專利名稱：用于抗ErbB2抗體治療的制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及下列各項 1.治療易患或已診斷患有以過度表達ErbB2受體為特征的病癥的人類患者的方法，包括向患者施用治療有效量抗ErbB2抗體的步驟，所述方法包括 向患者施用初始劑量至少約5mg/kg的抗ErbB2抗體；和 向患者多次施用接近等于或小于初始劑量的繼續(xù)量的所述抗體。
2.項1的方法，其中所述初始劑量是至少約6mg/kg。
3.項2的方法，其中所述初始劑量是至少約8mg/kg。
4.項3的方法，其中所述初始劑量是至少約12mg/kg。
5.項1的方法，其中所述繼續(xù)量是以至少1周的間隔分開給藥。
6.項1的方法，其中所述繼續(xù)量是以至少2周的間隔分開給藥。
7.項1的方法，其中所述繼續(xù)量是以至少3周的間隔分開給藥。
8.項1的方法，其中初始劑量通過靜脈注射給藥，且其中至少一次繼續(xù)量是通過皮下注射給藥。
9.項1的方法，其中初始劑量通過靜脈注射給藥并施用至少兩次繼續(xù)量，所述繼續(xù)量是通過選自基本上由靜脈注射和皮下注射組成的組中的一種方法來給藥的。
10.項1的方法，其中初始劑量和至少一次繼續(xù)量是通過皮下注射給藥。
11.項1的方法，其中所述初始劑量選自約6mg/kg、8mg/kg或12mg/kg，其中所述多次繼續(xù)量均至少約2mg/kg，并且所述繼續(xù)量以至少1周的間隔分開給藥。
12.項11的方法，其中所述多次繼續(xù)量以至少2周的間隔分開給藥。
13.項12的方法，其中所述多次繼續(xù)量以至少3周的間隔分開給藥。
14.項13的方法，其中初始量是約8mg/kg，其中至少一次繼續(xù)量是約6mg/kg。
15.項13的方法，其中初始量是約12mg/kg，其中至少一次繼續(xù)量是約6mg/kg。
16.項11的方法，其中初始量是約8mg/kg，其中至少一次繼續(xù)量是約8mg/kg。
17.項11的方法，其中初始量是約8mg/kg，其中至少一次繼續(xù)量是約8mg/kg，并且所述初始量和繼續(xù)量以至少2周的間隔分開。
18.項17的方法，其中所述初始量和繼續(xù)量以至少3周的間隔分開。
19.項1的方法，其中初始量是多次劑量，所述多次劑量的每一次劑量是至少約1mg/kg并且連續(xù)給藥至少2天，其中至少一次繼續(xù)量是至少2mg/kg，并且所述最后一次初始劑量給藥和第一次繼續(xù)量給藥之間以及其它繼續(xù)量之間的給藥相隔至少1周。
20.項19的方法，其中初始量是多次劑量，所述多次劑量的每一次劑量是至少約1mg/kg并且連續(xù)給藥至少3天，其中至少一次繼續(xù)量是至少約6mg/kg，并且所述最后一次初始劑量和第一次繼續(xù)量之間以及其它繼續(xù)量之間的給藥相隔至少3周。
21.項1的方法，其中初始量是多次劑量，所述多次劑量的每一次劑量是至少約1mg/kg并按照每周至少2次給藥3周作為最初的劑量周期，重復(fù)該劑量周期，每個周期中的每次給藥相隔至少1天，而每周期之間的給藥相隔至少1周。
22.項1的方法，其中所述病癥是良性或惡性腫瘤。
23.項23的方法，其中所述病癥是癌癥。
24.項23的方法，其中所述癌癥選自乳腺癌、白血病、鱗狀上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、胰腺癌、惡性膠質(zhì)瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝性癌和各種類型的頭頸部癌癥。
25.項24的方法，其中所述癌癥是乳腺癌。
26.項25的方法，其中所述癌癥是轉(zhuǎn)移性乳腺癌。
27.項1的方法，其中所述抗體與ErbB2受體的胞外結(jié)構(gòu)域相結(jié)合。
28.項27的方法，其中所述抗體與ErbB2胞外結(jié)構(gòu)域序列內(nèi)的4D5表位相結(jié)合。
29.項28的方法，其中所述抗體是人源化4D5抗EbrB抗體。
30.項1的方法，進一步包括施用有效量的化療劑。
31.項30的方法，其中所述化療劑是taxoid。
32.項31的方法，其中所述taxoid是紫杉醇或紫杉萜。
33.項30的方法，其中有效量抗ErbB2抗體和有效量化療劑聯(lián)合時的用量，小于有效量的該抗ErbB2抗體和有效量的該化療劑各自單獨用藥時用量的總和。
34.項30的方法，其中化療劑是蒽環(huán)類抗生素的衍生物。
35.項34的方法，其中蒽環(huán)類抗生素的衍生物是阿霉素或表阿霉素。
36.項34的方法，其中該方法進一步包括施用心臟保護劑。
37.項1的方法，其中效力是通過測定疾病進展時間或應(yīng)答速率而測出的。
38.一種產(chǎn)品，包括容器、盛在容器中的含抗ErbB2抗體的組合物和包裝插頁，所述包裝插頁包括向給藥者說明抗ErbB2抗體初始劑量至少5mg/kg和至少一次繼續(xù)量等于或小于初始量的說明書。
39.項38的產(chǎn)品，其中說明書用于說明初始量通過靜脈注射給藥和至少一次繼續(xù)量通過皮下注射給藥。
40.項38的產(chǎn)品，其中初始劑量為至少6mg/kg。
41.項40的產(chǎn)品，其中初始劑量為至少8mg/kg。
42.項41的產(chǎn)品，其中初始劑量為至少12mg/kg。
43.項38的產(chǎn)品，其中繼續(xù)量以至少1周的間隔彼此分開給藥。
44.項38的產(chǎn)品，其中繼續(xù)量以至少2周的間隔彼此分開給藥。
45.項38的產(chǎn)品，其中繼續(xù)量以至少3周的間隔彼此分開給藥。
46.項38的產(chǎn)品，其中初始量和至少一次繼續(xù)量經(jīng)皮下注射給藥。
47.項38的產(chǎn)品，其中所述初始劑量選自約6mg/kg、8mg/kg或12mg/kg，其中所述多次繼續(xù)量均至少約2mg/kg，并且所述繼續(xù)量以至少1周的間隔分開給藥。
48.項47的產(chǎn)品，其中所述多次繼續(xù)量以至少2周的間隔分開給藥。
49.項48的產(chǎn)品，其中所述多次繼續(xù)量以至少3周的間隔分開給藥。
50.項49的產(chǎn)品，其中初始量是約8mg/kg，其中至少一次繼續(xù)量是約6mg/kg。
51.項49的產(chǎn)品，其中初始量是約12mg/kg，其中至少一次繼續(xù)量是約6mg/kg。
52.項47的產(chǎn)品，其中初始量是約8mg/kg，其中至少一次繼續(xù)量是約8mg/kg。
53.項47的產(chǎn)品，其中初始量是約8mg/kg，其中至少一次繼續(xù)量是約8mg/kg，并且所述初始量和繼續(xù)量以至少2周的間隔分開給藥。
54.項53的產(chǎn)品，其中所述初始量和繼續(xù)量以至少3周的間隔分開給藥。
55.項38的產(chǎn)品，其中初始量是多次劑量，所述多次劑量的每一次劑量是至少約1mg/kg并且連續(xù)給藥至少2天，其中至少一次繼續(xù)量是至少約2mg/kg，并且所述最后一次初始劑量給藥和第一次繼續(xù)量給藥之間以及其它繼續(xù)量之間的給藥相隔至少1周。
56.項55的產(chǎn)品，其中初始量是多次劑量，所述多次劑量的每一次劑量是至少約1mg/kg并且連續(xù)給藥至少3天，其中至少一次繼續(xù)量是至少約6mg/kg，并且所述最后一次初始劑量給藥和第一次繼續(xù)量給藥之間以及其它繼續(xù)量之間的給藥相隔至少3周。
57.項38的產(chǎn)品，其中初始量是多次劑量，所述多次劑量的每一次劑量是至少約1mg/kg并按照每周至少2次給藥3周作為最初的劑量周期，重復(fù)該劑量周期，每個周期中的每次給藥相隔至少1天，而每周期之間的給藥相隔至少1周。
58.項38的產(chǎn)品，其中說明書用于說明初始劑量經(jīng)皮下注射給藥和至少一次繼續(xù)量經(jīng)皮下注射給藥。
59.項58的產(chǎn)品，其中初始量為至少約6mg/kg。
60.項59的產(chǎn)品，其中初始量為至少約8mg/kg。
61.項60的產(chǎn)品，其中初始量為至少約12mg/kg。
62.項58的產(chǎn)品，其中繼續(xù)量以至少1周的間隔彼此分開給藥。
63.項58的產(chǎn)品，其中繼續(xù)量以至少2周的間隔彼此分開給藥。
64.項58的產(chǎn)品，其中繼續(xù)量以至少3周的間隔彼此分開給藥。
65.項58的產(chǎn)品，其中所述初始劑量選自約6mg/kg、8mg/kg或12mg/kg，其中所述多次繼續(xù)量均至少約2mg/kg，并且所述繼續(xù)量以至少1周的間隔分開給藥。
66.項58的產(chǎn)品，其中所述多次繼續(xù)量以至少2周的間隔分開給藥。
67.項66的產(chǎn)品，其中所述多次繼續(xù)量以至少3周的間隔分開給藥。
68.項67的產(chǎn)品，其中初始量是約8mg/kg，其中至少一次繼續(xù)量是約6mg/kg。
69.項67的產(chǎn)品，其中初始量是約12mg/kg，其中至少一次繼續(xù)量是約6mg/kg。
70.項65的產(chǎn)品，其中初始量是約8mg/kg，其中至少一次繼續(xù)量是約8mg/kg。
71.項65的產(chǎn)品，其中初始量是約8mg/kg，其中至少一次繼續(xù)量是約8mg/kg，并且所述初始量和繼續(xù)量以至少2周的間隔分開給藥。
72.項71的產(chǎn)品，其中所述初始量和繼續(xù)量以至少3周的間隔分開給藥。
73.項58的產(chǎn)品，其中初始量是多次劑量，所述多次劑量的每一次劑量是至少約1mg/kg并且連續(xù)給藥至少2天，其中至少一次繼續(xù)量是至少約2mg/kg，并且所述最后一次初始劑量給藥和第一次繼續(xù)量給藥之間以及其它繼續(xù)量之間的給藥相隔至少1周。
74.項73的產(chǎn)品，其中初始量是多次劑量，所述多次劑量的每一次劑量是至少約1mg/kg并且連續(xù)給藥至少3天，其中至少一次繼續(xù)量是至少約6mg/kg，并且所述最后一次初始劑量給藥和第一次繼續(xù)量給藥之間以及其它繼續(xù)量之間的給藥相隔至少3周。
75.項58的產(chǎn)品，其中初始量是多次劑量，所述多次劑量的每一次劑量是至少約1mg/kg并按照每周至少2次給藥3周作為最初的劑量周期，重復(fù)該劑量周期，每個周期中的每次給藥相隔至少1天，而每周期之間的給藥相隔至少1周。
76.項38的產(chǎn)品，其中說明書進一步包括化療劑給藥的說明。
77.項76的產(chǎn)品，其中化療劑是taxoid。
78.項77的產(chǎn)品，其中taxoid是紫杉醇或紫杉萜。
79.項76的產(chǎn)品，其中化療劑是蒽環(huán)類抗生素的衍生物。
80.項79的產(chǎn)品，其中說明書進一步包括施用心臟保護劑的說明。
81.項38的產(chǎn)品，進一步包括貼在容器上的或由容器附帶的一個標簽，所述標簽指明該組合物可用于治療以過度表達ErbB2受體為特征的病癥。
82.項81的產(chǎn)品，其中所述標簽指明所述組合物可用于治療乳腺癌。
83.項38的產(chǎn)品，其中所述抗ErbB2抗體與所述受體的胞外結(jié)構(gòu)域相結(jié)合。
84.項83的產(chǎn)品，其中所述抗ErbB2抗體與ErbB2胞外結(jié)構(gòu)域序列內(nèi)的4D5表位相結(jié)合。
85.項84的產(chǎn)品，其中所述抗體是人源化4D5抗EbrB2抗體。
86.治療人類癌癥患者的方法，包括向患者施用首次劑量的抗ErbB2抗體，接著施用至少一次繼續(xù)量的該抗體，其中首次劑量和繼續(xù)量給藥以至少約2周的間隔彼此分開。
87.項86的方法，其中首次劑量和繼續(xù)量給藥以至少約3周的間隔彼此分開。
88.項86的方法，其中首次劑量和繼續(xù)量分別是約2mg/kg～約16mg/kg。
89.項88的方法，其中首次劑量和繼續(xù)量分別是約4mg/kg～約12mg/kg。
90.項89的方法，其中首次劑量和繼續(xù)量分別是約6mg/kg～約12mg/kg。
91.項86的方法，其中向患者施用兩次或多次繼續(xù)量的所述抗體。
92.項91的方法，其中向患者施用約2次～約10次繼續(xù)量的所述抗體。
93.項91的方法，其中兩次或多次繼續(xù)量彼此之間按照至少約2周的間隔給藥。
94.項93的方法，其中兩次或多次繼續(xù)量彼此之間按照至少約3周的間隔給藥。
95.項91的方法，其中兩次或多次繼續(xù)量給藥分別是約2mg/kg～約16mg/kg。
96.項91的方法，其中兩次或多次繼續(xù)量給藥分別是約4mg/kg～約12mg/kg。
97.項91的方法，其中兩次或多次繼續(xù)量給藥均是約6mg/kg～約12mg/kg。
98.項86的方法，其中該方法進一步包括向患者施用有效量的化療劑。
99.項98的方法，其中化療劑是taxoid。
100.一種產(chǎn)品，包括容器、盛在容器中的含有抗ErbB2抗體的組合物和包裝插頁，所述包裝插頁包括按照項86-99任一方法給藥的說明書。
101.治療人類癌癥患者的方法，包括向患者施用有效量的抗ErbB抗體，所述方法包括 向患者施用初始劑量至少為約5mg/kg的抗ErbB抗體；和向患者多次施用繼續(xù)量的所述抗體，所述繼續(xù)量大約等于或小于所述初始劑量。
102.項101的方法，其中所述抗ErbB抗體選自抗-表皮生長因子受體(EGFR)、抗ErbB3和抗ErbB4抗體。
103.治療人類癌癥患者的方法，包括向患者施用首次劑量的抗ErbB抗體，接著施用至少一次繼續(xù)量的該抗體，所述首次劑量和繼續(xù)量以至少均2周的間隔彼此分開給藥。
104.項103的方法，其中所述抗ErbB抗體選自抗-表皮生長因子受體(EGFR)、抗ErbB3和抗ErbB4抗體。
105.一種產(chǎn)品，包括容器、盛在容器中的含有抗ErbB抗體的組合物和包裝插頁，所述包裝插頁含有按照項101～104中任一項的方法給藥的說明書。
附圖簡述

圖1顯示了通過截短突變分析和定點誘變測得的ErbB2胞外結(jié)構(gòu)域的表位作圖(Nakamura等，J.Virology 67(10)6179-6191[1993年10月])；Renz等J.Cell Biol.125(6)1395-1406[1994年1月])?？乖鲋矼abs 4D5和3H4與跨膜結(jié)構(gòu)域的鄰近區(qū)結(jié)合。各種ErbB2-ECD截短突變體或點突變體是利用聚合酶鏈式反應(yīng)從cDNA產(chǎn)生。ErbB2突變體在哺乳動物的表達質(zhì)粒中表達為gD融合蛋白。這種表達質(zhì)粒使用了巨細胞病毒啟動子/增強子和SV40終止序列以及位于cDNA插入片段下游的聚腺苷酸信號。用質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染293S細胞。轉(zhuǎn)染一天后，將細胞在無甲硫氨酸和半胱氨酸的低糖DMEM培養(yǎng)基中通過代謝(metabolically)標記過夜，所述DMEM培養(yǎng)基中含1％經(jīng)透析的胎牛血清和25μCi35S甲硫氨酸以及25μCi35S半胱氨酸。收獲上清，并向上清中加入抗ErbB2單克隆抗體或?qū)φ湛贵w，4℃培育2-4小時。沉淀復(fù)合物，在10-20％Tricine SDS梯度凝膠上用100V電壓進行電泳。將該凝膠電印跡到膜上并通過放射自顯影進行分析。SEQ ID Nos8和9分別描述3H4和4D5表位。
圖2用下劃線顯示ErbB2結(jié)構(gòu)域1(SEQ ID NO1)的氨基酸序列。粗體氨基酸表示單克隆抗體7C2和7F3識別的表位的位置(經(jīng)缺失圖譜測得)，即“7C2/7F3表位”(SEQ ID NO2)。
圖3是抗ErbB2抗體(HERCEPTIN

)谷血清濃度(μg/ml，均值±SE，黑圈)對用HERCEPTIN

抗ErbB2抗體治療ErbB2過度表達型患者的周時間的作圖，所述治療從第2周至第36周，其中抗ErbB2抗體的初始劑量為4mg/kg，繼續(xù)量為每周2mg/kg。每個時間點的患者人數(shù)用“n”表示(白色方框)。
圖4A是用HERCEPTIN

