專利名稱：一種抑制血管內(nèi)膜增生的小分子干擾rna的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抑制血管內(nèi)膜增生的小分子干擾RNA。
背景技術(shù)：
RNA干擾(RNA Interference, RNAi)是指由于外源或內(nèi)源性的雙鏈RNA導(dǎo)入細 胞而特異性地抑制靶基因轉(zhuǎn)錄后表達的現(xiàn)象。自1998年發(fā)現(xiàn)以來，作為一種高效、 特異的調(diào)節(jié)基因表達技術(shù)，RNAi已成為基因功能研究的有力工具。在短短幾年中， RNAi的研究取得了突飛猛進的發(fā)展，如2001年首次報道了在哺乳動物細胞中成功 應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制基因表達(Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE， Mello CC. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans Nature. 1998 Feb 19;391(6669):806-11.)，開創(chuàng)了 RNAi技術(shù) 應(yīng)用于高等生物基因功能研究的先河；2002年Kay研究小組首次報道了應(yīng)用RNAi 技術(shù)在哺乳動物整體水平進行基因表達沉默的實驗研究(McCaffrey AP, Meuse L, Pham TT, Conklin DS， Hannon GJ, Kay MA. RNA interference in adult mice. Nature. 2002 Jul 4;418(6893):38-9.) ; 2004年哺乳動物全基因組范圍RNAi的研究也取得了 重要進展。
這種高效、特異的基因沉默技術(shù)，為疾病的治療增添了一種潛在的手段。目前， 世界各大生物技術(shù)公司正躍躍欲試開發(fā)能使致病基因"沉默"的新藥。RNAi藥物 的研發(fā)仍然面臨諸多挑戰(zhàn)，例如，如何將siRNA更高效的導(dǎo)入宿主細胞、怎樣保證 導(dǎo)入的siRNA的穩(wěn)定性、如何有效的延長其作用時間和siRNA藥物的靶細胞特異性、
體內(nèi)導(dǎo)向及可能出現(xiàn)的毒性問題等。
經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(PCI)是冠心病治療的一個重要手段，但PCI術(shù)后血管再 狹窄一直是影響PCI療效的主要問題。單純球囊擴張術(shù)由于早期血管彈性回縮及晚 期血管內(nèi)膜過度增殖、血管再重塑，使得術(shù)后再狹窄率高達30% 50%。冠狀動脈 內(nèi)支架術(shù)能降低術(shù)后即刻殘余狹窄并有效限制血管彈性回縮和動脈再塑型，使得 PCI術(shù)后的再狹窄率明顯下降。但由于支架植入術(shù)后依然存在血管內(nèi)膜增殖，再狹 窄仍達20% 30%。藥物洗脫支架(DES)通過抑制炎癥反應(yīng)和細胞增殖、延緩血 管內(nèi)皮化，使PCI術(shù)后的再狹窄率降至l(P/。以內(nèi)。但近期公布的隨機試驗結(jié)果認為，DES有增加遠期非心性死亡和晚期血栓所致的心源性死亡和(或)心肌梗死的風險
(Pfisterer M, Brunner-La Rocca HP, Buser PT, Rickenbacher P, Hunziker P, Mueller C， Jeger R, Bader F, Osswald S, Kaiser C; BASKET-LATE Investigators. Late clinical events after clopidogrel discontinuation may limit the benefit of drug-eluting stents: an observational study of drug-eluting versus bare-metal stents. J Am Coll Cardiol. 2006 Decl9;48(12):2584-91)。因此，發(fā)掘更為特異的抑制血管平滑肌細胞(VSMC)增殖、 遷移和血管內(nèi)膜增生的藥物，是防治血管成形術(shù)后再狹窄的新策略。
