通過(guò)對(duì)完整抗體進(jìn)行蛋白水解消化來(lái)衍生(見(jiàn)例如，Morimoto等，J!歷oc/zew.所c^/z;as.MefWs24:107國(guó)117(1992)和Brennan等，ScZ,e229:81(1985》。然而，這些片段現(xiàn)在可通過(guò)重組宿主細(xì)胞直接生產(chǎn)。Fab，F(xiàn)v和ScFv抗體片段均可在大腸桿菌中表達(dá)并從中分泌，從而使這些片段的大量生產(chǎn)變?nèi)菀?。也可自上述的抗體噬菌體文庫(kù)分離抗體片段?？蛇x地，F(xiàn)ab，-SH片段可自大腸桿茵直接回收并利用化學(xué)方法偶聯(lián)形成F(ab，)2片段(Carter等，Bio/Technology10:163-167(1992))。根據(jù)另一方法，F(xiàn)(ab，)2片段可直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中分離。包括補(bǔ)救受體結(jié)合表位殘基并具有延長(zhǎng)的體內(nèi)半壽期的Fab和F(ab')2片段在美國(guó)專利5,869,046中描述。熟練技術(shù)人員掌握其它產(chǎn)生抗體片段的技術(shù)。其它實(shí)施方案中，選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。見(jiàn)WO93/16185;美國(guó)專利5,571,894;和美國(guó)專利5,587,458。Fv和sFv是具有完整結(jié)合位點(diǎn)的種類中唯一缺乏恒定區(qū)的；因此，其適于在體內(nèi)應(yīng)用期間降低非特異結(jié)合?？梢詷?gòu)建sFv融合蛋白，從而在sFv的氨基或羧基末端融合效應(yīng)蛋白。見(jiàn)上文的AntibodyEngineering,Borrebaeck編輯。抗體片賴二也可以是"線性抗體，，，例如在美國(guó)專利5,641,870中描述。此種線型抗體片段可以是單特異或雙特異的。雙#并我謬雙特異抗體是對(duì)至少兩種不同表位具有結(jié)合特異性的抗體。典型的雙特異抗體可結(jié)合CD20蛋白質(zhì)的兩種不同表位。其它此種抗體可將CD20結(jié)合位點(diǎn)與針對(duì)另一蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)組合?；蛘?，抗CD20臂可以與結(jié)合白細(xì)胞上觸發(fā)分子的臂結(jié)合，觸發(fā)分子例如T細(xì)胞受體分子(例如CD3)或IgG的Fc受體(FcyR)例如Fc7RI(CD64)、FcyRII(CD32)和FcyR(CD16),或NKG2D或其它NK細(xì)胞激活配體，以將細(xì)胞防御機(jī)制針對(duì)和定位在CD20表達(dá)細(xì)胞上。雙特異抗體也可用來(lái)將細(xì)胞毒制劑定位在表達(dá)CD20的細(xì)胞上。這些抗體具CD20臂和結(jié)合細(xì)胞毒性制劑的臂(例如皂草素(saporin),抗a-干擾素，長(zhǎng)春花生物堿，蓖麻毒蛋白A鏈，氨曱蝶呤或放射性同位素半抗原)?？梢詫㈦p特異抗體制備成全長(zhǎng)抗體或抗體片段(例如F(ab')2雙特異抗體)。W096/16673描述了雙特異性抗ErbB2/抗FcyRIII抗體，美國(guó)專利5,837,234披露了雙特異性抗ErbB2/抗FcyRI抗體。在WO98/02463中顯示雙特異性抗ErbB2/Fca抗體。美國(guó)專利5,821,337教導(dǎo)了雙特異性抗ErbB2/抗CD3抗體。制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。全長(zhǎng)雙特異性抗體的傳統(tǒng)制備是基于兩個(gè)免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)的共表達(dá)，其中這兩條鏈具有不同特異性(Millsteinetal,Nature,305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈輕鏈隨機(jī)分配，這些雜交瘤("四鏈瘤，，(quadroma))產(chǎn)生IO種不同抗體分子的可能混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。對(duì)所述正確分子的純化(通常通過(guò)親和層析步驟來(lái)進(jìn)行)非常復(fù)雜，且產(chǎn)量很低。類似的方法在WO93/08829和Traunecker等，EMBOJ,10:3655-3659(1991)中披露。依據(jù)另一不同方法，可將具有所需結(jié)合特異性的抗體可變區(qū)(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。該融合優(yōu)選與包含鉸鏈區(qū)、CH2及CH3區(qū)的至少一部分的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)融合。優(yōu)選使含有輕鏈結(jié)合所需位點(diǎn)的第一重鏈恒定區(qū)(CH1)出現(xiàn)在至少在一種融合中?？蓪⒕幋a免疫球蛋白重鏈融合體，以及必要時(shí)，編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA插入不同表達(dá)載體，共轉(zhuǎn)染至適當(dāng)宿主細(xì)胞。在使用非等比的三種多肽鏈進(jìn)行構(gòu)建以獲得所需雙特異性抗體最佳產(chǎn)量的實(shí)施方案中，這提供調(diào)整三種多肽片段的相互比例上的較大靈活性。但也可在至少兩種多肽鏈以等比例表達(dá)而獲得高產(chǎn)時(shí)或所述比例對(duì)所需鏈組合的產(chǎn)量無(wú)特別意義時(shí)，將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入同一表達(dá)載體。在該方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體由一條臂上的具有第一結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈和另一條臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)(提供第二結(jié)合特異性)構(gòu)成。已發(fā)現(xiàn)這種不對(duì)稱結(jié)構(gòu)有利于從不想要的免疫球蛋白鏈的混合中分離出所需雙特異性化合物，因?yàn)橹挥性撾p特異性分子的一半存在免疫球蛋白輕鏈，這使得分離更加容易。此方法公開(kāi)于1994年3月3日公開(kāi)的WO94/04690中。制備雙特異性抗體的進(jìn)一步細(xì)節(jié)可以參見(jiàn)，例如Suresh等，MethodsinEnzymology，121:210(1986)。根據(jù)美國(guó)專利5，731,168所述的另一種方法，可改造一對(duì)抗體分子之間的界面，使得從重組細(xì)胞培養(yǎng)中獲得的異二聚體的百分比最大。優(yōu)選的界面包括CH3結(jié)構(gòu)域的至少一部分。在該方法中，源于第一抗體分子界面上的一條或多條氨基酸小側(cè)鏈被較大側(cè)鏈(如酪氨酸或色氨酸)取代。與所述大側(cè)鏈大小相同或相近的互補(bǔ)"溝"可通過(guò)將氨基酸大側(cè)鏈用小側(cè)鏈(如丙氨酸或蘇氨酸)取代而在第二抗體分子的界面上形成。這提供了一種機(jī)制，其使異二聚體的產(chǎn)量比其它不想要的終產(chǎn)物如同型二聚體高。雙特異性抗體包括交聯(lián)抗體或"異源偶聯(lián)的，，抗體。例如，可使異源偶聯(lián)物中的抗體之一與抗生物素蛋白偶聯(lián)，使另一抗體與生物素偶聯(lián)。有觀點(diǎn)認(rèn)為，這類抗體可用于將免疫系統(tǒng)細(xì)胞導(dǎo)向不想要的細(xì)胞(美國(guó)專利4,676,980)，也可用于治療HIV感染(W091/00360，WO92/200373,EP03089)。異源偶聯(lián)抗體可通過(guò)任何適當(dāng)?shù)慕宦?lián)方法制備。適當(dāng)?shù)慕宦?lián)制劑和多種交聯(lián)技術(shù)為本領(lǐng)域已知，在美國(guó)專利4,676,980號(hào)中獲得。從抗體片段制備雙特異性抗體的技術(shù)已有文獻(xiàn)。例如，雙特異性抗體可利用化學(xué)連接制備。Brennan等，科學(xué)229:81(1985)中描述了將完整抗體經(jīng)蛋白水解切割制備F(ab')2片段的方法。這些片段在二疏基復(fù)合劑亞砷酸鈉存在時(shí)被還原，從而穩(wěn)定相鄰的巰基，并阻止分子間二硫鍵的形成。生成的Fab'片段被轉(zhuǎn)化為硫硝基苯曱酸鹽(TNB)衍生物。其中一種Fab'-TNB衍生物經(jīng)巰基乙胺還原再轉(zhuǎn)化成Fab'-硫醇，再與等摩爾量的其它Fab'-TNB衍生物混合形成雙特異性抗體。如此產(chǎn)生的雙特異性抗體可作為酶的選擇性固相化中所用的試劑。近期的進(jìn)展促進(jìn)了Fab'-SH片段從大腸桿菌的直接回收，該片段可經(jīng)化學(xué)偶聯(lián)形成雙特異性抗體。Shalaby等，MW.，175:217-225(1992)描述了完全人源化雙特異抗體F(ab')2分子的產(chǎn)生。每一Fab'片段分別從大腸桿菌中分泌出來(lái)，體外直接化學(xué)偶聯(lián)形成雙特異性抗體。如此制備的雙特異性抗體能與過(guò)表達(dá)ErbB2受體的細(xì)胞和正常人T細(xì)胞結(jié)合，還能引發(fā)人類細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞對(duì)人乳腺腫瘤靶向的裂解活性。直接從重組細(xì)胞培養(yǎng)中制備并分離雙特異性抗體片段的多種技術(shù)也已有描述。例如，可用亮氨酸拉鏈制備雙特異性抗體。Kostelny等，//w,肌"o/.,148(5):1547-1553(1992)。將來(lái)自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽與兩種不同抗體的Fab'部分通過(guò)基因融合而連接。使抗體的同二聚體在鉸鏈區(qū)被還原成單體，然后被再氧化形成抗體的異二聚體。該方法也可用于制備抗體同二聚體。Hollinger等，A^/.4cad5W,t/SA90:6444-6448(1993)所述的"二價(jià)抗體"技術(shù)提供了另一種制備雙特異性抗體片段的方法。所述片段中含有Vh，其通過(guò)接頭與VL相連，該接頭非常短，使得同一鏈的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間無(wú)法配對(duì)。因此，同一片段上的Vh和VL結(jié)構(gòu)域被迫與另一片段上的互補(bǔ)Vl和VH結(jié)構(gòu)域配對(duì)，從而形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。此外還報(bào)道了另一種用單鏈Fv(sFv)二聚體來(lái)制備雙特異性抗體的策略。見(jiàn)Gruber等，■//畫畫/.，152:5368(1994)。本發(fā)明還涉及二價(jià)以上的抗體。例如可制備三特異抗體。Tutt等//mw歸/.147:60(1991)。多價(jià)抗體比二價(jià)抗體更容易被表達(dá)與該抗體結(jié)合的抗原的細(xì)胞內(nèi)化(和/或異化)。本發(fā)明的抗體可以是具有三個(gè)或更多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的多價(jià)抗體(例如四價(jià)抗體)(它們不是IgM類)，通過(guò)使編碼所述抗體多肽鏈的核酸重組表達(dá)可輕易制備該抗體。多價(jià)抗體可以包含二聚體化結(jié)構(gòu)域和三個(gè)或更多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。優(yōu)選的二聚體化結(jié)構(gòu)域包括Fc區(qū)或鉸鏈區(qū)，或由其組成。在本文中，抗體包含一個(gè)Fc區(qū)和三個(gè)或更多個(gè)位于Fc區(qū)氨基端的抗原結(jié)合位點(diǎn)。優(yōu)選的多價(jià)抗體在此包括三到約八個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，或由它們組成，但優(yōu)選四個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。多價(jià)抗體包括至少一條多肽鏈(并優(yōu)選兩條多肽鏈)，其中所述多肽鏈包含兩個(gè)或多個(gè)可變區(qū)。例如，多肽鏈可包含VDl-(XlVVD2-(X2)n-Fc,其中VD1是第一可變區(qū)，VD2是第二可變區(qū)，F(xiàn)c是Fc區(qū)的一條多肽鏈，XI和X2代表氨基酸或多肽，n是0或l。例如，多肽鏈可包括VH-CHl-柔韌接頭(flexiblelinker)-VH-CHl-Fc區(qū)鏈；或VH-CH1-VH-CH1-Fc區(qū)鏈。本文的多價(jià)抗體優(yōu)選進(jìn)一步包含至少兩個(gè)(優(yōu)選四個(gè))輕鏈可變區(qū)多肽。例如本文的多價(jià)抗體可包含從約兩個(gè)到約八個(gè)輕鏈可變區(qū)多肽。本文的輕鏈可變區(qū)多肽包含輕鏈可變區(qū)以及可選地進(jìn)一步包含CL結(jié)構(gòu)域。^它瘋差^修謬本發(fā)明還涉及對(duì)本文所述CD20結(jié)合抗體的氨基酸序列修飾。例如，可能希望改進(jìn)抗體的結(jié)合親和力和/或其它生物學(xué)特性。抗CD20抗體的氨基酸序列變體可通過(guò)在抗CD20抗體核酸中導(dǎo)入適當(dāng)?shù)暮塑账岣淖?，或通過(guò)肽合成法來(lái)制備。所述修飾包括，如該抗CD20抗體的氨基酸序列中的殘基缺失，和/或插入和/或取代?？蓪?duì)缺失、插入、和取代進(jìn)行任意組合以獲得最終構(gòu)建體，只要該最終構(gòu)建體具有所需特性。氨基酸的變化還可改變抗CD20抗體的翻譯后加工，如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)目或位置。一種鑒別抗CD20抗體中處于誘變優(yōu)選位置的特定殘基或區(qū)域的有效方法是Cunningham和Wells，科學(xué)244:1081-1085(1989)所述的"丙氨酸掃描誘變"。這里，筌定一個(gè)殘基或一組靶殘基(例如，帶電的殘基如精氨酸、天冬氨酸、組氨酸、賴氨酸和谷氨酸)并用中性或帶負(fù)電的氨基酸(最優(yōu)選丙氨酸或多聚丙氨酸)取代，以便影響氨基酸與CD20抗原的相互作用。那些證實(shí)對(duì)取代具有功能敏感性的氨基酸位置通過(guò)在取代點(diǎn)51入進(jìn)一步的或其它的變體而改進(jìn)。故，盡管引入氨基酸序列變異的位點(diǎn)是預(yù)先決定的，但突變本身不必是預(yù)定的。例如，為分析在指定位點(diǎn)處突變的作用，在所述靶密碼子或區(qū)域?qū)嵭斜彼釖呙杌螂S機(jī)誘變，并篩選所表達(dá)的具有預(yù)期活性的抗CD20抗體變體。氨基酸序列插入包括氨基-和/或羧基-端的融合(其長(zhǎng)度從一個(gè)殘基至包括100個(gè)或更多殘基的多肽)，以及序列內(nèi)單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的插入。末端插入的例子包括帶有N-末端曱硫氨酰殘基的抗CD20抗體或與細(xì)胞毒性多肽融合的抗體?？笴D20抗體分子的其它插入變體包括使該抗CD20抗體的N或C末端與酶(例如ADEPT)或增加該抗體血清半壽期的多肽融合形成的融合體。另一類變體是氨基酸取代變體。這些變體使抗CD20抗體分子中至少一個(gè)氨基酸殘基被不同殘基取代。最有興趣進(jìn)行取代誘變的位點(diǎn)包括高變區(qū)，也可以改變FR。保守取代見(jiàn)表1的"優(yōu)先取代"欄。如果這些取代引起生物學(xué)活性的改變，則可引入表l中"取代舉例"欄的更實(shí)質(zhì)性改變，或進(jìn)一步在下文的氨基酸分類中所述的更實(shí)質(zhì)性改變，并篩選產(chǎn)物。<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>的效應(yīng)在維持(a)取代區(qū)多肽框架的結(jié)構(gòu)，例如片層結(jié)構(gòu)或螺旋構(gòu)象，(b)該分子耙位點(diǎn)的電荷或疏水性，(c)側(cè)鏈的大小這幾方面有顯著差異。天然殘基根據(jù)共有的側(cè)鏈特性可分為(1)疏水性正亮氨酸，蛋氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸(2)中性親水半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸(3)酸性天冬氨酸，谷氨酸(4)堿性天冬酰胺，谷氨酰胺，組氨酸，賴氨酸，精氨酸C5)影響側(cè)鏈定向的殘基甘氨酸，脯氨酸，和(6)芳香族色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸。非保守取代將限定上述某一類的成員被另一類取代。任何不參與保持抗CD20抗體正確構(gòu)型的半胱氨酸殘基可被替代，通常由絲氨酸替代，來(lái)提高分子的氧化穩(wěn)定性并防止錯(cuò)誤交聯(lián)。反之，可在抗體中添加半胱氨酸連接以提高其穩(wěn)定性(特別當(dāng)抗體為抗體片段如FV片段時(shí))。取代變體的特別優(yōu)選類型包括取代親本抗體(例如人源化抗體或人抗體高變區(qū)的一或多個(gè)殘基。通常，所選用于進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的所得變體相對(duì)于其所來(lái)源的親本抗體應(yīng)具有改進(jìn)的生物學(xué)活性。產(chǎn)生這種取代變體的一個(gè)方便方法是利用了噬菌體展示的親和力成熟。簡(jiǎn)單地說(shuō)，使高變區(qū)的幾個(gè)位點(diǎn)(如6-7個(gè)位點(diǎn))突變以便在每一位點(diǎn)產(chǎn)生所有可能的氨基酸取代。這樣產(chǎn)生的抗體變體以單價(jià)形式展示在絲狀噬菌體顆粒上，其為與每個(gè)顆粒內(nèi)包裝的Ml3基因III產(chǎn)物的融合體。然后篩選噬菌體展示的變體是否具有本文所述生物學(xué)活性(如結(jié)合親和力)。為了鑒定備選的高變區(qū)修飾位點(diǎn)，可通過(guò)丙氨酸掃描誘變來(lái)鑒定對(duì)抗原結(jié)合作出主要貢獻(xiàn)的高變區(qū)殘基?；蛘呋虼送猓治隹乖?抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)以確定CD20與抗體之間的接觸點(diǎn)也較有利。這些接觸殘基及鄰近殘基是根據(jù)本文所述技術(shù)進(jìn)行取代的候選位點(diǎn)。一旦產(chǎn)生這樣的變體，如本文所述對(duì)它們?nèi)窟M(jìn)行篩選，選出在一或多個(gè)相關(guān)實(shí)驗(yàn)中具有良好特性的抗體以便進(jìn)一步開(kāi)發(fā)?？贵w的另一種氨基酸變體改變了該抗體原來(lái)的糖基化模式。所謂改變就是去掉抗體中的一或多個(gè)糖組分，和/或添加一或多個(gè)原本不存在于該抗體中的糖基化位點(diǎn)。抗體的糖基化通常為N-連接或O-連接。N-連接指將糖組分與天冬酰胺殘基的側(cè)鏈相連。三肽序列天冬酰胺-x-絲氨酸和天冬酰胺-x-蘇氨酸(其中x是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是使糖組分與天冬酰胺進(jìn)行側(cè)鏈酶促相連的識(shí)別序列。因此，多肽中存在上述任一種三肽序列都可產(chǎn)生潛在的糖基化位點(diǎn)。O-連接糖基化指將N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖附著于羥基氨基酸，主要是絲氨酸、蘇氨酸，但也可用5-羥脯氨酸和5-羥賴氨酸。在抗體分子中添加糖基化位點(diǎn)可通過(guò)改變氨基酸序列，使其包含一或多個(gè)上述三肽序列(在添加N-連接糖基化位點(diǎn)的情況下)而實(shí)現(xiàn)。這種改變也可通過(guò)在原始抗體序列中添加或取代一或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基來(lái)實(shí)現(xiàn)(在添加O-連接的情況下)。編碼抗CD20抗體的氨基酸序列變體的核酸分子由本領(lǐng)域已知的各種方法制備。這些方法包括但不限于從天然來(lái)源分離(在天然氨基酸序列變體的情況下)，或通過(guò)對(duì)早期制備的變體或未變異的抗CD20抗體進(jìn)行寡核苷酸介導(dǎo)的(或定點(diǎn))誘變，PCR誘變和盒式誘變來(lái)制備。也許希望在效應(yīng)子功能方面修飾本發(fā)明的抗體，例如以增強(qiáng)抗體的抗原依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)和/或依賴于補(bǔ)體的細(xì)胞毒性(CDC)。這可通過(guò)在抗體Fc區(qū)域引入一或多個(gè)氨基酸取代而達(dá)到。二者擇一地或者另外，半胱氨酸殘基可被引入Fc區(qū)域，從而允許在該區(qū)內(nèi)形成鏈間二硫鍵。如此生產(chǎn)的同型二聚體抗體可具有改善的內(nèi)在化能力，和/或增加補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷與抗體依賴的細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)。見(jiàn)Caronetal.,J.ExpMed.176:1191-1195(1992)與Shopes,B丄Immunol.148:2918-2922(1992)。也可以利用如Wolffetal.CancerResearch53:2560-2565(1993)描述的異雙功能交聯(lián)劑制備具有增強(qiáng)的抗腫瘤活性的同型二聚體抗體?；蛘撸贵w可以被改造使其具有兩個(gè)Fc區(qū)域，并且可以由此具有增強(qiáng)的補(bǔ)體介導(dǎo)的溶解與ADCC能力。見(jiàn)Stevensonetal.Anti-CancerDrugDesign3:219-230(1989)。為延長(zhǎng)抗體的血清半衰期，可以將補(bǔ)救受體結(jié)合表位加入抗體(特別是抗體片段)，例如在美國(guó)專利5,739,277中描述的。如同在這里所使用的，術(shù)語(yǔ)"補(bǔ)救受體結(jié)合表位"指IgG分子(例如IgGl，IgG2，IgG3，或IgG4)Fc區(qū)域的表位，其負(fù)責(zé)延長(zhǎng)IgG分子的體內(nèi)血清半衰期。,它在體,謬在此也涉及抗體的其它修飾。例如，抗體可以與各種非蛋白聚合物中的一種連接，例如聚乙二醇，聚丙二醇，聚氧化烯，或聚乙二醇與聚丙二醇的共聚物?？贵w也可以在膠體藥物遞送系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球粒、微乳劑、納米顆粒與納米膠嚢)中，或者在粗乳狀液中捕捉在微膠囊中，所述微膠嚢例如通過(guò)凝聚技術(shù)或界面聚合作用制備，例如，分別是羥曱基纖維素或明膠微膠嚢與聚異丁烯酸曱酯微膠嚢。這一技術(shù)在Remington'sPharmaceuticalSciences,16thedition,Oslo,A.，Ed.,(1980)中才皮露。謬逸^^"席需一一^的我沐可如實(shí)驗(yàn)實(shí)施例中描述的選擇具有某些生物學(xué)特性的抗體。本發(fā)明的抗CD20抗體的生長(zhǎng)抑制效果可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法評(píng)估，例如利用內(nèi)源或者在用CD20基因轉(zhuǎn)染之后表達(dá)CD20的細(xì)胞。例如，腫瘤細(xì)胞系與CD20轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以用本發(fā)明的抗CD20單克隆抗體在各種濃度處理幾天(例如，2-7天)，用結(jié)晶紫或MTT染色，或用其它比色定量進(jìn)行在下處理，細(xì)胞3H-胸腺嘧啶核苷的攝取。在抗體處理之后，收獲細(xì)胞，并且在閃爍計(jì)數(shù)器上測(cè)定摻入DNA的放射性的量。合適的正對(duì)照包括用已知抑制該細(xì)胞系生長(zhǎng)的生長(zhǎng)抑制性抗體處理選定的細(xì)胞系。為選擇誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的抗體，可相對(duì)于對(duì)照評(píng)估膜完整性的喪失，膜完整性的喪失用例如碘化丙錠(PI)、錐蟲藍(lán)或7AAD攝取指示。PI攝取試驗(yàn)可以在缺乏補(bǔ)體與免疫效應(yīng)細(xì)胞下進(jìn)行。表達(dá)CD20的腫瘤細(xì)胞單獨(dú)與培養(yǎng)基孵育，或者與包含濃度例如大約10pg/ml的合適的單克隆抗體的培養(yǎng)基一起孵育。細(xì)胞孵育3天。每次處理后，洗細(xì)胞，等分入35毫米帶過(guò)濾器帽的12x75管(每管lml，每試驗(yàn)組3管)，以除去細(xì)胞團(tuán)塊。樣品可用FACSCANTM流式細(xì)胞儀與FACSCONVERTTMCellQuest軟件(BectonDickinson)分析。用PH聶取確定誘導(dǎo)統(tǒng)計(jì)上顯著意義的細(xì)胞死亡水平的抗體可被選為誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的抗體。為了篩選與被目的抗體結(jié)合的CD20上的表位結(jié)合的抗體，可以進(jìn)行常規(guī)雜交阻滯試驗(yàn)，例如在antibodies,aLaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,EdHarlowandDavidLane(1988)中所描述的。這一試驗(yàn)可用于判斷受試抗體是否與本發(fā)明的抗CD20抗體結(jié)合在相同的位點(diǎn)或表位上?；蛘呋蛄硗?