抗ErbB2抗體治療小鼠時，腫瘤體積隨時間變化的線圖。圖4B是圖4A相同數(shù)據(jù)的半對數(shù)作圖，這樣受治動物的腫瘤體積變化更為直觀。
圖5A和5B描述了對下述序列的排列對比(alignment)，即小鼠單克隆抗體2C4的輕鏈可變區(qū)(VL)(圖5A)和重鏈可變區(qū)(VH)(圖5B)氨基酸序列(分別見SEQ ID NOs 10和11)；人源化Fab版574的VL和VH區(qū)(分別見SEQ ID Nos12和13)，以及人VL和VH的共有框架(humκ1，輕鏈κ亞群I；humIII，重鏈亞群III)(分別見SEQ ID Nos 14和15)。星號表明人源化Fab版574和鼠單克隆抗體2C4之間，或者人源化Fab版574和人的框架之間的差異?；パa決定區(qū)(CDRs)用括號標出。人源化Fab版574(帶有ArgH71Val、AspH73Arg和IleH69Leu的改變)顯示恢復(fù)了與原始嵌合2C4Fab段的結(jié)合。為了進一步精煉或增加人源化抗體的結(jié)合，可修飾其它的FR和/或CDR殘基如L2、L54、L55、L56、H35和/或H48(例如如下取代IleL2Thr；ArgL54Leu；TyrL55Glu；ThrL56Ser；AspH35Ser；和ValH48Ile)?；蛘?或另外)，為了改善或精煉所述人源化抗體的親和力和/或其它生物學(xué)活性，可對其進行親和力成熟。
優(yōu)選實施方案詳述 I.定義 “ErbB受體”是受體蛋白酪氨酸激酶，屬于ErbB受體家族并且包括EGFR、ErbB2、ErbB3和ErbB4受體和在將來被鑒定的此家族其它成員。ErbB受體通常包括可結(jié)合ErbB配體的細胞外結(jié)構(gòu)域；親脂性跨膜結(jié)構(gòu)域；保守的細胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域；和含幾個可被磷酸化的酪氨酸殘基的羧基末端信號結(jié)構(gòu)域。ErbB受體可以是“天然序列”ErbB受體或其“氨基酸序列變體”。優(yōu)選該ErbB受體是天然序列人ErbB受體。
術(shù)語“ErbB1”、“表皮生長因子受體”和“EGFR”在本文中可互換應(yīng)用，是指如Carpenter等(Ann.Rev.Biochem.56881-914(1987))公開的EGFR，包括其天然突變型(例如Humphrey等(PNAS(USA)874207-4211(1990))所述缺失突變型EGFR)。erbB1是指編碼EGFR蛋白產(chǎn)物的基因。與EGFR結(jié)合的抗體實例包括Mab 579(ATCC CRL HB8506)、MAb 455(ATCC CRL HB8507)、Mab 225(ATCC CRL HB 8508)、Mab 528(ATCC CRL HB 8509)(見美國專利4943533，Mendelsohn等)及其變體，例如嵌合型225(C225)和重塑型人225(H225)(見WO96/40210，Imclone Systems Inc.)。
“ErbB3”和“HER3”是指如美國專利5183884和5480968以及Kraus等(PNAS(USA)869193-9197(1989))公開的受體多肽，包括其變體。與HER3結(jié)合的抗體的實例在美國專利5868511(Akita和Sliwkowski)中作了描述，例如8B8抗體(ATCC HB 12070)或其人源化變體。
術(shù)語“ErbB4”和“HER4”是指在下述文獻中公開的受體多肽，如歐洲專利申請599274、Plowman等，美國國家科學(xué)院院刊，901746-1750(1993)，和Plowman等，自然，366473-475(1993)，包括其變體，如在1999年4月22公開的WO99/19488中所述的同種型。
術(shù)語“ErbB2”、“HER2”和“c-Erb-B2”可互換應(yīng)用。除非另外聲明，術(shù)語“ErbB2”、“c-Erb-B2”和“HER2”在本文中是指人蛋白質(zhì)，而“erbB2”、“c-erb-B2”和“her2”是指人基因。人erbB2基因和ErbB2蛋白，例如在Semba等(PNAS(USA)826497-6501(1985))和Yamamoto等(自然319230-234(1986))中的描述(Genebank登記號X03363)。ErbB2包括四個結(jié)構(gòu)域(結(jié)構(gòu)域1-4)。
“表位4D5”是ErbB2細胞外結(jié)構(gòu)域中與抗體4D5(ATCC CRL 10463)結(jié)合的區(qū)域。該表位靠近ErbB2的跨膜結(jié)構(gòu)域。為了篩選與4D5表位結(jié)合的抗體，可進行常規(guī)的交叉阻斷試驗，例如《抗體》，實驗室指南，冷泉港實驗室，Harlow和David Lane編(1998)所述方法。或者，可進行表位作圖(見圖1)來評定抗體是否與ErbB2的4D5表位(例如ErbB2上從約殘基529到殘基625的區(qū)域中的任何一個或多個殘基，包括這兩個端點殘基)結(jié)合。
“表位3H4”是ErbB2細胞外結(jié)構(gòu)域中與抗體3H4結(jié)合的區(qū)域。該表位包括ErbB2細胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中從約541到約599(包括這兩個端點殘基)的殘基，見圖1。
“表位7C2/7F3”是與7C2和/或7F3抗體(均在ATCC保存，見下述)結(jié)合的ErbB2細胞外結(jié)構(gòu)域N末端區(qū)域。為了篩選與7C2/7F3表位結(jié)合的抗體，可進行常規(guī)的交叉阻斷試驗，例如《抗體》，實驗室指南，冷泉港實驗室，Harlow和David Lane編(1998)所述方法?；蛘?，可進行表位作圖來評定抗體是否與ErbB2的7C2/7F3表位(例如ErbB2上從約殘基22到殘基53的區(qū)域中的任何一個或多個殘基；SEQ ID NO2)結(jié)合。
“誘導(dǎo)細胞死亡”的抗體是使活細胞失去活性的抗體。所述細胞通常是表達ErbB2受體的細胞，尤其是過度表達ErbB2受體的細胞。優(yōu)選所述細胞為癌細胞，例如乳腺、卵巢、胃、子宮內(nèi)膜、唾液腺、肺、腎、結(jié)腸、甲狀腺、胰腺或膀胱的細胞。在體外，所述細胞可以是SK-BR-3、BT474、Calu3、MDA-MB-453、MDA-MB-361或SKOV3細胞。在體外的細胞死亡可在無補體和免疫效應(yīng)細胞的條件下進行檢測，以便與抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒(ADCC)或補體依賴性細胞毒作用(CDC)誘導(dǎo)的細胞死亡進行區(qū)分。因此，可使用熱滅活的血清(即在無補體的條件下)并在無免疫效應(yīng)細胞的條件下進行細胞死亡檢測。為了檢測抗體能否誘導(dǎo)細胞死亡，可通過評價相對于未處理細胞，對propidium iodide(PI)、臺盼藍(見Moore等，細胞技術(shù)171-11(1995))或7AAD的吸收來評估膜完整性的喪失。優(yōu)選的細胞死亡誘導(dǎo)抗體是那些在“BT474細胞的PI攝入試驗”中誘導(dǎo)PI攝入的抗體。
術(shù)語“誘導(dǎo)凋亡”或“能夠誘導(dǎo)細胞凋亡”是指抗體誘導(dǎo)細胞程序性細胞死亡的能力，所述凋亡可通過膜聯(lián)蛋白V的結(jié)合，DNA片段化，細胞皺縮，內(nèi)織網(wǎng)膨脹，細胞碎裂，和/或膜泡(稱為凋亡小體)的形成而確定。所述細胞通常是過度表達ErbB2受體的細胞。優(yōu)選所述細胞為癌細胞，例如乳腺、卵巢、胃、子宮內(nèi)膜、唾液腺、肺、腎、結(jié)腸、甲狀腺、胰腺或膀胱的細胞。在體外，所述細胞可以是SK-BR-3、BT474、Calu 3、MDA-MB-453、MDA-MB-361或SKOV3細胞。可用各種方法檢測與凋亡相關(guān)的細胞事件。例如，磷脂酰絲氨酸(PS)易位可通過膜聯(lián)蛋白結(jié)合來測定；DNA片段化可通過DNA序列梯(laddering)來評估；與DNA片段化相伴的核/染色體濃縮可通過亞二倍體細胞中的任何增加來評估。優(yōu)選凋亡誘導(dǎo)抗體是在BT474細胞的膜聯(lián)蛋白結(jié)合試驗中，導(dǎo)致對膜聯(lián)蛋白的結(jié)合為未處理細胞的約2-50倍，優(yōu)選約5-50倍，最優(yōu)選約10-50倍的那些抗體(見下述)。
有時前凋亡性(pro-apoptotic)抗體是進一步阻斷ErbB2/ErbB3復(fù)合物的HER結(jié)合/活化的抗體(例如7F3抗體)。在其它情況中，所述抗體是不明顯阻斷被HRG激活的ErbB2/ErbB3復(fù)合物的抗體(例如7C2)。而且，該抗體可以是與7C2相似的抗體，其在誘導(dǎo)細胞凋亡時，不引起S期細胞的百分比大幅下降(例如與對照相比僅引起這些細胞的百分比下降約0-10％的抗體)。
目標抗體可以象7C2那樣，它可與人ErbB2特異性結(jié)合，且不與其它蛋白(由erbB1、erbB2、erbB3和/或erbB4基因編碼的蛋白)發(fā)生顯著的交叉反應(yīng)。有時，抗體可能不與大鼠neu蛋白(例如Schecter等Nature 312513(1984)和Drebin等Nature 312545-548(1984)中所述的)發(fā)生明顯的交叉反應(yīng)。在該實例中，此抗體與這些蛋白(如結(jié)合于內(nèi)源性受體的細胞表面)的結(jié)合程度將低于10％，所述結(jié)果是用熒光激活細胞分選(FACS)或放射免疫沉淀(RIA)測定的。
本文中的“遺傳調(diào)節(jié)蛋白”(HRG)在是指激活ErbB2-ErbB3和ErbB2-ErbB4蛋白復(fù)合物的多肽(即，在結(jié)合到其上時誘導(dǎo)復(fù)合物中的酪氨酸磷酸化)。該術(shù)語中囊括的各種遺傳調(diào)節(jié)蛋白多肽公開在例如下述文獻中Holmes等Science 2561205-1210(1992)；WO92/20798；Wen等Mol.Cell.Biol.14(3)1909-1919(1994)；和Marchionni等，Nature 362312-318(1993)。該術(shù)語包括天然序列HRG多肽的生物學(xué)活性片段和/或其氨基酸序列變體，例如其EGF樣結(jié)構(gòu)域片段(如HRGβ1177-244)。
術(shù)語“ErbB2-ErbB3蛋白復(fù)合物”和“ErbB2-ErbB4蛋白復(fù)合物”是ErbB2受體分別與ErbB3受體或ErbB4受體非共價結(jié)合的寡聚物。所述復(fù)合物在表達這些受體的細胞接觸HRG時形成，可通過免疫沉淀分離獲得，并可用Sliwkowski等在J.Biol.Chem.269(20)14661-14665(1994)中描述的SDS-PAGE來分析。
“抗體(Ab)”和“免疫球蛋白(Ig)”是具有相同結(jié)構(gòu)特征的糖蛋白?？贵w表現(xiàn)出對特異抗原的結(jié)合特異性，而免疫球蛋白包括抗體和其它缺少抗原特異性的抗體-樣分子。譬如，淋巴系統(tǒng)可產(chǎn)生少量后一類多肽，而骨髓瘤可產(chǎn)生較高含量的后一類多肽。
“天然抗體”和“天然免疫球蛋白”是約150000道爾頓的異四聚糖蛋白，其由兩個相同的輕鏈(L)和兩個相同的重鏈(H)組成，每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈間的二硫鍵數(shù)目不同。每條重鏈和輕鏈還有規(guī)則間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈的一端有可變區(qū)(VH)，其后是多個不變區(qū)。每條輕鏈的一端有可變區(qū)(VL)，另一端有恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一個恒定區(qū)相對應(yīng)，輕鏈的可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)相對。據(jù)信特殊的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈的可變區(qū)之間形成界面。
術(shù)語“可變”是指可變區(qū)某些部分的序列在抗體之間有很大差異，它們可在各個抗體對其特殊抗原的結(jié)合和特異性方面發(fā)揮作用。然而，該變異性不是均勻的分布于整個抗體的可變區(qū)。它集中于輕鏈和重鏈可變區(qū)中三個稱為互補決定區(qū)(CDR)或超變區(qū)的節(jié)段中?？勺儏^(qū)中保守性較高的區(qū)域稱為框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)各包括4個FR，主要采取β折疊構(gòu)象，由形成環(huán)狀連接的三個CDR相連接，而在某些情況下可形成部分β折疊結(jié)構(gòu)。每條鏈的CDR通過FR緊密的靠近在一起，并且與其它鏈的CDR一起形成抗體的抗原結(jié)合位點(見Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，第I卷，第647-669頁(1991))。恒定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但是表現(xiàn)出各種效應(yīng)功能，例如參與抗體的抗體依賴性細胞毒性作用。
木瓜蛋白酶消化抗體可產(chǎn)生兩個相同的各帶有單個抗原結(jié)合位點的抗原結(jié)合片段(稱為“Fab”片段)和殘余的“Fc”片段，F(xiàn)c段的名稱反應(yīng)了其易于結(jié)晶的能力。經(jīng)胃蛋白酶處理可產(chǎn)生具有兩個抗原結(jié)合位點并仍然能交聯(lián)抗原的F(ab’)2片段。
“Fv”段是含有完整的抗原識別和抗原結(jié)合位點的最小抗體片段。此區(qū)由緊密地非共價連接的一個重鏈可變區(qū)與一個輕鏈可變區(qū)的二聚體組成。在這個構(gòu)象中每個可變區(qū)的三個CDR相互作用，在VH-VL二聚體表面限定一個抗原結(jié)合位點。這六個CDR共同賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個可變區(qū)(或FV的一半僅含有三個抗原特異性CDR)也具有識別和結(jié)合抗原的能力，盡管與完整的結(jié)合位點相比其親和力較低。
Fab段還包括輕鏈恒定區(qū)和重鏈的第一個恒定區(qū)(CH1)。Fab’與Fab的差別在于Fab’在重鏈CH1的羧基末端多出幾個殘基，包括抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸。Fab’-SH在本文中是指恒定區(qū)半胱氨酸殘基中至少有一個游離巰基的Fab’。F(ab’)2抗體片段在最初產(chǎn)生為Fab’片段對，在它們之間具有鉸鏈區(qū)半胱氨酸。抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)是眾所周知的。
脊椎動物任何物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”，可依據(jù)其恒定區(qū)氨基酸序列而歸為兩種完全不同的兩類(稱為κ和λ)中的一類。
根據(jù)其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，可將免疫球蛋白分為不同種類。主要有5類免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些還可進一步分成“亞類”(同種型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。對應(yīng)于不同類抗體的重鏈恒定區(qū)分別稱為α、δ、ε、γ和μ。不同類免疫球蛋白的亞單位結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)象是眾所周知的。
本文中術(shù)語“抗體”是指最廣義上的抗體，具體包括完整的單克隆抗體，多克隆抗體，由至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗體片段，只要其顯示所需生物學(xué)活性即可。
“抗體片段”包括完整抗體的一部分，優(yōu)選包括其抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的實例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；二價抗體；線性抗體(Zapata等，Protein Eng.8(10)1057-1062[1995])；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體。
本文中術(shù)語“單克隆抗體”是指來自基本上同質(zhì)的抗體群的抗體，即除了可能少量存在的天然突變以外，該抗體群中的各個抗體均相同。單克隆抗體具有高度的特異性，針對單個抗原位點。而且，與通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制劑相反，每種單克隆抗體是針對抗原上的單個表位。除了其特異性之外，單克隆抗體的優(yōu)點在于它們可被合成并不受其它抗體的污染。修飾詞“單克隆”表明該抗體的特點，即其來自基本上同質(zhì)的抗體群，不解釋為需通過任何特殊方法產(chǎn)生該抗體。例如，根據(jù)本發(fā)明應(yīng)用的單克隆抗體可通過由Kohler等(自然，256495(1975))首先描述的雜交瘤法進行制備，或者可通過重組DNA法進行制備(例如見美國專利4816567)?！皢慰寺】贵w”還可利用例如Clackson等(自然，352624-628(1991))和Marks等(分子生物學(xué)雜志，222581-597(1991))所述技術(shù)從噬菌體抗體文庫中分離。
本文中單克隆抗體特別包括“嵌合”抗體，其重鏈和/或輕鏈的一部分與源自特殊物種或?qū)儆谔厥饪贵w種類或亞類的抗體的相應(yīng)序列相同或同源，但所述鏈的剩余部分的序列與源自另一個物種或?qū)儆诹硪粋€抗體種類或亞類的抗體(以及此抗體的片段，只要它們顯示所需的生物學(xué)活性)的相應(yīng)序列相同或同源(美國專利4,816,567；和Morrison等，美國國家科學(xué)院院刊，816851-6855(1984))。
“人源化”型非人(例如小鼠)抗體是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(如Fv、Fab、Fab’、F(ab)’)或抗體的其它抗原結(jié)合序列，它們包含非人免疫球蛋白的最小序列。在很大程度上，人源化抗體是人免疫球蛋白(受者抗體)中受者的互補決定區(qū)(CDR)殘基被具有所需特異性、親和力和性能的小鼠、大鼠、家兔或非人靈長類等非人源物種抗體(供體抗體)的CDR殘基所取代。在一些實例中，人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基由相應(yīng)的非人類殘基所取代。而且，人源化抗體可包括在受者抗體或供體CDR或框架序列中不存在的殘基。這些修飾旨在進一步改善和最大化抗體的性能。通常，人源化抗體基本上包括至少一個(通常包括兩個)可變區(qū)的全部，其中CDR的全部或基本上全部對應(yīng)于非人免疫球蛋白的相應(yīng)部分，而FR序列的全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列。人源化抗體還任選包括免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常為人免疫球蛋白的恒定區(qū)的至少一部分。詳見Jones等，自然，321522-525(1986)；Riechmann等，自然332323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596(1992)。人源化抗體包括PRIMATIZEDTM抗體，其中抗體的抗原結(jié)合區(qū)可從通過感興趣抗原免疫接種獼猴制得的抗體中衍生獲得。
“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段包括抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域存在于單個多肽鏈上。優(yōu)選Fv多肽在VH和VL結(jié)構(gòu)域之間還包含一個多肽接頭，它能使scFv形成抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述見Pluckthun在《單克隆抗體的藥理學(xué)》，第113卷，Rosenburg和Moore編，Springer-Verlag，New York，第269-315頁(1994)。
術(shù)語“二價抗體”是指具有兩個抗原結(jié)合位點的小分子抗體片段，這些片段在一條多肽鏈(VH-VL)上含有相連的一個重鏈可變區(qū)(VH)和一個輕鏈可變區(qū)(VL)。利用一種非常短的接頭，其使得同一條鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域無法配對，不得不與另一條鏈上的互補結(jié)構(gòu)域配對，從而形成兩個抗原結(jié)合位點。在EP 404,097；WO93/11161；和Hollinger等，美國國家科學(xué)院院刊，906444-6448(1993)中有對二價抗體的更詳細描述。
“分離的”抗體是已從其天然環(huán)境的組成中鑒定、分離和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染成分是干擾抗體的診斷或治療應(yīng)用的物質(zhì)，可包括酶、激素和其它蛋白性或非蛋白性溶質(zhì)。在優(yōu)選的實施方案中，該抗體的純度應(yīng)達到(1)經(jīng)Lowery法確定的抗體重量的95％以上，最優(yōu)選所述重量的99％以上，(2)足以獲得用旋轉(zhuǎn)杯狀(spinning cup)序列分析儀所測至少15個殘基的N端或內(nèi)部氨基酸序列，(3)通過還原或非還原條件下的SDS-PAGE以及考馬斯亮藍染色、優(yōu)選銀染色所證實的同質(zhì)性。分離的抗體包括重組細胞內(nèi)的原位抗體，因為該抗體的自然環(huán)境中的至少一種組分已不存在。一般情況下分離的抗體可通過至少一個純化步驟來制備。
本文所用術(shù)語“補救受體結(jié)合表位”是指IgG分子(如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)Fc區(qū)的一種表位，它負責延長IgG分子的體內(nèi)血清半衰期。
“治療”是指治療和預(yù)防措施，那些需要治療的對象是已經(jīng)患有疾病以及有待預(yù)防疾病的個體。
需要治療的“哺乳動物”是指哺乳類任何動物，包括人、家禽、農(nóng)用動物，和動物園、運動項目用的動物或?qū)櫸?，如犬、馬、貓、牛等。優(yōu)選哺乳動物是人。
“疾病”是將受益于抗BrbB2抗體治療的任何病癥。這包括慢性和急性疾病，包括使哺乳動物易患上所討論疾病的病理狀況。這些被治療疾病的非限定實例包括良性和惡性腫瘤；白血病和淋巴樣惡性腫瘤；神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、星形交質(zhì)細胞、下丘腦和其它腺體、巨噬細胞、上皮細胞、間質(zhì)和囊胚腔的疾?。谎仔?、血管原性和免疫性疾病。
術(shù)語“治療有效量”是指具有已知增生效果的量。優(yōu)選地，治療有效量具有細胞凋亡(apoptotic)活性，或者能夠誘導(dǎo)細胞死亡，并且優(yōu)選良性或惡性腫瘤細胞尤其是癌細胞死亡。根據(jù)所治病癥的情況，可用常規(guī)方法測定治療效力。對于癌癥治療來說，可通過例如評估疾病進展時間(TTP)或測定應(yīng)答率(RR)來測定其效力(見下述實施例1)。治療有效量也指目標血清濃度，如谷血清濃度，當在一段期間保持該濃度時，能夠有效抑制疾病癥狀。
術(shù)語“癌癥”和“癌性的”是指或描述哺乳動物中以細胞生長失控為典型特點的病理狀態(tài)。癌癥的實例包括但不限定于癌(carcinoma)，淋巴瘤，母細胞瘤，肉瘤和白血病或淋巴樣惡性腫瘤。更具體而言，這些癌包括鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)，肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌和肺鱗狀上皮癌)，腹膜癌，肝細胞癌(hepatocellular cancer)，胃癌(包括胃腸癌)，胰腺癌，膠質(zhì)母細胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝癌(liver cancer)，膀胱癌，肝細胞瘤(hepatoma)，乳腺癌，結(jié)腸癌，直腸癌，結(jié)直腸癌，子宮內(nèi)膜或子宮癌，唾液腺癌，腎癌，前列腺癌，外陰癌，甲狀腺癌，肝癌(hepaticcrcinoma)，以及各種頭、頸部癌。
本文所用術(shù)語“細胞毒性劑”是指抑制或阻止細胞功能和/或引起細胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語意在包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)，化療劑，毒素如細菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素或其片段。
“化療劑”是在腫瘤治療中使用的化學(xué)化合物?；焺嵗ㄍ榛瘎?，如噻替哌(thiotepa)；環(huán)磷酰胺(cyclosphamide)(CYTOXANTM)；烷基磺酸酯如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶(aziridine)如苯并多巴(benaodopa)，卡波醌(carboquone)，美妥替哌(meturedopa)和尿烷亞胺(uredopa)；氮丙啶和methylamelamine包括六甲蜜胺(altretamine)，三亞胺嗪(triethylenemelamine)，三亞乙基磷酰胺，三亞乙基硫代磷酰胺和三羥甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥，萘氮芥，膽磷酰胺(cholophosphamide)，雌氮芥(estramustine)，異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)，氮芥(mechlorethamine)，鹽酸氧氮芥；左旋苯丙氨酸氮芥(melphalan)，新氮芥(novembichin)，膽甾醇苯乙酸氮芥，松龍苯芥(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥；亞硝基脲(nitrosureas)如亞硝基脲氮芥(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)，雷莫司汀(ranimustine)；抗生素如阿克拉霉素，放線菌素，authramycin，重氮絲氨酸，博來霉素，放線菌素C(cactinomycin)，加利車霉素(calicheamicin)，carabicin，洋紅霉素(chromomycin)，嗜癌素(carzinophilin)，色霉素，放線菌素D，柔紅菌素(daunorubicin)，地托比星(detorubicin)，6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸，阿霉素(doxorubicin)，表阿霉素(epirubicin)，依索比星(esorubicin)，伊達比星(idarubicin)，發(fā)波霉素(marcellomycin)，絲裂霉素，霉酚酸，諾加霉素(nogalamycin)，橄欖霉素(olivomycin)，培洛霉素(peplomycin)，potfiromycin，嘌呤霉素，三鐵阿霉素(quelamycin)，羅多比星(rodorubicin)，鏈黑菌素；鏈脲霉素(streptozocin)，殺結(jié)核菌素，烏苯美司(ubenimex)，凈司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代謝藥如氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物如二甲葉酸(denopterin)，氨甲蝶呤，蝶羅呤，三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物氟達拉濱(fludarabine)，6-巰基嘌呤，硫咪嘌呤，硫鳥嘌呤；嘧啶類似物如安西他濱(ancitabine)，阿扎胞苷(azacitidine)，6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷，雙脫氧尿苷，去氟氧尿苷(doxifluridine)，依諾他濱(enocitabine)，氟尿苷，5-FU；雄激素類如二甲睪酮(calusterone)，丙酸甲雄烷酮(dromostanolong propionate)，環(huán)硫雄醇(epitiostanol)，美雄氨(mepitiostane)，睪內(nèi)酯(testolactone)；抗腎上腺類如氨魯米特(aminoglutethimide)，米托坦(mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑如frolinic acid；醋葡內(nèi)酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(biasntrene)；依達曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋銨(elliptinium acetate)；依托格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼達明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidamol)；硝呋旦(nitracrine)；噴司他丁(pintostatin)；phenamet；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼樹酸(podophyllinicacid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK

雷佐生(razoxane)；西索菲蘭(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺(trichlorrotriethylamine)；烏拉坦(urethan)；長春堿酰胺；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；環(huán)磷酰胺；三胺硫磷(thiotepa)；taxoid(taxanes)，如紫杉醇(TAXOL

Bristol-Myers SquibbOncology，Princeton，NJ)和紫杉萜(TAXOTERE

Rhone-Poulenc Rorer，Antony，F(xiàn)rance)；苯丁酸氮芥；吉西他濱(gemcitabine)；6-硫代鳥嘌呤；巰基嘌呤；氨甲蝶呤；鉑類似物如順鉑和卡鉑；長春花堿；鉑；依托泊甙(etoposide)(VP-16)；異環(huán)磷酰胺；絲裂霉素C；米托蒽醌；長春新堿；長春瑞賓(vinorelbine)；新霉酰胺(navelbine)；novantrone；替尼泊甙(teniposide)；柔紅霉素；氨基蝶呤；xeloda；伊拜膦酸鹽(ibandronate)；CPT-11；拓撲異構(gòu)酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；維甲酸；esperamicins；capecitabine；以及上述任何物質(zhì)的可藥用鹽，酸或衍生物。此定義還包括能調(diào)節(jié)或抑制激素對腫瘤的作用的抗激素制劑，如抗雌激素制劑包括他莫昔芬(tamoxifen)，雷洛昔芬(raloxifene)，芳香酶抑制劑4(5)-咪唑，4-羥基他莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene)，keoxifene，LY117018，onapristone，和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素制劑如氟他氨(flutamide)，尼魯米特(nilutamide)，bicalutamide，亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；和上述任何物質(zhì)的可藥用鹽、酸或衍生物。
本文中“生長抑制劑”是指在體內(nèi)或體外抑制細胞生長，尤其抑制表達ErbB的癌癥細胞生長的化合物或組合物。因此，生長抑制劑可以是顯著降低S期ErbB表達細胞百分比的藥物。生長抑制劑的實例包括阻斷細胞周期(在除S期以外的某個階段)進展的藥物，例如誘導(dǎo)G1停滯和M期停滯的藥物。經(jīng)典的M期阻斷劑包括長春花類(長春新堿和長春花堿)，taxoid(taxane)和topo II抑制劑如阿霉素、表阿霉素、柔紅霉素、依托泊甙(etoposide)和博來霉素等。那些使G1期停滯的藥物還連帶(spill over)使S期停滯，例如DNA烷化劑象他莫昔芬、強的松、達卡巴嗪、氮芥(mechlorethamine)、順鉑、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷等。詳見《癌癥的分子基礎(chǔ)》Mendelsohn和Israel編，第一章，Murakami等的題為“細胞周期的調(diào)節(jié)、癌基因和抗腫瘤藥”的文章(WB SaundersPhiladephia，1995)，尤其見13頁。4D5抗體(和其功能性等同物)也可用于此目的。
“阿霉素”是蒽環(huán)類抗生素。阿霉素的化學(xué)全稱為(8S-順式)-10-[(3-氨基-2，3，6-三去氧-α-L-來蘇-吡喃糖苷)]-7，8，9，10-四氫-6，8，11-三羥-8-(羥乙酰)-甲氧基-5，12-naphthacenedion。
術(shù)語“細胞因子”是一般性術(shù)語，指由一個細胞群釋放的對另一個細胞群起細胞間介質(zhì)作用的蛋白。這些細胞因子包括生長激素，如人生長激素，N-甲二磺酰人生長激素，和牛生長激素；甲狀旁腺素；甲狀腺素；胰島素；前胰島素；松馳素；前松馳素；糖蛋白激素如卵泡刺激素(FSH)，甲狀腺刺激素(TSH)，促黃體(生成)激素(LH)；肝細胞生長因子；成纖維細胞生長因子；催乳激素；胎盤催乳素；腫瘤壞死因子-α和β；繆氏抑制物質(zhì)(mullerian-inhibiting substance)；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；苯丙酸諾龍；血管內(nèi)皮細胞生長因子；整聯(lián)蛋白；血小板生成素(TPO)；神經(jīng)生長因子如NGF-β；血小板生長因子；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)如TGF-α和TGF-β；胰島素樣生長因子-I和-II；促紅細胞生成素(EPO)；骨誘導(dǎo)因子(osteoinductivefactors)；干擾素如干擾素-α，-β，-γ；集落刺激因子(CSF)如巨噬細胞-CSF(M-CSF)；粒細胞-巨噬細胞-CSF(GM-CSF)；粒細胞-CSF(G-CSF)；白細胞介素(IL)如IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-11，IL-12；腫瘤壞死因子如TNF-α或TNF-β；和其它多肽因子包括LIF和kit配體(KL)。本文中術(shù)語細胞因子包括天然蛋白或來自重組細胞培養(yǎng)物的蛋白以及天然序列細胞因子的生物活性等效物。
本申請使用的術(shù)語“前體藥物”是指藥物活性物質(zhì)的前體或衍生物形式，其相對于親本藥物對腫瘤細胞的細胞毒作用較小且可酶促活化或被轉(zhuǎn)換成更具活性的親本形式。例見Wilman，“癌癥化療中的前體藥物”BiochemicalSociety Transaction，14，pp.375-382，615th Meeting Belfast(1986)和Stella等，“前體藥物一種藥物定向運送的化學(xué)方法”定向藥物運送，Borchardt等(編)，pp.247-267，Humana press(1985)。本發(fā)明的前體藥物包括，但不限于含有磷酸鹽的前體藥物，含有硫代磷酸鹽的前體藥物，含有硫酸鹽的前體藥物，含有肽的前體藥物，D-氨基酸修飾的前體藥物，糖基化的前體藥物，含有β-內(nèi)酰胺的前體藥物，任選含有取代的苯氧乙酰胺的前體藥物或任選含有取代的苯基乙酰胺的前體藥物，5-氟胞嘧啶和可轉(zhuǎn)化為更具細胞毒活性的游離藥物的其它5-氟尿嘧啶前體藥物?？裳苌鸀楸景l(fā)明所用前體藥物形式的細胞毒藥物包括，但不限于上述化療劑。
“固相”是指本發(fā)明抗體可粘附的非水性基質(zhì)。本文中固相的實例包括部分或全部由玻璃(如具有控制孔徑的玻璃)、多糖(如瓊脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和硅氧烷制成的那些固相。在某些實例中，根據(jù)上下文的內(nèi)容，固相可包括測試板的孔；在其它的例子中，它可以是純化柱(如親和層析柱)。該術(shù)語也包括美國專利4275149中公開的分散顆粒的不連續(xù)固相。
“脂質(zhì)體”是由能向哺乳動物有效運送藥物(如本文公開的抗ErbB2抗體，和任選的一種化療劑)的各類脂質(zhì)、磷脂和/或表面活性劑組成的小分子囊泡。脂質(zhì)體的組分通常排列為雙層形式，與生物膜的脂質(zhì)排列相似。
所用的術(shù)語“包裝插頁”是指通常包括在治療產(chǎn)品的商業(yè)包裝中，含有與這些治療產(chǎn)品使用有關(guān)的說明、用法、劑量、給藥、禁忌和/或警示等的說明書。
術(shù)語“血清濃度”、“血清藥物濃度”或“血清HERCEPTIN

抗ErbB2抗體濃度”是指藥物(如HERCEPTIN

抗ErbB2抗體)在接受該藥物治療的病人或動物血清中的濃度。例如，HERCEPTIN

抗ErbB2抗體優(yōu)選是用免疫分析法測定的。免疫分析法優(yōu)選根據(jù)本文公開的ELISA方法。
術(shù)語“峰血清濃度”是指向動物或病人給藥后不久藥物已經(jīng)分布在整個血液系統(tǒng)但尚未在機體內(nèi)發(fā)生明顯組織分布、代謝或排泄時的最大血清藥物濃度。
術(shù)語“谷血清濃度”是指在前一劑量給藥后和在緊接著就要施用一系列繼續(xù)量之前的那一時間點的血清藥物濃度。一般而言，谷血清濃度是系列給藥期間維持效力的最小藥物濃度。此外，谷血清濃度經(jīng)常定位為發(fā)生效力的最低血清濃度，因為它代表以下血清濃度，在此血清濃度時就要施用作為治療方案一部分的另一劑量的藥物。如果經(jīng)靜脈施用藥物，最優(yōu)選在施用前負荷初始劑量的1天內(nèi)達到谷血清濃度。如果經(jīng)皮下施用藥物，則優(yōu)選在3天或更短時間達到峰濃度。根據(jù)本發(fā)明，使用本文公開的任一給藥方法，優(yōu)選在4周或更短、優(yōu)選3周或更短、更優(yōu)選2周或更短、最優(yōu)選1周或更短包括1天或更短時間達到谷血清濃度。
術(shù)語“靜脈輸注”是指在大于約5分鐘、優(yōu)選在約30至90分鐘的時間內(nèi)將藥物引入到動物或人類患者的靜脈內(nèi)，但根據(jù)本發(fā)明靜脈輸注也可以給藥10小時或更短時間。
術(shù)語“靜脈快速灌注”是指將藥物施用到動物或人類患者的靜脈內(nèi)以使機體在約15分鐘或更短、優(yōu)選5分鐘或更短時間內(nèi)接受該藥物。
術(shù)語“皮下給藥”是指從藥物容器中以相對緩慢、持續(xù)釋放的方式把藥物引入到動物或人類患者的皮下部位，優(yōu)選在位于皮膚和皮下組織之間的囊袋中。所述囊袋可以通過捏起或拉起皮膚離開皮下組織而造成。
術(shù)語“皮下輸注”是指從藥物容器中以相對緩慢、持續(xù)釋放一段時間的方式把藥物引入到動物或人類患者的皮下部位，優(yōu)選在位于皮膚和皮下組織之間的囊袋中，所述一段時間包括但不限于30分鐘或更短、或90分鐘或更短。任選地，可以通過在動物或人類患者的皮下植入藥物釋放泵來實現(xiàn)輸注，所述泵在預(yù)定時間如30分鐘、90分鐘或治療方案全程時間跨度內(nèi)釋放預(yù)定量的藥物。
術(shù)語“皮下快速灌注”是指將藥物施用到動物或人類患者的皮下，其中快速灌注給藥優(yōu)選小于約15分鐘，更優(yōu)選短于5分鐘，更優(yōu)選短于60秒。優(yōu)選將藥物施用到位于皮膚和皮下組織之間的囊袋中，所述囊袋可以通過例如捏起或拉起皮膚離開皮下組織而造成。
當在談到藥物給藥時，術(shù)語“前負荷”是為了描述初始較高劑量，在該較高劑量之后則間歇地施用等量或較低劑量。初始較高劑量(一次或多次)是為了更快地增加動物或人類患者的血清藥物濃度以達到有效的目標血清濃度。根據(jù)本發(fā)明，前負荷量可通過在3周或更短時間內(nèi)給藥起始劑量(一次或多次)，使動物或病人的血清濃度達到目標血清谷濃度而獲得。優(yōu)選地，初始前沿負荷量(單次或一系列量)在2周或更短時間、優(yōu)選在1周或更短時間包括1天或更短時間內(nèi)施用。最優(yōu)選地，當初始劑量是單次劑量且至少1周不跟隨繼續(xù)維持量時，初始劑量在1天或更短時間內(nèi)施用。當初始劑量是一系列量時，每一次劑量之間至少相隔3小時，但不超過3周或更短，優(yōu)選2周或更短，更優(yōu)選1周或更短，最優(yōu)選1天或更短。為避免那些先前未用抗體如抗ErbB2抗體(HERCEPTIN