血管平滑肌細胞的遷移和增殖是造成血管成型術(shù)后再狹窄的主要原因。血管平 滑肌細胞向血管內(nèi)膜下遷移的一個重要前提是細胞外基質(zhì)成分的降解，而這個過程 是由降解基質(zhì)的各種蛋白酶所介導(dǎo)的(Sluijter JP, de KleijnDP, Pasterkamp G. Vascular remodeling and protease inhibition—bench to bedside. Cardiovasc Res. 2006;69:595-603.)。其中，金屬蛋白酶由于在中性pH條件下起作用，其成員可以共 同降解幾乎所有的細胞外基質(zhì)等特性而受到人們的重視，尤其是基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMP)。理論上講，抑制金屬蛋白酶的活性，阻礙血管基質(zhì)的降解，就可以抑制 平滑肌細胞的遷移和增殖，從而達到預(yù)防和治療再狹窄的目的。從上世紀六十年代 以來，共有近50種MMP的廣譜抑制劑被研發(fā)，但能通過臨床試驗的寥寥無幾，而真 正被美國藥品食物管理局批準的只有一種。其原因主要是由于金屬蛋白酶家族種類 繁多，各組分起到的作用可能不同，甚至相反，因此尋找特異的金屬蛋白酶的抑制 劑才是真正有效可行的策略。
在這個前提下，近年來，單個金屬蛋白酶的功能被重新深入評價。ADAMTS-7 (a disintegrin-like and metalloprotease-7，含I型血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣 金屬蛋白酶)是2004年被克隆的一種新型金屬蛋白酶，屬于Zi^+依賴的金屬蛋白酶 家族。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種抑制血管內(nèi)膜增生的小分子干擾RNA。 本發(fā)明所提供的小分子干擾RNA，名稱為ADAMTS-7 siRNA，它的正義鏈的核
苷酸序列如序列表中序列1所示，反義鏈的核苷酸序列如序列表中序列2所示。 編碼ADAMTS-7siRNA的shRNA也屬于本發(fā)明的保護范圍。另夕卜，含有
ADAMTS-7 siRNA的編碼shRNA的表達盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌也屬
于本發(fā)明的保護范圍。試驗證明，ADAMTS-7siRNA可抑制血管內(nèi)膜增生。因此，本發(fā)明的另一個目 的是提供一種抑制血管內(nèi)膜增生的藥物。
本發(fā)明所提供的抑制血管內(nèi)膜增生的藥物，它的活性成分是下述l)和2)兩 種物質(zhì)中的至少一種
1) ADAMTS-7 siRNA;
2) 含有ADAMTS-7 siRNA的編碼shRNA的重組表達載體。 為了提高所述藥物的療效，所述藥物中還含有輔料，如普流尼羅膠(Pluronic
gel)。
需要的時候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學上可接受的載體。所述 載體包括藥學領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸 收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等。
本發(fā)明的藥物可以制成注射液、膏劑、霜劑等多種形式。上述各種劑型的藥物 均可以按照藥學領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