，可以用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行表位作圖。例如，抗體序列可以例如通過(guò)丙氨酸掃描進(jìn)行誘變處理，以鑒別接觸殘基。一開(kāi)始測(cè)試突變抗體對(duì)多克隆抗體的結(jié)合以保證適當(dāng)?shù)恼郫B。在一不同方法中，相應(yīng)于CD20不同區(qū)域的肽可用在與測(cè)試抗體或者與測(cè)試抗體和具有已表征或已知表位的抗體的竟?fàn)幵囼?yàn)中。載體，宿主細(xì)胞和重組方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明還提供編碼人源化CD20結(jié)合抗體的分離的核酸，包含該核酸的載體和宿主，以及制備該抗體的重組纟支術(shù)。為了重組制備所述抗體，分離其編碼核酸并插入復(fù)制型載體中以便進(jìn)一步克隆(擴(kuò)增DNA)或表達(dá)。編碼所述抗體的DNA可以用常規(guī)方法很容易地分離并測(cè)序(例如使用能夠特異性結(jié)合編碼抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。有多種載體可以利用。載體組分通常包括但不限于一或多個(gè)下列組分信號(hào)序列，復(fù)制起點(diǎn)，一或多個(gè)標(biāo)記基因，增強(qiáng)子元件，啟動(dòng)子，和轉(zhuǎn)錄終止序列。0針,順為、本發(fā)明的CD20結(jié)合抗體不僅可以直接重組產(chǎn)生，還可作為與異源多肽融合的融合多肽來(lái)重組產(chǎn)生，所述異源多肽優(yōu)選信號(hào)序列或其它在成熟蛋白或多肽的N末端上具有特異性裂解位點(diǎn)的多肽。所選異源信號(hào)序列優(yōu)選是被宿主細(xì)胞識(shí)別并加工(即被信號(hào)肽酶裂解)的序列。對(duì)于不能識(shí)別和加工天然CD20結(jié)合抗體信號(hào)序列的原核宿主細(xì)胞，信號(hào)序列被選自，例如，堿性磷酸酶，青霉素酶，lpp或熱穩(wěn)定腸毒素II前導(dǎo)序列的原核生物信號(hào)序列取代。為了進(jìn)行酵母分泌，可以將天然信號(hào)序列取代為，例如，酵母轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)序列，a因子前導(dǎo)序列(包括糖酵母OSacc/wram;;ce力a因子前導(dǎo)序列和克魯維酵母(尺/wyvera^yc^)a因子前導(dǎo)序列)，或酸性磷酸酶前導(dǎo)序列，白色念珠菌葡萄糖淀粉酶前導(dǎo)序列，或WO90/13646描述的信號(hào)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)中，哺乳動(dòng)物信號(hào)序列以及病毒的分泌前導(dǎo)序列，如單純皰滲病毒gD信號(hào)都可以采用。這些前體區(qū)的DNA與編碼CD20結(jié)合抗體的DNA連4妾在閱讀框內(nèi)。表達(dá)載體和克隆載體都包含能使該載體在一或多種選定的宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列。一般情況下，在克隆載體中，這種序列是能使該載體獨(dú)立于宿主染色體DNA而復(fù)制的序列，包括復(fù)制起點(diǎn)或自主復(fù)制序列。這樣的序列在各種細(xì)菌、酵母和病毒中都是眾所周知的。質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點(diǎn)適合大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌，2p質(zhì)粒起點(diǎn)適合酵母菌，多種病毒起點(diǎn)(SV40,多瘤病毒(Polyoma)，腺病毒，VSV或BPV)可用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的克隆載體。復(fù)制起點(diǎn)組分一般不是哺乳動(dòng)物表達(dá)載體所必需的(SV40起點(diǎn)的使用通常僅僅是由于其包含早期啟動(dòng)子)?！芬?^西遂分表達(dá)載體和克隆載體可以包含選擇基因，也稱選擇標(biāo)記。典型的選擇基因編碼具有以下性質(zhì)的蛋白(a)賦予對(duì)抗生素或其它毒素(如氨千青霉素，新霉素，氨曱蝶呤或四環(huán)素)的抗性，(b)彌補(bǔ)營(yíng)養(yǎng)缺陷，或(c)提供復(fù)合培養(yǎng)基不能供給的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物，例如編碼芽孢桿菌(^""7//)0-丙氨酸消旋酶的基因。選擇方案的一個(gè)實(shí)例是利用藥物限制(arrest)宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)。那些被異源基因成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞產(chǎn)生賦予藥物抗性的蛋白，從而在該選擇環(huán)境中存活。這種顯性選擇的實(shí)例采用藥物新霉素，霉酚酸和潮霉素。適合于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的另一例選擇標(biāo)記是允許鑒定能攝取所述抗體核酸的細(xì)胞的那些，如DHFR，胸苷激酶，金屬硫蛋白-I型和-II型，優(yōu)選靈長(zhǎng)類金屬硫蛋白基因，腺苷脫氨酶，鳥氨酸脫羧酶等。例如，細(xì)胞被DHFR選擇基因轉(zhuǎn)化后，先將所有轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)在包含氨甲蝶呤(Mtx，為DHFR的一種竟?fàn)幮娃卓箘?的培養(yǎng)基中來(lái)鑒定細(xì)胞。當(dāng)采用野生型DHFR時(shí)，合適的宿主細(xì)胞是DHFR活性有缺陷的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系?；蛘?，宿主細(xì)胞(尤其包含內(nèi)源DHFR的野生型宿主)被編碼CD20結(jié)合抗體的DNA序列，野生型DHFR蛋白，以及另一種選擇標(biāo)記如氨基糖苷3，-磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化以后，可以通過(guò)在含有針對(duì)該選擇標(biāo)記的選擇試劑如氨基糖苷類抗生素(如卡那霉素，新霉素或G418)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)進(jìn)行選擇。參見(jiàn)美國(guó)專利4,965，199。適用于酵母的合適選擇基因是存在于酵母質(zhì)粒YRp7中的基因(Stinchcomb等，Atow^，282:39(1979))。^1基因?yàn)椴荒茉谏彼嶂猩L(zhǎng)的酵母突變抹(例如ATCC44076或PEP4-1)提供了選擇標(biāo)記(Jones，Ge"Wcs,85:12(1977))。此后，酵母宿主細(xì)胞基因組中^pl損傷的存在提供了通過(guò)在缺乏色氨酸的條件中生長(zhǎng)而檢測(cè)轉(zhuǎn)化的有效環(huán)境。類似地，丄ew2-缺陷型酵母菌抹(ATCC20,622或38,626)可以由攜帶丄ew2基因的已知質(zhì)粒來(lái)互補(bǔ)。此外，源自1.6pm環(huán)狀質(zhì)粒pKDl的載體可以用于轉(zhuǎn)化克魯維酵母(尺/wyverawyce力。備選地，VandenBerg,5/o/Tec/7"o/ogv,8:135(1990)報(bào)道了一種用于在乳克魯維酵母(K/flCto)中大規(guī)模制備重組小牛凝乳酶的表達(dá)系統(tǒng)。還有人公開(kāi)了用于通過(guò)克魯維酵母工業(yè)菌抹分泌成熟重組人血清白蛋白的穩(wěn)定、多拷貝表達(dá)載體。Fleer等，Ao/rec/z"o/ogy,9:968-975(1991)。啟動(dòng)子iff為、表達(dá)載體和克隆載體通常包含能被宿主生物識(shí)別的啟動(dòng)子，它與所述編碼CD20結(jié)合抗體的核酸可操作相連。適用于原核宿主的啟動(dòng)子包括;^"啟動(dòng)子，(3-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)，堿性磷酸酶，色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)，和雜合(hybrid)啟動(dòng)子如tac啟動(dòng)子。但其它已知的細(xì)菌啟動(dòng)子也是合適的。適用于細(xì)菌系統(tǒng)的啟動(dòng)子還可以包含與編碼CD20結(jié)合抗體的DNA可才喿作相連的Shine-Dalgamo(S.D.)序列。真核生物的啟動(dòng)子序列是已知的。幾乎所有的真核基因在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游約25-30個(gè)堿基處具有AT-富集區(qū)。很多基因在其轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游70-80個(gè)堿基處有另一種序列CNCAAT區(qū)，其中N可以是任何核苷酸。大多數(shù)真核基因的3'端是AATAAA序列，它可以作為一種信號(hào)用于將poly-A尾添加到編碼序列3，端。所有這些序列都適合于插入真核表達(dá)載體中。適用于酵母宿主的啟動(dòng)子序列的實(shí)例包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的啟動(dòng)子，所述其它糖酵解酶如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脫氫酶，己糖激酶，丙酮酸脫羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6磷酸異構(gòu)酶，3-磷酸甘油變位酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖異構(gòu)酶，磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和葡萄糖激酵。其它的酵母啟動(dòng)子，即那些另具有由生長(zhǎng)條件控制轉(zhuǎn)錄的優(yōu)點(diǎn)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，是下述基因的啟動(dòng)子區(qū)醇脫氫酶2、異細(xì)胞色素C(isocytochromeC)、酸性磷酸酶、與氮代謝相關(guān)的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氬酶，以及負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶。在EP73,657中進(jìn)一步描述了適用于酵母表達(dá)的載體和啟動(dòng)子。酵母增強(qiáng)子與酵母啟動(dòng)子聯(lián)合使用也是有利的。在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中，從載體轉(zhuǎn)錄CD20結(jié)合抗體是受，例如啟動(dòng)子調(diào)控，所述啟動(dòng)子來(lái)自病毒基因組，如多形瘤病毒、雞痘病毒(fowlpoxvirus)、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒，最優(yōu)選猴病毒40(SV40)的啟動(dòng)子，來(lái)自異源哺乳動(dòng)物的啟動(dòng)子，如肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或免疫球蛋白啟動(dòng)子等，來(lái)自熱休克啟動(dòng)子，前提是這些啟動(dòng)子與宿主細(xì)胞系統(tǒng)相容。SV40病毒的早期和晚期啟動(dòng)子可以作為還包含SV40病毒復(fù)制起點(diǎn)的SV40限制性片段而方便地獲得。人巨細(xì)胞病毒的立即早期啟動(dòng)子可以作為HindIIIE限制性片段方便地獲得。美國(guó)專利4,419，446中公開(kāi)了在哺乳動(dòng)物宿主中用牛乳頭瘤病毒作為載體來(lái)表達(dá)DNA的系統(tǒng)。美國(guó)專利4，601，978中敘述了對(duì)這個(gè)系統(tǒng)改進(jìn)。另見(jiàn)Reyes等，iV^ww,297:598-601(1982)關(guān)于在單純皰滲病毒胸苦激酶啟動(dòng)子控制下在小鼠細(xì)胞中表達(dá)人|3干擾素cDNA。備選地，可以將勞氏肉瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列用作啟動(dòng)子。fv」增強(qiáng)子無(wú)伴細(xì)、編碼本發(fā)明CD20結(jié)合抗體的DNA在高等真核生物中的轉(zhuǎn)錄常常通過(guò)將增強(qiáng)子序列插入載體中來(lái)增加。目前已知很多哺乳動(dòng)物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、曱胎蛋白和胰島素)的增強(qiáng)子序列。但通常使用真核細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子。實(shí)例包括在復(fù)制起始點(diǎn)晚期側(cè)的SV40增強(qiáng)子(bp100-270)，巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子，在復(fù)制起始點(diǎn)晚期側(cè)的多形瘤增強(qiáng)子，和腺病毒增強(qiáng)子。也可參見(jiàn)Yaniv,A^"w,297:17-18(1982)所述用于活化真核啟動(dòng)子的增強(qiáng)元件。增強(qiáng)子可以剪接插入載體中抗體編碼序列的5，或3'側(cè)，但優(yōu)選位于啟動(dòng)子的5'側(cè)。脊錄終乂iff分用于真核宿主細(xì)胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動(dòng)物、人或來(lái)自其它多細(xì)胞生物的有核細(xì)胞)的表達(dá)栽體，還可以包括對(duì)轉(zhuǎn)錄終止和mRNA穩(wěn)定所必需的序列。這些序列通常來(lái)自真核細(xì)胞或病毒的DNA或cDNA的5，(偶爾為3')非翻譯區(qū)。這些區(qū)域包含轉(zhuǎn)錄為編碼多價(jià)抗體的mRNA的非翻譯區(qū)中聚腺苷酸化片段的核苷酸片段。一種有效的轉(zhuǎn)錄終止組分是牛生長(zhǎng)激素聚腺苦酸化區(qū)。參見(jiàn)WO94/11026以及本文公開(kāi)的表達(dá)載體。^這舉;^^化荷J:細(xì)ig克隆或表達(dá)本文所述載體中的DNA的適宜宿主細(xì)胞，包括上述原核生物、酵母或高等真核細(xì)胞。適于此目的的原核生物包括真細(xì)菌，如革蘭氏陰性或革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，例如腸桿菌科(Enterobacteriaceae),如埃希氏菌屬C&c/zen'c/2/a),例如，大腸桿菌CE.co"),腸桿菌屬(五"fera^cfer),歐文菌屬(五nWw'a)，克雷白菌屬C^/e^wW/a)，變形菌桿屬(尸ra&w力，沙門菌屬(5W/wowe〃a)(長(zhǎng)口鼠i另寒沙、門菌0S""/附o"e〃fl/^//w'wwn'ww))，沙、雷菌屬(5"erraf/1/(3)(如粘質(zhì)沙雷菌(&m7"awwc^com))和志賀菌屬(幼/ge〃a)等，以及芽孢桿菌屬(5ac/〃/)如枯草芽孢桿菌(及sw6"fc)和地衣芽孢桿菌(及//c/2ew/om^)(例如1989年4月12日出版的DD266,710中所述地衣芽孢桿菌41P)等，假單胞菌屬^口#1纟錄菌4艮單月包菌oferwg7'"c^(3),及鏈霉菌(&reptom;;ce力。優(yōu)選的大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294(ATCC31,446)，但其它菌林，如大腸桿菌B，大腸桿菌X1776(ATCC31,537)和大腸桿菌W3110(ATCC27,325)也是合適的。這些實(shí)例是用于說(shuō)明，并非限制。全長(zhǎng)抗體、抗體片段與抗體融合蛋白質(zhì)可以在細(xì)菌中產(chǎn)生，特別是當(dāng)不需要糖基化作用與Fc效應(yīng)子功能時(shí)，例如當(dāng)治療抗體偶聯(lián)至細(xì)胞毒藥劑(例如毒素)并且免疫偶聯(lián)物自身顯示在破壞胂瘤細(xì)胞上的效力時(shí)。全長(zhǎng)抗體在循環(huán)中具有更長(zhǎng)的半衰期。在大腸桿菌中生產(chǎn)是更快和更具有成本效率的。對(duì)于抗體片段與多肽在細(xì)菌中的表達(dá)，見(jiàn)例如美國(guó)專利5,648，237(Carteret.al.)，美國(guó)專利5，789，199(Jolyetal.)，與美國(guó)專利5,840,523(Simmonsetal.),其中描繪了用于最優(yōu)化表達(dá)與分泌的翻譯起始區(qū)域(TIR)和信號(hào)順序，這些專利在此引入作為參考。在表達(dá)之后，抗體從大腸桿菌細(xì)胞糊狀混合物中在可溶組分中分離，并且取決于同種型，可以通過(guò)例如蛋白A或者G柱純化。最后純化可以以類似于純化在CHO細(xì)胞中表達(dá)的抗體的程序進(jìn)行。除了原核生物，真核微生物如絲狀真菌或酵母也是適合于編碼CD20結(jié)合#元體的載體的克隆或表達(dá)宿主。酉良酒酵母(5"acc/207wwjKcescerev7、/ae)或常見(jiàn)的面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。還有多個(gè)其它屬、種和抹已有商品供應(yīng)，并且可以用于本發(fā)明，例如粟酒裂殖酵母(Sc/n'zosacc/zarawyc&s1pom6e);克魯維酵母屬(X7wyveramyces)宿主,侈'H口乳克魯維酵母(K/flc他)、脆壁克魯維酵母(/rag/fc)(ATCC12,424)、保加利亞克魯維酵母(K6w/gan'cw力(ATCC16,(M5)、威克曼氏克魯維酵母(尺.w/cferam")(ATCC24，178)、Kwa/"/(ATCC56,500)、果蠅克魯維酵母(尺.Awo;/n7aram)(ATCC36，906)、耐熱克魯維酵母(KAe/7wto/erara)和馬克斯克魯維氏酵母(/:.wwx/am^)等；西洋蓍霉0wrow/a)(EP卯2，2M);巴斯德畢赤酵母0/c/n'a/oston;)(EP183,070);念珠菌屬(Camfe/");7Hc/2o^rwaew'a(EP244，234);粗糙鏈孢霉(7Vewmy;ora;許旺氏酵母屬(sc/2麗ww.omyce力如西方許旺氏酵母(sc/z而wm'cw7c"oc"'ofe她//力等；和絲狀真菌,i"列^口"f連孑包霉屬(iVeMnw/on3)、青霉屬(尸e"/c/〃/ww)、7b(v/oc/acZ/w/w以及曲霉屬宿主如構(gòu)巢曲霉(AmV/w/a""和黑曲霉(Am'ger)等。適合于表達(dá)糖基化CD20結(jié)合抗體的宿主細(xì)胞來(lái)自多細(xì)胞生物。無(wú)脊推動(dòng)物細(xì)胞的實(shí)例包括植物和昆蟲細(xì)胞。目前已經(jīng)從下述宿主中鑒定了大量的桿狀病毒林和變體以及相應(yīng)的容許型昆蟲宿主細(xì)胞草地夜蛾(5^ocb/^erai^wg^eraa，毛蟲)、i矣及〗尹蟲丈(」aegvp",蟲丈子)、白纟丈〗尹蟲文(」e(iesa/6o/〖c/ws,蟲丈子)、Dnwop/n'/awe/awoga^er(果蟲菱)禾口家蠶蛾(5ow6yA:mon')等。用于轉(zhuǎn)染的各種病毒抹可以公開(kāi)地獲得，例如加利福尼亞Y級(jí)夜蛾C4wtogra/7/2aca/z/orm'a)NPV的L-l變體和家蠶蛾NPV的Bm-5林，并且這些病毒可以在此用作本發(fā)明的病毒，尤其是用于轉(zhuǎn)染草地夜蛾細(xì)胞。棉花(cotton)、玉米(corn)、土豆(potato)、大豆(soybean)、矮牽牛(petunia)、西紅柿(tomato)和煙草(tobacco)的植物細(xì)胞培養(yǎng)物也可以用作宿主。然而，關(guān)注最多的是脊推動(dòng)物細(xì)胞，而且在培養(yǎng)(組織培養(yǎng))中繁殖脊推動(dòng)物細(xì)胞已經(jīng)成為常規(guī)方法。有效哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的實(shí)例是用SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1細(xì)胞系(COS-7，ATCCCRL1651);人胚腎細(xì)胞系(293細(xì)胞或經(jīng)過(guò)再克隆后能在懸浮培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的293細(xì)胞，Graham等，Wra/.36:59(1977));倉(cāng)鼠幼鼠腎細(xì)胞(BHK,ATCCCCL10);中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞ADHFR(CHO，Urlaub等，戶rac.A^/.^a^.Sc/.t/.S.A77:4216(1980));小鼠足細(xì)胞(TM4，Mather,5/o/.23:243-251(1980));猴腎細(xì)胞(CV1ATCCCCL70);非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO-76，ATCCCRL-1587);人宮頸癌細(xì)胞(HELA,ATCCCCL2);犬腎細(xì)胞(MDCKATCCCCL34);布法羅(buffalo)大鼠肝細(xì)胞(BRL3A，ATCCCRL1442);人肺細(xì)胞(W138，ATCCCCL75);人肝細(xì)胞(HepG2，HB8065);小鼠乳腺肺瘤(MMT060562,ATCCCCL51);TRI細(xì)胞(Mather等，7VUcad383:44-68(1982));MRC5細(xì)胞；FS4細(xì)胞；和人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系(HepG2)。宿主細(xì)胞用上述用于制備CD20結(jié)合抗體的表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)化，并在改進(jìn)型傳統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基經(jīng)改進(jìn)已適于誘導(dǎo)啟動(dòng)子、篩選轉(zhuǎn)化體、或擴(kuò)增編碼所需序列的基因?！?}接#涼力皮應(yīng)用于產(chǎn)生本發(fā)明的CD20結(jié)合抗體的宿主細(xì)胞可以在各種培養(yǎng)基中培養(yǎng)。市售培養(yǎng)基如Ham'sF10(Sigma),極限必需培養(yǎng)基((MEM)，Sigma)，RPMI-1640(Sigma),和Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基((DMEM)，Sigma)都適于j備養(yǎng)戶斤述宿主纟田月包。jt匕夕卜，HamWa/.,tW^/z.Swz.58:44(1979)，BarnesW爿"a/.102:255(1980)，U.S.Pat.Nos.4,767,704;4,657,866;4,927,762;4,560,655;or5,122,469;WO90/03430;WO87/00195;或U.S.PatentRe.30，985所述的任一種培養(yǎng)基也可以用作宿主細(xì)胞培養(yǎng)基。任何上述培養(yǎng)基可以根據(jù)需要添加激素和/或其它生長(zhǎng)因子(如胰島素，運(yùn)鐵蛋白，或表皮生長(zhǎng)因子)，鹽(如氯化鈉，釣，鎂，和磷酸鹽)，緩沖液(如HEPES),核苷酸(如腺苷和胸苷)，抗生素(如Gentamycin),痕量元素(定義為通常以微摩爾水平的終濃度出現(xiàn)的無(wú)機(jī)化合物)，和葡萄糖或等效能源。還可以包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適當(dāng)濃度的任何其它必需添加物。培養(yǎng)條件，如溫度，pH等，都是在選定的表達(dá)宿主上已用到的那些，并且對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言也是顯而易見(jiàn)的。p力在謬趟化使用重組技術(shù)時(shí)，所述抗體可產(chǎn)生在細(xì)胞內(nèi)，在周質(zhì)空間中，或直接分泌到培養(yǎng)基中。如果所述抗體是產(chǎn)生在細(xì)胞內(nèi)，首先要通過(guò)例如離心或超濾作用除去顆粒狀殘?jiān)?為宿主細(xì)胞或裂解的片^:)。Carter"a/.,歷o/Tec/mo/^y10:163-167(1992)描述了一種將已分泌到大腸桿菌周質(zhì)空間中的抗體分離的方法。簡(jiǎn)言之，在有乙酸鈉(pH3.5),EDTA，和苯曱基磺酰氟(PMSF)存在的情況下將細(xì)胞團(tuán)解凍約30分鐘。細(xì)胞碎片可以通過(guò)離心除去。在抗體分泌至培養(yǎng)基的情況中，通常首先使用諸如Amicon或MilliporePellicon超濾單元等市售蛋白濃縮濾器濃縮這類表達(dá)系統(tǒng)的上清。上述任一步驟中可以包括PMSF等蛋白酶抑制劑，以便抑制蛋白水解，還可以包括抗生素，以便防止外來(lái)污染物(adventitiouscontaminant)的生長(zhǎng)。從所述細(xì)胞制備的抗體組合物可以利用，例如，羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析、和親和層析等方法純化，優(yōu)選親和層析純化技術(shù)。蛋白A作為親和配體的適宜性有賴于所述抗體中存在的任何免疫球蛋白Fc區(qū)的種類和同種型。蛋白A可以用來(lái)純化基于人yl,或丫4重鏈的抗體(Lindmark"a/.，J://wmwo/.M"/2.62:1-13(1983))。