抗ErbB2抗體)治療過的動物或病人對該抗體產(chǎn)生不利的免疫反應(yīng)，優(yōu)選經(jīng)靜脈輸注施用初始劑量。本發(fā)明包括通過靜脈或皮下經(jīng)輸注或快速灌注方式來施用初始前沿負荷量和維持量的藥物。
與抗ErbB2抗體有關(guān)的出版物信息包括下述發(fā)行的專利和公布的申請PCT/US89/00051，1989年1月公布；PCT/US90/02697，1990年5月18日公布；EU0474727，1997年7月23日公告；DE69031120.6，1997年7月23日公告；PCT/US97/18385，，1997年10月9日公布；SA97/9185，1997年10月14日公告；US5677171，1997年10月14日公告；US 5720937，1998年2月24日公告；US 5720954，1998年2月24日公告；US 5725856，1998年3月10日公告；US 5770195，1998年6月23日公告；US 5772997，1998年6月30日公告；PCT/US98/2626，1998年3月10日公布；和PCT/US99/06673，1999年3月26日公布，每一個專利和出版物均以其全部在此引入作為參考。
II.抗ErbB2抗體的制備 下面是關(guān)于本發(fā)明所用抗體的制備技術(shù)實例的敘述。用于制備抗體的ErbB2抗原可以是例如ErbB2的可溶型細胞外結(jié)構(gòu)域或其含所需表位的一部分。或者，可用在其表面表達ErbB2的那些細胞(例如轉(zhuǎn)化為過度表達ErbB2的NIH-3T3細胞；或SK-BR-3細胞等癌細胞系，見Srancovski等，PNAS(USA)888691-8695(1991))來制備抗體。ErbB2的可用于制備抗體的其它形式對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
(i)多克隆抗體 多克隆抗體優(yōu)選通過多次給動物皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原和佐劑而產(chǎn)生。將所述相關(guān)抗原與針對所免疫的物種具有免疫原性的蛋白(如匙孔血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin)、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑)用雙功能試劑或衍生試劑，如馬來酰亞氨苯甲?；虼牾啺孵?通過半胱氨酸殘基結(jié)合)、N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR(R和R1是不同烷基，進行偶聯(lián)是有效的。
用所述抗原、免疫原性偶聯(lián)物或衍生物免疫動物，方法是，將100μg或5μg蛋白或偶聯(lián)物(分別針對兔或鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑混合，在多位點皮內(nèi)注射該溶液。1個月后，多位點皮內(nèi)注射初始量為1/5-1/10的肽或與弗氏完全佐劑的偶聯(lián)物來加強免疫。7-14天后，對動物采血，測定血清中的抗體效價。對動物的加強免疫直到效價達到平臺期為止。優(yōu)選給動物加強注射相同抗原的偶聯(lián)物，但也可以是偶聯(lián)至不同蛋白和/或通過不同的交聯(lián)劑偶聯(lián)的偶聯(lián)物。偶聯(lián)物還可以是重組細胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的融合蛋白。此外，可用明礬等聚集劑增強免疫應(yīng)答。
(ii)單克隆抗體 單克隆抗體來自基本均一的抗體群，即該群體中的每個抗體除了可能的很小量天然突變外都相同。因此，修飾詞“單克隆”指所述抗體的并非不同抗體混合物的特性。
例如，單克隆抗體可用由Kohler等，自然(1975)首次描述的雜交瘤技術(shù)制備，或用重組DNA方法制備(美國專利4,816,567)。
在雜交瘤方法中，如上述免疫小鼠或其它適合的宿主動物如倉鼠，以激發(fā)那些產(chǎn)生或能產(chǎn)生與用于免疫之蛋白特異性結(jié)合的抗體的淋巴細胞。另外，可體外免疫淋巴細胞。然后用適當融合劑，如聚乙二醇，使淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，形成雜交瘤細胞(Goding，單克隆抗體原理及應(yīng)用，pp.59-103(Academic Press，1986))。
將如此制備的雜交瘤細胞接種至適當培養(yǎng)基中并進行培養(yǎng)，優(yōu)選該培養(yǎng)基含有一或多種能抑制未融合的親本骨髓瘤細胞生長或存活的物質(zhì)。例如，如果親本骨髓瘤細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，雜交瘤培養(yǎng)基通常將包含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止HGPRT-缺陷型細胞的生長。
優(yōu)選骨髓瘤細胞是那些能有效融合、支持所選抗體生成細胞以穩(wěn)定的高水平產(chǎn)生抗體，并對諸如HAT培養(yǎng)基等類似培養(yǎng)基敏感的細胞。其中，優(yōu)選的骨髓瘤細胞系是鼠骨髓瘤系，如由Salk Institute Cell Distreibution Center，San Diego，California USA提供的MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤細胞和由美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，Maryland USA提供的SP-2或X63-Ag8-653細胞。也有報道稱人骨髓瘤以及小鼠-人異質(zhì)性骨髓瘤細胞系可用于產(chǎn)生人單克隆抗體(Kozbor，免疫學(xué)雜志1333001(1984)；Brodeur等，單克隆抗體制備技術(shù)及應(yīng)用，第51-63頁(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)) 可在含有生長的雜交瘤細胞培養(yǎng)基中分析直接針對所述抗原的單克隆抗體的產(chǎn)生。雜交瘤細胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性通過免疫沉淀或通過體外結(jié)合試驗，如放射免疫分析(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)來分析。
單克隆抗體的結(jié)合親和力可通過如Muson等，Anal.Biochem.，107220(1980)所述Scatchard分析來測定。
一旦鑒定出能產(chǎn)生具有所需特異性、親和力、和/或活性的抗體的雜交瘤細胞后，將這些克隆通過有限稀釋法進一步克隆并用標準方法進行培養(yǎng)(Goding，單克隆抗體原理及應(yīng)用，第59-103頁(Academic Press，1986))。適于此目的的培養(yǎng)基包括如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。另外，雜交瘤細胞可作為腹水中腫瘤的形式在動物體內(nèi)生長。
由亞克隆分泌的單克隆抗體可用常規(guī)免疫球蛋白純化方法如蛋白-A-Sepharose、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析從培養(yǎng)基、腹水或血清中分離。
編碼單克隆抗體的DNA可用常規(guī)方法很容易的分離和測序(如利用能與編碼小鼠抗體重鏈和輕鏈的基因特異結(jié)合的寡核苷酸探針)。雜交瘤細胞是這類DNA的優(yōu)選來源。DNA分離后，可將其插入表達載體中，然后用此表達載體轉(zhuǎn)染宿主細胞，如大腸桿菌細胞、猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或不產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髓瘤細胞，以便在重組宿主細胞中合成單克隆抗體。編碼抗體的DNA在細菌中的重組表達的綜述見Skerra等，Curr.Opinion in Immunol.，5256-262(1993)和Pluckthun，Immunol.Revs.，130151-188(1992)。
在另一實施方案中，可從用McCafferty等，自然，348552-554(1990)所述技術(shù)產(chǎn)生的抗體噬菌體文庫中分離抗體或抗體片段。Clackson等，自然，352624-628(1991)和Marks等，分子生物學(xué)雜志222581-597(1991)分別描述了用噬菌體文庫分離鼠和人的抗體。后來的文獻描述了通過鏈改組制備高親和力(nM范圍)的人型抗體(Marks等，生物/技術(shù)10779-783(1992))，以及用于構(gòu)建大規(guī)模噬菌體文庫的組合感染和體內(nèi)重組方法(Waterhouse等，核酸研究212265-2266(1993))。因此，這些技術(shù)都可取代傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)來分離克隆抗體。
DNA也可通過用人類重鏈和輕鏈的恒定區(qū)編碼序列取代小鼠同源序列來修飾(美國專利4,816,567；Morrison等，美國國家科學(xué)院學(xué)報816851(1984))，或通過將非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列與免疫球蛋白編碼序列共價結(jié)合來修飾。
通常用所述非免疫球蛋白多肽取代抗體恒定區(qū)，或取代抗體上一個抗原結(jié)合點的可變區(qū)，形成二價嵌合抗體，其中一個抗原結(jié)合位點特異于一種抗原而另一個抗原結(jié)合位點特異于另一抗原。
(iii)人源化抗體和人抗體 關(guān)于人源化非人抗體的制備方法為本領(lǐng)域所熟知。優(yōu)選人源化抗體中已導(dǎo)入一或多個源自非人類的氨基酸殘基。這些非人類氨基酸殘基常稱為“引進的”殘基，它們通常來自“引進的”可變區(qū)。人源化過程基本如Winter及其同事(Jones等，自然，321522-525(1986)；Riechmann等，自然，332323-327(1988)；Verhoeyen等，科學(xué)，2391534-1536(1988))所述的方法，用嚙齒動物CDRs或CDR序列取代人抗體的相應(yīng)序列來進行。因此，這樣的“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利4,816,567)，其中完整(intact)人類可變區(qū)的很少一部分被非人物種的相應(yīng)序列取代。實踐中，人源化抗體通常是人的抗體，其中CDR殘基且可能有部分FR殘基被嚙齒類抗體中類似位點的殘基取代。
對用于制備人源化抗體的人類可變區(qū)(包括重鏈和輕鏈)的選擇，對降低抗原性非常重要。根據(jù)所謂“最適應(yīng)”方法，針對已知人類可變區(qū)序列的整個文庫篩選嚙齒類抗體可變區(qū)序列。將與嚙齒類的序列最相似的人類序列作為人源化抗體的人框架區(qū)(FR)(Sims等，免疫學(xué)雜志，1512296(1993)；Chothia等，分子生物學(xué)雜志，196901(1987))。另一種方法是用人類輕鏈或重鏈特定亞型的所有抗體的共有序列作為特定框架區(qū)。相同的框架可用于幾種不同的人源化抗體(Carter等，美國國家科學(xué)院學(xué)報，894285(1992)；Presta等，免疫學(xué)雜志，1512623(1993))。
更重要的是，將抗體人源化后保留了對抗原的高親和力和其它有利的生物特性。為達到此目的，在一種優(yōu)選方法中，通過用親本序列和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念性人源化產(chǎn)物來制備人源化抗體。免疫球蛋白三維模型已有商品，是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。還有用于描述和展示所選免疫球蛋白序列可能的三維構(gòu)象的計算機程序。通過觀察這些展示結(jié)果可分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中可能發(fā)揮的作用，即分析能影響候選免疫球蛋白與其抗原結(jié)合的能力的殘基，通過這種方法，可從受者和引進序列中選出FR殘基并組合，從而得到所需抗體性質(zhì)，如對靶抗原的親和力增加?？傊?，CDR殘基直接并且最主要影響到抗原的結(jié)合。
或者，現(xiàn)在可以制備轉(zhuǎn)基因動物(如小鼠)，所述轉(zhuǎn)基因動物能夠經(jīng)免疫接種而在沒有內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生時產(chǎn)生出人抗體的全部組成成分。例如，有報道稱，嵌合抗體和種系(germ-line)突變型小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合缺失導(dǎo)致內(nèi)源抗體的產(chǎn)生被完全抑制。將人種系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移到這些種系突變型小鼠中，能使其在抗原攻擊時產(chǎn)生人抗體。例如參見下列文獻Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，902551(1993)；Jakobovits等，Nature 362255-258(1993)；Bruggermann等，Year in Iminuno.733(1993)。人抗體也可從噬菌體展示文庫中獲得(Hoogenboom等，J.Mol.Biol.227381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.222581-597[1991])。
(iv)抗體片段 已開發(fā)了生成抗體片段的多種技術(shù)。傳統(tǒng)上，這些片段通過對完整抗體的蛋白水解性消化獲得(見Morimoto等，生物化學(xué)和生物物理學(xué)方法雜志(Journal of Biochemical and Biophysical Methods)24107-117(1992))和Brennan等，科學(xué)，22981(1985))。但現(xiàn)在可直接通過重組宿主細胞產(chǎn)生這些片段。例如，可從上述抗體噬菌體庫分離抗體片段。另外，可從大腸桿菌直接回收Fab’-SH片段，并經(jīng)化學(xué)連接形成F(ab’)2片段(Carter等，生物/技術(shù)10163-167(1992))。依據(jù)另一種方法，可直接從重組宿主細胞培養(yǎng)中分離F(ab’)2片段。其它產(chǎn)生抗體片段的技術(shù)對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。在其它實施方案中，所選抗體是單鏈Fv片段(scFv)。見WO 93/16185。
(v)雙特異性抗體 雙特異性抗體是具有針對至少兩種不同表位的結(jié)合特異性的抗體。代表性雙特異性抗體可以與ErbB2蛋白的兩種不同表位結(jié)合。譬如，一個臂可以與ErbB2結(jié)構(gòu)域1中的表位如7C2/7F3表位結(jié)合，另一個臂可以與不同表位如4D5結(jié)合。其它這種抗體可將ErbB2結(jié)合位點與針對EGFR、ErbB3和/或ErbB4的結(jié)合位點組合起來?；蛘?，可將抗ErbB2臂與結(jié)合白細胞上引發(fā)分子的臂結(jié)合，從而集中針對ErbB2表達細胞的細胞防御機制，所述引發(fā)分子如T細胞受體分子(CD2或CD3)，或IgG Fc受體(FcγR)如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。雙特異性抗體還可用于將細胞毒制劑定位至表達ErbB2的細胞。這些抗體具有ErbB2結(jié)合臂和結(jié)合細胞毒制劑(例如皂草素，抗INF-α，長春花生物堿，蓖麻毒蛋白A鏈，氨甲蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。雙特異性抗體可制備成全長抗體或抗體片段(如F(ab’)2雙特異性抗體)。
制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。完整雙特異性抗體的傳統(tǒng)制備方法是基于兩種具有不同特異性的免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共表達，(Millstein等，自然，305537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈輕鏈隨機分配，這些雜交瘤(細胞雜交瘤(quadroma))可能產(chǎn)生10種不同抗體分子的混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。對所述正確分子的純化(通常通過親和層析步驟來進行)非常復(fù)雜，且產(chǎn)量很低。類似的方法見WO93/08829和Traunecker等，EMBO J.，103655-3659(1991)。
依據(jù)另一種方法，可將具有所需結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點)的抗體可變區(qū)與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。該融合優(yōu)選與包含鉸鏈區(qū)的至少一部分、CH2及CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)融合。優(yōu)選使含有輕鏈結(jié)合所需位點的第一重鏈恒定區(qū)(CH1)出現(xiàn)在至少在一種融合中?？蓪⒕幋a免疫球蛋白重鏈融合體，以及必要時，編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA插入不同表達載體，共轉(zhuǎn)染至適當宿主生物。這使得在使用非等比的三種多肽鏈進行構(gòu)建的實施方案中，能較靈活地調(diào)整三種多肽片段的相互比例，以獲得最佳產(chǎn)量。但也可在至少兩種多肽鏈以等比例表達而獲得高產(chǎn)時或所述比例無關(guān)緊要時，將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入同一表達載體。
在該方法的一個優(yōu)選實施方案中，所述雙特異性抗體由一條臂上的帶有第一結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈和另一條臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結(jié)合特異性)構(gòu)成。已發(fā)現(xiàn)這種不對稱結(jié)構(gòu)有利于從非必要免疫球蛋白鏈的混合中分離出所需雙特異性化合物，因為只有該雙特異性分子的一半上存在免疫球蛋白輕鏈，這使得分離更加容易。此方法公開于WO94/04690中。制備雙特異性抗體的進一步細節(jié)，見Suresh等，酶學(xué)方法，121210(1986)。
根據(jù)WO96/27011中描述的另一種方法，可改造一對抗體分子之間的界面，使得從重組細胞培養(yǎng)中回收獲得的異源二聚體的百分比最大。優(yōu)選的界面包括抗體恒定區(qū)CH3結(jié)構(gòu)域的至少一部分。在該方法中，第一抗體分子界面上的一條或多條氨基酸小側(cè)鏈被較大側(cè)鏈(如酪氨酸或色氨酸)取代。與所述大側(cè)鏈大小相同或相近的互補“溝”可通過將氨基酸大側(cè)鏈用小側(cè)鏈(如丙氨酸或蘇氨酸)取代而在第二抗體分子的界面上形成。這使得異二聚體的產(chǎn)量高于不想要的終產(chǎn)物如同型二聚體。
雙特異性抗體包括交聯(lián)抗體或“異源偶聯(lián)的”抗體。例如，可使異源偶聯(lián)物中的抗體之一與抗生物素蛋白偶聯(lián)，使另一抗體與生物素偶聯(lián)。有觀點認為，這類抗體可用于將免疫細胞導(dǎo)向不想要的細胞(美國專利4676980)，也可用于治療HIV感染(WO91/00360，WO92/200373，EP03089)。異源偶聯(lián)抗體可通過任何適當?shù)慕宦?lián)方法制備。適當?shù)慕宦?lián)制劑和多種交聯(lián)技術(shù)為本領(lǐng)域已知，可在美國專利4676980中獲知。
從抗體片段制備雙特異性抗體的技術(shù)也已有文獻描述。例如，雙特異性抗體可利用化學(xué)連接制備。Brennan等，科學(xué)22981(1985)中描述了將完整抗體經(jīng)蛋白水解制備F(ab’)2片段的方法。這些片段在二巰基復(fù)合劑亞砷酸鈉存在時被還原，從而穩(wěn)定相鄰的巰基，并阻止分子間二硫鍵的形成。生成的Fab’片段被轉(zhuǎn)化為硫硝基苯甲酸鹽(TNB)衍生物。其中一種Fab’-TNB衍生物經(jīng)巰基乙胺還原成Fab’-硫醇，再與等分子量的其它Fab’-TNB衍生物混合形成雙特異性抗體。如此產(chǎn)生的雙特異性抗體可作為酶的選擇性固相化中所用的試劑。
近期的進展促進了從大腸桿菌中直接回收可化學(xué)偶聯(lián)形成雙特異性抗體的Fab’-SH片段。Shalaby等，實驗醫(yī)學(xué)雜志，175217-225(1992)中描述了完全人源化雙特異性抗體F(ab’)2分子的產(chǎn)生。每一Fab’片段分別從大腸桿菌中分泌出來，體外直接化學(xué)偶聯(lián)形成雙特異性抗體。如此制備的雙特異性抗體能與過度表達ErbB2受體的細胞和正常人T細胞結(jié)合，還能觸發(fā)人細胞毒淋巴細胞對人乳腺腫瘤細胞的裂解活性。
直接從重組細胞培養(yǎng)中制備并分離雙特異性抗體片段的多種技術(shù)也已有描述。例如，可用亮氨酸拉鏈制備雙特異性抗體。Kostelny等，免疫學(xué)雜志，148(5)1547-1553(1992))。將來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽與兩種不同抗體的Fab’部分通過基因融合而連接。使抗體的同型二聚體在鉸鏈區(qū)被還原成單體，然后被再氧化形成抗體的異二聚體。該方法也可用于制備抗體同型二聚體。由Hollinger等，美國國家科學(xué)院學(xué)報，906444-6448(1993))描述的“二價抗體”技術(shù)提供了另一種制備雙特異性抗體片段的方法。所述片段中含有重鏈可變區(qū)(VH)，其通過接頭與輕鏈可變區(qū)(VL)相連，該接頭非常短，使得同一鏈的兩個結(jié)構(gòu)域之間無法配對。因此，同一片段上的VH和VL結(jié)構(gòu)域被迫與另一片段上的互補VL和VH結(jié)構(gòu)域配對，從而形成兩個抗原結(jié)合位點。此外還報道了另一種用單鏈Fv(sFv)二聚體來制備雙特異性抗體的策略。見Gruber等，免疫學(xué)雜志，1525368(1994)。
還考慮了二價以上的抗體。如可制備三特異性抗體。Tutt等，免疫學(xué)雜志，14760(1991)。
(vi)篩選具有所需特性的抗體 上面描述了制備抗體的方法?，F(xiàn)在挑選具有本文所述特性的那些抗體。
為了篩選誘導(dǎo)細胞死亡的抗體，可評價相對于對照，膜完整性的喪失，其可由例如PI、臺盼藍或7AAD攝入來指示。優(yōu)選的試驗是利用BT474細胞進行的PI攝入試驗。根據(jù)該試驗，將BT474細胞(可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，MD)獲得)培養(yǎng)在含10％熱滅活的FBS(Hyclone)和2mM L-谷氨酰胺的Dulbeco’s改良型Eagle培養(yǎng)基(D-MEM)Ham’s F-12(50∶50)中。(因此，該檢測是在無補體和免疫效應(yīng)細胞的條件下進行)。將BT474細胞以3×106/皿的濃度接種至100×20mm的培養(yǎng)皿中，并使其粘附過夜。然后棄去培養(yǎng)基，僅用新鮮培養(yǎng)基或用含10μg/ml適當單克隆抗體的培養(yǎng)基取代。細胞以3天為一周期進行培養(yǎng)。每次處理后，單層細胞用PBS洗滌，并用胰酶消化使其脫附。然后將細胞在4℃以1200rpm離心5分鐘，將沉淀重懸于3ml冰冷的Ca2+結(jié)合緩沖液(10mM Hepes，pH7.4，140mM NaCl，2.5mMCaCl2)中，再分裝到35mm濾器封蓋的12×75試管中(每管1ml，每處理組3管)以去除細胞團塊。然后向試管中加入PI(10μg/ml)。樣品利用FACSCANTM流式細胞儀和FACSCONVERTTM CellQuest軟件(BectonDickinson)分析。可將那些誘導(dǎo)統(tǒng)計顯著水平的細胞死亡(如PI攝入法所測)的抗體選為誘導(dǎo)細胞死亡的抗體。
為了篩選凋亡誘導(dǎo)抗體，可采用“利用BT474細胞進行的膜聯(lián)蛋白結(jié)合試驗”。將BT474細胞按上段所述接種并培養(yǎng)。然后棄去培養(yǎng)基，僅用新鮮培養(yǎng)基或用含10μg/ml單克隆抗體的培養(yǎng)基取代。細胞以3天為一周期進行培養(yǎng)后，將單層用PBS洗滌，并用胰酶消化使其脫附。然后如上文細胞死亡試驗所述將細胞離心，重懸于Ca2+結(jié)合緩沖液中，并分裝到試管中。向試管中加入標記的膜聯(lián)蛋白(例如膜聯(lián)蛋白V-FTIC)(1μg/ml)。利用FACSCANTM流式細胞儀和FACSCONVERTTMCellQuest軟件(BectonDickinson)分析樣品。在用PI攝入法檢測時，可將那些誘導(dǎo)統(tǒng)計顯著水平的膜聯(lián)蛋白結(jié)合(如PI攝入法所測)的抗體選為凋亡誘導(dǎo)抗體。
除了膜聯(lián)蛋白結(jié)合試驗，還可用“利用BT474細胞進行的DNA染色試驗”。為此，將已如前兩段所述用目的抗體處理過的BT474細胞與9μg/mlHOECHST 33342TM于37℃溫育2小時，然后在EPICS ELITETM流式細胞儀(Coulter Corporation)上用MODFITLTTM軟件(Verity Software House)進行分析。引起凋亡細胞百分率改變(比未處理細胞高兩倍或更多(優(yōu)選高3倍或更多)(直到100％的凋亡細胞))的抗體可用此試驗篩選為前凋亡抗體。
為了篩選能與結(jié)合目的抗體之ErbB2上某一表位結(jié)合的抗體，可如《抗體，實驗室指南》，冷泉港實驗室，Ed Harlow和David Lane(1998)所述進行常規(guī)交叉阻斷試驗?；蛘?，可通過本領(lǐng)域已知技術(shù)進行表位作圖。
為了鑒定細胞培養(yǎng)中50-100％地抑制SKBR3細胞生長的抗ErbB2抗體，進行WO89/06692中所述的SKBR3試驗。根據(jù)該試驗，SKBR3細胞在F12和DMEM培養(yǎng)基(添加了10％胎牛血清、谷氨酰胺和青霉素鏈霉素)的混合物(1∶1)中生長。在35mm細胞培養(yǎng)碟中接種20000個SKBR3細胞(2ml/35mm碟)。每個碟中加入2.5μg/ml抗ErbB2抗體。6天后，用COULTERTM電子細胞計數(shù)儀來計數(shù)細胞數(shù)目，與未處理細胞計數(shù)進行比較。選出50-100％地抑制SKBR3細胞生長的那些抗體，按照所需與細胞凋亡抗體聯(lián)合使用。
(vii)效應(yīng)物功能的工程改造 在效應(yīng)物功能方面可能希望改進本發(fā)明的抗體，以增強在治療(例如治療癌癥)時的效果。例如，可在Fc區(qū)域中引入半胱氨酸殘基，從而在該區(qū)域中形成鏈間二硫鍵。這樣制得的均二聚體可能有改進的內(nèi)化能力和/或提高的補體介導(dǎo)細胞殺傷能力及依賴于抗體的細胞毒性(ADCC)。參見Caron等，J.Exp Med.1761191-1195(1992)和Shopes，B.J.Immunol.1482918-2922(1992)。也可如Wolff等，Cancer Research 532560-2565(1993)描述的那樣，用異二聚功能性交聯(lián)劑來制備抗腫瘤活性增強的均二聚抗體。或者，可將抗體工程改造成具有雙Fc區(qū)，從而可能增強補體裂解和ADCC能力。見Stevenson等，Anti-Cancer Drug Design 3219-230(1989)。
(viii)免疫偶聯(lián)物 本發(fā)明還涉及免疫偶聯(lián)物，其中含有與細胞毒藥物偶聯(lián)的抗體，所述細胞毒藥物如化療劑、毒素(例如小分子毒素或細菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素，包括其片段和/或變體)或放射性同位素(即放射偶聯(lián)物)。
適用于制備這類免疫偶聯(lián)物的化療劑在上文已作描述?？梢詰?yīng)用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單孢菌)、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-帚曲毒素、油桐(Aleutites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸(Phytolaca Americana)蛋白(PAPI，PAPII，PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制因子、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑，白樹毒素，米托菌素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依諾霉素和單端孢菌毒素(tricothecenes)。多種放射性同位素可用于制備放射性偶聯(lián)的抗ErbB2抗體，實例包括Bi212、I131、In131、Y90和Re186。
抗體與細胞毒制劑的偶聯(lián)物可通過多種雙功能蛋白偶聯(lián)劑來連接，所述雙功能蛋白偶聯(lián)劑如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二巰基)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亞氨基-4-(N-馬來酰亞氨甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯，亞氨基硫烷(iminothiolane)(IT)，亞氨酸酯的雙功能衍生物(如亞氨基己二酸二甲酯鹽酸鹽)，活性酯類(如二琥珀酰亞胺基辛二酸酯)，醛類(如戊二醛(glutareldehyde))，雙-疊氮化合物(如雙(對-疊氮基苯甲酰基)己二胺)，雙-重氮衍生物(如雙-(對-重氮苯甲?；?-乙二胺)，二異氰酸酯(如亞甲代苯基2，6-二異氰酸酯)，和雙-活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等，科學(xué)2381098(1987)所述制備。C14標記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二亞乙基三氨五乙酸酯(MX-DTPA)是將放射性核苷酸偶聯(lián)至抗體的偶聯(lián)劑之一。見WO94/11026。
在另一實施方案中，抗體可與腫瘤預(yù)靶向中應(yīng)用的“受體”(如鏈霉抗生物素蛋白)偶聯(lián)，將該抗體-受體偶聯(lián)物給予患者，之后用清除劑除去循環(huán)中未結(jié)合的偶聯(lián)物，再給予已偶聯(lián)了細胞毒制劑(如放射性核苷酸)的“配體”(如抗生物素蛋白)。
(ix)免疫脂質(zhì)體 本文公開的抗-ErbB2抗體還可制成免疫脂質(zhì)體。含抗體的脂質(zhì)體可通過本領(lǐng)域已知方法制備，如Epstein等，美國國家科學(xué)院學(xué)報823688(1985)；Hwang等，美國國家科學(xué)院學(xué)報774030(1980)；美國專利4,485,045和4,544,545及1997年10月23日公開的WO97/38731。在美國專利5,013,566中公開了循環(huán)時間已增加了的脂質(zhì)體。
特別有用的脂質(zhì)體可利用包含磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質(zhì)組合物經(jīng)反相蒸發(fā)法而制得。脂質(zhì)體擠壓通過限定孔徑的濾膜，獲得具有所需直徑的脂質(zhì)體。本發(fā)明抗體的Fab’片段可如Martin等，生物學(xué)化學(xué)雜志，257286-288(1982)所述的那樣，經(jīng)二硫化物交換反應(yīng)與脂質(zhì)體偶聯(lián)。可任選在所述脂質(zhì)體中包含一種化療劑。見Gabizon等，J.National Cancer Inst，81(19)1484(1989)。
(x)抗體依賴性酶介導(dǎo)的前體藥物治療(ADEPT) 本發(fā)明的抗體還可與前體藥物活化酶相結(jié)合，然后用于ADEPT，所述活化酶可以將前體藥物(如肽基化療劑，見WO81/01145)轉(zhuǎn)化為活性抗癌藥物。見WO88/07378和美國專利4,975,278。
這些用于ADEPT的偶聯(lián)物中的酶組分包括能作用于前體藥物使其轉(zhuǎn)化為活性更強的細胞毒形式的任何酶。
本發(fā)明的方法中用到的酶包括，但不限于，能將含磷酸基的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的堿性磷酸酶；可將含硫酸基的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的芳香基硫酸酯酶；將無毒的5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化為抗癌藥物，如5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脫氨酶；能將含肽的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的蛋白酶，如沙雷氏菌屬蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶和組織蛋白酶(如組織蛋白酶B和L)等；可轉(zhuǎn)化含D-氨基酸取代基的前體藥物的D-丙氨酰羧肽酶；能將糖基化前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的碳水化合物裂解酶類如β-半乳糖苷酶和神經(jīng)氨酸酶；能將β-內(nèi)酰胺衍生的藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的β-內(nèi)酰胺酶；能在藥物中的氨基氮處分別用苯氧乙?；虮揭阴；D(zhuǎn)化而使藥物游離的青霉素酰胺酶如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶?；蛘?，可用本領(lǐng)域稱為“抗體酶”的具有酶活性的抗體，將本發(fā)明的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離的活性藥物(見Massey，自然328457-458(1987))。可如本文所述制備抗體-抗體酶偶聯(lián)物以便將抗體酶運送至腫瘤細胞群。
本發(fā)明的酶可通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)，如上述異源雙功能交聯(lián)試劑的使用而與抗ErbB2抗體共價結(jié)合?；蛘?，可以利用本領(lǐng)域熟知的DNA重組技術(shù)(如Neuberger等，自然，312604-608(1984))構(gòu)建含至少本發(fā)明抗體的抗原結(jié)合區(qū)的融合蛋白，所述抗體與本發(fā)明酶的至少一個功能活性部分連接。
(xi)抗體補救性受體結(jié)合表位融合 在本發(fā)明的某些實例中，希望采用抗體片段而不是完整的抗體，以提高腫瘤穿透性。在這種情況下，希望對抗體片段進行修飾，以延長其血清半衰期。例如，可通過在抗體片段中摻入補救(salvage)受體結(jié)合表位(如，通過抗體片段中合適區(qū)域的突變，或通過在肽尾端中摻入表位，然后通過例如DNA或肽合成而融入抗體片段末端或中部)來實現(xiàn)。
制備體內(nèi)半衰期延長的這種抗體變體的系統(tǒng)性方法包括以下步驟首先鑒定IgG分子Fc區(qū)的補救受體結(jié)合表位的序列和構(gòu)象。一旦確定了該表位，就可以修飾目的的抗體序列使其包括經(jīng)鑒定的結(jié)合表位序列及構(gòu)象。在序列發(fā)生突變后，測定該抗體變體，以檢查其體內(nèi)半衰期是否比原來的抗體長。如果在測試時抗體變體沒有較長的半衰期，則再一次改變其序列使其包括經(jīng)鑒定的結(jié)合表位序列和構(gòu)象。測試變化后的抗體是否有延長的體內(nèi)半衰期，繼續(xù)該過程直至獲得具有延長的體內(nèi)半衰期的分子。
如此摻入目標抗體的補救受體結(jié)合表位是上述任何合適的表位，其特征取決于例如被修飾的抗體類型。所進行的轉(zhuǎn)移應(yīng)使目標抗體仍然具有本文所述的生物活性。
優(yōu)選地，表位構(gòu)成一個區(qū)域，其中來自Fc區(qū)的一個或兩個環(huán)的任何一個或多個氨基酸殘基被轉(zhuǎn)移到抗體片段的類似位置上。更優(yōu)選，F(xiàn)c區(qū)中一個或兩個環(huán)的三個或多個氨基酸殘基被轉(zhuǎn)移。更加優(yōu)選的是，表位取自(例如IgG的)Fc中CH2區(qū)，并被轉(zhuǎn)移到抗體的CH1、CH3或VH區(qū)或者一個以上的此類區(qū)域中?；蛘撸砦蝗∽訤c的CH2區(qū)，并被轉(zhuǎn)移到抗體片段的CL區(qū)或VL區(qū)或這兩者中。
在一最佳實施方案中，補救受體結(jié)合表位包含以下序列(從5’到3’)PKNSSMISNTP(SEQ ID NO3)，還任選地包括選自HQSLGTQ(SEQ IDNO4)、HQNLSDGK(SEQ ID NO5)、HQNISDGK(SEQ ID NO6)或VISSHLGQ(SEQ ID NO7)的序列，尤其當抗體片段是Fab或F(ab’)2時。在另一最優(yōu)選實施方案中，補救受體結(jié)合部位是含有下述序列(從5’到3’)的多肽HQNLSDGK(SEQ ID NO5)、HQNISDGK(SEQ ID NO6)或VISSHLGQ(SEQ ID NO7)和PKNSSMISNTP(SEQ ID NO3)。
(xii)抗ErbB2抗體的純化 當使用重組技術(shù)時，抗體可以在細胞內(nèi)胞質(zhì)空間中產(chǎn)生，或直接分泌到培養(yǎng)基中。如果所述抗體在細胞內(nèi)產(chǎn)生，第一步通過離心或超濾除去顆粒狀碎片，即宿主細胞或其裂解片段。Carter等，生物/技術(shù)10163-167(1992)中敘述了用于分離分泌到大腸桿菌周質(zhì)空間中的抗體的方法。簡言之，在醋酸鈉(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)存在的條件下融解細胞團超過30分鐘。通過離心可以將細胞碎片除去。在抗體分泌到培養(yǎng)基的情況中，通常首先用市售的蛋白濃縮濾膜(例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單位)濃縮此類表達系統(tǒng)的上清。在任何上述步驟中可以包括抑制蛋白裂解的PMSF等蛋白酶抑制劑，并且可以包括抑制外來污染物生長的抗生素。
從所述細胞中制備的抗體組合物可利用例如羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析和親和層析等方法純化，優(yōu)選親和層析。蛋白A作為親和配體的適合性取決于該抗體上任何免疫球蛋白Fc區(qū)的種類和同種型。蛋白A可用于純化基于人γ1、γ2或γ4重鏈的抗體(Lindmark等，免疫學(xué)方法雜志，621-13(1983))。蛋白G被建議用于所有的小鼠同種型和人γ3(Guss等，EMBOJ.51567-1575(1986))。與親和配體結(jié)合的基質(zhì)最常用瓊脂糖，但也可利用其它基質(zhì)。具有機械穩(wěn)定性的基質(zhì)如控制孔徑的玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯等，比瓊脂糖允許更快的流速且耗時更短。在所述抗體包括CH3結(jié)構(gòu)域的情況中，Bakerbond ABXTM樹脂(J.T.Baker，PhilliPBSurg，NJ)有利于純化。根據(jù)待回收的抗體，還可以應(yīng)用其它蛋白純化技術(shù)，例如在離子交換柱上的分級分離、乙醇沉淀、反向HPLC、硅層析、在陽離子或陰離子交換樹脂層析(例如聚天冬氨酸柱)上進行的肝素SEPHAROSETM層析、聚焦層析、SDS-PAGE和硫酸銨沉淀。
在任何最初純化步驟之后，利用pH約2.5-4.5的洗脫緩沖液，可以對包括所述目的抗體和污染物的混合物進行低pH疏水相互作用層析，優(yōu)選在低鹽濃度條件下進行(例如大約0-0.25M鹽濃度)。
III.抗ErbB2抗體血清濃度的測定 下述非-限制性分析法用于測定特異性rhuMab HER2(人源化抗p185HER2單克隆抗體，包括HERCEPTIN