所述藥物可通過注射、噴射、滴鼻、滴眼、滲透、吸收、物理或化學介導(dǎo)的方 法導(dǎo)入機體如肌肉、皮內(nèi)、皮下、靜脈、粘膜組織；或是被其他物質(zhì)混合或包裹后 導(dǎo)入機體。
實驗證明，將上述抑制血管內(nèi)膜增生的藥物制成膏劑，直接涂抹于血管外膜， 可持續(xù)顯著抑制血管內(nèi)膜增生，可用于治療血管成形術(shù)后再狹窄。


圖1為ADAMTS-7 siRNA對原代培養(yǎng)的平滑肌細胞中ADAMTS-7的抑制 A為ADAMTS-7基因的表達水平 B為ADAMTS-7蛋白的表達水平
圖2為ADAMTS-7 siRNA抑制原代培養(yǎng)的平滑肌細胞遷移
圖3為ADAMTS-7 siRNA抑制大鼠頸動脈拉傷后血管內(nèi)ADAMTS-7蛋白的水
平
圖4為組織學染色鑒定球囊拉傷大鼠和對照組大鼠的血管內(nèi)膜增生情況和 ADAMTS-7的表達
N為內(nèi)膜，M為中膜，A為外膜
圖5為ADAMTS-7 siRNA抑制大鼠頸動脈拉傷后血管內(nèi)膜的增生
圖6為ADAMTS-7 siRNA抑制大鼠頸動脈拉傷后血管內(nèi)膜增生的統(tǒng)計結(jié)果
具體實施例方式
實施例1、 ADAMTS-7 siRNA對原代培養(yǎng)的平滑肌細胞中ADAMTS-7的抑制 首先設(shè)計合成了 ADAMTS-7特異的小分子干擾RNA。具體方法如下根據(jù)大 鼠ADAMTS-7序列(GenBank Accession Number NM—001047101)由Invitrogen公 司Blcok-iTrM RNAi Designer軟件設(shè)計ADAMTS-7 siRNA序列ADAMTS-7 siRNA 的正義鏈為5' -UAAUAAGGCGCACAACGGUGAUGUG-3'(序列表中序列1)， ADAMTS-7 siRNA的反義鏈為5' -UAAUAAGGCGCACAACGGUGAUGUG-3' (序列表中序列2)。合成上述序列的ADAMTS-7 siRNA。
將50nmol/L ADAMTS-7 siRNA用Oligofectamine (購自Invitrogen公司，CA)轉(zhuǎn) 染至原代培養(yǎng)的大鼠主動脈平滑肌細胞(原代大鼠主動脈平滑肌細胞采用常規(guī)組織 貼塊法制備)中，48小時后提取細胞的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA并以其為模板，以 5' -GCAACGCTATTGATGAGGAAGACC-3'禾B5' -TTGGGAAGGGCAGGTGAT GTAGGA-3'為引物，實時定量PCR擴增ADAMTS-7基因。以大鼠的P-actin基 因作為內(nèi)參，擴增e-actin基因的正義鏈為
5' -GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3'，反義鏈為5' -TCGGGGCATCGGAAC CGCTCA-3'。同時以O(shè)ligofectamine轉(zhuǎn)染的原代培養(yǎng)的平滑肌細胞及轉(zhuǎn)染scramble siRNA (購自Invitrogen公司，Stealth RNAi duplex Cat. No. 12935)的原代培養(yǎng)的 平滑肌細胞作為對照。設(shè)定Oligofectamine轉(zhuǎn)染的原代培養(yǎng)的平滑肌細胞的mRNA 水平為1，轉(zhuǎn)染scramble siRNA的原代培養(yǎng)的平滑肌細胞和轉(zhuǎn)染ADAMTS-7 siRNA 的原代培養(yǎng)的平滑肌細胞與之相比。實驗設(shè)三次重復(fù)，每種處理設(shè)重復(fù)孔。結(jié)果如 圖1A (N-3,尸〈0.05)所示。其中，Vehicle為Oligofectamine轉(zhuǎn)染的原代培養(yǎng)的平 滑肌細胞，siRNA scramble為轉(zhuǎn)染scramble siRNA的原代培養(yǎng)的平滑肌細胞，siRNA ADAMTS-7為轉(zhuǎn)染的ADAMTS-7 siRNA的原代培養(yǎng)的平滑肌細胞。結(jié)果表明，轉(zhuǎn) 染ADAMTS-7 siRNA的原代培養(yǎng)的平滑肌細胞中ADAMTS-7的mRNA水平顯著 被抑制(50%)。圖IA中的數(shù)據(jù)為平均值土標準差。