蛋白G被建議用于所有小鼠同種型以及用于人丫3(Guss"a/"五M5(9J:5:15671575(1986))。親和配體附著的基質(zhì)最常是瓊脂糖，也可以采用其它基質(zhì)。機(jī)械穩(wěn)定的基質(zhì)例如控制孔徑的3皮璃(controlledporeglass)或聚(苯二乙烯)苯(poly(styrenedivinyl)benzene)與瓊脂糖相比，其流速更快且處理時(shí)間更短。當(dāng)抗體包含Ch3區(qū)時(shí)，可以用BakerbondABXTM樹脂(J.T.Baker,Phillipsburg，NJ)純化。其它蛋白純化技術(shù)，例如離子交換柱分級(jí)分離，乙醇沉淀，反相HPLC，硅層析，肝素SEPHAROSETM層析，陽(yáng)離子或陰離子交換樹脂(例如聚天冬氨酸柱)層析，層析聚焦，SDS-PAGE，和硫酸銨沉淀也可以采用，這取決于所回收的抗體。在任何初步提純步驟之后，在pH大約2.5-4.5之間利用洗脫緩沖液對(duì)包含目的抗體與污染物的混合物進(jìn)行低pH疏水相互作用層析，優(yōu)選地在低鹽濃度下進(jìn)行(例如大約0-0.25M鹽)?？贵w偶聯(lián)物抗體可被偶聯(lián)至細(xì)胞毒性劑例如毒素或放射性同位素。在某些實(shí)施方式中，毒素是力口利車霉素、maytansinoid、多拉司他汀、auristatinE與其類似物或衍生物是優(yōu)選的。優(yōu)選的藥物/毒素包括DNA損傷劑、微管聚合或解聚抑制劑與抗代謝物。細(xì)胞毒藥劑的優(yōu)選類別包括，例如，酶抑制劑例如二氫葉酸還原酶抑制劑，與胸苷酸合酶抑制劑，DNA嵌入劑，DNA裂解劑、拓樸異構(gòu)酶抑制劑、蒽環(huán)類抗生族藥物、長(zhǎng)春花屬藥物、絲裂霉素素、博來(lái)霉素、細(xì)胞毒核苷、喋啶族藥物、diynenes、鬼臼霉素與分化誘導(dǎo)物。這些類別的特別有用的成員包括，例如，氨曱喋呤，曱氨喋呤，二氯氨曱喋呤，5-氟尿嘧啶，6-巰基嘌呤，阿糖胞苷，美法侖，環(huán)氧長(zhǎng)春堿，洛諾西丁、放線菌素、道諾紅菌素、阿霉素、N-(5，5-二醋氧戊基)阿霉素、嗎啉代阿霉素、l-(2-氯乙基)-l，2-二精脒曱磺酰酰肼、N8-乙?；?、氨基蝶呤曱氨喋呤、esperamidn、絲裂霉素C、絲裂霉素A、放線菌素、博來(lái)霉素、洋紅霉素、氨基蝶呤、太利蘇霉素、鬼臼霉素與鬼臼霉素衍生物例如鬼臼亞乙苷或鬼臼亞乙苷磷酸鹽、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、去乙酰長(zhǎng)春酰胺、紫杉酚、泰索帝、視黃酸、丁酸、N8-乙?；?、喜樹堿、加利車霉素、苔蘚才中素、cephalostatins、美登木素、布4立》也殺斤4內(nèi)、maytansinoids例i口DM-1、美登素、美登醇、N-去曱基-4,5-去環(huán)氧基美登醇、C-19-去氯美登醇、C-20-羥美登醇、C-20-去曱氧基美登醇、C-9-SH美登醇、C-14-烷氧基曱基美登醇、C-14-雍基或乙酰氧曱基美登醇、C-15-羥基/乙酰氧美登醇、C-15-曱氧基美登醇、C-l8-N-去甲基美登醇與4,5-脫氧美登醇、auristatins例如auristatinE、M、PHE與PE;dolostatins例如dolostatinA、dolostatinB、dolostatinC、dolostatinD、dolostatinE、(20-epi與ll-epi)、dolostatinG、dolostatinH、dolostatinI、dolostatin1、dolostatin2、dolostatin3、dolostatin4、dolostatin5、dolostatin6、dolostatin7、dolostatin8、dolostatin9、dolostatin10、deo-dolostatin10、dolostatin11、dolostatin12、dolostatin13、dolostatin14、dolostatin15、dolostatin16、dolostatin17、與dolostatin18;cephalostatins例如cephalostatin1、cephalostatin2、cephalostatin3、cephalostatin4、cephalostatin5、cephalostatin6、cephalostatin7、25'-epi-cephalostatin7、20-epi-cephalostatin7、cephalostatin8、cephalostatin9、cephalostatin10、cephalostatin11、cephalostatin12、cephalostatin13、cephalostatin14、cephalostatin15、cephalostatin16、cephalostatin17、cephalostatin18、與cephalostatin19。Maytansinoids是有絲分裂抑制劑，通過(guò)抑制微管蛋白聚合而起作用。美登素最初從東非灌木齒葉美登木分離出來(lái)(美國(guó)專利3，896，111)。隨后，人們發(fā)現(xiàn)某些微生物也產(chǎn)生maytansinoids,例如美登醇與C-3美登醇酯(美國(guó)專利4,151,042)。在美國(guó)專利4,137,230;4，248，870;4,256,746;4,260,608;4，265，814;4,294,757;4,307,016;4,308,268;4,308,269;4,309,428;4,313,946;4,315,929;4317,821;4,322,348;4,331,598;4,361,650;4,364,866;4,424,219;4,450,254;4,362,663;與4,371,533中披露了合成美登醇與其衍生物和類似物，在此特別地引入作為參考。美登素與maytansinoids已與特定地與腫瘤細(xì)胞抗原結(jié)合的抗體偶聯(lián)。包含maytansinoids的免疫偶聯(lián)物及其治療用途在例如美國(guó)專利5，208，020，5,416,064與歐洲專利EP0425235B1中披露，其公開(kāi)在此特別地引入作為參考。Liuetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:8618-8623(1996)描述了包含指定為DM1的maytansinoid，該maytansinoid與4f只于人結(jié)腸直腸癌癥的單克隆抗體C242連接。偶聯(lián)物被發(fā)現(xiàn)對(duì)培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞具有高度細(xì)胞毒性，并且在體內(nèi)胂瘤生長(zhǎng)試驗(yàn)中顯示抗肺瘤活性。Charietal.CancerResearch52:127-131(1992)描述了免疫偶聯(lián)物，其中maytansinoid通過(guò)二硫鍵接頭與鼠抗體A7偶聯(lián)，該鼠抗體A7與人結(jié)腸癌細(xì)胞系上的抗原結(jié)合，或者maytansinoid偶聯(lián)至另一鼠單克隆抗體TA.l，該抗體與HER-2/neu癌基因結(jié)合。本領(lǐng)域已知許多連接基團(tuán)用于制備抗體maytansinoid偶聯(lián)物，包括，例如，在美國(guó)專利5，208,020或EP專利0425235B1，與Charietal.CancerResearch52:127-131(1992)中所披露的。連接基團(tuán)包括如上述專利中所披露的二硫化物基團(tuán)、硫醚基團(tuán)、對(duì)酸敏感的基團(tuán)、對(duì)光敏感的基團(tuán)、對(duì)肽酶敏感的基團(tuán)、或?qū)︴ッ该舾械幕鶊F(tuán)，優(yōu)選二硫化物與硫醚基團(tuán)?？梢允褂酶鞣N雙功能蛋白偶聯(lián)劑制備抗體與maytansinoid的偶聯(lián)物，例如N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二巰基)丙酸鹽(SPDP)、琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來(lái)酰亞胺曱基)環(huán)己烷-l-羧酸鹽、iminothiolane(IT)、亞氨酸酯的雙功能衍生物(例如二甲基己二酰亞氨酯HCL)，活性酯(例如二琥珀酰亞胺基辛二酸酯)、醛(例如戊二醛)、二疊氮化物(例如二-(p-疊氮苯曱?；?已二胺)、二重氮衍生物(例如二-(p-重氮苯曱酰基)-乙二胺)、二異氰酸鹽(例如曱苯2,6-二異氰酸鹽)、與二-活性氟化合物(例如1,5-二氟-2，4-二硝基苯)。特別優(yōu)選的偶聯(lián)劑包括N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二巰基)丙酸鹽(SPDP)(Carlssonetal.，Biochem.J.173:723-737[1978])與N畫琥珀酰亞胺基-4-(2-吡啶基巰基)戊酸鹽(SPP)，以提供二硫鍵。取決于連接類型，接頭可以附著于maytansinoid分子的各個(gè)位置。例如，利用常規(guī)的偶聯(lián)技術(shù)，用羥基反應(yīng)可以形成酯鍵。反應(yīng)可以發(fā)生在有羥基的C-3位置，C-14位置用羥曱基修飾，C-15位置用羥基修飾，C-20位置具有羥基。在優(yōu)選實(shí)施方式中，在美登醇或美登醇類似物的C-3位置形成連接*辦另一個(gè)感興趣的免疫偶聯(lián)物包含偶聯(lián)至一或多個(gè)加利車霉素分子的CD20結(jié)合抗體。加利車霉素族抗生素能夠在皮摩爾濃度以下產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂。制備加利車霉素族的偶聯(lián)物參見(jiàn)美國(guó)專利5,712,374，5,714,586，5,739,116,5,767285,5,770,701,5,770,710，5，773，001,5，877,296(均屬于AmericanCyanamidCompany)?？杀皇褂玫募永嚸顾氐慕Y(jié)構(gòu)類似物包括，4旦不局限于，yl1，a21，a31，N-乙酰基yl1，PSAG與211(Hinmanetal.CancerResearch53:3336-3342(1993),Lodeetal.CancerResearch58:2925-2928(1998)與前面提到過(guò)的屬于AmericanCyanamid的美國(guó)專利)。另一個(gè)可以偶聯(lián)至抗體的抗腫瘤藥物是QFA,其為抗葉酸物。加利車霉素與QFA均具有胞內(nèi)作用位點(diǎn)，并且不容易越過(guò)質(zhì)膜。因此，通過(guò)抗體介導(dǎo)的內(nèi)在化所導(dǎo)致的這些藥劑的細(xì)胞攝取大大增強(qiáng)他們的細(xì)胞毒效果。放射性同位素抗體可以包含高度放射性原子以選擇性破壞腫瘤。已有各種放射性同位素用于生產(chǎn)放射性偶聯(lián)的抗CD20抗體。實(shí)例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re'88、Sm153、Bi212、P32、Pb212與Lu的放射性同位素。當(dāng)偶聯(lián)物被用于診斷時(shí)，其可包含放射性原子用于閃爍法研究，例如tc"m或I123,或包含自旋標(biāo)記物用于核/磁共振(NMR)成像(又名》茲共振成象，mri),例如還是石典-123,碘-131,銦-111,氟國(guó)19，碳隱13,氮畫15，氧-17,4U，錳或鐵。放射性或其它標(biāo)記可以已知方式摻入偶聯(lián)物。例如，肽可以生物合成或可以利用合適的氨基酸前體經(jīng)由化學(xué)氨基酸合成來(lái)合成，化學(xué)氨基酸合成涉及例如用氟-19代替氫。標(biāo)記例如tc"m或I123、Re186、Re哪與In'"可以通過(guò)肽中的半胱氨酸殘基附著。釔-90可以通過(guò)賴氨酸殘基附著。IODOGEN方法(Frakeretal(1978)Biochem,Biophys.Res.Commun.80:49-57)可用于摻入石典-123。"MonoclonalAntibodiesinImmunoscintigraphy"(Chatal,CRCPress1989)詳細(xì)描述了其它方法?？梢允褂酶鞣N雙功能蛋白偶聯(lián)劑制備抗體與細(xì)胞毒性劑的偶聯(lián)物，例如N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二巰基)丙酸鹽(SPDP)、琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來(lái)酰亞胺曱基)環(huán)己烷-l-羧酸鹽、iminothiolane(IT)、亞氨酸酯的雙功能衍生物(例如二曱基己二酰亞氨酯HCL),活性酯(例如二琥珀酰亞胺基辛二酸酯)、醛(例如戊二醛)、二疊氮化物(例如二-(p-疊氮苯甲?；?已二胺)、二重氮衍生物(例如二-(p-重氮笨曱?；?-乙二胺)、二異氰酸鹽(例如曱苯2，6-二異氰酸鹽)、與二-活性氟化合物(例如1，5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以如Vitettaetal.Science238:1098(1987)描述制備蓖麻毒免疫毒素。碳-14-標(biāo)記的l-異硫氰酸節(jié)基-3-曱基二乙烯-三胺五乙酸(MX-DTPA)是示例性的螯合劑，用來(lái)將放射性核苷酸結(jié)合至抗體。見(jiàn)WO94/11026。接頭可以是"可斷裂的接頭"，以促進(jìn)細(xì)胞毒類藥物在細(xì)胞中的釋放。例如，可使用酸不穩(wěn)定的接頭、肽酶敏感的接頭、光敏感的接頭、二曱基接頭或包含二硫化物的接頭(Charietal.CancerResearch52:127-131(1992);美國(guó)專利5,208,020)。CD20結(jié)合抗體的治療用途本發(fā)明的CD20結(jié)合抗體可用于治療多種惡性與非惡性疾病，包括自身免疫病與相關(guān)病癥，與CD20陽(yáng)性癌癥，包括B細(xì)胞淋巴瘤與白血病。骨髓中的干細(xì)胞(B細(xì)胞祖先)缺乏CD20抗原，允許健康B細(xì)胞在治療后再生，并在幾個(gè)月之內(nèi)回復(fù)至正常水平。風(fēng)濕性關(guān);炎,'i關(guān)節(jié)i^，牛皮癬關(guān)節(jié)炎)，、牛:癬:皮炎包括異位性皮炎；慢性自身免疫蕁麻疹，多肌炎/皮肌炎，中毒性表皮壞死松解，全身性硬皮病/硬化癥，與炎性腸疾病(inflammatoryboweldisease(IBD))有關(guān)的應(yīng)答(Crobn，s病，潰瘍性結(jié)腸炎)，呼吸窘迫綜合癥，成人呼吸窘迫綜合癥，腦膜炎，過(guò)敏性鼻炎，腦炎，葡萄膜炎，結(jié)腸炎，腎小球腎炎，過(guò)敏性病癥，濕滲，哮喘，T細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)的病癥和慢性炎癥反應(yīng)，動(dòng)脈粥樣硬化，自身免疫性心肌炎，白細(xì)胞粘附缺陷，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE),狼瘡(包括腎炎型，非腎型，盤型，脫發(fā)型)，少年發(fā)作的糖尿病(juvenileonsetdiabetes),多發(fā)性硬化，變應(yīng)性腦脊髓炎，細(xì)胞因子與T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的與急性和遲發(fā)性過(guò)敏反應(yīng)有關(guān)的免疫反應(yīng)，肺結(jié)核，結(jié)節(jié)病，肉芽腫病包括韋格內(nèi)氏肉芽腫病，粒細(xì)胞缺乏癥，血管炎，再生障礙性貧血，庫(kù)姆斯氏陽(yáng)性貧血，戴布二氏貧血，免疫性溶血性貧血包括自身免疫性溶血性貧血(AIHA)，惡性貧血，純紅細(xì)胞發(fā)育不全(PRCA),凝血因子VIII缺乏，甲型血友病，自身免疫性中性白細(xì)胞減少，全血細(xì)胞減少癥，白血球減少癥，涉及白細(xì)胞血細(xì)胞滲出的疾病，CNS炎性紊亂，多器官損傷綜合癥，重癥肌無(wú)力，抗原抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾病，抗腎小球基底膜疾病，抗磷脂抗體綜合癥，過(guò)敏性神經(jīng)炎，Bechet病，Castleman綜合癥，古德帕斯徹氏綜合癥，蘭-伊二氏類重癥肌無(wú)力綜合征，雷諾氏綜合癥，斯耶格侖氏綜合癥，斯-約二氏綜合癥，實(shí)體器官移植排斥(包括對(duì)高位反應(yīng)性抗體滴度的預(yù)處理，IgA在組織沉積，等等)，移植物抗宿主病(GVhD),天皰瘡樣大皰，天皰瘡(所有的，包括尋常的、葉狀的)，自身免疫性多內(nèi)分泌腺病，賴特爾氏病(Reiter'sdisease),僵人綜合癥，巨細(xì)胞性動(dòng)脈炎，免疫復(fù)合物性腎炎，IgA腎病，IgM多神經(jīng)病或IgM介導(dǎo)的神經(jīng)病，特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)，血栓性血小板減少性紫癜(TTP),自身免疫性血小板減少，睪丸與卵巢的自身免疫病包括自身免疫性睪丸炎與卵巢炎，原發(fā)性曱狀腺功能減退，自身免疫性內(nèi)分泌疾病包括自身免疫性曱狀腺炎，慢性甲狀腺炎(橋本氏曱狀腺炎)，亞急性曱狀腺炎，自發(fā)性曱狀腺機(jī)能減退，阿狄森氏病，格雷夫斯氏病、自身免疫的多腺綜合癥(或多腺內(nèi)分泌病綜合癥)，I型糖尿病也稱為胰島素依賴性糖尿病(IDDM)與席漢氏綜合癥，自身免疫性肝炎，淋巴結(jié)間質(zhì)肺炎(HIV),閉塞性細(xì)支氣管炎(非移植)與NSIP，格-巴二氏綜合癥，大血管血管炎(包括風(fēng)濕性多肌痛與巨細(xì)胞(高安氏)動(dòng)脈炎)，中等血管血管炎(包括川崎病與結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎)，強(qiáng)直性脊柱炎，貝爾格爾氏病(IgA腎病)，快速進(jìn)展的腎小球腎炎，原發(fā)性膽汁性肝硬變，Celiacsprue(粘膠質(zhì)腸病)，冷球蛋白血癥，ALS，冠狀動(dòng)爿永病。CD20陽(yáng)性癌癥是那些包含在細(xì)胞表面表達(dá)CD20的細(xì)胞的異常增殖的癌癥。CD20陽(yáng)性B細(xì)胞胂瘤包括CD20陽(yáng)性何杰金氏病，包括淋巴細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)的何杰金氏病(LPHD);非何杰金氏淋巴瘤(NHL);濾泡中心細(xì)胞(FCC)淋巴瘤；急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL);慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL);毛細(xì)胞白血病。非何杰金氏淋巴瘤包括低級(jí)/濾泡的非何杰金淋巴瘤(NHL)，小淋巴細(xì)胞性淋巴瘤(SLL)，中等/濾泡NHL,中等擴(kuò)散NHL，高級(jí)成免疫細(xì)胞的(highgradeimmuoblastic)NHL,高級(jí)成淋巴細(xì)胞的NHL,高級(jí)小非核裂細(xì)月包(highgradesmallnon-cleavedcell)NHL,bulkydiseaseNHL,類漿細(xì)月包淋巴細(xì)胞性淋巴瘤，套細(xì)胞淋巴瘤，AIDS相關(guān)的淋巴瘤與瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥。也涉及這些癌癥復(fù)發(fā)的治療。LPHD是一類何杰金氏病，盡管用放射或化學(xué)療法治療仍傾向經(jīng)常復(fù)發(fā)，其特征在于CD20陽(yáng)性的惡性細(xì)胞。CLL是四種主要類型的白血病之一。作為稱為淋巴細(xì)胞的成熟B細(xì)胞的癌癥，CLL表現(xiàn)為細(xì)胞在血液、骨髓與淋巴組織中的進(jìn)行性堆積。在具體的實(shí)施方式中，人源化CD20結(jié)合抗體與其功能性片段被用于治療非何杰金氏淋巴瘤(NHL),淋巴細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)的何杰金氏病(LPHD)，小淋巴細(xì)胞性淋巴瘤(SLL)，慢性淋巴細(xì)胞性白血病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎與青年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)包括狼瘡腎炎，韋格內(nèi)氏病，炎癥性腸病，特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)，血栓性血小板減少性紫癜(TTP),自身免疫性血小板減少，多發(fā)性硬化，牛皮癬，IgA腎病，IgM多神經(jīng)病，重癥肌無(wú)力，血管炎，糖尿病，雷諾氏癥，斯耶格侖氏綜合癥與腎小球腎炎。人源化CD20結(jié)合抗體或其功能性片段可用在對(duì)，例如，復(fù)發(fā)或難治的低級(jí)或?yàn)V泡CD20陽(yáng)性B細(xì)胞NHL的單一藥劑治療中，或者可以在多種藥物療法中與其它藥物聯(lián)合對(duì)病人給藥。無(wú)痛淋巴瘤是一緩慢增長(zhǎng)、不可治愈的疾病，其中一般的病人存活六到十年之間，經(jīng)歷多個(gè)癥狀緩解與復(fù)發(fā)周期。在一個(gè)實(shí)施方式中，人源化CD20結(jié)合抗體或其功能性片段被用來(lái)治療無(wú)痛NHL。評(píng)估肺瘤治療效力或成績(jī)的參數(shù)對(duì)于對(duì)該恰當(dāng)疾病熟悉的醫(yī)師來(lái)說(shuō)是已知的。通常，熟練醫(yī)師將試圖減少該特定疾病的體征和癥狀。參數(shù)可以包括疾病進(jìn)行的中值時(shí)間、癥狀緩解時(shí)間及病情平穩(wěn)。以下參考文獻(xiàn)描述了淋巴瘤與CLL，其診斷、治療和用于測(cè)量治療效力的標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)學(xué)程序。CanellosGP,Lister,TA，SklarJL:T7zeZ^wp/wwos.W.B.SaundersCompany,Philadelphia,1998;vanBesienKandCabanillas,F:ClinicalManifestations,StagingandTreatmentofNon-Hodgkin'sLymphoma,第70章,pp1293-1338,在//emato/ogy,5ow/cPn'"")/^a"t/ZVac"ce，3rded.Hoffmanetal.(editors).ChurchillLivingstone,Philadelphia,2000中；和Rai,KandPatel，D:ChronicLymphocyticLeukemia,第72章,pp1350-1362，在//ewafo/ogy,5as7.c/V/wc^/eya"<i尸narc7'ce,3rded.Hoffmanetal.(editors).ChurchillLivingstone,Philadelphia,2000.評(píng)估治療自身免疫或自身免疫相關(guān)疾病效力或成績(jī)的參數(shù)對(duì)于在該恰當(dāng)疾病領(lǐng)域熟練的醫(yī)師來(lái)說(shuō)是已知的。通常，熟練醫(yī)師將試圖減少該特定疾病的體4正和癥狀。以下舉例i兌明。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的特征在于多關(guān)節(jié)炎癥、軟骨損耗與骨侵蝕，導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞，并且最終減低關(guān)節(jié)功能。另外，由于RA是全身疾病，其可對(duì)其它組織例如肺、眼與骨髓產(chǎn)生作用。在患RA超過(guò)10年的病人中不到50%能繼續(xù)進(jìn)行曰常工4乍或生活。抗體可以在早期RA(即未用氨曱喋呤(MTX)治療的)病人中作為第一線治療使用，可作為單一治療藥物使用，或者與例如MTX或環(huán)磷酰胺聯(lián)合使用?；蛘?，抗體可以在治療DMARD和/或MTX難治的病人中作為第二線治療藥物使用，可作為單一治療藥物使用，或者與例如MTX聯(lián)合使用。人源化CD20結(jié)合抗體在預(yù)防和控制關(guān)節(jié)損害、延緩結(jié)構(gòu)破壞、降低與RA中炎癥相關(guān)的疼痛中有用，并且通常在中度至嚴(yán)重RA中減少體征和癥狀。可以在用其它用于治療RA的藥物治療之前、之后或過(guò)程中用人源化CD20抗體治療RA病人(見(jiàn)下面的聯(lián)合治療)。在一個(gè)實(shí)施方式中，先前曾用具有減輕疾病效果的抗風(fēng)濕藥治療失敗和/或?qū)H用氨曱喋呤治療反應(yīng)不足的病人用本發(fā)明的人源化CD20結(jié)合抗體治療。在這一治療的實(shí)施方式中，對(duì)病人實(shí)施17天的治療方案，其中僅接受人源化CD20結(jié)合抗體(在第1與第15天，lgiv輸注)；CD20結(jié)合抗體加環(huán)石粦酰胺(在第3與第17天，750mgiv輸注)；或者CD20結(jié)合抗體加氨曱喋呤。評(píng)價(jià)RA治療效力的一個(gè)方法是以美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)學(xué)院(ACR)標(biāo)準(zhǔn)為基礎(chǔ)，該標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量在關(guān)節(jié)觸痛與肺脹上改善的百分比，同時(shí)測(cè)量其它內(nèi)容。與未用抗體治療(例如治療前基線)或用安慰劑治療相比較，RA病人可被評(píng)分為，例如ACR20(改善20%)。評(píng)價(jià)抗體治療效力的其它途徑包括X線評(píng)分，例如SharpX線評(píng)分，該評(píng)分被用來(lái)對(duì)結(jié)構(gòu)破壞例如骨侵蝕與關(guān)節(jié)間隙變窄評(píng)分。在治療期間或之后，也可以健康評(píng)估調(diào)查表[HAQ]評(píng)分、AIMS評(píng)分、SF36為基礎(chǔ)，評(píng)價(jià)病人殘疾的預(yù)防或改善。