抗ErbB2抗體)在哺乳動物體液，包括但不限于血清、羊水、乳汁、臍帶血清、眼房水和玻璃體液以及玻璃體凝膠中的存在及定量。
rhuMab HER2(人源化抗p185HER2單克隆抗體)的平板結(jié)合活性分析測定 本文描述的rhuMab HER2的測定方法只是作為方法的一個實例，并非是旨在限定于本方法。用分析稀釋液(Assay diluent)(PBS/0.5％BSA/吐溫20/0.01％硫汞撒)稀釋rhuMab HER2標準化制劑(Genentech，Inc.，South SanFrancisco，CA)、對照和血清樣本。制備標準化rhuMab HER2稀釋液，其濃度跨度范圍適宜于制作標準曲線。稀釋樣本使其濃度落入該標準曲線范圍。
等份包被緩沖液中的包被抗原(溶于0.05M碳酸鈉緩沖液的重組p185HER2)加入到微量滴定板上的每一個孔中，并于2-8℃孵育12-72小時。棄去包被溶液，用水洗滌每個孔6遍，然后去除多余的水。
向每一個孔中加入等份的分析稀釋液，室溫下攪拌保溫1-2小時。按照前一步所述方法洗滌每一個孔。
向孔中加入等份的稀釋標準品、對照和樣本溶液，在室溫下攪拌保溫1小時，以使得抗體與包被抗原結(jié)合。仍按前面步驟所述方法用水洗滌孔。
用分析稀釋液稀釋辣根過氧化物酶-偶聯(lián)物(HRP-偶聯(lián)，山羊抗人IgG Fc偶聯(lián)到辣根過氧化物酶上；Organon Teknika catalog#55253或等價物)以制得處于最高和最低標準品濃度之間的適合的光密度范圍。向每個孔中加入等份HRP-偶聯(lián)物溶液，室溫下攪拌保溫1小時。按前面步驟所述方法用水洗滌孔。
向每個孔中加入等份底物溶液(5mg鄰苯二胺(OPD)片劑(Sigma P6912或等同物)溶于12.5ml 4mM H2O2的PBS溶液)，室溫避光孵育足夠長時間(接近8-10分鐘)，以顯色。用一等份4.5N硫酸溶液終止該反應(yīng)。讀取490-492nm處的光密度以檢測吸收度，405nm處的光密度作為參照吸收。用標準曲線的數(shù)據(jù)作圖，并從所作標準曲線上得出對照和樣本的測定結(jié)果。
IV.藥物制劑形式 根據(jù)本發(fā)明使用的抗體的藥用制劑通過將具有所需純度的抗體與任選的藥用載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(雷氏藥學(xué)(Remington’s Pharmaceutical Sciences)第16版，Osol，A.編(1980))混合而制備，然后以凍干劑或含水劑的形式保存?？伤幱幂d體、賦形劑、穩(wěn)定劑在所用劑量及濃度下對受者無毒性，并包括緩沖劑例如磷酸鹽，檸檬酸鹽及其它有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯化己烷雙胺；氯化芐烷銨(benzalkonium chloride)，苯索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；烷基對羥基苯甲酸酯如甲基或丙基對羥基苯甲酸酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；間甲酚)；低分子量多肽(少于10個殘基)；蛋白質(zhì)如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA；糖類如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽反離子如鈉；金屬復(fù)合物(例如鋅-蛋白復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑如吐溫TM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。WO97/04801敘述了優(yōu)選的凍干型抗ErbB2抗體劑型，在此引入本文作為參考。
所述制劑還可根據(jù)所治療的具體情況而包含一種以上活性成分，優(yōu)選具有互補活性但相互無負面影響的那些。例如，可能需要在一種制劑中進一步提供與EGFR、ErbB2(例如結(jié)合ErbB2上不同表位的抗體)、ErbB3、ErbB4或血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)結(jié)合的抗體?；蛘?或另外)，所述組合物可進一步包括化療劑、細胞毒性劑、細胞因子、生長抑制劑、抗激素藥、EGFR-靶向藥、抗血管生成藥、和/或心臟保護劑。這些分子以對所需目的有效的總量在組合中適當?shù)卮嬖凇?br> 活性成分也可容納在通過凝聚技術(shù)或界面聚合作用制備的微膠囊中，如分別在膠體性質(zhì)的藥物運送系統(tǒng)(如脂質(zhì)體，白蛋白微珠，微乳劑，納米顆粒及納米膠囊)或大乳劑(macroemulsions)的羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(異丁烯酸甲酯)微膠囊。這些技術(shù)見雷氏藥學(xué)，第16版Osol，A.編(1980)。
用于體內(nèi)給藥的制劑必須是無菌的。這可以通過除菌濾膜過濾而輕易實現(xiàn)。
也可制備控釋制劑?？蒯屩苿┑倪m當實例包括含有抗體的固態(tài)疏水聚合物的半通透性基質(zhì)，所述基質(zhì)為具有一定形狀的制品，如膜或微膠囊?？蒯屩苿嵗ň埘?、水凝膠(如聚(2-羥基乙基-異丁烯酸酯)或聚(乙烯醇)，聚交酯(美國專利3,773,919)，L-谷氨酸與γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物，不可降解的乙烯乙酸乙酯，可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物和亮氨酰脯氨酸(leuprolide)乙酸酯組成的可注射的微球體)，以及聚D-(-)-3-羥丁酸。盡管聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羥基乙酸能持續(xù)釋放分子100天以上，但是某些水凝膠釋放蛋白的時間卻較短。當膠囊化的抗體長時間停留在體內(nèi)時，它們會由于暴露在37℃潮濕環(huán)境下而變性或凝聚，從而導(dǎo)致生物活性損失，且免疫原性可能會改變?？梢愿鶕?jù)涉及的機理來設(shè)計穩(wěn)定化的合理策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)凝聚的機理是通過硫代二硫鍵互換而形成了分子間S-S鍵，則可通過修飾巰基殘基、從酸性溶液中凍干、控制濕度、采用合適的添加劑和開發(fā)特殊的聚合物基質(zhì)組合物來達到穩(wěn)定化。
V.用抗ErbB2抗體進行的治療 根據(jù)本發(fā)明，抗ErbB2抗體可用于治療以ErbB2受體過度表達和/或激活為特征的各種病癥。例舉性病癥的實例包括良性或惡性腫瘤(如腎(renal)癌、肝癌、腎(kidney)癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、結(jié)腸直腸癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝細胞癌；肉瘤；惡性膠質(zhì)瘤和各種類型的頭頸部癌癥)；白血病和淋巴的惡性疾病；其它疾病，如神經(jīng)細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞、下丘腦和其它腺體、巨噬細胞、上皮、基質(zhì)和囊胚腔的病癥；及炎癥性、血管生成性和免疫性的病癥。
可根據(jù)已知的方法將本發(fā)明的抗體施用于病人，所述方法例如，經(jīng)快速灌注或一定期間的持續(xù)輸注方式的靜脈給藥，經(jīng)肌內(nèi)、腹腔內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜腔內(nèi)、鞘內(nèi)、口服、局部或吸入途徑給藥。優(yōu)選靜脈或皮下施用抗體。
本發(fā)明的治療涉及將抗ErbB2抗體施用于動物或病人，接著以一定間隔通過施用等量或較小量的繼續(xù)量從而達到目標血清濃度并在治療期間維持此濃度。優(yōu)選地，以快速灌注方式優(yōu)選皮下快速灌注給予維持量，使得治療更為便捷和對患者和保健專業(yè)人士而言取得花費低療效高的效果。
期望與化療劑(蒽環(huán)類抗生素之外)聯(lián)合給藥，聯(lián)合給藥包括共同給藥(使用分離的制劑或單個藥物制劑)和以任何次序聯(lián)貫給藥，其中優(yōu)選有一段時間為兩種(或所有)活性藥物同時發(fā)揮它們的生物活性。這些化療劑的制劑和劑量方案，可根據(jù)生產(chǎn)商的說明書來使用，或者根據(jù)專業(yè)醫(yī)師的實踐經(jīng)驗來確定。這類化療的制劑和給藥分案亦參見Chemotherapy Service Ed.，M.C.Perry，Williams和Wilkins，Baltimore，MD(1992)?；焺┛稍诮o予抗體前、后或同時給予?？贵w可以與抗雌激素化合物(如三苯氧胺)或抗黃體酮(如onapristone)按照這些分子的已知劑量聯(lián)合用藥(見EP 616812)。
還希望給予抗其它腫瘤相關(guān)抗原的抗體，如與EGFR、ErbB3、ErbB4或血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)結(jié)合的抗體，或者另外，可以將兩種或多種抗ErbB2抗體施用于患者。有時，還可將一種或多種細胞因子施用于患者。在一個優(yōu)選的實施方案中，抗ErbB2抗體與生長抑制劑一起給藥。例如，可以首先給予生長抑制劑，然后再給予抗ErbB2抗體。然而，也可考慮同時給藥，或者首先給予抗ErbB2抗體。生長抑制劑的合適劑量是目前使用的那些劑量，而且由于生長抑制劑與抗ErbB2抗體的聯(lián)合作用(協(xié)同作用)，該劑量還可以降低。
除了上述治療方案外，患者可以接受腫瘤細胞的手術(shù)切除和/或放射治療。
進行疾病的預(yù)防或治療時，抗體ErbB2抗體的的適當劑量依賴于所治疾病的類型(如上所述)，疾病的嚴重程度和進程，抗體給藥的目的是預(yù)防還是治療，先前的治療，患者的臨床病史和對抗體的應(yīng)答，以及主治醫(yī)生的判斷?？贵w適宜一次性地或在一系列治療中施用于患者。當治療涉及一系列治療時，初始劑量(一次或多次)之后，以每日一次或每周一次的間隔施用維持量。每次維持量與初始劑量所施用抗體量相比，相同或者更少量。
施用于患者的抗體的初始侯選劑量是約1μg/kg～15mg/kg(如0.1-20mg/kg)，無論是例如通過一次或分多次給藥，還是通過連續(xù)輸注給藥，取決于受治疾病的嚴重程度和類型。依據(jù)上述因素，代表性的每日劑量為約1μg/kg～100mg/kg或更多。重復(fù)給藥數(shù)天或更長時間時，視具體情況而將治療持續(xù)至出現(xiàn)對疾病癥狀的所需抑制為止。治療的進展很容易通過常規(guī)技術(shù)和試驗來監(jiān)測。
根據(jù)本發(fā)明，劑量方案可以包括經(jīng)靜脈或皮下輸注施用初始劑量為6mg/kg、8mg/kg或12mg/kg的抗ErbE2抗體，接下來經(jīng)靜脈輸注、靜脈快速灌注、皮下輸注或皮下快速灌注每周一次繼續(xù)施用2mg/kg維持量。如果患者對抗體耐受性好，則可以縮短輸注時間。
或者，本發(fā)明包括抗ErbE2抗體初始劑量為12mg/kg，接下來的繼續(xù)維持量為6mg/kg每3周一次。
另一劑量方案包括抗ErbE2抗體初始劑量為8mg/kg，接下來的繼續(xù)維持量為6mg/kg每3周一次。
再一劑量方案包括抗ErbE2抗體初始劑量為8mg/kg，接下來的繼續(xù)維持量為8mg/kg每周一次或者8mg/kg每2-3周一次。
另一方案包括第1、2、3天每天施用初始劑量為4mg/kg的抗ErbE2抗體，接下來施用6mg/kg繼續(xù)維持量每3周一次。
另一方案包括抗ErbE2抗體初始劑量為4mg/kg，接下來的繼續(xù)維持量為2mg/kg每周兩次，其中維持量以3天的間隔分開。
或者，本發(fā)明可包括一個給藥周期，其中每周施用抗ErbE2抗體2-3次，共3周。優(yōu)選重復(fù)3周的周期以達到抑制疾病癥狀的效果。
本發(fā)明還包括周期性給藥方案，其中每日施用抗ErbE2抗體，共5天。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選必要地重復(fù)周期方案以達到抑制疾病癥狀的效果。關(guān)于合適劑量的進一步信息在下文實施例中提供。
VI.產(chǎn)品 在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了含有用于治療上述疾病的物質(zhì)的產(chǎn)品。所述產(chǎn)品包括一個容器、一個標簽和一張包裝插頁。適當?shù)娜萜靼ㄆ孔?，小瓶，注射器等。容器可由各種材料如玻璃或塑料制成。該容器內(nèi)盛放能有效治療病癥的組合物，并具有無菌存取口(例如該容器可以是靜脈注射袋或帶有能通過皮下注射針刺穿的塞子的小瓶)。組合物中至少一種活性劑是抗ErbB2抗體。容器上的或附帶的標簽說明該組合物用于治療所列出的病癥。產(chǎn)品還包括第二個容器，其中含可藥用的緩沖液，例如磷酸鹽緩沖液，Ringer’s溶液和葡萄糖溶液。產(chǎn)品還可進一步包括具有商業(yè)需要以及符合用戶需要的其它材料，如其它緩沖液、稀釋劑，濾器，針頭和注射器。另外，制備的產(chǎn)品可以包括有使用說明的包裝插頁，插頁包括例如組合物不與蒽環(huán)類化療劑如阿霉素或表阿霉素聯(lián)合使用的警告。
材料的保藏 下述雜交瘤細胞已保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，12301 ParklawnDrive，Rockville，MD，美國(ATCC) 抗體命名 ATCC編號 保藏日 7C2 ATCC HB-12215 1996年10月17日 7F3 ATCC HB-12216 1996年10月17日 4D5 ATCC CRL 104631990年5月24日 2C4 ATCC HB-12697 1999年4月8日 本發(fā)明的進一步細節(jié)通過下述非限定性實施例舉例說明。
實施例 實施例1HERCEPTIN