用抗ADAMTS-7特異性抗體(購自AbCAM, Cambridge公司，UK)做免疫印 跡實驗，結(jié)果如圖1B所示。其中，Vehicle為Oligofectamine轉(zhuǎn)染的原代培養(yǎng)的平 滑肌細胞，siRNA scramble為轉(zhuǎn)染scramble siRNA的原代培養(yǎng)的平滑肌細胞，siRNA ADAMTS-7為轉(zhuǎn)染ADAMTS-7 siRNA的原代培養(yǎng)的平滑肌細胞，以J3-actin作為參 照。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染ADAMTS-7 siRNA的原代培養(yǎng)的平滑肌細胞中ADAMTS-7蛋白水平也明顯降低。
實施例2、 ADAMTS-7 siRNA抑制原代培養(yǎng)的平滑肌細胞遷移
利用經(jīng)典的離體平滑肌細胞劃痕實驗?zāi)M血管損傷，以證明ADAMTS-7 siRNA 可以抑制平滑肌細胞的遷移，具體實驗如下
將50nmol/L上述實施例1構(gòu)建的ADAMTS-7 siRNA用Oligofectamine (購自 Invitrogen公司,CA)轉(zhuǎn)染至原代培養(yǎng)的小鼠平滑肌細胞中，同時以O(shè)ligofectamine轉(zhuǎn) 染的原代培養(yǎng)的平滑肌細胞及轉(zhuǎn)染scramble siRNA的原代培養(yǎng)的平滑肌細胞作為 對照。48小時后劃痕，劃痕6小時后觀察、照相，比較細胞遷移的相對距離。實驗 設(shè)三次重復(fù)。各組細胞遷移的圖像如圖2A (N二3,尸〈0.05)所示。設(shè)定Oligofectamine 轉(zhuǎn)染的原代培養(yǎng)的平滑肌細胞的遷移距離為1，轉(zhuǎn)染scramble siRNA的原代培養(yǎng)的 平滑肌細胞和轉(zhuǎn)染ADAMTS-7 siRNA的原代培養(yǎng)的平滑肌細胞的遷移距離與之相 比。結(jié)果如圖2B所示。其中，Vehicle為Oligofectamine轉(zhuǎn)染的原代培養(yǎng)的平滑肌 細胞，siRNA scramble為轉(zhuǎn)染scramble siRNA的原代培養(yǎng)的平滑肌細胞，siRNA ADAMTS-7為轉(zhuǎn)染ADAMTS-7 siRNA的原代培養(yǎng)的平滑肌細胞的。結(jié)果表明，轉(zhuǎn) 染ADAMTS-7 siRNA的原代培養(yǎng)的平滑肌細胞比Oligofectamine轉(zhuǎn)染的原代培養(yǎng)的 平滑肌細胞及轉(zhuǎn)染scramble siRNA的原代培養(yǎng)的平滑肌細胞均明顯緩慢(50%)。 圖2A中的數(shù)據(jù)為平均值土標準差。
實施例3、 ADAMTS-7 siRNA抑制大鼠頸動脈拉傷后血管內(nèi)ADAMTS-7蛋白 的水平
1、大鼠球囊拉傷模型的建立
200-220克雄性Sprague-Dawley大鼠，腹腔注射水合氯醛(300mg/kg)。 1.5mm 球囊(Medtronic, Minneapolis,,)從左側(cè)頸外動脈插入頸總動脈，并向胸主動脈 方向前進4cm,球囊充氣后(0.5大氣壓)旋轉(zhuǎn)拉回至頸總動脈分叉處，該過程重復(fù) 3次，保證內(nèi)皮去除的完整，對側(cè)血管進行類似組織分離。同時用沒有球囊拉傷的 大鼠(以Sham表示)作為對照。