ACR20標(biāo)準(zhǔn)可以包括在觸痛(疼痛)關(guān)節(jié)計(jì)數(shù)與腫脹關(guān)節(jié)計(jì)數(shù)上改善20%,加上在如下5個(gè)附加測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)中至少3個(gè)改善20%:用視覺(jué)模擬尺度(VAS)評(píng)估病人疼痛，病人對(duì)疾病活動(dòng)性的綜合評(píng)估(VAS)，醫(yī)師對(duì)疾病活動(dòng)性的綜合評(píng)估(VAS)病人通過(guò)健康評(píng)估調(diào)查表對(duì)殘疾的自我評(píng)估，和急性期反應(yīng)物，CRP或ESR。ACR50與70類似地進(jìn)行定義。優(yōu)選地，給予病人有效量的本發(fā)明的CD20結(jié)合抗體，以達(dá)到評(píng)分為至少ACR20，優(yōu)選地至少ACR30,更優(yōu)選地至少ACR50，甚至更優(yōu)選地至少ACR70，優(yōu)選地至少ACR75和更高。牛皮癬關(guān)節(jié)炎具有獨(dú)一無(wú)二和特殊的放射線照相特征。對(duì)于牛皮癬關(guān)節(jié)炎而言，關(guān)節(jié)侵蝕與關(guān)節(jié)間隙變窄也可以用Sharp記分評(píng)估。本發(fā)明的人源化CD20結(jié)合抗體可用于防止關(guān)節(jié)損害和減少該紊亂的疾病體征和癥狀。本發(fā)明的另一方面為通過(guò)給予患SLE的患者治療有效量的本發(fā)明的人源化CD20結(jié)合抗體，治療狼瘡或SLE的方法。SLEDAI評(píng)分提供疾病活動(dòng)性的數(shù)值定量。SLEDAI是24個(gè)已知與疾病活動(dòng)性相關(guān)的臨床與實(shí)驗(yàn)室參數(shù)的加權(quán)指數(shù)，數(shù)值范圍為0-103。見(jiàn)BryanGescuk&JohnDavis,"Noveltherapeuticagentforsystemiclupuserythematosus"在CurrentOpinioninRheumatology2002，14:515-521中。針對(duì)雙鏈DNA的抗體被認(rèn)為導(dǎo)致腎性潮紅(renalflares)及其它狼瘉表現(xiàn)?？梢詫?duì)進(jìn)行抗體治療的病人隨時(shí)間監(jiān)測(cè)腎性潮紅，其被定義為血清肌酸酐、尿蛋白質(zhì)或血尿的顯著的、可再現(xiàn)的增加。或者或另外，可以監(jiān)測(cè)病人抗核抗體與抗雙鏈DNA抗體的水平。對(duì)于SLE的治療包括高劑量皮質(zhì)類固醇和/或環(huán)磷酰胺(HDCC)。脊推關(guān)節(jié)病是關(guān)節(jié)的一組疾病，包括強(qiáng)直性脊柱炎、牛皮癬關(guān)節(jié)炎與克朗氏病(crohn'sdisease)。治療成果可以用經(jīng)驗(yàn)證實(shí)的病人與醫(yī)師綜合評(píng)估測(cè)量工具來(lái)判定。各種藥物被用來(lái)治療牛皮癬，治療與疾病嚴(yán)重程度直接有關(guān)。具有較輕型牛皮癬的病人一般用局部治療，例如局部類固醇、蒽林、卡泊三烯、氯氟美松、與他佐羅汀，以控制病癥，而具有中度與重度牛皮癬的病人則更可能使用系統(tǒng)的(氨甲喋呤、類視黃醇、環(huán)孢菌素、PUVA與UVB)療法。也使用焦油(Tars)。這些療法的缺點(diǎn)在于安全性考慮、耗時(shí)或治療過(guò)程不便利。此外，有些要求昂貴的設(shè)備與在辦公室環(huán)境下設(shè)定專用空間。系統(tǒng)藥物可產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，包括高血壓、高脂血癥、骨髓抑制、肝臟疾病、腎病與胃腸不適。并且，使用光照療法可以增加皮膚癌的發(fā)病率。除與使用局部治療相關(guān)的不便與不適之外，光照療法和系統(tǒng)治療要求不斷地使病人在治療與停止治療之間反復(fù)，并由于其副作用需要監(jiān)測(cè)終生照射量。牛皮褲治療效力通過(guò)監(jiān)測(cè)與基礎(chǔ)狀態(tài)相比較疾病臨床征象與癥狀的改變而評(píng)估，包括醫(yī)師綜合評(píng)估(PGA)改變與牛皮癬面積和嚴(yán)重性指數(shù)(PASI)評(píng)分、牛皮癬癥狀評(píng)估(PSA)?？稍谡麄€(gè)治療過(guò)程重周期性地測(cè)量病人的視覺(jué)模擬等級(jí)(Visualanalogscale),視覺(jué)模擬等級(jí)被用來(lái)表示特定時(shí)間點(diǎn)所感受到的癢感程度。病人在首次輸注治療性抗體時(shí)可發(fā)生輸注反應(yīng)或輸注相關(guān)癥狀。這些癥狀在嚴(yán)重程度方面有差異，并且通常在藥物介入后是可逆的。這些癥狀包括但不局限于流感樣發(fā)熱、寒戰(zhàn)/強(qiáng)直、惡心、蕁麻疹、頭痛、支氣管痙攣、血管性水胂。對(duì)本發(fā)明的疾病治療方法來(lái)說(shuō)，可能需要使輸注反應(yīng)達(dá)到最小。因此，本發(fā)明的另一方面是通過(guò)給予人源化CD20結(jié)合抗體而披露的治療疾病的方法，其中抗體同用Rituxan⑧治療比較起來(lái)具有降低的或不具有依賴于補(bǔ)體的細(xì)胞毒性，并且導(dǎo)致與輸注相關(guān)的癥狀的減少。在一個(gè)實(shí)施方式中，人源化CD20結(jié)合抗體是2H7.vl16。取決于所要治療的適應(yīng)癥以及本領(lǐng)域熟練醫(yī)師所熟悉的與規(guī)定劑量有關(guān)的因素，本發(fā)明的抗體將以有效治療適應(yīng)癥并使毒性與副作用減至最小的劑量被給藥。對(duì)于治療CD20陽(yáng)性癌癥或自身免疫病來(lái)說(shuō)，治療有效的劑量在大約250mg/mS至大約400mg/m2或500mg/ml范圍內(nèi)，優(yōu)選地大約250-375mg/m2。在一個(gè)實(shí)施方式中，劑量范圍是275-375mg/m2。在治療CD20陽(yáng)性B細(xì)胞腫瘤的一個(gè)實(shí)施方式中，抗體以300-375mg/n^的范圍給藥。對(duì)于治療患B細(xì)胞淋巴瘤例如非何杰金氏淋巴瘤的病人而言，在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗CD20抗體與人源化抗CD20抗體將以10mg/kg或375mg/m2劑量給予人類患者。對(duì)于治療NHL來(lái)說(shuō)，一個(gè)給藥法是在治療第一周以10mg/kg劑量給予一次劑量的抗體組合物，繼之以二周間隔，然后給予第二次劑量的相同量的抗體。通常，NHL病人在一年內(nèi)接受一次象這樣的治療，但是一旦淋巴瘤復(fù)發(fā)，象這樣的治療可以被重復(fù)。在另一個(gè)給藥法中，治療低級(jí)NHL的病人接受四周一種型式的人源化2H7，優(yōu)選地vl6(375mg/m2每周)，隨后在第五周進(jìn)行三個(gè)附加療程的抗體加標(biāo)準(zhǔn)CHOP(環(huán)磷酰胺、阿霉素、長(zhǎng)春新堿和強(qiáng)的松)或CVP(環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春新堿、強(qiáng)的松)化療，其每三周給藥，共三個(gè)周期。對(duì)于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎而言，在一個(gè)實(shí)施方式中，人源化抗體的劑量范圍是125mg/m、相當(dāng)于大約200mg/每劑)至600mg/m2,分成兩劑，例如第一劑200mg在第一天給藥，繼之以在第15天給予第二劑量200mg。在不同實(shí)施方式中，劑量是250mg/每劑、275mg、300mg、325mg、350mg、375mg、400mg、425mg、450mg、475mg、500mg、525mg、550mg、575mg、600mg。在治療疾病時(shí)，如在該疾病領(lǐng)域熟練的醫(yī)師所決定的，本發(fā)明的CD20結(jié)合抗體可以長(zhǎng)期或者間歇地給予病人。靜脈內(nèi)輸注或皮下給藥可使病人感覺(jué)到不利反應(yīng)例如發(fā)熱、寒戰(zhàn)、燒灼感、無(wú)力和頭痛。為緩和或使這樣的不利反應(yīng)達(dá)到最小，病人可接受抗體的初始調(diào)制劑量(initialconditioningdose),繼之以治療劑量。調(diào)制劑量可以比治療劑量低，以調(diào)節(jié)病人使其耐受較高劑量。絲途徑根據(jù)已知方法將CD20結(jié)合抗體給予人類病人，例如通過(guò)靜脈內(nèi)給藥，例如以丸劑(bolus)或通過(guò)在一段時(shí)期內(nèi)的連續(xù)輸注，經(jīng)過(guò)皮下、肌肉、腹膜內(nèi)、腦脊膜內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、或吸入途徑，通常經(jīng)過(guò)靜脈內(nèi)或皮下給藥。在一個(gè)實(shí)施方式中，人源化2H7抗體經(jīng)過(guò)靜脈內(nèi)輸注給藥，以0.9%氯化鈉溶液作為輸注載體。在治療上面描述的B細(xì)胞肺瘤時(shí)，病人可以用本發(fā)明的CD20結(jié)合抗體與一或多種治療劑例如化療劑一起用多藥物療法加以治療。CD20結(jié)合抗體可以與化療劑同時(shí)、序貫地或者交替地給藥，或在用其它治療不反應(yīng)之后進(jìn)行聯(lián)合治療。淋巴瘤治療的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)療法包括環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、美法侖、與米托蒽醌加美法侖。CHOP是治療非何杰金氏淋巴瘤最常見(jiàn)的化學(xué)療法。以下是用于CHOP療法的藥物環(huán)磷酰胺(商品名Cytoxan,neosar);阿霉素(亞德里亞霉素/羥基亞德里亞霉素)；長(zhǎng)春新堿(Oncovin);與氫化潑尼松(有時(shí)稱為Deltasone或Orasone)。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，CD20結(jié)合抗體與下列化療劑中的一個(gè)或多個(gè)聯(lián)合給藥至需要其的病人阿霉素、環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春新堿與氫化潑尼松。在特定的實(shí)施方式中，患淋巴瘤(例如非何杰金氏淋巴瘤)的病人用本發(fā)明的抗CD20抗體與CHOP(環(huán)磷酰胺、阿霉素、長(zhǎng)春新堿和強(qiáng)的松)療法聯(lián)合治療。在另一個(gè)實(shí)施方式中，癌癥病人可以用本發(fā)明的人源化CD20結(jié)合抗體與CVP(環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春新堿與強(qiáng)的松)化療聯(lián)合治療。在特定的實(shí)施方式中，患CD20陽(yáng)性NHL的病人用人源化2H7.vl6與CVP結(jié)合進(jìn)行治療。在治療CLL的特定實(shí)施方式中，CD20結(jié)合抗體與用氟達(dá)拉濱與環(huán)磷酰胺中的一個(gè)或兩個(gè)進(jìn)行的化學(xué)療法聯(lián)合給藥。在治療上面描述的自身免疫病或自身免疫相關(guān)病癥中，病人可以用本發(fā)明的CD20結(jié)合抗體與第二治療劑，例如免疫抑制劑，例如在多藥物療法中聯(lián)合治療。CD20結(jié)合抗體可以與免疫抑制劑同時(shí)、序貫地或者交替地給藥，或在不反應(yīng)時(shí)與其它療法聯(lián)用。免疫抑制劑可以以現(xiàn)有技術(shù)中所披露的相同或較少劑量給藥。優(yōu)選的附加免疫抑制劑將取決于許多因素，包括所治療的疾病種類以及病人的病史。在此用于附加治療的"免疫抑制劑，，指抑制或掩蔽病人的免疫系統(tǒng)的物質(zhì)。象這樣的藥劑將包括抑制細(xì)胞因子生產(chǎn)、下調(diào)或抑制自身抗原表達(dá)、或掩蔽MHC抗原的物質(zhì)。象這樣的藥劑的例子包括類固醇例如糖皮質(zhì)激素，例如強(qiáng)的松、甲基強(qiáng)的松龍、與地塞米松、2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(見(jiàn)美國(guó)專利4,665,077)、咪唑^琉嘌呤(或環(huán)磷酰胺，如果有對(duì)咪唑^/票呤的副反應(yīng))；溴隱亭；戊二醛(掩蔽MHC抗原，如美國(guó)專利4，120，649所描述)；針對(duì)MHC抗原與MHC片段的抗特應(yīng)抗體；環(huán)孢菌素A;細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體拮抗劑包括抗干擾素Y，(3，或a抗體；抗腫瘤壞死因子a抗體；抗腫瘤壞死因子p抗體；抗白介素-2抗體與抗IL-2受體抗體；抗L3T4抗體；異源的抗淋巴細(xì)胞球蛋白；泛T抗體，優(yōu)選地抗CD3或抗CD4/CD4a抗體；包含LFA-3結(jié)合結(jié)構(gòu)域的可溶性肽(W090/08187,公開(kāi)日7/26/90);鏈激酶；TGF-(3;鏈道酶；來(lái)自宿主的RNA或DNA;FK506;RS-61443;脫氧精胍菌素；雷帕霉素；T細(xì)胞受體(美國(guó)專利5,114，721);T細(xì)胞受體片l殳(Offneretal.,Science251:430-432(1991);WO90/11294;與WO91/01133);與T細(xì)胞受體抗體(EP340,109)例如T10B9。為了治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，病人可以用本發(fā)明的CD20抗體結(jié)合下述藥物中的任何一個(gè)或更多進(jìn)行治療DMARDS(減輕病癥的抗風(fēng)濕病藥物(例如氨曱喋呤)，NSAI或NSAID(非類固醇類抗炎藥物)，HUMIRATM(adalimumab;AbbottLaboratories),ARAVA(來(lái)氟米特)，REMICADE(infliximab;CentocorInc.ofMalvern,Pa),ENBREL(etanercept;Immimex，WA):COX-2抑制劑。通常用于RA的DMARD是hydroxydoroquine、sulfasalazine、氨曱喋呤、來(lái)氟米特、依那西普、英夫利昔單抗、咪唑硫嘌呤、D-青霉胺、Gold(口服)、Gold(肌肉)、二曱胺四環(huán)素、環(huán)孢菌素、葡萄球菌蛋白A免疫吸附。阿達(dá)木單抗(Adalimumab)是與TNFa結(jié)合的人單克隆抗體。英夫利昔單抗(Infliximab)是與TNFa結(jié)合的嵌合單克隆抗體。依那西普(etanercept)是一"免疫粘附素"融合蛋白，包括人75kD(p75)腫瘤壞死因子受體(TNFR)的細(xì)胞外配體結(jié)合部分連接至人IgGl的Fc部分。對(duì)于RA的常規(guī)治療，參見(jiàn)例如,"GuidelinesForthemanagementofrheumatoidarthritis，,,arthritis&Rheumatism46(2):328-346(2002年2月)。在一特定的實(shí)施方式中，RA病人用本發(fā)明的CD20抗體聯(lián)合氨曱喋呤(MTX)治療。示例性的MTX劑量為大約7.5-25mg/kg/周。MTX可口服和皮下給藥對(duì)于治療強(qiáng)直性脊柱炎、牛皮癬關(guān)節(jié)炎與克朗氏病而言，病人可以用本發(fā)明的CD20結(jié)合抗體與例如Remicade(infliximab;來(lái)自CentocorInc.,Malvern,Pa),ENBREL(etanercept;Immunex,WA)聯(lián)合治療。對(duì)于SLE的治療包括高劑量皮質(zhì)類固醇和/或環(huán)磷酰胺(HDCC)。對(duì)于治療牛皮癬而言，可以給予病人CD20結(jié)合抗體結(jié)合局部治療，例如局部類固醇、蒽林、卡泊三烯、氯氟美松與他佐羅汀，或結(jié)合氨曱喋呤、類4見(jiàn)黃醇、環(huán)孢菌素、PUVA與UVB治療。在一個(gè)實(shí)施方式中，牛皮癬病人用CD20結(jié)合抗體順序處理或者同時(shí)用環(huán)孢菌素處理。藥物制劑根據(jù)本發(fā)明使用的CD20結(jié)合抗體的治療制劑通過(guò)以凍干制劑或水溶液的形式混合具有所需純度的抗體和任選藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)、定劑(Remington'sPharmaceuticalSciences16thedition,Osol,A.Ed.(1980))用于儲(chǔ)存而制備。可接受的載體、賦形劑、穩(wěn)定劑在所用劑量及濃度對(duì)受體無(wú)毒性，并包括緩沖劑例如磷酸鹽，檸檬酸鹽，及其它有機(jī)酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和曱硫氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基千基氯化銨；氯化己烷雙胺；笨扎氯銨，笨索氯銨；酚、丁醇或苯曱醇；烷基對(duì)羥基苯曱酸酯如曱基或丙基對(duì)羥基苯曱酸酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間曱酚)；4氐分子量多肽(少于約IO個(gè)殘基)；蛋白質(zhì)如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖及其它糖包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA;糖類如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽反離子如鈉；金屬?gòu)?fù)合物(例如鋅-蛋白復(fù)合物)和/或非離子表面活性劑如TWEEN,PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。示例性的抗CD20抗體制劑在W098/56418中描述，在此特別地引入作為參考。另一種制劑是液體多劑量制劑，包含40mg/mL抗CD20抗體、25mM醋酸鹽、150mM海藻糖、0.9%苯曱醇、0.02。/。pH5.0的聚山梨酸酯20，在2-8。C最短保存期限兩年。另一感興趣的抗CD20制劑包含溶解在9.0mg/mL氯化鈉、7.35mg/mL檸檬酸鈉二水合物、0.7mg/mL聚山梨酸酯80與滅菌注射水中的10mg/mL抗體，pH6.5。另一水性藥物制劑包含大約pH4.8至大約pH5.5、優(yōu)選地pH5.5的10畫30mM乙酸鈉、含量大約0.01-0.1%v/v的聚山梨酸酯作為表面活性劑、含量大約2-10%w/v的海藻糖與作為防腐劑的苯曱醇(U.S.6，171,586)。適宜于皮下給藥的凍干制劑在WO97/04801中描述。象這樣的凍干制劑可以用合適的稀釋劑重新配制成高蛋白濃度溶液，并且重新配制的制劑可皮下給藥至在此將要#1治療的哺乳動(dòng)物。人源化2H7變體的一個(gè)制劑是12-14mg/mL抗體，溶解在10mM組氨酸、6%蔗糖、0.02%聚山梨酸酯20中,pH5.8。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，2H7變體并且特別地是2H7.vl6，以20mg/mL抗體溶解在10mM組氨酸硫酸酯、60mg/mL蔗糖、0.2mg/mL聚山梨酸酯20與滅菌注射水中，pH5.8的形式配制。制劑在此也可包含特定適應(yīng)癥所需的多于一種活性化合物，優(yōu)選地是那些具有不對(duì)彼此產(chǎn)生不利影響的互補(bǔ)活性的化合物。例如，可能需要進(jìn)一步提供細(xì)胞毒藥劑、化療劑、細(xì)胞因子或免疫抑制劑(例如作用于T細(xì)胞的藥劑例如環(huán)孢菌素，或作用于結(jié)合T細(xì)胞的抗體的藥劑例如結(jié)合LFA-1的藥劑)。象這樣的其它藥劑的有效量取決于制劑中存在的抗體量、疾病或紊亂或治療的種類、以及上面所討論的其它因素。這些通常以相同劑量、和經(jīng)由在此所描述的給藥途徑、或在此以前所使用的劑量的大約1-99%而使用?；钚猿煞忠部梢栽谀z體藥物遞送系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球粒、微乳劑、納米顆粒與納米膠嚢)中，或者在粗乳狀液中捕捉在微膠嚢中，所述微膠囊例如通過(guò)凝聚技術(shù)或界面聚合作用制備，例如，分別是羥甲基纖維素或明膠微膠嚢與聚異丁烯酸甲酯微膠嚢。這一技術(shù)在Remington'sPharmaceuticalSciences,16thedition,Oslo,A.,Ed.,(1980)中披露。可以制備緩釋制劑。合適的緩釋制劑的例子包括含拮抗劑的固態(tài)疏水聚合物的半滲透性基質(zhì)，其中基質(zhì)是以成形物品的形式，例如薄膜或微嚢劑。緩釋基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-異丁烯酸)、或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國(guó)專利3,773,919)、L-谷氨酸與乙基-L-谷氨酸的共聚物、非可降解乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物例如LUPRONDEPOTTMC由乳酸-羥基乙酸共聚物與醋酸亮丙瑞林組成的可注射微球粒)、與聚-D-(-)-3-羥丁酸。用于體內(nèi)給藥的制劑必須是無(wú)菌的。這通過(guò)經(jīng)由無(wú)菌過(guò)濾膜過(guò)濾而很容易地完成。制品和試劑盒本發(fā)明的另一實(shí)施方式是一種制品，包含對(duì)治疔自身免疫病與相關(guān)病癥和CD20陽(yáng)性癌癥例如非何杰金氏淋巴瘤有用的物質(zhì)。制品包含容器和標(biāo)簽或包裝說(shuō)明書，該標(biāo)簽或包裝說(shuō)明書在容器上或與容器相關(guān)。合適的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器等等。容器可能是由各種材料形成，例如玻璃或塑料。容器容納對(duì)治療該病癥有效的組合物，并且可具有無(wú)菌進(jìn)入孔(例如容器可以是具有可被皮下注射針穿透的塞子的靜脈內(nèi)溶液袋或小瓶)。組合物中至少一種活化劑是本發(fā)明的CD20結(jié)合抗體。標(biāo)簽或包裝說(shuō)明書指示該組合物用于治療該特定病癥。標(biāo)簽或包裝i兌明書將進(jìn)一步包含將抗體組合物給藥病人的指示。包裝說(shuō)明書指通常包括在治療產(chǎn)品商業(yè)包裝中的指示，該指示包含有關(guān)適應(yīng)癥、用法、劑量、給藥、禁忌癥和/或關(guān)于使用象這樣的治療產(chǎn)品的警告的信息。在一個(gè)實(shí)施方式中，包裝說(shuō)明書指示該組合物用于治療非何杰金氏'淋巴瘤。另外，該制品可進(jìn)一步包含第二容器，該容器包含藥學(xué)上可接受的緩沖液，例如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩沖鹽水、林格氏液與右旋糖溶液。其可進(jìn)一步包括從商業(yè)與用戶角度需要的其它材料，包括其它緩沖液、稀釋劑、濾器、針頭與注射器。也提供用于各種用途的試劑盒，例如用于B細(xì)胞殺傷試驗(yàn)、作為細(xì)胞程序死亡試驗(yàn)的正對(duì)照、用于從細(xì)胞純化或免疫沉淀CD20。為了分離和純化CD20，試劑盒可包含偶聯(lián)至珠(例如瓊脂糖i朱)的抗CD20抗體?？商峁┰噭┖校撛噭┖邪糜隗w外，例如在ELISA或者蛋白質(zhì)印跡中檢測(cè)與定量CD20的抗體。如同制品一樣，試劑盒包含容器，和在容器上或與容器相關(guān)的標(biāo)簽或包裝說(shuō)明書。容器容納包含本發(fā)明的至少一個(gè)抗CD20抗體的組合物。可包括額外的容器，該容器包含例如稀釋劑和緩沖液、對(duì)照抗體。標(biāo)簽或包裝說(shuō)明書可提供對(duì)組合物的描述，以及對(duì)預(yù)期體外或診斷用途的指示。獼猴CD20本發(fā)明還提供分離的核酸，該核酸包含如圖19所示的獼猴CD20的核苷酸序列SEQIDNO.:24。在一個(gè)實(shí)施方式中，核酸是cDNA。在一個(gè)實(shí)施方式中，編碼猴CD20的核酸位于用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)的表達(dá)載體中。表達(dá)載體中的SEQIDNO.:24的核苷酸序列可操作地連接至表達(dá)控制序列，例如啟動(dòng)子、或啟動(dòng)子與增強(qiáng)子。表達(dá)控制序列可以是通常與獼猴CD20基因相關(guān)的天然序列，或者是對(duì)該基因異源的序列。還提供分離的多肽，該多肽包含獼猴CD20的氨基酸順序[SEQIDNO.25;圖19和20]，以及包含獼猴CD20核酸的宿主細(xì)胞。在一個(gè)方面，宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，例如CHO細(xì)胞。也考慮包含獼猴CD20氨基酸序列或序列片段的融合蛋白。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例實(shí)施例12H7抗CD20鼠單克隆抗體的人源化鼠抗人CD20抗體2H7(在這里也稱為m2H7，m指鼠的)的人源化在一系列定點(diǎn)誘變步驟中進(jìn)行。鼠2H7抗體可變區(qū)序列和小鼠V與人C的嵌合2H7已被描述，見(jiàn)例如美國(guó)專利5，846,818與6，204，023。通過(guò)將鼠2H7可變區(qū)的氨基酸序歹Q(披露在U.S.5,846，818中)與已知抗體的序列(Kabatetal.，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,Ed.5.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991))進(jìn)行比較，而筌別2H7的CDR殘基?；谛蛄懈咦冃?Kabatetal.,上文)定義輕與重鏈的CDR區(qū)域，并分別顯示于圖1A與圖1B。利用合成寡核苷酸(表1),用定點(diǎn)誘變(Kunkel,Proc.Natl.Acad.Sci.82:488-492(1985))將所有六個(gè)鼠2H7CDR區(qū)域引入包含在質(zhì)粒pvx4上包含的相應(yīng)于共有序列VkI、VHin(vlk亞群i、vH亞群in)的完整人Fab框架(圖2)。