抗ErbB2抗體的制備和效力 材料與方法 抗ErbB2單克隆抗體按Fendly等，癌癥研究501550-1558(1990)和WO89/06692中所述方法，制備與ErbB2的細胞外結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合的抗ErbB2IgG1κ鼠單克隆抗體4D5。簡言之，用含25mM EDTA的磷酸鹽緩沖液(PBS)收獲按Hudziak等(美國國家科學(xué)院院刊847159(1987))所述方法制備的NIH 3T3/HER2-3400細胞(約表達1×105ErbB2分子/細胞)，并用其免疫BALB/c小鼠。在第0、2、5和7周給小鼠腹腔注射含107個細胞的0.5ml PBS。于第9和第13周，給帶有特定抗血清(其可與32P-標記的ErbB2免疫共沉淀)的小鼠腹腔注射麥胚凝集素-Sepharose(WGA)純化的ErbB2膜提取物。之后靜脈注射0.1ml ErbB2制劑，并將脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞系X63-Ag8.653融合。通過ELISA和放射性免疫沉淀法，篩選雜交瘤細胞上清液的ErbB2結(jié)合。MOPC-21(IgG1)(Cappell，Durham，NC)用作同種異型-匹配對照。用鼠4D5抗體的人源化版(HERCEPTIN

抗ErbB2)進行治療。對該人源化抗體進行工程改造，方法是將鼠4D5抗體的互補決定區(qū)插入人免疫球蛋白IgG1(IgG1)共有序列的框架區(qū)中(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA894289[1992])。所得人源化抗ErbB2單克隆抗體對p185HER2有很高的親和力(Dillohiation常數(shù)[Kd]＝0.1nmol/L)，在體外和人異體移植物中明顯抑制含有高水平p185HER2的乳腺癌細胞的生長，誘導(dǎo)出依賴于抗體的細胞毒性(ADCC)作用，而且發(fā)現(xiàn)作為單一治療劑，對接受過廣泛先期治療的ErbB2過度表達型轉(zhuǎn)移乳腺癌患者具有臨床活性。HERCEPTIN

