專利名稱：一種大豆11s球蛋白含量的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測大豆、豆粕及相關(guān)產(chǎn)品中大豆11S球蛋白含量的方法，具體地說，涉及一種ELISA (酶聯(lián)免疫吸附測定法)定量檢測大豆、豆粕及相關(guān)產(chǎn)品中大豆11S球蛋白含量的方法。
背聚技術(shù)
大豆IIS球蛋白是大豆的主要抗原蛋白，當其進入幼年動物及疾病導致的免疫力低下和遺傳性過敏體 質(zhì)動物體內(nèi)就會產(chǎn)生免疫反應，其主要臨床表現(xiàn)為腹瀉。
大豆脫脂后的產(chǎn)品為豆粕，其粗蛋白含量在46%左右，且約60%為大豆球蛋白。大豆球蛋白由7S球蛋 白和11S球蛋白組成，后者約占全部球蛋白的60%。雖然豆粕是重要的蛋白飼料原料，但是由于其抗原蛋 白的存在，在一定程度上限制了它在幼年動物日糧中的添加量。由于不同品種、不同來源大豆及不同加工 工藝均影響豆粕中抗原蛋白的量，因此不能對大豆抗原蛋白進行有效的定量分析，就不能準確把握豆粕在 幼年動物日糧中的安全添加量。建立準確、快速、靈敏和方便的大豆抗原檢測方法，對有效監(jiān)控豆粕中大 豆抗原蛋白水平，促進豆粕在幼年動物中的安全使用具有十分重要的現(xiàn)實意義。本發(fā)明就是應用ELISA(嗨 聯(lián)免疫吸附測定法)建立大豆11S球蛋白的準確、快速、靈敏和方便的定量檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
在分析比較了間接抑制酶聯(lián)免疫法檢測大豆球蛋白靈敏度不夠布的不足后，發(fā)明人采用雙抗體夾心酶 聯(lián)免疫吸附測定法測定大豆、豆粕及相關(guān)產(chǎn)品中大豆IIS球蛋白的含量。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的以等電點沉淀和凝膠層析等方法純化的大豆IIS球蛋內(nèi)為抗原免疫動物 獲得抗體，將抗體與辣根過氣化物酶連接作為酶標抗體，再將其用作雙抗體夾心ELISA檢測大豆、豆粕及
相關(guān)產(chǎn)品中大豆iis球蛋白含量。
本發(fā)明的優(yōu)越性靈敏度高。本發(fā)明的大豆llS球蛋白的檢測限為2.5ng,而間接抑制酶聯(lián)免疫法檢 測大豆球蛋白的檢測限則為16ng，此外，常用的SDS-PAGE方法只能進行大豆球蛋白的定性檢測，不能定 量。


圖1為雙抗體夾心ELISA檢測標準曲線圖。其中，檢測孔OD值為縱軸，抗原濃度為橫軸。
具體實施例方式
1) 脫脂大豆粉在緩沖液A中提取得到含大豆球蛋白的溶液，
2) 將溶液pH調(diào)至6. 4得到沉淀1和上清液，
3〉將沉淀1溶解在緩沖液B中，并加固^9R酸銨制得51-66繊酸銨沉淀組分，過凝膠過濾柱'得到 純化的大豆球蛋白，
4)用大豆球蛋白免疫動物，獲得抗血清， 5)鹽析和凝膠過濾層析純化抗體，檢測抗體效價，
6)將純化抗體與辣根過氧化物酵連接作為酶標抗體，7)用雙抗體夾心嘛聯(lián)免疫法檢測大豆、豆粕及相關(guān)產(chǎn)品中大豆11S球蛋白含量。
本發(fā)明所述的緩沖液A為0.01-0. 03mol/L的Tris-HCl的緩沖液，含10咖ol/L 2-巰基乙醇，p朋.0 。
本發(fā)明所述的緩沖液B為磷酸鹽緩沖液(2.6咖ol/L KH2P0,， 32.5 mmol/L K2HP0J，含0. 4mol/L的 NaCl, 10mmol/L 2-巰基乙酵，pH7.6 。
本發(fā)明所述的凝膠過濾介質(zhì)為S印harose CL-6 B。
本發(fā)明所述的免疫動物為健康雄性新西蘭大白兔。
本發(fā)明所述的純化抗體凝膠介質(zhì)為S印hadex G-200。
本發(fā)明所述的酶標法采用過碘酸鈉改良法標記辣根過氧化物酶。
本發(fā)明所述的酶聯(lián)免疫方法為雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法。
詳細描述本發(fā)明大豆US球蛋白含量的ELISA檢測方法的建立過程和檢測過程如下
1) 將脫脂大豆粉與0.01-0.03raol/L, p朋.0的Tris-HC1緩沖液A混合，料水比1: 15-25, 25-37X: 提取l-2小時。收集上清液l。將上淸液l pH調(diào)至6.4 , 5000rmp離心20min。得到沉淀1。