噬菌粒pVX4(圖2)被用于誘變以及用于F(ab)s在大腸桿菌中的表達(dá)。pVX4以pb0475(Cunninghametal.，Science243:1330-1336(1989))的衍生物、謹(jǐn)菌粒pb0720為基礎(chǔ)，包含一DNA片段，該片段編碼人源化的共有K亞群I輕鏈(VLKl-CL)和人源化的共有亞群III重鏈VHIII-CH1抗IFN-a(干擾素-ot)抗體。pVX4還具有堿性磷酸酶啟動(dòng)子和Shine-Dalgamo序列，兩者均來(lái)源于另一以前描述過(guò)的以pUC119為基礎(chǔ)的質(zhì)粒pAK2(Carteretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4285(1992))。在編碼F(ab)輕與重鏈DNA之間引入唯一的Spd限制性位點(diǎn)?？笽FN-a重與輕鏈中的前23個(gè)氨基酸是StII分泌信號(hào)序列(Changetal.,Gene55:189-196(1987))。為了構(gòu)建2H7的CDR交換型式(CDR-swapversion)(2H7.v2)，在包含脫氧尿苦的pVX4模板上進(jìn)行定點(diǎn)誘變；抗IFN-a的所有六個(gè)CDR都換成小鼠2H7CDR。所得到的分子稱為人源化的2H72型(2H7.v2)或2H7的"CDR交換型式，，；其具有圖1A與1B所示的帶有共有人FR殘基的m2H7CDR殘基。人源化的2H7.v2被用于進(jìn)一步人源化。表1顯示被用來(lái)生成重鏈與輕鏈中每一鼠2H7(m2H7)CDR的寡核苷酸序列。例如，CDR-H1寡核香酸被用來(lái)再生成m2H7重鏈CDRl。CDR-H1、CDR-H2與CDR-H3分別指重鏈CDR1、CDR2、與CDR3;類似地，CDR-L1、CDR-L2與CDR-L3指輕鏈CDR中的每一個(gè)。CDR-H2中的取代用兩個(gè)寡核苷酸，CDR-H2A與CDR-H2B，在兩個(gè)步驟中進(jìn)行。表1用于將鼠2H7CDR的CDR交換構(gòu)建入pVX4中的人框架的寡核香酸。在被每一寡核苷酸改變的殘基下劃線。<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>CATTG(SEQIDNO.31)CDR-L2AACTACTGATTTACGCTCCATCGAACCTCGCGTCTGGAGTCC(SEQIDNO.32)CDR-L3TATTACTGTCAACAGTGGAGCTTCAATCCGCCCACATTTGGACAG(SEOIDNO.33)為與人源化的構(gòu)建物進(jìn)行比較，使用合成寡核普酸、經(jīng)由定點(diǎn)誘變(Kunkel，上文)構(gòu)建表達(dá)嵌合2H7Fab(包含鼠Vl和Vh結(jié)枸域，和人Cl與Cw結(jié)構(gòu)域)的質(zhì)粒，以將鼠框架殘基引入2H7.v2。所得到的質(zhì)粒構(gòu)建物序列示于圖3，該構(gòu)建物用于表達(dá)稱為2H7.v6.8的嵌合Fab。Fab的每一編碼鏈具有如上面為pVX4(圖2)所描述的23個(gè)氨基酸的StII分泌信號(hào)序列?；谑?H7框架殘基與人VkI，VhIII共有框架(困1A與1B)和先前人源化的抗體(Carteretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4285-4289(1992))進(jìn)行的序列比較，通過(guò)定點(diǎn)誘變將幾個(gè)框架突變引入2H7.v2Fab構(gòu)建物。這些突變導(dǎo)致某些人共有框架殘基改變成在鼠2H7框架中發(fā)現(xiàn)的那些殘基，所述改變?cè)谀切┛赡苡绊慍DR構(gòu)型或抗原接觸的位點(diǎn)發(fā)生。型式3包含VH(R71V，N73K)，型式4包含Vh(R71V)，型式5包含Vh(R71V，N73K)和Vl(L46P),型式6包含Vh(R71V,N73K)和Vl(L46P,L47W)。如下述在大腸桿菌中表達(dá)與純化m2H7抗體的人源化與嵌合Fab型式。質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化入大腸桿菌抹XL-1Bue(Stratagene,SanDiego,CA)用于制備雙鏈DNA與單鏈DNA。對(duì)于每一變體，使用雙脫氧核苷酸法(Sequenase，，U.S.BiochemicalCorp.)對(duì)輕與重鏈進(jìn)行完全測(cè)序。質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化入MM294的衍生物、大腸桿菌抹16C9，鋪于含5嗎/ml羧千青霉素的LB板上，選擇用于蛋白表達(dá)的單一菌落。單個(gè)菌落生長(zhǎng)在5mlLB-100嗎/ml羧千青霉素上，37°C5-8小時(shí)培養(yǎng)。5ml培養(yǎng)物被加至500mlAP5-100嗎/ml羧千青霉素中，并允許在4L帶障板的搖瓶中在37C生長(zhǎng)16小時(shí)。AP5培養(yǎng)基包括1.5g葡萄糖，11.0HycaseSF，0.6g酵母抽提物(經(jīng)過(guò)檢驗(yàn)的)，0.19g無(wú)水MgS04,1.07g麗4Cl，3.73gKCl，1.2gNaCl，120ml1M三乙醇胺，pH7.4,加水至1L，然后通過(guò)0.1pMSealkeen過(guò)濾器無(wú)菌過(guò)濾。通過(guò)在1L離心瓶(Nalgene)中在3000xg離心收獲細(xì)胞，并且除去上清液。冰凍1小時(shí)后，沉淀小丸被再懸浮在25ml冷的10mMMES-10mMEDTA，pH5.0(緩沖液A)。加入250pl0.1MPMSF(Sigma)以抑制蛋白質(zhì)水解，并且力口入3.5ml10mg/ml雞蛋白溶菌酶(heneggwhitelysozyme)(Sigma)儲(chǔ)存液，以幫助細(xì)菌細(xì)胞壁溶解。水上輕輕搖動(dòng)l小時(shí)后，樣品在40，000xg離心15分鐘。上清液用緩沖液A加至體積50ml,并且加樣至用緩沖液A平衡的2mlDEAE柱上。然后將流出物(flow-through)上樣至用緩沖液A平衡的G蛋白-瓊脂糖CL-4B(Pharmacia)柱(0.5ml柱床體積)。柱子用10ml緩沖液A洗，用3ml0.3M甘氨酸pH3.0洗脫入1.25mllMTris,pH8.0中。然后用Centricon-30(Amicon)將F(ab)緩沖液更換入PBS，并且濃縮至終容積0.5ml。所有F(ab)的SDS-PAGE凝膠均進(jìn)行電泳以保證純度，每個(gè)變體的分子量用電噴射質(zhì)譜法證實(shí)。在以細(xì)胞為基礎(chǔ)的ELISA結(jié)合試驗(yàn)中(如下所述)，包括嵌合2H7Fab在內(nèi)的Fab與CD20的結(jié)合難以檢測(cè)。因此，2H7Fab型式被重新4各式化(reformatted)成全長(zhǎng)IgGl抗體，以進(jìn)行試驗(yàn)和進(jìn)一步誘變。通過(guò)將嵌合2H7(v6.8)Fab的V^與Vh結(jié)枸域和人源化Fab型式2至型式6亞克隆至先前描述過(guò)的用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的pRK載體(Gormanetal.，DNAProt.Eng.Tech.2:3(1990))，構(gòu)建表達(dá)全長(zhǎng)IgG的質(zhì)粒。簡(jiǎn)要地說(shuō)，每個(gè)Fab構(gòu)建物用五co/V與5/;I消化以切除VL片段，該片段被克隆入質(zhì)粒pDRl的五coiV/5/pI位點(diǎn)(圖4)用于完整輕鏈(VL-CL結(jié)構(gòu)域)的表達(dá)。另夕卜，每個(gè)Fab構(gòu)建物用尸v"TI與j/7al消化以切除VH片段，該片段被克隆入質(zhì)粒pDR2的尸vwIIA4;al位點(diǎn)(圖5)用于完整重鏈(VH-CH廣鉸鏈-CH2-CH3結(jié)構(gòu)域)的表達(dá)。對(duì)于每個(gè)IgG變體，通過(guò)將表達(dá)輕鏈的質(zhì)粒與表達(dá)重鏈的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入用腺病毒轉(zhuǎn)化的人胚腎細(xì)胞系293(Grahametal.，J.Gen.Virol.，36:59-74，(1977)),進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。簡(jiǎn)要地說(shuō)，在轉(zhuǎn)染的前一天將293細(xì)胞分瓶，并且鋪于含血清的培養(yǎng)基上。第二天，加入以磷酸鈣沉淀制備的雙鏈DNA,繼之以pAdVAntageTMDNA(Promega，Madison,WI)，細(xì)胞在37°C孵育過(guò)夜。細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在4天之后收獲。用蛋白質(zhì)A-瓊脂糖CL-4B從培養(yǎng)物上清液純化抗體，然后緩沖液更換入10mM琥珀酸鈉、140mMNaCl，pH6.0,并用Centricon-10(Amicon)濃縮。用定量的氨基酸分析測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。為了測(cè)量對(duì)CD20抗原的相對(duì)結(jié)合親合力，發(fā)展出以細(xì)胞為基礎(chǔ)的ELISA試驗(yàn)。將人B類淋巴母WIL2-S細(xì)胞(ATCCCRL8885,AmericanTypeCultureCollection,Rockville,MD)在補(bǔ)充有2mML-谷氨酰胺、20mMHEPES,pH7.2與10。/。熱滅活的胎牛血清的RPMI1640中、在濕潤(rùn)的5%C02培育箱中生長(zhǎng)。細(xì)胞用含1%FBS的PBS(分析緩沖液)洗，以250-300,000細(xì)胞/孔接種于96孔圓底平板上(Nunc,Roskilde,Denmark)。向板中加入溶于分析緩沖液的兩倍連續(xù)稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液(15.6-1000ng/ml的2H7v6.8嵌合的IgG)與三倍連續(xù)稀釋的樣品(2.7-2000ng/ml)。將平板埋在水中，孵育45分鐘。為了除去未結(jié)合抗體，向孔中加入O.lmL分析緩沖液。將平板離心，除去上清。細(xì)胞再用0.2mL分析緩沖液洗兩次。通過(guò)向平板中加入過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗人Fc抗體(JacksonImmunoResearch,Grove,PA)，檢測(cè)與平板結(jié)合的抗體。孵育45分鐘后，如以前所述洗細(xì)胞。板中加入TMB底物(3，3',5,5'-四曱基聯(lián)苯胺；Kirkegaard&PerryLaboratories,Gaithersburg,MD)。力口入1M磷酸以停止反應(yīng)。用四參數(shù)非線性回歸曲線擬合程序(KaleidaGraph,Synergysoftware,Reading,PA)擬合滴定曲線。測(cè)定滴定曲線中點(diǎn)的吸收率(中點(diǎn)-OD)確定標(biāo)準(zhǔn)物的相應(yīng)濃度。然后測(cè)定每個(gè)變體在這一中點(diǎn)OD所對(duì)應(yīng)的濃度，標(biāo)準(zhǔn)物濃度被每個(gè)變體的濃度除。因此所得數(shù)值是每個(gè)變體的結(jié)合相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)的比率。相對(duì)親合力(當(dāng)量濃度)在實(shí)驗(yàn)間的標(biāo)準(zhǔn)偏差通常為+/-10%。如表2所示，與嵌合2H7(v.6.8)相比，CDR交換變體(CDR-swapvariant)(v.2)的結(jié)合被極度降低。然而，型式3至6顯示結(jié)合改善。為了測(cè)定將結(jié)合親合力恢復(fù)至嵌合2H7的結(jié)合親合力所需突變的最小數(shù)目，通過(guò)定點(diǎn)誘變構(gòu)建額外的突變與突變組合，以生成變體7至17,如表2中所指示。特別地，這些包括Vh突交A49G、F67A、I69L、N73K和L78A;與VL突變M4L、M33I和F71Y。型式16和17顯示最好的相對(duì)結(jié)合親合力，在嵌合型式的2倍范圍內(nèi)，型式16和17之間沒(méi)有顯著差異(s.d尸+/-10%)。為了使突變數(shù)目最少，因此選擇型式16作為人源化形式用于額外表征，該型式僅具有4個(gè)由人框架殘基變?yōu)槭罂蚣軞埢耐蛔?表3)。表2.使用以細(xì)胞為基礎(chǔ)的ELISA，將人源化的2H7IgG變體和CD20的相對(duì)結(jié)合親合力與嵌合2H7和CD20的相對(duì)結(jié)合親合力進(jìn)行比較。相對(duì)結(jié)合用嵌合2H7的濃度比等量結(jié)合所需變體濃度來(lái)表示；因此比值<1指示對(duì)變體親合力較弱。相對(duì)親合力測(cè)定中的標(biāo)準(zhǔn)偏差平均為+/-10%。可變結(jié)構(gòu)域中的框架取代系根據(jù)Kabat的編號(hào)系統(tǒng)(Kabatetal.,上文)相對(duì)于CDR-交換型式。<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>表3用來(lái)在人源化2H7型式16(2H7.vl6)中構(gòu)建突變Vh(A49QR71V，N73K)與V!XL46P)的寡核香酸序列。帶下劃線的密碼子編碼所指示的氨基酸取代。對(duì)于Vh(R71V,N73K)與VL(L46P),寡核苷酸以有意義鏈顯示，因?yàn)檫@些被用于在Fab模板上誘變，而對(duì)于VH(A49G)，寡核苷酸以反義鏈顯示，因?yàn)樵撴湵慌cpRK(IgG重鏈)模板一起使用。型式16的蛋白質(zhì)序列示于圖6和圖7。<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>實(shí)施例22H7的抗原結(jié)合決定簇(互補(bǔ)位)在2H7.vl6或2H7.vl7中進(jìn)行丙氨酸取代(Cunningham&Wells,Science244:1081-1085(1989)以檢驗(yàn)抗體的個(gè)別側(cè)鏈在與CD20結(jié)合中的作用。在293細(xì)胞中從pDRl與pDR2載體表達(dá)IgG變體，純化，并如上述分析相對(duì)結(jié)合親合力。幾處丙氨酸取代導(dǎo)致WIL-2S細(xì)胞上與CD20相對(duì)結(jié)合的顯著降低(表4)。表4利用以細(xì)胞為基礎(chǔ)的ELISA(WIL2-S細(xì)胞)測(cè)量得到的丙氨酸取代對(duì)人源化2H7.vl6的CDR區(qū)域的效應(yīng)。相對(duì)結(jié)合用2H7.vl6親本的濃度比等量結(jié)合所需的變體濃度來(lái)表示，因此比值<1指示變體具有較弱親合力；比值>1指示變體具有較高親合力。相對(duì)親合力測(cè)定中的標(biāo)準(zhǔn)偏差平均為+/-10%?？勺兘Y(jié)構(gòu)域中的框架取代系根據(jù)Kabat的編號(hào)系統(tǒng)(Kabatetal.,上文)相對(duì)于2H7.v16。NBD的意思是沒(méi)有可檢測(cè)的結(jié)合。型式45中的兩個(gè)數(shù)字來(lái)自于各自獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>實(shí)施例32H7CDR區(qū)域內(nèi)部的附加突變也測(cè)試了額外殘基的取代以及通過(guò)丙氨酸掃描被鑒定為是重要的CDR位置的取代的結(jié)合。幾種變體組合，特別是v.96,似乎比v.l6結(jié)合更緊密。表5使用以細(xì)胞為基礎(chǔ)的ELISA(WIL2-S細(xì)胞)測(cè)量在人源化2H7.vl6的CDR區(qū)域中的突變組合與非丙氨酸取代的效應(yīng)。對(duì)CD20的相對(duì)結(jié)合用2H7.vl6親本的濃度比等量結(jié)合所需的變體濃度來(lái)表示，因此比值<1指示變體具有較弱親合力；比值>1指示變體具有較高親合力。相對(duì)親合力測(cè)定中的標(biāo)準(zhǔn)偏差平均為+/-10%。可變結(jié)構(gòu)域中的框架取代系根據(jù)Kabat的編號(hào)系統(tǒng)(Kabatetal.,上文)相對(duì)于2H7.vl6。<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>實(shí)施例4在框架人源化取代位點(diǎn)的突變?cè)谌嗽椿陂g發(fā)生改變的框架位置中附加殘基的取代也在2H7.vl6背景中被測(cè)試。特別地，在Vl(P46)與VH(G49，V71,與K73)中進(jìn)行既不在鼠2H7親本中也不在人共有框架中存在的可替換的框架取代。這些取代通常導(dǎo)致相對(duì)結(jié)合的極子的改變(表6)，指示在這些位置的框架殘基中存在一些靈活性。對(duì)于2H7.vl6背景的突變顯示IgG變體。相對(duì)結(jié)合用2H7.v6.8嵌合體的濃度比等量結(jié)合所需的變體濃度來(lái)表示，因此比值<1指示變體具有較弱親合力；比值>1指示變體具有較高親合力。相對(duì)親合力測(cè)定中的標(biāo)準(zhǔn)偏差平均為+/-10%?？勺兘Y(jié)構(gòu)域中的框架取代系根據(jù)Kabat的編號(hào)系統(tǒng)(Kabatetal.，上文)相對(duì)于2H7.vl6的。(*)用2H7.vl6作為標(biāo)準(zhǔn)比較物分析的變體；相對(duì)值校正至嵌合體的值。<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>(*)用2H7.vl6作為標(biāo)準(zhǔn)比較物分析的變體；相對(duì)值校正至嵌合體的值。實(shí)施例5具有增強(qiáng)的效應(yīng)子功能的人源化2H7變體由于2H7可通過(guò)補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性(CDC)和抗體依賴的細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)介導(dǎo)B細(xì)胞溶解，我們?cè)O(shè)法產(chǎn)生具有改善的CDC與ADCC活性的人源化2H7.v16的變體。其它抗體的Fc區(qū)域內(nèi)的某些殘基突變也已經(jīng)被描述(Idusogieetal.,J.Immunol.166:2571-2575(2001))，用于通過(guò)增強(qiáng)與補(bǔ)體成分Clq的結(jié)合而改善CDC。用于改善ADCC的某些突變也已被描述>(Shieldsetal.,丄Biol.Chem.276:6591-6604(2001);Prestaetal.,Biochem.Soc.Trans.30:487-490(2002)),所述改善是通過(guò)增強(qiáng)IgG與激動(dòng)性Fcy受體的結(jié)合、并降低IgG與抑制性FcY受體的結(jié)合而達(dá)到的。特別地，三種突變已被鑒別具有改善的CDC與ADCC活性如所描述的(Idusogieetal.,上文(2001);Shieldsetal.,上文)，S298A/E333A/K334A(在這里也稱為三重丙氨酸突變體或變體；Fc區(qū)域的編號(hào)方式才艮據(jù)EU編號(hào)系統(tǒng)；Kabatetal.，上文)。為了增強(qiáng)2H7的CDC與ADCC活性，構(gòu)建2H7Fc的三重丙氨酸突變體。用突變S298A/E333A/K334A也已經(jīng)產(chǎn)生抗HER2抗體4d5的人源化變體，稱為4D5FcllO(即抗pl85HER2IgGl(S298A/E333A/K334A);ShieldsetaL上文)。編碼抗體4D5Fc110的質(zhì)粒p4D5FcllO(ShieWsetal.，上文)用與歷w/ni消化，F(xiàn)c片段(包含突變S298A/E333A/K334A)連接入2H7重鏈載體pDR2-v16的^al////w/in位點(diǎn)，產(chǎn)生pDR2-v31。31型完整重鏈的氨基酸序列示于圖8。輕鏈與vl6的輕鏈相同。雖然IgGl抗體的Fc區(qū)域恒定區(qū)在一特定物種內(nèi)相對(duì)保守，仍存在等位基因變異(綜述見(jiàn)Lefranc與Lefranc,在"ThehumanIgGsubclasses:molecularanalysisofstructure,function,andregulation"中,pp.43-78,F.Shakib(ed.),PergammonPress,Oxford(1990))。表7Fc區(qū)域的取代對(duì)CD20結(jié)合的影響。與CD20的相對(duì)結(jié)合在對(duì)框架取代所進(jìn)行的以細(xì)胞為基礎(chǔ)的(WIL2-S)試驗(yàn)中加以測(cè)量。Fc突變(*)用EU編號(hào)方式(Kabat,上文)加以指示，并相對(duì)于2H7.vl6親本。v.31的Fc區(qū)域中三個(gè)丙氨酸改變的組合被稱作"FcllO"。用相對(duì)于2H7.vl6背景的突變顯示IgG變體。相對(duì)結(jié)合用2H7.v6.8嵌合體的濃度比等量結(jié)合所需的變體濃度來(lái)表示；因此比值<1指示變體的親合力較弱。相對(duì)親合力測(cè)定中的標(biāo)準(zhǔn)偏差平均為+/-10%。<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>實(shí)施例6穩(wěn)定性增強(qiáng)的人源化2H7變體為了開(kāi)發(fā)出治療性蛋白質(zhì)，需要選擇在適當(dāng)制劑緩沖液中，在氧化、脫胺或其它可影響產(chǎn)品質(zhì)量的過(guò)程中保持穩(wěn)定的變體。在2H7.vl6中，幾個(gè)殘基被鑒定為不穩(wěn)定性的可能來(lái)源Vl(M32)與VH(M34，NIOO)。因此，突變被引入這些位點(diǎn)，用于與vl6進(jìn)行比較。表8.被設(shè)計(jì)具有增強(qiáng)的穩(wěn)定性和/或效應(yīng)子功能的2H7變體在以細(xì)胞為基礎(chǔ)的(WIL2-S)試驗(yàn)中對(duì)CD20的相對(duì)結(jié)合。用相對(duì)于2H7.vl6背景的突變顯示IgG變體。相對(duì)結(jié)合用2H7.v6.8嵌合體的濃度比等量結(jié)合所需的變體濃度來(lái)表示；因此比值<1指示變體的親合力較弱。相對(duì)親合力測(cè)定中的標(biāo)準(zhǔn)偏差平均為+/-10%?？勺兘Y(jié)構(gòu)域框架取代相對(duì)于2H7.vl6，并根據(jù)Kabat的編號(hào)系統(tǒng)，F(xiàn)c突變(*)用EU編號(hào)方式(Kabatetal.，上文)指示。(**)用2H7.vl6測(cè)量的變體，作為標(biāo)準(zhǔn)比較物；相對(duì)值校正至嵌合體的值?；谙惹皥?bào)導(dǎo)過(guò)的突變(Idusogieetal.(2000);Idusogieetal.(2001);Shieldseta1.(2001)),附加的Fc突變與穩(wěn)定性或親合力增強(qiáng)的突變結(jié)合起來(lái)，以改變或增強(qiáng)效應(yīng)子功能。這些改變包括實(shí)施例中所描述的S298、E333A、K334A;K322A,以降低CDC活性；D265A,以降低ADCC活性；K326A或K326W,以增強(qiáng)CDC活性；和E356D/M358L，以測(cè)試Fc區(qū)域異型改變(allotypicchange)的效果。這些突變均不導(dǎo)致CD20結(jié)合親合力的顯著變化。<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>(**)用2H7.vl6測(cè)量作為比較物的變體相對(duì)結(jié)合值校正至嵌合體的值為了測(cè)試穩(wěn)定性突變對(duì)蛋白質(zhì)降解率的影響，2H7.vl6與2H7.v73以12-14mg/mL配制在10mM組氨酸、6%蔗糖、0.02%聚山梨酸酯20,pH5.8中，在40。C孵育16天。所孵育的樣品然后用離子交換層析分析電荷變體的改變、用大小排阻層析分析聚合與斷裂、通過(guò)測(cè)試以細(xì)胞為基礎(chǔ)的(WIL2-S)試驗(yàn)分析相對(duì)結(jié)合。結(jié)果(圖9)顯示，與2H7v.l6相比，2H7v.73具有4t高穩(wěn)定性，這是通過(guò)在增加穩(wěn)定性的條件下離子交換層析中主峰級(jí)分的丟失而檢測(cè)的。在聚合、斷裂或結(jié)合親合力上未見(jiàn)明顯差別。實(shí)施例7在WIL2-S細(xì)胞上抗體與CD20結(jié)合的Scatchard分析使用放射性同位素標(biāo)記的2H7IgG測(cè)定2H7IgG變體與WIL2-S細(xì)胞結(jié)合的平衡離解常數(shù)(Kd)。IgG變體在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生。Rituxai^(所有實(shí)驗(yàn)中均來(lái)自Genentech,S.SanFrancisco，CA)和小鼠2H7(BDPharMingen，SanDiego，CA)被用來(lái)與人源化變體比較。鼠2H7抗體也可從其它來(lái)源獲得，例^口eBioscience與Calbiochem(均在SanDiego,CA)、AccurateChemical&ScientificCorp.(Westbury，NY)、Ancell(Bayport,應(yīng))、與Vinci-Biochem(Vinci,Italy)。所有稀釋均在結(jié)合分析緩沖液(DMEM培養(yǎng)基，包含1%牛血清白蛋白、25mMHEPESpH7.2、與0.01%疊氮鈉)中進(jìn)行。將濃度為0.8nM的^I-2H7.vl6(用乳過(guò)氧物酶碘化了的)等分試樣(0.025mL)分配入V形底96孔微分析板的孔中，加入冷的抗體的系列稀釋物(0.05mL),并混合。然后加入WIL2-S細(xì)胞(0.025mL中60，000個(gè)細(xì)胞)。封閉板子，在室溫下孵育24小時(shí)，然后在3,500RPM離心15分鐘。