由經(jīng)基因工程改造的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系產(chǎn)生，該細胞系大規(guī)模生長，并將抗體分泌到培養(yǎng)基中。該抗體用標準的層析和過濾方法，從CHO培養(yǎng)物中純化獲得。對用于本研究的每批抗體進行檢驗，以確認它的性質(zhì)、純度和效力，并符合“食品和藥品管理局”對無菌性和安全性的要求。
合格標準患者必須符合研究許可的下列合格標準 -轉(zhuǎn)移乳腺癌 -ErbB2(HER2)癌基因過度表達(經(jīng)免疫組織化學(xué)或熒光原位雜交(FISH)測定為2+至3+)。[ErbB2的腫瘤表達可如前面所述(Slamon等[1987]和[1989])的方法，通過免疫組織化學(xué)分析從石蠟包埋的患者腫瘤塊制得的一系列薄切片來測定。所用主要檢測抗體是鼠4D5Mab，它具有和用于治療的人源化抗體相同的CDR。如果至少25％的腫瘤細胞表現(xiàn)出特征性的p185HER2膜染色，則認為腫瘤過度表達ErbB2]。
-通過放射照相手段、物理檢查或照片表現(xiàn)出可二維測量的疾病(包括溶解性骨病變) 可測量的疾病定義為，在兩個垂直直徑中可通過物理檢查、X-射線(平片)、計算機化的X線斷層攝影術(shù)(CT)、磁共振成像(MRI)、超聲或照片可重復(fù)測出的任何塊狀物。
成骨細胞轉(zhuǎn)移灶、胸膜腔積液或腹水不認為是可測量的。可測量的病變的最大尺寸至少為1cm。轉(zhuǎn)移性疾病的可評價部位的敘述以及可評價部位(如肺)中的病變數(shù)目，必須記錄在合適的病例報告表格(CRF)中。如果肺或肝存在多處病變，則跟蹤每個部位最大的6個病變。
-能理解并愿意簽署書面知情同意書 -婦女應(yīng)年滿18周歲 -通過對血液、腎、肝和代謝功能的篩選性實驗室評價，證明候選人適合接受同時進行的細胞毒化療。
排除的標準 具有下列任一情況的患者應(yīng)被排除在研究之外 -以前接受過轉(zhuǎn)移乳腺癌的細胞毒化療 -患者可能在以前曾接受過轉(zhuǎn)移性疾病的激素治療(如三苯氧胺)或佐劑環(huán)境中的細胞毒性治療。
-伴發(fā)的惡性腫瘤未被有效治愈 -用Karnofsky評分，性能狀況低于60％ -妊娠或正在受護理的婦女；有懷孕可能的婦女，除非經(jīng)研究者確定已經(jīng)采取有效避孕措施 -雙側(cè)乳腺癌(原發(fā)性腫瘤必須有2+至3+的HER2過度表達，或者轉(zhuǎn)移部位必須有2+至3+的HER2過度表達) -在研究前30天內(nèi)使用了調(diào)查性或未經(jīng)許可的制劑 -臨床上不穩(wěn)定的或有不能治療的轉(zhuǎn)移到腦部的轉(zhuǎn)移灶(例如需要放射治療) 根據(jù)上述標準，選擇469位患者參加本研究。隨機地使半數(shù)患者(通過化學(xué)治療分層)另外接受HERCEPTIN

抗ErbB2抗體(見下文)。
給藥和劑量 抗ErbB2抗體 在第0天，用90分鐘的時間靜脈內(nèi)施用4mg/kg人源化抗ErbB2抗體(HERCEPTIN

)。從第7天起，患者接受每周一次的用90分鐘時間施用的2mg/kg抗體。
化療 只要患者的疾病沒有進展，患者就接受下列兩種化療方案之一至少6個周期a)環(huán)磷酰胺和阿霉素或表阿霉素(AC)，如果患者沒有在佐劑背景中接受過蒽環(huán)類抗生素治療，或b)紫杉醇(T，TAXOL

)，如果患者在佐劑背景中接受過蒽環(huán)類抗生素治療。HERCEPTIN

抗ErbB2抗體的初始劑量在任一化療方案第一個周期之前24小時給藥。如果抗體的初始劑量能夠被很好地耐受的話，則在化療劑即將開始前施用繼續(xù)量抗體。如果抗體的首次劑量未被很好地耐受的話，則在化療劑給藥前24小時繼續(xù)輸注。如果在主治醫(yī)師看來患者繼續(xù)治療有利的話，則讓患者在6個周期后繼續(xù)接受化療。
環(huán)磷酰胺(600mg/m2)的給藥，可以在最短3分鐘內(nèi)靜脈推注或在最長2小時內(nèi)輸注。
阿霉素(60mg/m2)或表阿霉素(75mg/m2)的給藥，可根據(jù)方案規(guī)定的程序，在最短3-5分鐘內(nèi)靜脈緩慢推入或者在最長2小時內(nèi)輸注。
紫杉醇(TAXOL

)的給藥劑量是在3小時內(nèi)靜脈輸入175mg/m2。接受紫杉醇的所有患者，預(yù)先在給予紫杉醇之前12和6小時口服地塞米松(或其等價物)20mg×2；在紫給予杉醇之前30分鐘靜脈輸入50mg苯海拉明(或其等價物)，并在紫杉醇之前給予二甲茚啶(dimetidine)300mg(或另一H2阻斷劑)。
應(yīng)答標準 進展性疾病任何可測定的病變有增加25％或更多的客觀證據(jù)。進展性疾病還包括出現(xiàn)新病變的那些情況。對于骨病變，進展定義為平片、CT、MRI客觀測得增加25％；并非由骨折引起的有癥狀的新?lián)p傷；或需要姑息敕射治療。
完全應(yīng)答 所有放射照片和/或肉眼能看到的腫瘤在最短4周內(nèi)消失。皮膚和胸壁完全應(yīng)答，必須通過活檢來確證。
部分應(yīng)答 所有可測定的病變的垂直直徑總和在最短4周內(nèi)減小至少50％。既沒有新的病變出現(xiàn)，任何病變的大小也沒有進展。
最小應(yīng)答 所有可測定的病變的垂直直徑總和減少25～49％。既沒有新的病變出現(xiàn)，任何病變的大小也沒有進展。
疾病穩(wěn)定 可測定的病變的大小變化不超過25％。沒有出現(xiàn)病變。
從治療開始到進展計算出疾病進展時間(TTP)。用針對單一部分的確切方法計算應(yīng)答速度的置信度。(Fleiss，JL，Statistical Methods for Rates andProportions(第2版)New York，NY，Wiley，1981，13-17)。
結(jié)果 在10.5個月的中期隨訪中，疾病進展時間(TTP，月為單位)和應(yīng)答比例(RR)的評價結(jié)果表明，HERCEPTIN

抗ErbB2抗體顯著增加化療劑的效果，而毒副作用(AE)在總體上沒有增加 表1 HERCEPTIN

抗ErbB2抗體的效力 參與者TTP(月) RR(％) AE(％) CRx 234 5.5 36.266 CRx+H 235 8.6* 62.00** 69 AC145 6.5 42.171 AC+H 146 9.0 64.968 T 894.2 25.059 T+H 897.1 57.370 *對數(shù)秩和檢驗p＜0.001；**X2檢驗p＜0.01；CRx化療； AC蒽環(huán)類抗生素/環(huán)磷酰胺治療；HHERCEPTIN

抗ErbB2抗體；TTAXOL
據(jù)報道，AC+H(18％級3/4)聯(lián)合治療比單用AC(3％)、T(0％)或T+H(2％)更經(jīng)常出現(xiàn)類似于用蒽環(huán)類抗生素時所觀察到的心肌功能紊亂。
這些數(shù)據(jù)表明，正如由應(yīng)答比例和疾病進展所評價的那樣，抗ErbB2抗體治療與化療劑聯(lián)合能提高臨床效果。但是，由于阿霉素或表阿霉素增加心肌副作用，因此，蒽環(huán)類抗生素與抗ErbB2抗體治療的聯(lián)合使用是禁忌的。從危險性和有益方面考慮，該結(jié)果表明聯(lián)合治療方案優(yōu)選HERCEPTIN

抗ErbB2抗體和紫杉醇(TAXOL

)的聯(lián)合治療。
實施例2抗ErbB2抗體(HERCEPTIN

)的藥動學(xué)和藥效學(xué)特性 經(jīng)靜脈輸注向按照實施例1提供的標準選出的患者施用HERCEPTIN

抗ErbB2抗體。靜脈輸注初始劑量為4mg/kg的HERCEPTIN

抗ErbB2抗體，接著每周一次連續(xù)數(shù)周靜脈輸注繼續(xù)量為2mg/kg的HERCEPTIN

抗ErbB2抗體。213名患者開始此治療方案，由于對發(fā)生疾病快速進展的患者進行選擇性中斷，所以僅采集到其中不足90名患者超過8周的血藥濃度。在開始治療的213名患者中，對應(yīng)于不同時間能測得血清谷濃度的人數(shù)是在12周時80名，16周時77名，20周時44名，24周時51名，28周時25名，32周時23名和36周時37名。
HERCEPTIN

抗ErbB2抗體第0-36周的谷血清濃度 從第2周到36周的HERCEPTIN

抗ErbB2抗體谷血清濃度(μg/ml，均值±SE)作圖見圖3(黑圈)。將由于疾病快速進展而未繼續(xù)療程的患者的數(shù)據(jù)排除在此分析之外，因而患者的人數(shù)相當恒定。在12周期間谷血清濃度逐漸增加，之后趨于平臺水平。
HERCEPTIN

抗ErbB2抗體第1-8周的谷和峰血清濃度 測得了開始治療的213名患者中212名的HERCEHPTIN

抗ErbB2抗體的血清濃度數(shù)據(jù)。得到了212名患者中195名的反映首次HERCEPTIN

抗ErbB2抗體輸注的谷和峰血清濃度。在第7次輸注時，測得137/212患者的谷血清濃度和114/212患者的峰血清濃度的數(shù)據(jù)。表2總結(jié)了治療開始后前8周的谷和峰血清濃度的統(tǒng)計情況。在HERCEHPTIN

抗ErbB2抗體給藥結(jié)束后不久即采集峰樣本；繼續(xù)量給藥前(即1周后)采集谷樣本。按照本文公開的方法測定HERCEHPTIN

抗ErbB2抗體的血清濃度。
表2 治療開始后前8周HERCEHPTIN

抗ErbB2抗體的谷和峰血清濃度(μg/ml) 表2中的數(shù)據(jù)提示，谷血清濃度隨時間增加。在第2至8周期間，在研究的眾多患者中，有18名患者的谷血清濃度不超過20μg/ml?；谙惹霸趧游锖驮谂R床試驗上進行的探索性檢測，20μg/ml HERCEPTIN

抗ErbB2抗體谷血清濃度作為這些研究的名義上的目標。
對患者HERCEPTIN

抗ErbB2抗體血清濃度的應(yīng)答狀態(tài)進行了評價。為了此目的，計算出各個時間的平均血清濃度(谷濃度和峰濃度的平均值)和患者應(yīng)答狀態(tài)(由獨立應(yīng)答評價委員會測定應(yīng)答狀態(tài))。第2周和第8周之間血清濃度的增加幅度在應(yīng)答者大于無應(yīng)答者，提示反應(yīng)狀況與HERCEPTIN

抗ErbB2抗體血清濃度之間存在關(guān)聯(lián)性。第2周谷血清濃度值以及第7和8周的平均值與應(yīng)答狀態(tài)相關(guān)性統(tǒng)計分析(方差分析)表明，應(yīng)答狀態(tài)與第7和8周谷血清平均值之間具有顯著相關(guān)性(p＜0.001)。該結(jié)果指明，在應(yīng)答者和無應(yīng)答者之間的谷血清濃度(第7和8周谷血清濃度的平均值)有顯著的差異應(yīng)答者的谷血清濃度為60±20μg/ml，而在無應(yīng)答者則為44±25μg/ml(均值±SD)。轉(zhuǎn)移部位的HER2過度表達水平和類型與谷血清濃度的顯著差異有關(guān)。在第2周，具有2+HER2過度表達水平的患者的谷血清濃度(n＝40，均值＝28.8μg/ml，SD＝10.4)，明顯高于3+HER2過度表達水平的患者的谷血清濃度(n＝155，均值＝24.1μg/ml，SD＝13.1)。這種在第7和8周谷血清濃度平均值之間的差異不再具有統(tǒng)計學(xué)意義的顯著性。另外，在第2周，患淺表疾病患者的谷血清濃度(n＝12，均值＝34.1μg/ml，SD＝12.0)明顯高于內(nèi)臟疾病患者的谷血清濃度(n＝183，均值＝24.4μg/ml，SD＝12.6)。這種在第7和8周谷血清濃度平均值之間的差異具有顯著性。這些數(shù)據(jù)表明，患不同疾病患者在第2周和第7/8周之間的谷血清濃度升高。
在接下來設(shè)計的類似研究中，用8mg/kg負荷量繼而用每周一次4mg/kg維持量對人乳腺癌患者進行治療。該項初步用于人的研究表明，8mg/kg負荷量每周一次4mg/kg維持量的給藥方案在縮小患者腫瘤體積方面非常有效。
本實施例的數(shù)據(jù)證明，前負荷施用抗體使較快達到目標血清濃度，其可能與提高治療效果有關(guān)。
實施例3HERCEPTIN

抗ErbB2抗體I.V快速灌注給藥和皮下輸注有效縮小鼠腫瘤體積 檢測了人源化抗ErbB2抗體(HERCEPTIN

，制備見實施例1)輸注或快速灌注的效力，無論是靜脈注射還是皮下注射。本研究的目的是考察皮下給藥是否可行和方便的皮下快速灌注給藥是否能治療接種了過度表達HER2基因的細胞系的動物體內(nèi)轉(zhuǎn)移性乳腺癌。結(jié)果(詳見下述)表明，靜脈和皮下輸注及快速灌注給藥是可行的治療方法。
在摻入了天然過度表達HER2基因的人乳腺癌細胞系(BT-474M1，衍生自BT-747細胞，ATCC登記號為HTB-20)的裸鼠異種移植模型的研究中，按下述步驟比較經(jīng)靜脈快速灌注與經(jīng)皮下輸注給藥時的腫瘤體積函數(shù)。在第一項研究中，從Taconic Inc(Germantown，NY)購進7-9周齡雌性無胸腺裸小鼠。為了引發(fā)腫瘤，給每只鼠皮下接種懸浮在MatrigelTM中的3×106個BT474M1細胞。當腫瘤結(jié)節(jié)達到約100mm3時，將動物隨機分為4個治療組。按照表3的指示對各組進行治療。
表3 I.V.快速灌注與S.C.輸注的動物分組和劑量比較 血清濃度＝血清中的濃度。LD＝負荷量。MD＝維持量。
使用Alzet

滲透性小型泵(Alza Corp.Palo Alto，CA)計算Infusate濃度以獲得目標血清濃度。
在開始給藥前，通過皮下持續(xù)釋放雌激素小丸9天使動物暴露于雌激素環(huán)境，從而促進所移植的腫瘤細胞生長。開始治療前8天，給動物接種BT474M1細胞并讓腫瘤生長。然后，按照表3的指示，讓動物接受非相關(guān)抗體E25(對HER2受體無特異性，但屬于單克隆IgG類的成員)或受測試抗體HERCEPTIN

抗ErbB2抗體。選擇劑量水平以達到HERCEPTIN

的目標血清濃度，即通過皮下泵輸注的1μg/ml或通過靜脈快速灌注給藥的20μg/ml。研究組接受治療至35天。使用3只小鼠/組/時間點，每周一次(在第4組給藥前)測定HERCEPTIN

抗ErbB2抗體的血清濃度。按照本文公開的有關(guān)標準化技術(shù)的方法測定抗ErbB2抗體濃度。給藥開始前2天和在本研究第6-35天期間每周2次測量腫瘤體積，結(jié)果列于下表。測量腫瘤三維尺寸，其體積用mm3表示。通過受試動物腫瘤體積與未治療的對照動物的統(tǒng)計學(xué)比較(ANOVA)來測定療效。
如下表4所見，用HERCEPTIN

抗ErbB2抗體對BT474M1荷瘤小鼠按照所指示的劑量方法治療，顯著抑制腫瘤的生長。相對于對照組而言，所有HERCEPTIN

治療組均顯示出對腫瘤增長的類似抑制。未觀察到劑量-應(yīng)答效應(yīng)。
表4 S.C.輸注和I.V.快速灌注給藥的比較
S.C.＝皮下給藥；I.V.＝靜脈給藥。
*4.0mg/kg負荷量和2.0mg/kg/周維持量。
**給藥前的濃度(維持量給藥前的最后谷血清濃度)。
上表結(jié)果表明，本研究中維持約2μg/ml的血清濃度與20μg/ml濃度的效果相同。結(jié)果證明，皮下輸注與靜脈快速灌注效果相同并達到類似的谷血清濃度。結(jié)果還表明，研究的劑量水平在本模型劑量應(yīng)答曲線的頂端，皮下給藥對于治療乳腺癌有效。因此，皮下施用維持量作為HERCEPTIN

抗ErbB2抗體治療方案的一部分是可行的。
實施例4HERCEPTIN

抗-ErbB2抗體I.V.快速灌注和皮下快速灌注給藥有效縮小小鼠腫瘤體積 對于患者和醫(yī)務(wù)人員而言，皮下快速灌注給藥是便捷和低消費高效率的。本實施例研究的結(jié)果表明，皮下快速灌注給藥在減小小鼠乳腺細胞腫瘤大小方面與靜脈快速灌注給藥同樣有效。
本研究按照實施例3公開的方法設(shè)計，以比較靜脈快速灌注和皮下快速灌注給藥。如實施例3所述，在腫瘤細胞接種前1天，將持續(xù)釋放雌激素的植入體埋入皮下。腫瘤細胞接種6天后，初次測量腫瘤大小。腫瘤細胞接種7天后，施用首次劑量的對照抗體或者HERCEPTIN

抗ErbB2抗體。表4列出動物分組、給藥類型、負荷量和維持量情況。對動物每周給藥一次，給藥4周。
表5 用于I.V.快速灌注和S.C.快速灌注給藥比較的動物分組和劑量 IV＝靜脈；SC＝皮下；n＝每組動物只數(shù)。
按照表4給出的信息和實施例3公開的技術(shù)對小鼠進行治療。按照本文公開的方法和使用標準化技術(shù)，在每周一次靜脈施用維持量之前每周一次測定HERCEPTIN

抗ErbB2抗體的血清濃度。根據(jù)標準免疫分析技術(shù)測定E25對照抗體的血清濃度。表6顯示HERCEPTIN

抗ErbB2抗體的血清濃度隨時間增加。
表6 IV和SC給藥HERCEPTIN

抗ErbB2抗體血清濃度血清濃度，μg/ml 在第0、7和14天的時間點n＝10，在第21天的時間點n＝9。
表7顯示組1-5經(jīng)靜脈快速灌注和皮下快速灌注給藥達到表6所示血清抗體濃度的相對效率。此研究中，以腫瘤體積的縮小作為檢測效率的指標。腫瘤體積每周測兩次。
表7 測量腫瘤體積變化作為比較HERCEPTIN