分別在造模7天和14天后固定取頸總動脈，組織學染色鑒定。結(jié)果如圖4所 示。其中，Sham表示對照組大鼠，Injury表示球囊拉傷模型組大鼠。H.E.為HE染 色結(jié)果，ADAMTS-7Ab為以抗ADAMTS-7特異性抗體進行免疫組化染色的結(jié)果， IgG為以辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體(Rockland Inc. Gilbertsville, PA) 為一抗進行免疫組化染色的結(jié)果。結(jié)果表明，造模7天后，球囊拉傷模型組大鼠的血管內(nèi)膜有輕度增生，14天時更為明顯。利用ADAMTS-7特異性抗體(購自AbCAM, Cambridge公司，UK)對造模7天后的6只球囊拉傷模型組大鼠的頸總動脈進行免 疫組化鑒定，結(jié)果表明，ADAMTS-7在新生內(nèi)膜處高表達。
2、 ADAMTS-7 siRNA抑制大鼠頸動脈拉傷后血管內(nèi)ADAMTS-7蛋白的水平 將15嗎上述實施例1構(gòu)建的ADAMTS-7 siRNA與200^1 30%普流尼羅膠
(Pluronicgel， Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 4。C下混勻，迅速均勻涂在上述步驟 1的球囊拉傷模型大鼠的血管外膜表面，對照組用scramble siRNA與200|il 30% Pluronicgel的混合物涂抹。隨即縫合傷口， 7天后，取損傷血管，分離周圍組織， 利用ADAMTS-7特異性抗體(購自AbCAM， Cambridge公司，UK)進行免疫印跡 測定ADAMTS-7蛋白水平，每組測定5只大鼠。結(jié)果如圖3A和圖3B所示。其中， Sham為沒有球囊拉傷的大鼠，siRNA scramble為涂抹scramble siRNA的球囊拉傷 大鼠，siRNA ADAMTS-7為涂抹ADAMTS-7 siRNA的球囊拉傷大鼠，以13-actin作 為參照。結(jié)果表明，涂抹ADAMTS-7 siRNA的球囊拉傷大鼠損傷部位ADAMTS-7 的表達在7天后比涂抹scramble siRNA的球囊拉傷大鼠顯著減少。圖3 B中的數(shù)據(jù) 為平均值土標準差。免疫印跡的定量以O(shè)dyssey紅外熒光掃描系統(tǒng)分析(LI-COR Biosciences, Lincoln, NE)。圖3 B中，以沒有球囊拉傷的大鼠ADAMTS-7的蛋白水 平為1。
3、 ADAMTS-7 siRNA抑制大鼠頸動脈拉傷后血管內(nèi)膜的增生
分別在用scramble siRNA和ADAMTS-7 siRNA涂抹球囊拉傷大鼠后的第0天、 第7天、第10天和第14天取頸總動脈，切片，組織學染色鑒定上述兩組大鼠血管 內(nèi)膜的增生情況。結(jié)果如圖5所示。其中，siRNA scramble為涂抹scramble siRNA 的球囊拉傷大鼠，siRNA ADAMTS-7為涂抹ADAMTS-7 siRNA的球囊拉傷大鼠。 結(jié)果表明，涂抹ADAMTS-7 siRNA的球囊拉傷大鼠血管內(nèi)膜的增生情況比涂抹 scramble siRNA的球囊拉傷大鼠明顯減輕，ADAMTS-7 siRNA顯著抑制大鼠頸動脈 拉傷后血管內(nèi)膜的增生，但對中膜和外膜沒有影響。
分別測定涂抹scramble siRNA的球囊拉傷大鼠和涂抹ADAMTS-7 siRNA的球 囊拉傷大鼠的血管內(nèi)膜面積、中膜面積和血管外膜周徑，計算內(nèi)膜和中膜面積的比 率。其中，第7天的兩組每組測定8只大鼠，第10天的兩組每組測定12只大鼠， 第14天的兩組每組測定7只大鼠。結(jié)果如圖6所示。尸O.05。其中，A為涂抹scramble siRNA的球囊拉傷大鼠和涂抹ADAMTS-7 siRNA的球囊拉傷大鼠的血管內(nèi)膜面積，B為涂抹scramble siRNA的球囊拉傷大鼠和涂抹的ADAMTS-7 siRNA的球囊拉傷 大鼠的血管中膜面積，C為血管內(nèi)膜面積和血管中膜面積的比率，D為涂抹scramble siRNA的球囊拉傷大鼠和涂抹ADAMTS-7 siRNA的球囊拉傷大鼠的外膜彈力板周 徑。