然后吸出上清液，洗細(xì)胞沉淀團(tuán)并離心。再次吸去上清液，細(xì)胞小團(tuán)溶解在1NNaOH中，并轉(zhuǎn)移至管中用于y計(jì)數(shù)。使用Ligand程序(McPherson，Comput.ProgramsBiomed.17:107-114(1983))對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Scatchard分析(Munson與Rodbard，Anal.Biochem.107:220-239(1980))。如表9所示，結(jié)果表明人源化2H7變體的CD20結(jié)合親合力類似于鼠2H7、結(jié)合親合力類似于Rituxai^?；谏厦姹?所示結(jié)合，預(yù)期2H7.v31將具有與v.16非常類似的Kd。<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>實(shí)施例8補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性(CDC)分析基本上如所描述的(Idusogieetal.，J.Immunol.164:4178-4184(2000);Idusogieetal.，J.Immunol.166:2571-2575(001))，分析2H7IgG變體介導(dǎo)WIL2-S細(xì)胞補(bǔ)體依賴的溶解的能力，該細(xì)胞是表達(dá)CD20的成淋巴細(xì)胞樣(limphoblastoid)的B細(xì)胞系?？贵w從O.lmg/mL貯存液中1:3連續(xù)稀釋。向包含0.05mL正常人補(bǔ)體(Quidel,SanDiego,CA)溶液的96孔組織培養(yǎng)板中加入每一稀釋的0.05mL等分試樣。向這一混合物中加入0.05mL體積的50，000WIL2-S細(xì)胞。37。C孵育2小時(shí)后，加入0.05mLAlamarblue溶液(AccumedInternational,Westlake,OH)，在37°C再繼續(xù)孵育18小時(shí)。將蓋子從板上拿開(kāi)，板子在定軌搖床上于室溫下?lián)u動(dòng)15分鐘。使用530nm激發(fā)濾光器和590nm發(fā)射濾光器讀取相對(duì)焚光單位(RFU)。使用KaleidaGraph軟件，通過(guò)將RFU擬合為每一抗體的濃度的函數(shù)計(jì)算EC50。結(jié)果(表10)顯示人源化2H7抗體導(dǎo)致CDC令人驚奇的改善，v.73的相對(duì)效能類似于Rituxan,v.75比Rit親n⑧強(qiáng)出3倍，v.16比Rituxan⑧弱3倍。表10與Rituxan相比2H7抗體的CDC活性。數(shù)字>1表示CDC活性不如Rituxai^強(qiáng)，數(shù)字<1表示活性比Rituxar^更強(qiáng)。除那些用(*)指示的是短暫產(chǎn)生的以外，抗體產(chǎn)生自穩(wěn)定的CHO系。<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>實(shí)施例9抗體依賴的細(xì)胞毒性(ADCC)分析基本上如所描述的(Shieldsetal.，J.Biol.Chem.276:6591-6604(2001))，利用乳酸脫氬酶(LDH)讀數(shù)，分析2H7IgG變體介導(dǎo)自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)溶解WIL2-S細(xì)胞的能力，該細(xì)胞是表達(dá)CD20的成淋巴細(xì)胞樣的B細(xì)胞系。NK細(xì)胞制備自用100mLPBS稀釋的100mL肝素化的血液，該血液獲得自已經(jīng)為FcyRIII(又名CD16)(Koeneetal.,blood90:1109-111409-1114(1997))同種型的(isotyped)正常人供體。在這一實(shí)驗(yàn)中，NK細(xì)胞來(lái)自于對(duì)CD16雜合的人供體(F158/V158)。稀釋的血液在15mL淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)(ICNBiochemical,Aurora,Ohio)上進(jìn)行分層，在2000RPM離心20分鐘。將層間分界面上的白細(xì)胞分配于4個(gè)干凈的50mL管中，管里充滿含15%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基。管子在1400RPM離心5分鐘，棄去上清液。細(xì)胞小團(tuán)重懸浮于MACS緩沖液(0.5。/oBSA,2mMEDTA)中，NK細(xì)胞用小珠(NK細(xì)胞分離試劑盒，130-046-S0"根據(jù)廠家的操作程序(MiltenyiBiotech，)純化。NK細(xì)胞在MACS緩沖液中稀釋至2xl06細(xì)胞/毫升。將分析培養(yǎng)基(F12/DMEM50:50無(wú)甘氨酸，lmMHEPES緩沖液pH7.2,青霉素/鏈霉素(100單位/mL;Gibco)，谷氨酰胺，與1%熱滅活的胎牛血清)中的抗體系列稀釋加至96孔圓底組織培養(yǎng)板中。WIL2-S細(xì)胞在分析緩沖液中稀釋至濃度4xl0VmL。WIL2-S細(xì)胞(0.05mL每孔)在96孔板中與稀釋抗體混合，在室溫下孵育30分鐘，讓抗體與CD20結(jié)合(調(diào)理作用)。通過(guò)向每孔中加入0.1mLNK細(xì)胞起動(dòng)ADCC反應(yīng)。在對(duì)照孔中，加入2%TritonX-100。板子在37。C孵育4小時(shí)。釋放的乳酸脫氫酶水平用細(xì)胞毒'I"生(LDH)斥企測(cè)i式劑盒G式齊寸盒#1644793，RocheDiagnostics，Indianapolis，Indiana)按照廠家指示進(jìn)行測(cè)量。每孔加入O.lmLLDH顯色劑，隨后混合10秒。板子然后用鋁箔覆蓋，在黑暗中室溫下孵育15分鐘。然后讀取490nm光密度，并通過(guò)被對(duì)照細(xì)胞中測(cè)得的總LDH除，來(lái)計(jì)算溶解百分比。溶解被繪制為抗體濃度的函數(shù)，四參數(shù)曲線擬合(KaleidaGraph)被用于判定EC50濃度。結(jié)果表明，人源化2H7抗體在ADCC方面活躍，v.31與v.75的相對(duì)功效比Rituxar^高20倍，v.16比Rituxan⑧強(qiáng)5倍，v.73比Rituxan⑧高幾乎4倍。表11基于n實(shí)驗(yàn)，與2H7.vl6相比，2H7抗體對(duì)WIL2-S細(xì)胞的ADCC活性。(數(shù)值H表示比2H7.vl6效力較低，數(shù)值<1表示效力較強(qiáng)。)<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>進(jìn)行額外的ADCC分析，以將2H7組合變體與Rituxar^比較。這些分析的結(jié)果顯示，同Rituxar^比較，2H7.vl14和2H7.vl15的ADCC效力改善超過(guò)10倍(表12)。表12基于n實(shí)驗(yàn)，與Rituxai^相比，2H7抗體對(duì)WIL2-S細(xì)胞的ADCC活性。(數(shù)值>1表示比Rituxan⑧效力較低，數(shù)值<1表示效力較強(qiáng)。)<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>實(shí)施例10獼猴pilot研究中2H7變體的體內(nèi)效應(yīng)在正常雄性獼猴(Macacafascicularis)中測(cè)試瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞所產(chǎn)生的2H7變體，以評(píng)定其體內(nèi)活性。其它抗CD20抗體，例如C2B8(Rituxan⑧已顯示具有在正常靈長(zhǎng)類動(dòng)物中消減B細(xì)胞的能力(Reffetal.,Blood83:435-445(1994))。在一項(xiàng)研究中，比較人源化2H7變體。在一項(xiàng)平行研究中，在獼猴中也測(cè)試了Rituxan。以下五個(gè)劑量組中，每組使用四只猴子(1)載體，(2)0,05mg/kghu2H7.v16，(3)10mg/kghu2H7.v16，(4)0.05mg/kghu2H7.v31，和(5)10mg/kghu2H7.v31。抗體以0、0.2、或20mg/mL濃度靜脈內(nèi)給藥，總共兩劑，一劑在研究的第一天，另一劑在第八天。給藥的第一天指定為第l天，前一天指定為第-l天；恢復(fù)的第一天(對(duì)于每組中兩個(gè)動(dòng)物而言)指定為第11天。在第-19、-12、l天(給藥前)，以及在第一次給藥后第6、24、72小時(shí)收集血樣。在第8天(給藥前)、第10天(殺死每組兩只動(dòng)物前)和在第36和37天(對(duì)于恢復(fù)動(dòng)物而言)取額外的樣本。用FACS方法測(cè)定外周B細(xì)胞濃度，該方法計(jì)數(shù)CD3-ZCD40+細(xì)胞。通過(guò)如下門化(gating)策略在猴樣品中獲得CD3-CD40+B細(xì)胞在總淋巴細(xì)胞中的百分率。在前向散射/側(cè)向散射點(diǎn)圖上標(biāo)記淋巴細(xì)胞群體以定義區(qū)域l(Rl)。使用R1中的事件，顯示CD40和CD3標(biāo)志物的熒光強(qiáng)度點(diǎn)圖。熒光標(biāo)記的同種型(isotype)對(duì)照被用來(lái)判定CD40和CD3陽(yáng)性各自的截止點(diǎn)。結(jié)果指示2H7.vl6和2H7.v31能在10mg/kg劑量產(chǎn)生完全外周B細(xì)胞削減、并且在0.05mg/kg劑量產(chǎn)生部分外周B細(xì)胞削減(圖11)。時(shí)間進(jìn)程與在給藥的第一個(gè)72小時(shí)期間測(cè)量得到的B細(xì)胞削減的程度在兩種抗體間類似。對(duì)恢復(fù)動(dòng)物的隨后分析表明，同用2H7.vl6給藥的動(dòng)物比較起來(lái)，那些用2H7.v31處理的動(dòng)物顯示B細(xì)胞削減的持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)。特別地，在用10mg/kg2H7.v16處理的恢復(fù)動(dòng)物中，B細(xì)胞在第10天與第36天取樣之間的某個(gè)時(shí)間顯示實(shí)質(zhì)性(substantial)的B細(xì)胞恢復(fù)。然而，對(duì)于用10mg/kg2H7.v31處理的恢復(fù)動(dòng)物中，B細(xì)胞直到第36天與第67天之間的某個(gè)時(shí)間才顯示恢復(fù)(圖11)。這暗示，與2H7.vl6相比，2H7.v31完全削減的持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)出大約一個(gè)月。在獼猴研究中，低或高劑量未觀察到毒性，總病理學(xué)(grosspathology)也是正常的。在其它研究中，在這些猴子中相隔兩周i.v.給藥兩次后，Vl6直到所評(píng)估的最高劑量(l00mg/kgx2^200mg/m、2)仍被良好耐受。在獼猴中用2H7.vl6與Rituxai^比較所得到的數(shù)據(jù)暗示，CDC活性減少5倍對(duì)于效力并沒(méi)有不利影響。具有強(qiáng)ADCC活性、但CDC活性降低的抗體在首次灌注反應(yīng)方面可能比具有較強(qiáng)CDC活性的抗體具有更好的安全特性。實(shí)施例11具有增強(qiáng)的效應(yīng)子功能的巖藻糖缺陷的2H7變體抗體正常CHO與HEK293細(xì)胞將巖藻糖加至IgG寡糖至高程度(97-98%)。來(lái)自血清的IgG也是高度巖藻糖基化的。DP12和Lecl3被用來(lái)產(chǎn)生本研究的抗體，DP12是具有巖藻糖基化能力的無(wú)二氫葉酸還原酶缺陷的(DHFR-)CHO細(xì)胞系，Lecl3是蛋白質(zhì)巖藻糖基化缺陷的細(xì)胞系。CHO細(xì)胞系Pro-Lecl3.6a(Lecl3)獲得自猶太高等學(xué)校大學(xué)阿爾伯特愛(ài)因斯坦醫(yī)學(xué)院PamelaStanley教授。親本系是Pro-(脯氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型)和Gat-(甘氨酸、腺苷、胸苷營(yíng)養(yǎng)缺陷型)。CHO-DP12細(xì)胞系是CH0-K1細(xì)胞系的衍生物(ATCC弁CCL-61)，后者是二氫葉酸還原酶缺陷的，并且對(duì)胰島素的需求降低。使用Superfect方法(Qiagen，Valencia,CA)用cDNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。使用噤呤霉素二鹽酸化物(Calbiochem,SanDiego,CA)在10pg/ml濃度在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中選擇表達(dá)轉(zhuǎn)染的抗體的Lecl3細(xì)胞，所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基含有具有L-谷氨酰胺、核糖核苷與脫氧核糖核苷酸的MEMa培養(yǎng)基(GIBCO-BRL,Gaithersburg,MD)、補(bǔ)充有10%滅活FBS(GIBCO)、10mMHEPES、與IX青霉素/鏈霉素(GIBCO)。在無(wú)GHT的包含Ham'sF12生長(zhǎng)培養(yǎng)基中類似地選擇CHO細(xì)胞無(wú)甘氨酸、有NaHC03、補(bǔ)充有5%FBS的低葡萄糖DMEM(GIBCO)、10mMHEPES、2mML-谷氨酰胺、IXGHT(甘氨酸、次黃嘌呤、胸苷)與1X青霉素/鏈霉素。在兩至三周之內(nèi)形成菌落，混合起來(lái)用于進(jìn)行擴(kuò)增和蛋白質(zhì)表達(dá)。細(xì)胞集合體最初以3乂106細(xì)胞/10厘米板的濃度接種，用于小批量蛋白質(zhì)表達(dá)。一旦細(xì)胞生長(zhǎng)至90-95%滿板，便轉(zhuǎn)移至無(wú)血清培養(yǎng)基中，并且在3-5天之后收集細(xì)胞上清液，在FcIgG與完整IgGELISA中測(cè)試以估計(jì)蛋白質(zhì)表達(dá)水平。Lecl3與CHO細(xì)胞在轉(zhuǎn)移至PS24生產(chǎn)培養(yǎng)基之前一天以大約8xl06細(xì)胞/15厘米板接種，所述PS24生產(chǎn)培養(yǎng)基補(bǔ)充有10mg/L重組人胰島素與lmg/L微量元素。Lecl3細(xì)胞與DP12細(xì)胞在無(wú)血清生產(chǎn)培養(yǎng)基中保持3-5天。收集上清液，在150ml錐形管中通過(guò)離心作用使之澄清以除去細(xì)胞和碎片。加入蛋白酶抑制劑PMSF與抑肽酶(Sigma,StLouis，MO)，使用MWCO30過(guò)濾器(Amicon，Beverly，MA)在攪動(dòng)的細(xì)胞上濃縮上清液5倍，然后使用G蛋白層析法(AmershamPharmaciaBiotech,Piscataway，NJ))立即純化上清液。所有蛋白質(zhì)均利用Centripriep-30濃縮器(Amicon)緩沖液更換入磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，并用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。利用A280測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，并利用氨基酸組成分析驗(yàn)證。使用表達(dá)人源化2H7v16、2H7v.31的載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，并如所描述的進(jìn)行選擇。2H7v.16抗體保留有野生型Fc區(qū)域，而v.31(見(jiàn)上面實(shí)施例5，表7)的Fc區(qū)域中3個(gè)氨基酸發(fā)生改變(S298A、E333A、K334A)，導(dǎo)致對(duì)FcyRIIIa受體的高親合力(Shieldsetal.J.Biol.Chem.276(9):6591-6604(2001))。轉(zhuǎn)染和選擇后，分離出細(xì)胞的單個(gè)集落，并評(píng)估蛋白質(zhì)表達(dá)水平，產(chǎn)量最高的細(xì)胞進(jìn)行氨曱喋呤選擇以選擇那些質(zhì)粒拷貝數(shù)被擴(kuò)增并且因此生產(chǎn)較高水平抗體的細(xì)胞。使細(xì)胞生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)移至無(wú)血清培養(yǎng)基中7天，然后收集培養(yǎng)基，裝載至A蛋白柱上，用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)洗脫抗體。使用測(cè)定完整抗體的Elisa測(cè)定抗體的最后濃度。使用Centripriep-30濃縮器(Amicon)將所有蛋白質(zhì)緩沖液更換入磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)并用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。夭冬魔展遂凝的漆^#的差|^#勿的濃^席吸/逸籌飛/戶^河fM^D/-rOF」j滲為Vf:使用Papacetal.，Glycobiology8,445-454(1998)的程序從重組糖蛋白上釋放N-連接的寡糖。簡(jiǎn)要地說(shuō)，96孔帶有PVDF襯里的微滴定板(Millipore，Bedford,MA)用100(^1曱醇調(diào)理，通過(guò)在Millipore多屏幕真空歧管上施加真空使該曱醇透過(guò)PDVF膜。調(diào)理過(guò)的PVDF膜用3X250pl水洗。在所有洗滌步驟之間，通過(guò)向歧管輕輕施加真空^f吏孔完全排干。用還原和羧曱基化緩沖液(RCM)洗膜，所述緩沖液包含6M鹽酸胍、360mMTris、2mMEDTA、pH8.6。將糖蛋白樣品(50昭)加至各個(gè)孔中，再次輕輕施加真空使其透過(guò)PVDF膜，孔用2X50pl的RCM緩沖液洗。通過(guò)向每孔中加入O.IM二硫蘇糖醇(DTT)溶液并將微滴定板在37。C孵育1小時(shí)來(lái)還原被固定化的樣品。用真空除去DTT，孔用4x250jul水洗。通過(guò)添加50)ul的O.IM碘乙酸(IAA)溶液來(lái)羧曱基化半胱氨酸殘基，所述碘乙酸溶液在1MNaOH中新鮮配制，并用RCM緩沖液稀釋至O.IM。通過(guò)在室溫下在黑暗中孵育30分鐘完成羧甲基化。向板子施加真空以除去IAA溶液，孔用4x250pl凈化水洗。通過(guò)添加100^1的1。/。PVP360(聚乙烯吡咯烷360，OOOMW)(Sigma)溶液并在室溫下孵育1小時(shí)封閉PVDF膜。通過(guò)輕輕施加真空除去PVP-360溶液，孑L用4x250(il水洗。PNGaseF(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)消化溶液(在10mMTris醋酸鹽中的25jul的25單位/ml溶液，pH8.4)被加入每孔中，消化在37。C進(jìn)行3小時(shí)。消化之后，樣品轉(zhuǎn)移至500^1-微量離心管中，每個(gè)樣品中加入2.5^1的1.5M乙酸溶液。酸化樣品在室溫孵育3小時(shí)以將寡糖從葡基胺轉(zhuǎn)換成羥基形式。在MALDI-TOF質(zhì)譜分析之前，所釋放的寡糖用勻漿填充入壓緊的反應(yīng)管(USBiochemical,Cleveland,OH)的0.7ml床的陽(yáng)離子交換樹脂(以氫形式的AG50W-X8樹脂)(Bio-Rad，Hercules,CA)脫鹽。為了以陽(yáng)性方式(positivemode)進(jìn)行樣品的MALDI-TOF質(zhì)譜分析，將脫鹽的寡糖(0.5jul等分試樣)用0.5)il的2，5二羥苯曱酸基質(zhì)(sDHB)上樣至不銹鋼輩巴(stainlesstarget),所述2,5二羥苯曱酸基質(zhì)通過(guò)將2mg2,5二羥苯曱酸用溶解在lml乙醇/lmM氯化鈉1:1(v/v)中的O.lmg的5-methoxyslicylicacid溶解而制備。樣品/基質(zhì)混合物用真空干燥。為了以負(fù)方式(negativemode)進(jìn)行分析，將脫鹽的N-連接的寡糖(0.5^11等分試樣)與0.5^112，，4，，6，-三羥基乙酰苯基質(zhì)(THAP)—起上樣至不銹鋼靶，所述2，，4，，6，-三羥基乙酰苯在l:3(v/v)乙腈/13.3mM檸檬酸銨緩沖液中制備。真空干燥樣品/基質(zhì)混合物，然后在分析之前讓其吸收空氣中的水分。所釋放的寡糖在PerSeptiveBioSystemsVoyager-質(zhì)譜儀上用MALDI-TOF進(jìn)行分析。質(zhì)譜儀在20kV以正性或負(fù)性方式用線狀排列(linearconfiguration)并利用延遲提取(ddayedextraction)進(jìn)行操作。使用1300的激光功率并以數(shù)據(jù)總和方式(240掃描)獲得數(shù)據(jù)以改善信噪比。儀器用標(biāo)準(zhǔn)寡糖的混合物校準(zhǔn)，并在質(zhì)量分配前用19點(diǎn)Savitsky-Golay算法將數(shù)據(jù)變平滑(smoothed)。利用Caesar7.0數(shù)據(jù)分析軟件包(SciBridgesoftware)得到質(zhì)譜數(shù)據(jù)的整合?！?殺務(wù)(2V/^勿/6我伴該慮的勿應(yīng)毒#試發(fā)如實(shí)施例9所描述進(jìn)行ADCC試驗(yàn)。NK細(xì)胞與靶細(xì)胞(WIL2-S)的比例為4:1，試驗(yàn)進(jìn)行4小時(shí)，如前面使用乳糖脫氫酶試驗(yàn)?zāi)菢訙y(cè)量毒性。在添加NK細(xì)胞之前用所指示的抗體濃縮物調(diào)理靶細(xì)胞30分鐘。所使用的Rituxan⑧抗體來(lái)自Genentech(S.SanFrancisco,CA)。圖12顯示代表性的ADCC試驗(yàn)的結(jié)果。結(jié)果表明，低巖藻糖基化的抗體比完全巖藻糖化的抗體更有效地介導(dǎo)NK細(xì)胞靶細(xì)胞殺傷。低巖藻糖基化抗體2H7v.31在介導(dǎo)靶細(xì)胞殺傷上最有效。這一抗體在較低濃度下有效，并能在較高濃度下比其它抗體介導(dǎo)更高比率的靶細(xì)胞殺傷?？贵w活性如下Lecl3衍生的2H7v31〉Lec13衍生的2H7vl6〉Dp12衍生的2H7v31>Dpl2書亍生的2H7vl6〉或-Rituxan。附加蛋白質(zhì)與糖的改變。比較Lecl3產(chǎn)生的與CHO產(chǎn)生的IgG中天然IgG上的糖，顯示在半乳糖苦化程度上沒(méi)有可明顯察覺(jué)的差異，由此該結(jié)果可以完全歸因于巖藻糖的存在或缺乏。實(shí)施例12具有體內(nèi)增強(qiáng)的ADCC的巖藻糖缺陷2H7變體抗體本實(shí)施例描述了在表達(dá)人CD16[FcRIII]和人CD20的小鼠中，Lecl3產(chǎn)生的巖藻糖缺陷的人源化2H7變體包括v.l6與v.31與在DP12中產(chǎn)生的正常的巖藻糖基化的同類抗體相比，體內(nèi)ADCC活性。/m0^org+/ma^6rg+wCD6^v、葳的,i人CD20轉(zhuǎn)基因小鼠從人CD20BACDNA(Invitrogen，Carlsbad,CA)產(chǎn)生。基于人CD20表達(dá)的FACS分析篩選小鼠。HuCD20Tg+小鼠然后與huCD16Tg+mCD16一小鼠雜交以生成huCD20Tg+huCD16Tg+mCD16一小鼠。經(jīng)腹膜內(nèi)注射將10至100|ug的每一2H7變體或Rituxan⑧給藥給huCD20Tg+huCD16Tg+mCD16一小鼠。等量的同種型匹配的抗體以類似方式給藥給負(fù)對(duì)照組動(dòng)物。Vv鼠淋S勿應(yīng)斜備來(lái)自全血、脾、淋巴結(jié)、與骨髓的小鼠淋巴細(xì)胞根據(jù)在"CurrentProtocolsinImmunology,JohnColigan、AdaKruisbeek、DavidMargulies編輯,EthanShevachandWarrenStrober，1994，，中所描述的標(biāo)準(zhǔn)程序制備。E4CS為、浙洗50萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，重懸在100|Lil的FACS緩沖液中，該緩沖液是含1°/。BSA的磷酸鹽緩沖鹽水，包含5pl的染色或?qū)φ湛贵w。所有染色抗體，包括同種型對(duì)照，均獲自PharMingen,SanDiego,CA。通過(guò)用Rituxan⑧與FITC-偶聯(lián)的抗人IgGl第二抗體一起染色，評(píng)估人CD20表達(dá)。使用FACScan和CellQuest(BectonDickinsonImmunocytometrySystems,SanJose，CA)進(jìn)行FACS分析。所有淋巴細(xì)胞用前和側(cè)光散射確定，而所有B淋巴細(xì)胞用細(xì)胞表面上的B220的表達(dá)確定。在注射后第一周每天、并在此后每周通過(guò)分析外周B細(xì)胞計(jì)數(shù)和通過(guò)對(duì)脾、淋巴結(jié)和骨髓進(jìn)行FACS分析hCD20+B細(xì)胞，來(lái)評(píng)估B細(xì)胞削減與恢復(fù)。監(jiān)測(cè)所注射的2H7變體抗體的血清水平。這一體內(nèi)試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了體外研究結(jié)果，即巖藻糖缺陷的2H7變體與野生型(在巖藻糖基化方面)糖基化同類抗體相比具有較高ADCC活性和較多的B細(xì)胞削減。實(shí)施例13細(xì)胞程序性死亡活性包括Rituxar^在內(nèi)的抗CD20抗體已表明當(dāng)^皮第二抗體或者通過(guò)化學(xué)方法凈皮交耳關(guān)時(shí)可體外諫導(dǎo)細(xì)胞程序死亡(Shanetal.,Blood9:1644-1652(1998);Byrdetal.,Blood99:1038-43(2002);Pedersonetal.，Blood99:1314-19(2002))。當(dāng)被化學(xué)交聯(lián)時(shí)，鼠2H7二聚物誘導(dǎo)Daudi細(xì)胞的細(xì)胞程序死亡(Ghetieetal.