抗ErbB2抗體經(jīng)靜脈快速灌注和皮下快速灌注給藥的效率指標，均值(SD) 每個數(shù)據(jù)點N＝10。TM＝腫瘤測量。IV＝靜脈。SC＝皮下。MD＝維持量。腫瘤體積，mm3。
*由于測量錯誤而剔除了第17天的數(shù)據(jù)。
計算第21天-第31天腫瘤生長速率Log(TM+1)。曲線下面積是腫瘤體積對時間作圖的曲線下面積。
圖4A和4B是腫瘤體積對時間所作的圖，其中一些數(shù)據(jù)見表7。圖4A是腫瘤體積對時間的線圖。圖4B是相同數(shù)據(jù)的半對數(shù)圖，使得檢測點更為直觀、清晰。表7的數(shù)據(jù)和圖4A和4B表明，盡管HERCEPTIN-治療組之間未觀察到劑量-相關(guān)效應(yīng)，但是經(jīng)皮下快速灌注給藥與靜脈快速灌注給藥同樣有效并且達到類似的谷血清濃度。
實施例5抗ErbB2抗體的靜脈和皮下給藥方案 根據(jù)本發(fā)明，抗ErbB2抗體(例如HERCEPTIN

)的給藥方法包括較大前沿負荷量的藥物以在近4周或更短、優(yōu)選3周或更短、更優(yōu)選2周或更短、最優(yōu)選1周或更短包括1天或更短時間達到目標血清濃度。根據(jù)本發(fā)明，該初始劑量后繼續(xù)施用等量或較小量的維持目標血清濃度的繼續(xù)量。本發(fā)明方法的優(yōu)點是維持量給藥頻率小和/或由皮下注射給藥，使得本發(fā)明治療方案的抗體給藥對于患者和醫(yī)務(wù)人員而言是便捷和低消費高效率的。另外，當患者的化療需要經(jīng)靜脈注射施用其它藥物時，維持量皮下給藥方案可以被靜脈給藥(如輸注)打斷。
為了測試下述劑量方案，按照前面實施例1公開的標準選擇受試人。初始劑量給藥一次或多次，其應(yīng)足以在近4周或更短、優(yōu)選3周或更短、更優(yōu)選2周或更短、最優(yōu)選1周或更短包括1天或更短時間達到有效目標血清濃度。維持量給藥次數(shù)可以是一次或多次，其應(yīng)足以達到抑制疾病癥狀如使腫瘤體積縮小的效果。維持量等于或小于初始量，與本發(fā)明通過提供更大前沿負荷量給藥方案來施用HERCEPTIN

抗ErbB2抗體的目的一致。本文公開的特定藥物給藥方案是代表性的，而不是限定性的。
在一個臨床試驗中，經(jīng)靜脈或皮下注射方式將初始劑量為6mg/kg、8mg/kg、或12mg/kg的HERCEPTIN

抗ErbB2抗體施用于患者。初始劑量(負荷量)經(jīng)靜脈輸注或快速灌注或優(yōu)選皮下快速灌注方式施用。優(yōu)選HERCEPTIN

抗ErbB2抗體的目標谷血清濃度達到約10-20μg/ml(治療組所有患者的平均值)，并且通過施用等于或小于初始量的抗ErbB2抗體繼續(xù)量而維持。在另一方法中，達到一個目標谷血清濃度，并通過靜脈或皮下注射方式每周一次施用2mg/kg HERCEPTIN

抗ErbB2抗體，給藥至少8周來維持?；蛘?，對于本文公開的這個或任何一個給藥方案，可使用皮下泵經(jīng)皮下連續(xù)輸注來施用后續(xù)維持量。
在另一方法中，經(jīng)靜脈注射(輸注或快速灌注)或皮下快速灌注施用初始量(前沿負荷量)為8mg/kg的HERCEPTIN

抗ErbB2抗體。接著，按照3周的間隔通過靜脈快速灌注、靜脈輸注、皮下輸注或皮下快速濃注6mg/kg來維持近10-20μg/ml的谷血清濃度(整個組的平均值)。
在另一方法中，經(jīng)靜脈注射(輸注或快速灌注)或皮下快速灌注施用初始量(前沿負荷量)為12mg/kg的HERCEPTIN

抗ErbB2抗體。接著，按照3周的間隔通過靜脈快速灌注、靜脈輸注、皮下輸注或皮下快速濃注6mg/kg來維持近10-20μg/ml的谷血清濃度。
還有一方法，經(jīng)靜脈輸注或快速灌注，優(yōu)選以皮下快速灌注或輸注施用初始量(前沿負荷量)為8mg/kg的HERCEPTIN

抗ErbB2抗體。接著，按照每周或每2-3周施用8mg/kg來維持HERCEPTIN

抗ErbB2抗體近10-20μg/ml的谷血清濃度。維持量是通過靜脈輸注或靜脈快速灌注，優(yōu)選經(jīng)皮下輸注或皮下快速灌注來施用的。
在另一方法中，前負荷初始量是一系列靜脈或皮下注射給藥，例如在第1、2和3天每日一次注射至少1mg/kg(初始注射施用抗ErbB2抗體的總量大于4mg/kg)，接著每3周一次施用6mg/kg的繼續(xù)量來維持HERCEPTIN

抗ErbB2抗體的谷血清濃度(例如近10-20μg/ml)。維持量是通過靜脈輸注或靜脈快速灌注，或皮下輸注或皮下快速灌注來施用的。
再一方法中，每連續(xù)5天靜脈輸注至少1mg/kg，優(yōu)選4mg/kg的前沿負荷量，接著重復(fù)此周期足夠次數(shù)以達到抑制疾病癥狀的效果。如果患者能夠耐受，則在初始劑量(一次或數(shù)次)后，經(jīng)皮下輸注或快速灌注施用繼續(xù)量。這樣的皮下給藥對于患者和醫(yī)務(wù)人員而言是便捷和低花費高效率的。還有一方法，每周至少2次靜脈輸注初始量的HERCEPTIN

抗ErbB2抗體，共輸注3周，接著重復(fù)此周期以維持HERCEPTIN

抗ErbB2抗體的有效谷血清濃度。此劑量至少為4mg/kg抗ErbB2抗體，優(yōu)選至少5mg/kg。經(jīng)靜脈或皮下施用維持量藥物。
只要動物或病人在初始給藥期間或之后能夠耐受所用抗體，就可以經(jīng)皮下施用繼續(xù)量，由此給患者和醫(yī)務(wù)人員帶來極大便捷和低花費高效率。
在動物實驗中，經(jīng)靜脈或皮下注射施用大于4mg/kg，優(yōu)選大于5mg/kg的初始量，接著每周2次(每隔3天)經(jīng)皮下快速灌注2mg/kg以維持約10-20μg/kg的谷血清濃度。而且，如果知道動物或患者能夠耐受抗體的話，則任選地并且優(yōu)選經(jīng)皮下快速灌注初始量HERCEPTIN

抗ErbB2抗體，接著經(jīng)皮下注射維持量。
盡管本文為了比較動物研究和人體試驗的目的而公開了目標血清濃度，但是臨床使用的目標血清濃度可以不同。本文公開的內(nèi)容指導(dǎo)使用者選擇能提供有效目標谷血清濃度的前沿負荷量藥物給藥方案。
本文公開的本發(fā)明方法任選地包括HERCEPTIN

抗ErbB2抗體與化療劑(除蒽環(huán)類抗生素的衍生物外)聯(lián)合給藥以抑制疾病癥狀?；焺┡cHERCEPTIN

抗ErbB2抗體可以一起給藥或者分開給藥，還可根據(jù)另一種劑量方案給藥。例如，本發(fā)明包括TAXO

與HERCEPTIN

抗ErbB2抗體一起皮下給藥。另外，8mg/kg HERCEPTIN

抗ErbB2抗體靜脈或皮下注射，接著6mg/kg HERCEPTIN

抗ErbB2抗體與化療劑一起每3周一次靜脈或皮下注射，所述化療劑如taxoid(如紫杉醇175mg/m2，每3周給藥一次)或蒽環(huán)類抗生素的衍生物(如阿霉素60mg/m2或表阿霉素75mg/m2，每3周給藥一次)。任選地，當施用蒽環(huán)類抗生素的衍生物時，也施用心臟保護劑(如600mg/m2環(huán)磷酰胺，每3周給藥一次)。在另一聯(lián)合治療中，施用抗ErbB2抗體的負荷量大于4mg/kg，優(yōu)選大于5mg/kg，更優(yōu)選至少8mg/kg。負荷量之后的維持量是至少2mg/kg，每周一次，優(yōu)選6mg/kg每3周一次。聯(lián)合治療包括在用抗ErbB2抗體治療期間施用taxoid。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，taxoid是紫杉醇且施用劑量為70-100mg/m2/周。根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，taxoid是紫杉萜且施用劑量為30-70mg/m2/周。
實施例6HERCEPTIN

與紫杉醇聯(lián)合每3周一次靜脈給藥 目前，HERCEPTIN

推薦劑量是2mg/kg，每周一次。代替每周一次給藥，在用紫杉醇(175mg/m2，每3周一次)治療的同時向患者每3周一次施用HERCEPTIN

。模擬所提出的治療方案建議谷血清濃度將是17mcg/ml，在前面HERCEPTIN

靜脈給藥臨床試驗得出的目標血清濃度的范圍(10-20mcg/ml)之內(nèi)。在開始評定了首批12個患者的PK參數(shù)之后，如果認為劑量不夠，那么接著將剩下的12名患者的劑量增加至8mg/kg，每3周一次。
入選標準 1)≥18歲的女性 2)組織學(xué)確定ErbB2過度表達型轉(zhuǎn)移性乳腺癌 3)最近已經(jīng)確診患轉(zhuǎn)移癌疾病的患者 4)Karnofsky性能狀況≥70％ 5)在進行任何特定篩選程序之前，給予書面知情同意書，使患者知道有權(quán)在任何時間沒有任何偏見地退出研究。
排除標準 1)妊娠或哺乳期婦女 2)可能會懷孕的婦女，除非(1)手術(shù)絕育或(2)使用有效(adequate)避孕措施如口服避孕藥、子宮內(nèi)避孕器或采用與殺精子凝膠聯(lián)合的避孕隔離措施。
3)CNS轉(zhuǎn)移灶的臨床或放射學(xué)證據(jù)。
4)任何明顯的心臟病病史 5)LVEF≤50％ 6)在任何治療背景中均沒有在先的taxane治療 7)下列任一項血液值基線異常 -Hb＜9g/dl -WBC＜3.0×109/l -粒細胞＜1.5×109/l -血小板＜100×109/l 8)下述任一項肝功能檢測值基線異常 -血膽紅素＞1.5×ULN(正常上限) -ALT和/或AST＞2.5×ULN(如果肝臟或骨轉(zhuǎn)移的話，大于4.0×ULN) -堿性磷酸酶＞2.5×ULN(如果肝臟或骨轉(zhuǎn)移的話，大于4.0×ULN) 9)下述腎功能檢測值基線異常 -血肌酐＞1.5×ULN 10)有妨礙患者參加試驗研究的其它嚴重醫(yī)學(xué)病癥的病史。
HERCEPTIN

負荷量和方案首次劑量8mg/kg。維持量和方案6mg/kg，每3周一次。
紫杉醇-175mg/m2靜脈注射每3周一次×6個周期，按3-小時輸注。
注意在治療的首輪周期中，在施用HERCEPTIN

前8小時施用紫杉醇，以測定紫杉醇單獨用藥的PK。只是在第一個周期中，HERCEPTIN

于施用紫杉醇8小時后給藥。在接下來的治療周期中，HERCEPTIN

在紫杉醇之前給藥。
整個研究共18周。受試者接受最多6個總HERCEPTIN

劑量(dose)。最后一個受試者接受最后一個周期的紫杉醇之后，停止有關(guān)安全性和藥代動力學(xué)的數(shù)據(jù)采集，研究趨向于擬定特定的治療方案。根據(jù)研究者的判斷，受試者可繼續(xù)接受HERCEPTIN

+/-紫杉醇。
據(jù)信不管對患者施用HERCEPTIN

的頻率如何，上述治療方案在治療轉(zhuǎn)移型乳腺癌中是有效的。
盡管詳細證明和公開的本發(fā)明的特定方面和實施方案能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明目的并提供本文前面提到的有益效果，但是應(yīng)當理解這只是本發(fā)明優(yōu)選實施方案的某些例證性說明，并不意味著對所示方法的細節(jié)和制備產(chǎn)品加以限制，本發(fā)明的保護范圍見權(quán)利要求書。說明書中所有引證的出版物，在本文中清楚地引入作為參考。
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<400>1
Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu
1 5 10 15
Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val
20 25 30
Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser
35 40 45
Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly Tyr Val Leu
50 55 60
Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu Gln Arg Leu Arg
65 70 75
Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala
80 85 90
Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro Val Thr
95 100 105
Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser Leu
110 115 120
Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln
125 130 135
Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys
140 145 150
Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg
155 160 165
Ala
<210>2
<211>32
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>2
Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro
1 5 10 15
Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln
20 25 30
Gly Cys
<210>3
<211>11
<212>PRT
<213>人工
<220>
<221>人工
<222>1-11
<223>
<400>3
Pro Lys Asn Ser Ser Met Ile Ser Asn Thr Pro
1 5 10
<210>4
<211>7
<212>PRT
<213>人工
<220>
<221>人工
<222>1-7
<223>
<400>4
His Gln Ser Leu Gly Thr Gln
1 5
<210>5
<211>8
<212>PRT
<213>人工
<220>
<221>人工
<222>1-8
<223>
<400>5
His Gln Asn Leu Ser Asp Gly Lys
1 5
<210>6
<211>8
<212>PRT
<213>人工
<220>
<221>人工
<222>1-8
<223>
<400>6
His Gln Asn Ile Ser Asp Gly Lys
1 5
<210>7
<211>8
<212>PRT
<213>人工
<220>
<221>人工
<222>1-8
<223>
<400>7
Val Ile Ser Ser His Leu Gly Gln
1 5
<210>8
<211>59
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>8
Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val
1 5 10 15
Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln
20 25 30
Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val
35 40 45
Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg
50 55
<210>9
<211>65
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>9
Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr
1 5 10 15
Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr
20 25 30
Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys
35 40 45
Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu
50 55 60
Gly Ala Cys Gln Pro
65
<210>10
<211>107
<212>PRT
<213>鼠(Mus Musculus)
<400>10
Asp Thr Val Met Thr Gln Ser His Lys Ile Met Ser Thr Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser
20 25 30
Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile
65 70 75
Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
80 85 90
Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
95 100 105
Ile Lys
<210>11
<211>119
<212>PRT
<213>鼠(Mus Musculus)
<400>11
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly
1 5 10 15
Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr
20 25 30
Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu
35 40 45
Glu Trp Ile Gly Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr
50 55 60
Asn Gln Arg Phe Lys Gly Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Arg Ser
65 70 75
Ser Arg Ile Val Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Phe Glu Asp
80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr
95 100 105
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
110 115
<210>12
<211>107
<212>PRT
<213>人工
<400>12
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser
20 25 30
Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
80 85 90
Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
95 100 105
Ile Lys
<210>13
<211>119
<212>PRT
<213>人工
<220>
<221>人工
<222>1-119
<223>Fab 574 VH
<400>13
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr
20 25 30
Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr
50 55 60
Asn Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr
95 100 105
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110 115
<210>14
<211>107
<212>PRT
<213>人工
<400>14
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser
20 25 30
Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
80 85 90
Tyr Asn Ser Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
95 100 105
Ile Lys
<210>15
<211>119
<212>PRT
<213>人工
<400>15
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20 25 30
Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr
50 55 60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Val Gly Tyr Ser Leu
95 100 105
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110 11權(quán)利要求
1.抗ErbB2抗體在制備用于治療易患或已診斷患有以過度表達ErbB2受體為特征的人類患者病癥之藥物中的用途，所述病癥為以過度表達ErbB2受體為特征的人類患者病癥，所述抗體的治療初始劑量至少約5mg/kg，抗體的治療繼續(xù)量接近等于或小于初始劑量。
2.一種產(chǎn)品，包括容器、盛在容器中的含抗ErbB2抗體的組合物和包裝插頁，所述包裝插頁包括向給藥者說明抗ErbB2抗體初始劑量至少5mg/kg和至少一次繼續(xù)量等于或小于初始量的說明書。
3.抗ErbB2抗體在制備治療人類癌癥的藥物中的用途，所述抗體治療劑量包括首次劑量和至少一次繼續(xù)量，其中首次劑量和繼續(xù)量間隔至少約2周。
4.一種產(chǎn)品，包括容器、盛在容器中的含有抗ErbB2抗體的組合物和包裝插頁，所述包裝插頁包括按照權(quán)利要求86-99任一用途使用的說明書。
5.有效量的抗ErbB抗體在制備治療人類癌癥的藥物中的用途，所述有效量包括
初始劑量至少為約5mg/kg和多次繼續(xù)量，所述繼續(xù)量大約等于或小于所述初始劑量。
6.有效量的抗ErbB抗體在制備治療人類癌癥的藥物中的用途有效量包括首次劑量和至少一次繼續(xù)量，所述首次劑量和繼續(xù)量的使用有至少約2周的間隔。
7.權(quán)利要求6的用途，其中所述抗ErbB抗體選自抗-表皮生長因子受體(EGFR)、抗ErbB3和抗ErbB4抗體。
8.一種產(chǎn)品，包括容器、盛在容器中的含有抗ErbB抗體的組合物和包裝插頁，所述包裝插頁含有按照權(quán)利要求101～104中任一項的方法給藥的說明書。
全文摘要
本發(fā)明涉及以過度表達ErbB2為特征的病癥的治療。更具體而言，本發(fā)明涉及用抗ErbB2抗體治療易患或診斷患有過度表達ErbB2的癌癥的人類患者。
文檔編號A61KGK101332299SQ20081013435
公開日2008年12月31日 申請日期2000年8月25日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月27日
發(fā)明者沙倫·A·鮑曼, 史蒂文·謝克 申請人:杰南技術(shù)公司