結(jié)果表明，球囊拉傷大鼠在分別涂抹scramble siRNA和ADAMTS-7 siRNA7天 后，涂抹的ADAMTS-7 siRNA的球囊拉傷大鼠的血管新生內(nèi)膜面積比涂抹scramble siRNA的球囊拉傷大鼠的血管新生內(nèi)膜面積減少70% (涂抹ADAMTS-7 siRNA的球 囊拉傷大鼠的血管新生內(nèi)膜面積為1.00士0.48X 104 pm2，涂抹scramble siRNA的球 囊拉傷大鼠的血管新生內(nèi)膜面積為3.52士1.17X10、m、r^8;尸O.05)。 10天后，涂 抹的ADAMTS-7 siRNA的球囊拉傷大鼠的血管新生內(nèi)膜面積比涂抹scramble siRNA的球囊拉傷大鼠的血管新生內(nèi)膜面積減少50% (涂抹ADAMTS-7 siRNA的球 囊拉傷大鼠的血管新生內(nèi)膜面積為3.37±0.90X 104 pm2，涂抹scramble siRNA的球 囊拉傷大鼠的血管新生內(nèi)膜面積為7.81±1.44X104 ^im2;n=12;JP<0.05;)。 14天后， 涂抹的ADAMTS-7 siRNA的球囊拉傷大鼠的血管新生內(nèi)膜面積比涂抹scramble siRNA的球囊拉傷大鼠的血管新生內(nèi)膜面積仍然減少50% (涂抹ADAMTS-7 siRNA的球囊拉傷大鼠的血管新生內(nèi)膜面積為6.47±2.30X 104 pm2，涂抹scramble siRNA的球囊拉傷大鼠的血管新生內(nèi)膜面積為12.95± 1.39 X 104 pm2; !1=7;尸<0.05)。 但涂抹ADAMTS-7 siRNA和涂抹scramble siRNA的球囊拉傷大鼠的血管中膜面積 和血管外膜周徑?jīng)]有區(qū)別。圖6中的數(shù)據(jù)為平均值士標準差。序列表
〈160〉 2
<210〉 1
<211〉 25
<212> RNA 〈213〉人工序列
〈400〉 1
uaauaaggcg cacaacggug augug 25
<210〉 2
<211〉 25
〈212〉 RNA 〈213>人工序列
<400〉 2
uaeiuaaggcg cacaacggug augug 2權(quán)利要求
1、一種小分子干擾RNA，所述小分子干擾RNA的正義鏈的核苷酸序列如序列表中序列1所示，所述小分子干擾RNA的反義鏈的核苷酸序列如序列表中序列2所示。
2、 編碼權(quán)利要求1所述的小分子干擾RNA的shRNA。
3、 含有權(quán)利要求2所述的shRNA的表達盒、重組表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系或 重組菌。
4、 一種抑制血管內(nèi)膜增生的藥物，它的活性成分是下述l)和2)兩種物質(zhì)中 的至少一種1) 權(quán)利要求1所述的小分子干擾RNA;2) 含有權(quán)利要求1所述的小分子干擾RNA的編碼shRNA的重組表達載體。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的抑制血管內(nèi)膜增生的藥物，其特征在于所述藥物 中還含有輔料，所述輔料為普流尼羅膠。
6、 一種抑制血管內(nèi)膜增生的藥物，它的活性成分是含有權(quán)利要求3所述的 shRNA的重組表達載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抑制血管內(nèi)膜增生的小干擾RNA。所述小干擾RNA的正義鏈的核苷酸序列如序列表中序列1所示，所述小干擾RNA的反義鏈的核苷酸序列如序列表中序列2所示。將上述抑制血管內(nèi)膜增生的小干擾RNA直接涂抹于血管外膜，可持續(xù)顯著抑制血管內(nèi)膜增生，用于治療血管成形術(shù)后再狹窄。
文檔編號A61K47/34GK101294158SQ200810114529
公開日2008年10月29日 申請日期2008年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月6日
發(fā)明者煒 孔, 利 王, 憲 王 申請人:北京大學