，ProcNatlAcadSciUSA94:7509-14(1997))。鼠2H7抗體與第二抗體交聯(lián)也誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡(Shanetal.,1998)。這些活性被認(rèn)為是在生理上相關(guān)的，因?yàn)楦鞣N各樣的機(jī)制可以導(dǎo)致體內(nèi)與細(xì)胞表面CD20結(jié)合的抗CD20抗體的交聯(lián)。利用第二交聯(lián)抗體在體外細(xì)胞程序死亡試驗(yàn)中比較RhuMAb2H7.vl6[人源化2H7vl6;RhuMAb表示重組人單克隆抗體]與Rituxai^。表達(dá)CD20的人B淋巴細(xì)胞細(xì)胞系Ramos細(xì)胞(CRL-1596,ATCC，Manassas,VA)被用于測(cè)量抗CD20單克隆抗體rhuMAb2H7.vl6與Rituximab相對(duì)于負(fù)對(duì)照抗體Trastuzumab(Herceptin,Genentech，SouthSanFrancisco,CA)誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡的能力，所述誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡的能力通過(guò)膜聯(lián)蛋白(Annexin)V染色與碘丙錠染料排斥(Vybrant⑧細(xì)胞程序死亡分析試劑盒，MolecularProbes,Seattle,WA)測(cè)量。Ramos細(xì)胞培養(yǎng)在包含10。/。胎牛血清(BiosourceInternational,Camarillo,CA)和2mML-谷氨酰胺(Gibco)的RPMI-1640培養(yǎng)基中。分析之前，細(xì)胞在新鮮培養(yǎng)基中洗兩次，然后調(diào)整至細(xì)胞濃度2X1()6每毫升。細(xì)胞(150pL)被加至96孔分析板(BectonDickinson,PaloAlto，CA)中，板子包含150)iL的預(yù)先確定H量的對(duì)照IgGl、rhuMAb2H7.vl6或Rituximab、以及F(ab)'2山羊抗人Fc(PierceBiotechnology,Rockford，IL)。最終的IgG濃度為100、10、1.0、0.1、0.01與O.OOlnM，F(xiàn)(ab)，2山羊抗人Fc抗體濃度被設(shè)置成各個(gè)樣品抗體濃度的兩倍。每次稀釋都設(shè)置成一式三份。在37。C孵育24小時(shí)后，細(xì)胞用PBS洗兩次，然后根據(jù)廠家建議用膜聯(lián)蛋白V與碘丙錠染色。Ramos細(xì)胞的染色才莫式〈吏用FACscan流式細(xì)月包4義(BectonDickinson,SanJose，CA)通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)分析，在10秒的時(shí)間內(nèi)收集數(shù)據(jù)。使用CellquestPro軟件(BectonDickinson)對(duì)數(shù)據(jù)還原。Ramos細(xì)胞對(duì)于(l)膜聯(lián)蛋白V染色、(2)膜聯(lián)蛋白V與捵丙錠雙染色呈陽(yáng)性，并且(3)計(jì)數(shù)未染色的活細(xì)胞的數(shù)目，并利用KaleidaGraph軟件(Synergysoftware,Reading,PA)纟會(huì)圖。當(dāng)與抗人Fc交聯(lián)和同無(wú)關(guān)IgG1對(duì)照抗體比較時(shí)，rhuMAb2H7.v16和Rituximab兩者都誘導(dǎo)Ramos細(xì)胞的細(xì)胞程序死亡(圖13-15)。rhuMAb2H7的細(xì)胞程序死亡活性稍低于Rituximab。在交聯(lián)rhuMAb2H7、Rituximab和對(duì)照IgGl抗體的濃度為10nM時(shí)，膜聯(lián)蛋白V染色的細(xì)胞的比例分別是18.5%、16.5%、2.5%,雙標(biāo)記細(xì)胞的比例為29%、38%與16%,并且每10秒計(jì)數(shù)的活細(xì)胞數(shù)目為5200、3100與8600。這些體外數(shù)據(jù)顯示，細(xì)胞程序死亡是體內(nèi)B細(xì)胞削減的一個(gè)可能的機(jī)制。與細(xì)胞表面CD20結(jié)合的rhuMAb2H7或Rituximab的體內(nèi)交聯(lián)可能通過(guò)免疫效應(yīng)細(xì)胞表面上的FcyR發(fā)生。實(shí)施例14肺瘤生長(zhǎng)的體內(nèi)抑制在Balb/c棵(無(wú)胸腺)小鼠中評(píng)估rhuMAb2H7.vl6抑制淋巴瘤細(xì)胞系Raji人B細(xì)胞(ATCCCCL86)生長(zhǎng)的能力。Raji細(xì)胞表達(dá)CD20,并已4艮道可在棵鼠中生長(zhǎng)，產(chǎn)生轉(zhuǎn)移性疾?。荒[瘤生長(zhǎng)被Rituxar^所抑制(Clyneseta1.，NatureMedicine6,443-446(2000))。五十六只8-10周大的Balb/c棵鼠被分成7組(A-G)，每組包括8只小鼠。在第0天，每只小鼠在脅部接受5xl06的RajiB淋巴瘤細(xì)胞皮下注射。從第O天開(kāi)始，每只小鼠接受lOOitil的負(fù)對(duì)照溶液(PBS;磷酸鹽緩沖鹽溶液)、Rituxar^或2H7.vl6。劑量取決于體重，通過(guò)尾靜脈靜脈內(nèi)給藥。A組小鼠接受PBS。B-D組分別以5.0mg/kg、0.5mg/kg、與0.05mg/kg接受Rituxan⑧。組E-G分別以5.0mg/kg、0.5mg/kg、與0.05mg/kg接受2H7v，16。注射每周重復(fù)，共6周。在治療期間一周一次，觀察每只小鼠注射部位可觸腫瘤的存在，如果存在則測(cè)量腫瘤體積并登記。在第8周做最后的檢查(在間隔兩周不進(jìn)行治療之后)。這一研究的結(jié)果表明rhuMAb2H7.vl6與Rituxan⑧在抑制棵鼠中皮下Raji細(xì)胞肺瘤的生長(zhǎng)中均有效(圖16-18)。從第4周開(kāi)始在PBS對(duì)照組中觀察到腫瘤生長(zhǎng)。然而，在該研究的8周持續(xù)時(shí)間內(nèi)，在用Rituxai^或2H7.vl6以5mg/kg或0.5mg/kg處理的組中沒(méi)有觀察到腫瘤生長(zhǎng)。在低劑量0.05mg/kg處理組中，在2H7組的一只動(dòng)物和在Rituxan③組的一只動(dòng)物中觀察到胂瘤(圖18)。實(shí)施例15獼猴CD20的克隆與抗體結(jié)合從獼猴脾cDNA文庫(kù)分離編碼CD20的cDNA之后，測(cè)定獼猴(7l/acflca/fls"'cw/an》CD20DNA序列。cDNA合成與質(zhì)?？寺〉腟UPERSCRIPTTM質(zhì)粒系統(tǒng)(目錄號(hào)18248-013，Invitrogen，Carlsbad，CA)稍加改變后被用于構(gòu)建文庫(kù)。使用限制性位點(diǎn)Xhol和Notl將cDNA文庫(kù)連接入pRK5E載體。從脾組織分離mRNA((CaliforniaRegionalResearchPrimateCenter,Davis,CA)。基于人CD20的非編碼序列設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增編碼CD20的cDNA的引物。N末端區(qū)域引物5'-AGTTTTGAGAGCAAAATG-3'(SEQIDNO.37)與C末端區(qū)域引物5'-AAGCTATGAACACTAATG-3'(SEQIDNO.38)被用來(lái)通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)克隆編碼獼猴CD20的cDNA。使用PlatinumTaqDNAPolymeraseHighFidelity根據(jù)廠家建議(Gibco,Rockville,MD)進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物亞克隆入PCR⑧2.1-TOPO⑧載體(Invitrogen),并轉(zhuǎn)化入XL-1藍(lán)色大腸桿菌(Stratagene.LaJolla,CA)。從單個(gè)克隆中分離包含連接有PCR產(chǎn)物的質(zhì)粒DNA,并測(cè)序。獼猴CD20的氨基酸序列示于圖19。圖20顯示獼猴與人CD20的比較。獼猴CD20與人CD20具有97.3。/。的相似性，有8處差異。細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域在V157A包含一個(gè)改變，而其余7個(gè)殘基可在細(xì)胞質(zhì)或跨膜區(qū)域找到。分析針對(duì)抗人CD20的抗體結(jié)合并替代FITC偶聯(lián)的鼠2H7結(jié)合表達(dá)CD20的獼猴細(xì)胞的能力。從兩只獼猴(CaliforniaRegionalResearchPrimateCenter,Davis,CA)取血20毫升加入肝素鈉，并直接運(yùn)至健泰科^〉司。在同一天，匯集血樣，通過(guò)添加40ml的磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)1:1稀釋。20ml的稀釋血液分層鋪于50ml錐形管(目錄號(hào)352098，F(xiàn)alcon,FranklinLakes,NJ)中的4x20mlFicoll-PaqueTMPlus(AmershamBiosciences，Uppsala,Sweden),在Sorval7離心機(jī)(Dupont,Newtown,CT)上以1300rpm室溫離心30分鐘。分離出PBMC層，在PBS中洗。紅細(xì)胞在0.2%NaCl溶液中裂解，用等體積的1.6。/。NaCl溶液恢復(fù)至等滲，以1000RPM離心10分鐘。PBMC小丸再懸浮在包含5。/。胎牛血清(FBS)的RPMI1640(Gibco，Rockville,MD)中，在37。C分散入10cm組織培養(yǎng)亞1小時(shí)。非粘附的B和T細(xì)胞群體用吸出除去，離心并計(jì)數(shù)?；厥盏玫娇偣?.4xl(f細(xì)胞。重新懸浮的PBMC分配入20個(gè)12x75mm培養(yǎng)管(目錄號(hào)352053，F(xiàn)alcon),每管包含lxl()6細(xì)胞，體積0.25ml。管子被分成四組，每組五管。每組加入培養(yǎng)基(RPMI1640，5%FBS)、滴定量的對(duì)照人IgGl抗體、Rituxan⑧、2H7.vl6、或2H7.v31,每個(gè)抗體的終濃度為30、10、3.3與l.lnM。此外，每管還加入20|ul的異硫氰酸熒光素(FITC)偶聯(lián)的抗人CD20(目錄號(hào)555622,BDBiosciences,SanDiego,CA)。輕輕混合細(xì)胞，在冰上孵育l小時(shí)，然后在冷PBS中洗兩次。在EpicXL-MCL(Coulter，Miami,FL)上分析細(xì)胞表面染色，針對(duì)抗體濃度導(dǎo)出并繪制幾何平均^:(KaleidaGraphTM,SynergySoftware,Reading,PA)。圖21中的數(shù)據(jù)顯示，2H7v.16與2H7v.31竟?fàn)幮蕴娲鶩ITC-鼠2H7與獼猴細(xì)胞的結(jié)合。此外，Rituxan⑧也替代FITC-鼠2H7的結(jié)合，因此證明2H7與Rituxar^兩者結(jié)合于CD20上的重疊表位。此外，數(shù)據(jù)顯示，2H7v.16、2H7v.31與Rituxan具有類似的IC50值，落在4-6nM范圍內(nèi)。實(shí)施例16rhuMAb2H7(2H7.vl6)在中度至重度類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的I/II期研究過(guò)程提要在患中度至重度類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的個(gè)體中，所述個(gè)體同時(shí)接受穩(wěn)定劑量的氨曱喋呤，對(duì)逐漸升高劑量的PRO70769(rhuMAb2H7)的安全性進(jìn)行隨機(jī)的、安慰劑對(duì)照的、多中心(multice血)、盲的I/II期研究。目的本研究的主要目的是評(píng)定在患中度至重度類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)個(gè)體中逐漸增高的靜脈內(nèi)(IV)劑量的PRO70769(rhuMAb2H7)的安全性與耐受性。研究設(shè)計(jì)這是一項(xiàng)隨機(jī)的、安慰劑對(duì)照的、多中心的、盲的、1/11期、研究者與受試者雙盲研究，研究逐漸增高劑量的PRO70769與MTX聯(lián)合在中度至重度RA個(gè)體中的安全性。研究包括劑量逐漸增高期和第二期，其中第二期中有更多數(shù)量的個(gè)體加入。主辦者對(duì)治療方案保持不參與?？梢约尤胫委煹氖茉囌呋贾卸戎林囟萊A,遭受一種至五種具有減輕癥狀作用的抗風(fēng)濕藥或生物制劑治療失敗，目前用MTX治療的臨床反應(yīng)不佳。在研究開(kāi)始之前，受試者要每周接受10-25mg范圍內(nèi)的MTX至少12周，并接受穩(wěn)定劑量至少4周，然后接受其首次量的研究藥物(PR070769或安慰劑)。受試者也可以接受穩(wěn)定劑量的口服皮質(zhì)激素(最多達(dá)每天10mg或等量強(qiáng)的松)和穩(wěn)定劑量的非類固醇類抗炎藥(NSAID)。根據(jù)下面的劑量漸增計(jì)劃(參見(jiàn)圖22)，受試者將在第1與第15天以指定劑量接受PR070769或安慰劑的兩次靜脈內(nèi)輸注。根據(jù)特定標(biāo)準(zhǔn)，并且在由內(nèi)部安全數(shù)據(jù)檢查委員會(huì)對(duì)安全性數(shù)據(jù)進(jìn)行檢查之后，并且在每一組的最后一個(gè)受試者接受第二次輸注后72小時(shí)對(duì)急性毒性進(jìn)行了評(píng)估之后，進(jìn)行劑量升級(jí)。劑量升級(jí)期后，另外40個(gè)受試者(32個(gè)接受藥物的和8個(gè)接受安慰劑的)將被隨機(jī)分配入以下劑量水平的每一劑量2x50mg、2x200mg、2x500mg、和2xl000mg，如果該劑量7K平在劑量升級(jí)期內(nèi)已經(jīng)被證實(shí)是可耐受的。大約205個(gè)受試者將加入該研究。獲得B細(xì)胞計(jì)數(shù)并登記。在為時(shí)6個(gè)月的效力估價(jià)期之外的48周追蹤期內(nèi)，利用流式細(xì)胞計(jì)評(píng)價(jià)B細(xì)胞計(jì)數(shù)。B細(xì)胞削減將不會(huì)被認(rèn)為是劑量限制的毒性(dose-limitingtoxicity,DLC)，而是PRO70769治療的預(yù)期藥效學(xué)結(jié)果。在一可選的亞研究中，將在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)從受試者獲得血清血和RNA分析、以及尿樣。這些樣品可被用來(lái)鑒定生物標(biāo)志物，這些生物標(biāo)志物可能對(duì)患中度至重度RA的受試者對(duì)PRO70769治療響應(yīng)性有預(yù)示作用。結(jié)果的測(cè)量本研究的主要結(jié)果測(cè)量是患中度至重度RA的受試者中PRO70769的安全性與耐受性。研究治療受試者群體將根據(jù)以下升級(jí)計(jì)劃在第l與第15天以指定劑量接受PRO70769或等量安慰劑的兩次靜脈內(nèi)輸注-lOmgPRO70769或等量安慰劑4個(gè)受試者接受活性藥物，1個(gè)接受對(duì)照-50mgPRO70769或等量安慰劑8個(gè)受試者接受活性藥物，2個(gè)接受對(duì)照-200mgPRO70769或等量安慰劑8個(gè)受試者接受活性藥物，2個(gè)接受對(duì)照-500mgPRO70769或等量安慰劑8個(gè)受試者接受活性藥物，2個(gè)接受對(duì)照墨1000mgPRO70769或等量安慰劑8個(gè)受試者接受活性藥物，2個(gè)接受對(duì)照效力PRO70769的效力將通過(guò)ACR反應(yīng)測(cè)量。取得ACR20、ACR50、和ACR70反應(yīng)的受試者百分率將通過(guò)處理組匯總，每一組生成95%置信區(qū)間。結(jié)論上面的數(shù)據(jù)證明制備人源化CD20結(jié)合抗體，特別是人源化2H7抗體變體的成功，所述抗體保持、甚至增強(qiáng)其生物學(xué)特性。本發(fā)明的人源化2H7抗體以與小鼠供體和嵌合2H7抗體類似的親合力與CD20結(jié)合，在靈長(zhǎng)類動(dòng)物的B細(xì)胞殺傷中是有效的，導(dǎo)致B細(xì)胞削減。某些變體與目前用于治療NHL的嵌合抗CD20抗體相比顯示出增強(qiáng)的ADCC,有利于在患者中使用較低劑量的治療抗體。此外，盡管對(duì)帶有鼠FR殘基的嵌合抗體而言，需要以足以取得完全B細(xì)胞削減的劑量給藥以消除針對(duì)其的抗體反應(yīng)，本發(fā)明人源化抗體可以以取得部分或完全B細(xì)胞削減的劑量給藥，并且依該特定疾病和病人所需按不同持續(xù)時(shí)間給藥。此外，這些抗體顯示出在溶液中的穩(wěn)定性。人源化2H7抗體的這些性質(zhì)使得它們?cè)贑D20陽(yáng)性癌癥和自身免疫疾病中可用作理想的免疫治療藥劑；在人類患者中這些抗體預(yù)期是不具免疫原性的，或?qū)⒅辽俦韧耆氖蠡蚯逗峡笴D20抗體免疫原性小。參考文獻(xiàn)在本申請(qǐng)中所引用的參考文獻(xiàn)，包括專利、公開(kāi)的申請(qǐng)及其它出版物，在此引入作為參考。除非另外指明，本發(fā)明的實(shí)施將使用本領(lǐng)域范圍內(nèi)的分子生物學(xué)的傳統(tǒng)方法等等。這樣的技術(shù)在文獻(xiàn)中充分加以解釋。參見(jiàn)，例如MolecularCloning:ALaboratoryManual,(J.SambrookColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.，1989);CurrentProtocolsinMolecularBiology(F.Ausubela/.，eds.，1987updated);EssentialMolecularBiology(T-Browned.,IRLPress1991);GeneExpressionTechnology(Goeddeled.，AcademicPress1991);MethodsforCloningandAnalysisofEukaryoticGeii6s(A.Bothwellaa/,eds.，BartlettPubl.1990);GeneTransferandExpression(M.Kriegler,StocktonPress1990);RecombinantDNAMethodologyU(R.Wua/,eds,，AcademicPress1995);PCR:APracticalApproach(M.McPhersona/.，IRLPressatOxfordUniversityPress1991);OligonucleotideSynthesis(M.Gaited.,1984);CellCultureforBiochemists(R.Adamsed.,ElsevierSciencePublishers1990);GeneTransferVectorsforMammalianCells(J.Miller&M.Caloseds"1987);MammalianCellBiotechnology(M.Butlered.,1991);AnimalCellCulture(J.Pollard&a/,eds"HumanaPress1990);CultureofAnimalCells,2ndEd.(R.Freshney&a/,eds"AlanR.Liss1987);FlowCytometryandSorting(M.Melamededs"Wiley-Liss1990);theseriesMethodsinEnzymology(AcademicPress,Inc.);WirthM.andHauserH.(1993);ImmunochemistryinPractice,3rdedition,A.Johnstone&R.Thorpe,BlackwellScience,Cambridge,MA,1996;TechniquesinImmunocytochemistry,(G.Bullock&RPetruszeds.,AcademicPress1982,1983，1985，1989);HandbookofExperimentalImmunology,(D.Weir&C.Blackwell,eds.);CurrentProtocolsinImmunology(J.Coliganetal.eds.1991);Immunoassay(E.RDiamandis&T.K.Christopoulos,eds.，AcademicPress,Inc.,1996);Goding(1986)MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice(2ded)AcademicPress,NewYork;EdHarlowandDavidLane,AntibodiesAlaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,1988;AntibodyEngineering,2ndedition(C.Borrebaeck,ed.，OxfordUniversityPress,1995);和theseriesAnnualReviewofImmunology;theseriesAdvancesinImmunology。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage94</formula>PheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSer657075SerLeuGinProGluAspPheAlaThrTyrTyrCysGinGinTrp808590SerPheAsnProProThrPheGyGinGlyThrLysValGlulie95100105LysArg<210>3<211>108<212〉PRT<213>人工序列<220><223〉該序列是人工合成的<400>3AsplieGinMetThrGinSerProSerSerLeuSerAlaSerVal151015GlyAspArgValThrlieThrCysArgAlaSerGinSerlieSer202530AsnTyrLeuAlaTrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProLys354045LeuLeulieTyrAlaAlaSerSerLeuGluSerGlyValProSer505560ArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlie657075SerSerLeuGinProGluAspPheAlaThrTyrTyrCysGinGin808590TyrAsnSerLeuProTrpThrPheGlyGinGlyThrLysValGlu95100105lieLysArg<210>4<211>10<212>PRT<213>鼠(Musmusculus)<400>4ArgAlaSerSerSerValSerTyrMetHis510<210>5<211>7<212>PRT<213>鼠(Musmusculus)<400〉5AlaProSerAsnLeuAlaSer5<210>6<211>9<212>PUT<213>鼠(Musmusculus)<400>6GinGinTrpSerPheAsnProProThr5<210>795<211>122<212>PRT<213>鼠(Mus畫culus)<400>7GinAlaTyrLeuGinGinSerGlyAlaGluLeuValArgProGly151015AlaSerValLysMetSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThr202530SerGluAsnSerSerTyrSerTyrTrpGinSerAlaTrpSerAsnMetHisTrpValLysGinThrProArgGinGlyLeu354045lieGlyAlalieTyrProGlyAsnGlyAspThrSerTyr505560LysPheLysGlyLysAla丁hrLeuThrValAspLysSer657075ThrAlaTyrMetGinLeuSerSerLeuThrSerGluAsp808590ValTyrPheCysAlaArgValValTyrTyrSerAsnSer95100105TyrPheAspValTrpGlyThrGlyThrThrValThrVal110115120<210>8<211>122<212>PRT<213>人工序列<220><223>該序列是人工合成的<楊>8GluValGinLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGly151015GlySerLeuArgLeuSerCysAUAlaSerGlyTyrThrPheThr202530SerTyrAsnMetHisTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeu354045GluTrpValGlyAlalieTyrProGlyAsnGlyAspThrSerTyr505560AsnGinLysPheLysGlyArgPheThrlieSerValAspLysSer657075LysAsnThrLeuTyrLeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAsp808590ThrAUValTyrTyrCysAlaArgValVatTyrTyrSerAsnSer95100105TyrTrpTyrPheAspVal丁rpGlyGinGlyThrLeuValThrVal110115120SerSer<210>9<211〉119<212〉PRT<213>人工序列<220〉<223>該序列是人工合成的<400>9GluValGinLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGly151015GlySerLeuArgUuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSer202530SerTyrAlaMetSerTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeu354045GluTrpValAlaVallieSerGlyAspGlyGlySerThrTyrTyr505560AlaAspSerValLysGlyArgPheThrlieSerArgAspAsnSer657075LysAsnThrI>euTyrLeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAsp808590ThrAlaValTyrTyrCysAlaArgGlyArgValGlyTyrSerLeu95100105TyrAspTyrTrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer110115<210>10<211>10<212>PRT<213〉鼠(Musmusculus)<400〉10GlyTyrThrPheThrSerTyrAsnMetHis510<210>11<211>17<212>PRT<213>鼠(Musmusculus)<400>11AlalieTyr1ProGlyAsnGlyAspThrSerTyrAsnGinLysPhe51015LysGly<210>12<211>13<212〉PRT<213>鼠(Musmusculus)<400>12ValValTyrTyrSerAsnSerTyrTrpTyrPheAspVal510<210>13<211>5679<212>DNA<213>人工序列<220><223>該序列是人工合成的<400>13gaattcaacttctccatactttggataaggaaatacagacatgaaaaatc50tcaugctgagttgttatttaagcttgcccaaaaagaagaagagtcgaat100gaactgtgtgcgcaggtagaagctttggagattatcgtcactgcaatgct150tcgcaatatggcgcaaaatgaxcaacagcgcaggtagagg200gggcgctgUcgaggtaaagcccgatgccagcattcctgacgacgatacg250gagctgctgcgcgattacgtaaagaagttattgaagcatcctcgtcagta300ct11tcaacagctgtcaUaagUgtcacggccgagactt350atagtcgctttgtttttattttttaatgu11tgtaacUgaattcgagc400tcggUcccgggg"cctctagaggttgaggtgatutatgaaaaagaat450atcgcatttcttcttgcatctatgttcgttttttcUUgctacaaacgc500gtacgctgatatccagatgacccagtccccgagctccctgtccgcctctg550tgggcgaUgggtcaccatcacctgcagagccagtcagagcgtgtcgact600agctcttatagctatatgcactggtatcaacagaaaccaggaaaagctcc650gaaactactgatttacutgctagcaacctcgagtctggagtcccttctc700gcttctctggatccggttctgggacggatttcactctgaccatcagcagt750ctgcagccagaagacttcgcaactuttactgtcaacactcttggggtat800tccgcgcacaUtggacagggtaccaaggtggagatcaaacgaactgtgg850ctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgaagagc汪gttgaaattct900ggaactgcttctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggc950caaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccagg1000agagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagc1050accctgacgctgagcaaagcagacUcgagaaacacaaagtcUcgcctg1100cgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaaca1150ggggagagtgttaagctgatcctctacgccggacgcatcgtggccctagt1200￡LCgC￡L￡LgttCggUtctatgaiggttgaggtga_UtUtgaat1250aaagaaUtcgcatUcUcttgcatctatgttcgttttttctattgcta1300caaacgcgtacgctgaggttcagctggtggagtctggcggtggcctggtg1350cagcc3gggggctcactccgUtgtcctgtgcagcttctggctacacctt1400caccgaatatatcatccactgggtccgtcaggccccgggtaagggcctgg1450aatgggttgcatcgattaatcctgacUcgacatcacgaactataaccag1500cgcttcaagggccgtttcactaUagtcgcgacgattccaaaaacacatt1550aUcctgcagatgaacagcctgcgtgctgaggaC2LCtgCCgtcuttatt1600gtgctcgatggatcagcg3tttcttcgactactggggtcaaggaaccctg1650gtcaccgtctcctcggcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggc1700accctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctgg1750tcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgcc1800ctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtccUcagtcctcaggact1850ctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcaccc1900agaccUcatctgcaacgtgaatcacaagcccagcatacaccaaggtggac1950aagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgaccaccgca2000tgcaccagtagctagcgccgatggagccggcggattcacctgaatgcgcatccagcagccggtgcgcatggttgccttacagcgactgctcttcggtttcgcaccattatggaacacctattttctctgggttccagtaactctctcgttacacggaggcccgctttatctggacgcggagatgagctttaaattcgcgtcgaaatcggctgagtgttgttccaacgtcatgaaccateataaatcgg3accggcgaacgtagggcgctgccgcgctUattcggtg"gcacagcttgtcgtcagcgggagcgaUgcggagaaaaUct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pLysAlaGlyGinGluGluGlyPheGinProAspGlyArgTrpThrValTyrAlaLysAspLeuGlyLeuAsnThrProlieHisGluSerTrpLeuProMetTyrGluSerGinLeuTyrPheSerSerTyrThrLeuGlyThrHisSerSerGluValThrLeuProArgThrProAsnPheGinTyr80Tyr95Asp110Thr125Thr140Phe155Ser170Tyr185Thr200Lys215Thr230Val245Arg260Asp275His290Tyr305Asn320Ala335Glu350Lys365Ser380Asn395Phe410Gly425LeuCysValLysSerProGlySerGinValCysPheThrProAsnArgGlyProProAsnAspTyrLeuAsnGinAlaTrpGlyGlyGluValLeuThrAspProLeuProGluAlaValLyslieGinGinlieLysTyrValMetArgGlyProGlyProHisSerTyrLysProPheGluValLysValGluGluValValAlaThrSerPheAsnValGinSerThrValThrSerlieLysCysProValLysThrSerTyrLysTyrSerValThrlysSerSer85Val100Gly115Val130Ala145Thr160Phe175Val190Cys205Val220Pro235Pro250Thr265Phe280Lys295Val310Lys325Thr340Thr355Leu370Glu385Pro400Leu415Cys430LeuTyrThrPheAlaValProValAsnGluAlaLysCysAsnProLeuCyslieLeuThrTrpProThrSerArgTyrLeuProLeuSerAlaThrValProProProValTrpArgThrLysSerProCysGluValValValAlaSerValLeuGlyTrpValValAsnLysGluLysValTyrGluValVal乙ysProLeuSerLeuAspMetGluAlaThrAlaCysAsnLeuProHisSerLeuAspValValGluJLeuSerAlaSerValAsnAspLysHisAsp90Ser105Val120Pro135Leu150Ser165Gin180Ser195Lys210Cys225Leu240Thr255Asp270Asp285Gin300His315Asn330Lys345Arg360Lys375Gly390Ser405Ser420Glu435128<formula>formulaseeoriginaldocumentpage129</formula>202530SerTyrAsnMetHisTrpValArg35GinAlaProGlyLysGlyLeu4045GluTrpValGlyAlalieTyrPro50GlyAsnGlyAlaThrSerTyr5560AsnGinLysPheLysGlyArgPhe65ThrlieSerValAspLysSer7075LysAsnThrLeuTyrLeuGinMet80AsnSerLeuArgAlaGluAsp8590ThrAlaValTyrTyrCysAlaArg95ValValTyrTyrSerAlaSer100105TyrTrpTyrPheAspValTrpGly110GinGlyThrLeuValThrVal115120SerSerAlaSerThrLysGlyPro125SerValPheProLeuAlaPro130135SerSerLysSerThrSerGlyGly140ThrAlaAlaLeuGlyCysLeu145150ValLysAspTyrPheProGluPro155ValThrValSerTrpAsnSer160165GlyAlaLeuThrSerGlyValHis170ThrPheProAlaValLeuGin175180SerSerGlyLeuTyrSerLeuSer185SerValValThrValProSer190195SerSerLeuGlyThrGinThrTyi200lieCysAsnValAsnHisLys205210ProSerAsiaThrLysValAspLys215LysValGluProLysSerCys220225AspLysThrHisThrCysProPro230CysProAUProGluLeuLeu235240GlyGlyProSerValPheLeuPhe245ProProLysProLysAspThr250255LeuMetlieSerArgThrProGlu260ValThrCysValValValAsp265270ValSerHisGluAspProGluVal275LysPheAsnTrpTyrValAsp280285GlyValGluValHisAsnAlaLys290ThrLysProArgGluGluGin295300TyrAsnAlaThrTyrArgValVal305SerValLeuThrValLeuHis310315GinAspTrpLeuAsnGlyLysGlu320TyrLysCysLysValSerAsn325330LysAlaLeuProAlaProlieAla335AlaThrlieSerLysAlaLys340345GlyGinProArgGluProGinVal350TyrThrLeuProProSerArg355360GluGluMetThrLysAsnGinVal365SerLeuThrCysLeuValLys370375GlyPheTyrProSerAsplieAla380ValGluTrpGluSerAsnGly385390GinProGluAsnAsnTyrLysThrThrProProValLeuAspSer395400405AspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeuThrValAspLysSer410415420ArgTrpGinGinGlyAsnValPheSerCysSerValMetHisGlu425430"5AlaUuHisAsnHisTyrThrGinl>ysSerLeuSerUuSerPro440445450GlyLys<210>47<211〉213<212>PRT<213>人工序列<220><223>該序列是人工合成的<400>47AsplieGinMetThrGin15GlyAspArgValThrlie20TyrLeuHisTrpTyrGin35LeulieTyrAlaProSer50PheSerGlySerGlySer65SerLeuGinProGluAsp80AlaPheAsnProProThr95LysArgThrValAlaAla110AspGluGinLeuLysSer125AsnAsnPheTyrProArgAsnAlaLeuGinSerGly155AspSerLysAspSerThr170SerLysAlaAspTyrGlu185ThrHisGinGlyLeuSer200GlyGluCysSerProSerSerLeuSerAlaSerVal1015ThrCysArgAlaSerSerSerValSer2530GinLysProGlyLysAlaProLysPro4045AsnLeuAlaSerGlyValProSerArg5560GlyThrAspPheThrLeuThrlieSer7075PheAlaThrTyrTyrCysGinGinTrp8590PheGlyGinGlyThrLysValGlulie100105ProSerValPheliePheProProSer115120GlyThrAlaSerValValCysLeuLeu130135GluAlaLysValGinTrpLysValAsp145150AsnSerGinGluSerValThrGluGin160165TyrSerLeuSerSerThrLeuThrLeu175180LysHisLysValTyrAlaCysGluVal190195SerProValThrLysSerPheAsnArg205210<210>48<211〉452<212>PRT131<213>人工序列<220><223>該序列是人工合成的<400>48Glu1ValGinLeuVal5GluSerGlyGlyGly10LeuValGinProGly15GlySerLeuArgLeu20SerCysAlaAlaSer25GlyTyrThrPheThr30SerTyrAsnMetHis35TrpValArgGinAla40ProGlyLysGlyLeu45GluTrpValGlyAla50lieTyrProGlyAsn55GlyAlaThrSerTyr60AsnGinLysPheLys65GlyArgPheThrlie70SerValAspLysSer75LysAsnThrLeuTyr80LeuGinMetAsnSer85LeuArgAlaGluAsp90ThrAlaValTyrTyr95CysAla人rgValVal100TyrTyrSerAlaSer105TyrTrpTyrPheAsp110ValTrpGlyGinGly115ThrLeuValThrVal120SerSerAlaSerThr125LysGlyProSerVal130PheProLeuAlaPro135SerSerLysSerThr140SerGlyGlyThrAla145AlaLeuGlyCysLeu150ValLysAspTyrPhe155ProGluProValThr160ValSerTrpAsnSer165GlyAlaLeuThrSer170GlyValHisThrPhe175ProAlaValLeuGin180SerSerGlyLeuTyr185SerLeuSerSerVal190ValThrValProSer195SerSerLeuGlyThr200GinThrTyrlieCys205AsnValAsnHisLys210ProSerAsnThr215ValAspLysLysVal220GluProLysSerCys225AspLysThrHisThr230CysProProCysPro235AlaProGluLeuLeu240GlyGlyProSerVal245PheLeuPheProPro250LysProLysAspThr255LeuMetlieSerArg260ThrProGluValThr265CysValValValAsp270ValSerHisGluAsp275ProGluValLysPhe280AsnTrpTyrValAsp285GlyValGluValHis290AsnAlaLysThrLys295ProArgGluGluGin300TyrAsnAlaThrTyr305ArgValValSerVal310LeuThrValLeuHis315GinAspTrpLeuAsn320GlyLysGluTyrLys325CysLysValSerAsn330LysAlaLeuProAlaProlieAlaAlaThrlieSerLysAlaLysGlyAspGlyGinAspArgAlaGlyGinGluPheProGlyTrpLeuLysProLeuTyrGluSerGinHisArgThrProAsnPheGinAsn335Glu350Lys365Ser380Asn395Phe410Gly425His440ProAsnAspTyrLeuAsnTyr<400>49GluVal1GlySerGluAsnLysThrTyrSerSerValGlySerSerTyrTrpGinAsnAlaTrpSerSerLysAlaSerGinLeuAsnValLysThrValTyrAlaLysAspLeuGlyLeuArgMetGlyPheLeuTyrPheSerSerTyrThrLeuVal5Leu20His35Ala50Lys65Tyr80Tyr95Asp110Thr125Thr140Phe155Ser170Tyr185GluSerTrplieGlyLeuCysValLysSerProGlySerGinValGinVallieAlaLysThrTyrSerValPheThrGin<210〉49<211>452<212>PRT<213>人工序列<220><223〉該序列是人工合成的SerGlyCysAlaValArgTyrProArgPheGinMetAlaArgTrpGlyGlyProGlyGlyGluProValHisLeuSerTyrSerValThrLysSerLys340Thr355Leu370Glu385Pro400Leu415Cys430Ser化GlyAlaGinGlyThrAsnValGinSerThrValThrSerLeuThrTrpProThrSerLeuGly10Ser25Ala40Asn55lie70Ser85Val100Gly115Val130Ala145Thr160Phe175Val190LeuGlyProGlySerLeuTyrThrPheAlaValProValProProCysLeuGluSerValLeuValAspValMetSerLeuSerValAsnAspLysHisSerValGinTyrThrGlyLysAlaThrValAspArgAlaTyrSerLeuValProLeuLeuGlySerTrpAlaValThrValProPheGlySerLysGluAlaThrAlaCysAsnLeuPro345Arg360Lys375Gly390Ser405Ser420Glu"5Pro450Gly15Thr30Leu45Tyr60Ser75Asp90Ser105Val120Pro135Leu150Ser165Gin180Ser195<formula>formulaseeoriginaldocumentpage134</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage135</formula>ArgTrpGinAlaLeuHisGlyLys410GinGlyAsn425AsnHisTyr440<400>51GluVal1GlySerSerTyrGluTrpAsnGinLysAsnThrAla丁yrTrpSerSerGinLeuLeuArgAsnMetValGlyLysPheThrLeuValTyrTyrPheVal5Leu20His35Ala50Lys65Tyr80Tyr95Asp110GluSerTrplieGlyLeuCysVal<400〉52Asplie1GlyAspTyrMetLeuliePheSerSerLeuGinArgHisTyrGlyGinMetValTrpAlaSerProThr5Thr20Tyr35Pro50Gly65Glu80ValPheSerThrGinLys415420CysSerValMetHisGlu430435SerLeuSerLeuSerPro445450<210>51<211>122<212>PRT<213>人工序列<220〉<223>該序列是人工合成的SerGlyGlyCysAlaAlaValArgGinTyrProGlyArgPheThrGinMetAsnAlaArgValTrpGlyGin<210>52<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>該序列是人工合成的GinlieGinSerSerAspGlyLeuValGinProGly1015SerGlyTyrThrPheThr2530AlaProGlyLysGlyLeu4045AsnGlyAlaThrSerTyr5560lieSerValAspLysSer7075SerLeuArgAlaGluAsp8590ValTyrTyrSerAlaSer100105GlyThrLeuValThrVal115120SerProSerThrCysArgGinLysProAsnLeuAlaGlyThrAspPheAlaThrSerLeuSerAlaSerVal1015AlaSerSerSerValSer2530GlyLysAlaProLysPro4045SerGlyValProSerArg5560PheThrLeuThrlieSer7075TyrTyrCysGinGinTrp8590AlaPheAsnProProThrPheGlyGinGlyThTLysValGlulie95100105LysArg<210>53<211>107<212>PRT<213〉人工序列<220〉<223>該序列是人工合成的<400>53AsplieGinMetThrGinSerProSerSerLeuSerAlaSerVal151015GlyAspArgValThrlieThrCysArgAlaSerSerSerValSer202530TyrLeuHisTrp丁yrGinGinLysProGlyLysAlaProLysPro354045LeulieTyrAlaProSerAsnLeuAlaSerGlyValProSerArg505560PheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSer657075SerLeuGinProGluAspPheAlaThrTyrTyrCysGinGinTrp808590AlaPheAsnProProThrPheGlyGinGlyThrLysValGlulie95100105LysArg權(quán)利要求1.一種與人CD20結(jié)合的人源化抗體或者其抗原結(jié)合片段，其中抗體對(duì)體內(nèi)削減靈長(zhǎng)類動(dòng)物B細(xì)胞是有效的，該抗體在重鏈可變區(qū)(VH)至少包含來(lái)自抗人CD20抗體的SEQIDNO.12的CDR3序列、和人重鏈亞群III(VHIII)的基本上的人共有框架(FR)殘基。2.—種分離的核酸，其編碼前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗體。3.—種表達(dá)載體，其編碼前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗體。4.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求2的核酸。5.生產(chǎn)權(quán)利要求1的抗體的方法，包含培養(yǎng)生產(chǎn)權(quán)利要求4的抗體的細(xì)月包，并/人細(xì)月包培養(yǎng)物中回收抗體。6.—種組合物，包含權(quán)利要求1的抗體和載體。7.—種制品，包含一種容器和包含在其中的組合物，其中該組合物包含權(quán)利要求1的抗體。8.—種體內(nèi)在B細(xì)胞中誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的方法，包含將B細(xì)胞與權(quán)利要求1中的抗體接觸，從而殺死B細(xì)胞。9.一種治療CD20陽(yáng)性癌癥的方法，包含給予患該癌癥的病人治療有效量的權(quán)利要求1中的人源化CD20結(jié)合抗體。10.—種治療自身免疫病的方法，包含給予患該自身免疫病的病人治療有效量的前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的人源化CD20結(jié)合抗體。全文摘要本發(fā)明涉及免疫球蛋白變體及其用途。本發(fā)明提供人源化和嵌合的抗CD20抗體，用于治療CD20陽(yáng)性惡性腫瘤和自身免疫病。文檔編號(hào)A61KGK101418044SQ20081017481公開(kāi)日2009年4月29日申請(qǐng)日期2003年12月16日優(yōu)先權(quán)日2002年12月16日發(fā)明者亨利·B·洛曼,倫納德·G·普雷斯塔,克雷格·W·克勞利,卡梅利亞·W·亞當(dāng)斯,安德魯·C·陳,杰拉爾德·R·納卡馬拉申請(qǐng)人:健泰科生物技術(shù)公司