2) 將沉淀1用磷酸鹽緩沖液B (含0. 4raol/L的NaCl, 10咖ol/L 巰基乙醇，PH7.6 )溶解，加硫 酸銨制得51-66%硫酸銨沉淀組分,離心收集上清過S印harose CL-6 B，用磷酸鹽緩沖液B(0.26-0. 52,ol/L KftPO,, 3. 25酺ol/L K,HPO。洗脫，收集對應吸收峰的溶液，即純化的大豆11S球蛋A。
3) 將純化的大豆11S球蛋白裝入截留分子量8,000-14,000的透析袋，對PBS緩沖液透析過夜。收集 透析液，濃縮，小份分裝。
4) 取上述純化濃縮的11S球蛋白用PBS緩沖液配成200ug/mL的溶液，分別與等量的弗氏完全佐劑 乳化，初次免疫健康雄性新西蘭大白兔，每只大白兔劑紫l-1.5raL，免疫部位為背部皮下。兩周后用以上 蛋白溶液與弗氏不完全佐劑的乳化液加強免疫，免疫劑量為l-1.5mL/只人白兔，免疫部位為背部皮下。再 —周后用以上蛋白溶液再次加強免疫，免疫劑量為l-1.5mL/只大白兔，免疫部位為腹腔。瓊脂糖雙擴成間 接ELISA檢測抗體效價。效價合適后心臟采血收集抗血清。
5) 將收集的抗大豆11S球蛋白的抗血清用鹽析和凝膠過濾層析法純化，再次檢測效價后小量分裝。
6) 將純化抗體與辣根過氧化物,結(jié)合制得酶標抗體。
7) 雙抗體夾心ELISA標準曲線的建立。其方法是方陣滴定法檢測血清IgG最佳濃度包被酶標板，4 ^C包被過夜，次日洗板，然后各孔中加入封閉液lOOlil， 28-37 1C孵育30-60min，洗板，然后將大豆11S 球蛋白分別做10000、 5000、 2500、 1250、 625、 312、 156、 78、 39、 20、 10、 5、 2.5、 1.25、 0.625 、 0.312 ng/mL的系列稀釋，取100ul依次加入酶標板孔中，每個梯度3個重復，每孔加入最佳稀釋度酶標抗體IgG 各100 W,解育1小時后洗板，每孔加入TMB底物100 W， 37 T顯色10-30 min后，每孔加入50u 1 2 mol/L 的琉酸終止液。然后送入酵標儀中在450咖波長下檢測每孔0D值。用以上梯度稀釋的抗原檢測到的0D 值建立標準曲線以檢測孔OD值為縱軸，抗原濃度為橫軸。
大豆球蛋白的定量檢測。按方法7)建立標準曲線，待測蛋白溶液稀釋到合適濃度后也按方法7)做3 個重復后檢測0D值。根據(jù)待測蛋白的0D值在標準曲線中査出蛋白溶液的實際濃度。
本發(fā)明的優(yōu)越性在于這種方法檢測準確、過程簡單、靈敏度極髙，可滿足實際生產(chǎn)的檢測需求。
4具體實施方法
按本發(fā)明大豆US球蛋白含量的ELISA檢測方法，A體實施操作步驟如下-
1) 將豆粕粉碎與0. 01-0.03邁ol/L, p朋.0的Tris-HCl緩沖液混合，料水比h 25, 25TC提取2小 時。收集上清液。將上清液pH調(diào)至6.4 , 5000 rmp離心20 min。得到沉淀1。
2) 將沉淀1用磷酸鹽緩沖液(含0.4 mol/L的NaCl, 10酺ol/L 2-巰基乙醇，pH 7. 6)溶解，加 硫酸銨制得51-66繊酸銨沉淀組分，離心收集上清過S印harose CL-6 B，用磷酸鹽緩沖液(同前)洗脫， 收集對應吸收峰的溶液，即純化的大豆球蛋白(IIS蛋白)。
3) 將純化的大豆球蛋白(IIS蛋白)裝入截留分子量8,000-14,000的透析袋，對PBS緩沖液透析過 夜。收集透析液，濃縮，小份分裝，冷凍干燥保存。
4) 取適量大豆球蛋白用PBS緩沖液配成200 Mg/mL的溶液，與等量的弗氏完全佐劑乳化，初次免疫 健康雄性新西蘭大白兔，每只大白兔劑量lraL,免疫部位為背部皮下。兩周后用以上蛋白溶液與弗氏不完 全佐劑的乳化液加強免疫，免疫劑量為1 mL/只大白兔，免疫部位為背部皮下。再一周后用以上蛋白溶液 再次加強免疫，免疫劑量為l mL/只大白兔，免疫部位為腹腔。瓊脂糖雙擴或間接ELISA檢測抗體效價。 效價合適后心臟采血收集抗血清。
5) 將收集的抗大豆球蛋白的抗血清用鹽析和凝膠過濾層析法純化，間接ELISA檢測效價后小量分裝。
6) 雙抗體夾心ELISA標準曲線的建立。其方法是方陣滴定法檢測血清IgG最佳包被濃度包被酶標 板，每孔IOO W, 4 1C包被過夜，次日洗板，然后各孔中加入封閉液100 W, 28-37匸孵育30~60 min， 洗板，并將大豆球蛋白分別做10000、 5000、 2500、 1250、 625、 312、 156、 78、 39、 20、 10、 5、 2.5、 1.25、 0.625、 0.312 ng/mL的系列稀釋，取100 W依次加入酶標板孔中，每個梯度3個重復，每孔加入 最佳稀釋度酶標抗體IgG各lOO W，孵育l小時，然后洗板，每孔加入TMB底物lOOlil， 371C顯色15min 后，每孔加入50ul 2mol/L的硫酸終止液。然后送入酶標儀中在450咖波長下檢測每孔OD值。用以上 梯度稀釋的抗原檢測到的OD值建立標準曲線以檢測孔OD值為縱軸，抗原濃度為橫軸。
7) 大豆11S球蛋白的定量檢測。按方法7)建立標準曲線，待測蛋A溶液稀釋到合適濃度后也按方法 7〉做3個重復后檢測OD值。根據(jù)待測蛋白的OD值在標準曲線中汽出蛋白溶液的實際濃度。
權(quán)利要求
1、大豆11S球蛋白含量的ELISA檢測方法，在于它使用等電沉淀、鹽析和凝膠過濾層析純化大豆11S球蛋白作為抗原免疫動物獲得抗體，將其用作雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法檢測大豆、豆粕及相關(guān)產(chǎn)品中大豆11S球蛋白含量，其具體步驟如下1)脫脂大豆粉在緩沖液A中提取得到含大豆球蛋白的溶液；2)將溶液pH調(diào)至6.4得到沉淀1和上清液；3)將沉淀1溶解在緩沖液B中，并加固體硫酸銨制得51-66％硫酸銨沉淀組分，過凝膠過濾柱，得到純化的大豆11S球蛋白；4)用大豆11球蛋白免疫動物，獲得抗血清；5)鹽析和凝膠過濾層析，檢測抗體效價；6)將純化抗體與辣根過氧化物酶連接作為酶標抗體；7)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法檢測大豆、豆粕及相關(guān)產(chǎn)品中大豆球蛋白含量。
2、 按權(quán)利要求1所述的大豆11S球蛋白含量的ELISA檢測方法，其特征在于緩沖液A為0.01-0. 03mol/L的Tris-HCl的緩沖液，含10,ol/L 2-巰基乙醉，p朋.0 。
3、 按權(quán)利要求l所述的大豆US球蛋白含量的ELISA檢測方法，其特征在于緩沖液B為磷酸鹽緩沖液，含0.4mol/L的NaCl， 10,ol/L 2-巰基乙醉，pH7.6 。
4、 按權(quán)利要求1所述的大豆US球蛋白含量的ELISA檢測方法，其特征在于凝膠過濾介質(zhì)為S印harose CL—6 B。
5、 按權(quán)利要求1所述的大豆IIS球蛋白含量的ELISA檢測方法，其特征在于免疫動物為兔。
6、 按權(quán)利要求1所述的大豆球蛋白含量的ELISA檢測方法，其特征在于純化抗體凝膠介質(zhì)為S印hadex G~200。
7、 按權(quán)利要求1所述的大豆球蛋白含量的ELISA檢測方法，其特征在于采用過碘酸鈉改良法標記辣根過氧化物酶。
8、按權(quán)利要求1所述的大豆球蛋白含量的ELISA檢測方法，其特征在于酶聯(lián)免疫方法為雙抗體夾心法。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種測定檢測大豆、豆粕及相關(guān)產(chǎn)品中11S球蛋白含量的ELISA方法。本發(fā)明采用等電點沉淀與凝膠層析純化大豆11S球蛋白作為抗原，并免疫動物獲得抗血清，然后提取抗大豆球蛋白抗體與辣根過氧化物酶連接作為酶標抗體，用作雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法檢測大豆、豆粕及相關(guān)產(chǎn)品中大豆11S球蛋白的含量。本發(fā)明的優(yōu)越性在于該法檢測快速、準確且靈敏度極高。
文檔編號G01N33/68GK101482567SQ200810246198
公開日2009年7月15日 申請日期2008年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月30日
發(fā)明者宋國福, 張邦輝, 李呂木, 韓景華 申請人:安徽農(nóng)業(yè)大學;安徽天邦飼料科技有限公司;安徽天邦生物技術(shù)有限公司