專利名稱：：脊髓灰質(zhì)炎疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種脊髓灰質(zhì)炎疫苗。
背景技術(shù)：
：接種脊髓灰質(zhì)炎疫苗是預(yù)防脊髓灰質(zhì)炎病毒感染的最主要途徑。通過使用口服減毒脊髓灰質(zhì)炎疫苗，我國已經(jīng)完全消滅了野生型病毒導(dǎo)致的脊髓灰質(zhì)炎，但是仍存在疫苗株變異引起的疫苗相關(guān)病例。滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗是一個包括脊髓灰質(zhì)炎病毒血清型i型、n型和m型的三價疫苗。由于我國已經(jīng)沒有野毒株流行，所以只能使用免疫原性較弱的Sabin減毒株來研制滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗。這種滅活疫苗的免疫效果差，產(chǎn)量低，價格昂貴，因此不可能作為計劃免疫疫苗在全國范圍內(nèi)大規(guī)模使用。目前發(fā)達(dá)國家均使用以野毒株為毒種生產(chǎn)的滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗。通過這一疫苗已消滅了野生型病毒導(dǎo)致的脊髓灰質(zhì)炎，而且也不存在減毒疫苗引起的疫苗相關(guān)病例。但是這一疫苗價格更為昂貴，無法在我國以及其它發(fā)展中國家和不發(fā)達(dá)國家大規(guī)模使用。因此，為了在全球范圍內(nèi)徹底消滅脊髓灰質(zhì)炎病毒，有必要研制一種高效低價的新型滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗。專利文獻(xiàn)1WO2006063152A2公開了一種提高TLR8介導(dǎo)的生物活性的免疫刺激組合物，該免疫刺激組合物包含胺類化合物和寡核苷酸，并且該組合物可以作為佐劑聯(lián)合活性病毒、細(xì)菌、滅活病毒等材料用于預(yù)防肝炎、脊髓灰質(zhì)炎等疾病。該專利文獻(xiàn)并未給出僅僅使用寡核苷酸作為佐劑可以聯(lián)合活性病毒、細(xì)菌、滅活病毒等材料用于預(yù)防肝炎、脊髓灰質(zhì)炎等疾病的技術(shù)啟示，而且其中的免疫刺激組合物是提高TLR8介導(dǎo)的生物活性，對于TLR9介導(dǎo)或其它途徑介導(dǎo)的生物活性是否有影響在該專利文獻(xiàn)中并未提及。專利文獻(xiàn)2CN1637013A公開了一種具有改善的免疫調(diào)節(jié)功能的經(jīng)修飾的CpG寡聚脫氧核苷酸，其是在ODN的3'-末端偶聯(lián)連續(xù)的胸腺嘧啶脫氧核糖核苷(dT)序列。專利文獻(xiàn)3CN1781930A公開了一種佐劑，該佐劑至少包含一個含CpG二核苷酸的單鏈脫氧核苷酸，該佐劑與乙型肝炎病毒疫苗聯(lián)合應(yīng)用時，能夠顯著增強(qiáng)乙型肝炎病毒疫苗的免疫效果。文獻(xiàn)《中華醫(yī)學(xué)雜志》第82巻第8期中綜述了CpG寡脫氧核苷酸作為人用疫苗佐劑的初步研究。但是這些文獻(xiàn)均未涉及滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒作為抗原單獨與含有至少一個非甲基化CpG二核苷酸的寡聚脫氧核苷酸(所述寡聚脫氧核苷酸的長度為15-35個核苷酸)的第一佐劑的聯(lián)合作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是要提供一種新型滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗，具體地說，本發(fā)明提供一種提高疫苗的免疫效果、降低疫苗抗原的用量并降低疫苗成本的滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗。為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供一種脊髓灰質(zhì)炎疫苗，其包含滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒和第一佐劑，該第一佐劑為含有至少一個非甲基化CpG二核苷酸的寡聚脫氧核苷酸，其化學(xué)本質(zhì)為人工合成的含有CpG二核苷酸的寡聚脫氧核苷酸(簡稱CpG-ODN)，該寡聚脫氧核苷酸的長度為15-35個核苷酸，優(yōu)選為20-30個核苷酸，更優(yōu)選為20-25個核苷酸。在本發(fā)明的一個實施方案中，每劑疫苗中優(yōu)選包含滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒O.l|ig~lmg，并包含第一佐劑10|ig10mg。根據(jù)本發(fā)明，更優(yōu)選的是，每劑疫苗中包含第一佐劑100|ig~lmg。根據(jù)本發(fā)明，所述寡聚脫氧核苷酸其序列中優(yōu)選具有兩個或兩個以上拷貝的5，-NTCGTT-3'基元，且其長度為1535個核苷酸，其中所述CpG是非甲基化的，并且所述N不代表A或G。更優(yōu)選的是，所述寡聚脫氧核苷酸序列中5'-末端為T，其后為3~8個，優(yōu)選5~7個CGTT串聯(lián)重復(fù)的寡聚脫氧核苷酸。本發(fā)明的另一個實施方案為TCGTT串聯(lián)重復(fù)38次，優(yōu)選57次的寡聚脫氧核苷酸。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述CpG-ODN的核苷酸序列優(yōu)選為5'-TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3'57-TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3'5'-TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3'5'-TCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3'5，-TCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3'5'-TCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3'。更優(yōu)選為5'-TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3'。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述寡聚脫氧核苷酸優(yōu)選是硫代修飾的。其中所述硫代寡聚脫氧核苷酸的制備方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，例如可以采用固相亞磷酰胺三酯法化學(xué)合成。在本發(fā)明的另一個實施方案中，該疫苗優(yōu)選還包含第二佐劑，該第二佐劑為氫氧化鋁、磷酸鋁、無定型鋁或其它任何適用于人用疫苗的佐劑。此處示例性的佐劑僅僅是為了說明本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制，任何適用于人用疫苗的佐劑都適用于本發(fā)明。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述脊髓灰質(zhì)炎病毒優(yōu)選為血清型I型(SabinI型)、II型(SabinII型)、III型(SabinIII型)毒株或其組合。這些病毒是現(xiàn)有技術(shù)中所公知的，目前世界上的脊髓灰質(zhì)炎病毒主要由WHO負(fù)責(zé)制備并發(fā)放給各個國家和各衛(wèi)生組織。例如WHO就負(fù)責(zé)提供SabinI型、SabinII型、SabinIII型脊髓灰質(zhì)炎病毒。中國使用的SabinI型、SabinII型、SabinIII型脊髓灰質(zhì)炎病毒基本上是由WHO提供的。本申請人申請的另一篇專利CN1647822A中就公開了一種使用由WHO提供的SabinI型、SabinII型、SabinIII型脊髓灰質(zhì)炎病毒制備的脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗及其制備方法。在本發(fā)明的實施方案中所使用的SabinI型、SabinII型、SabinIII型脊髓灰質(zhì)炎病毒也是由WHO提供的。在本發(fā)明中，滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，例如可以通過下述步驟滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒將脊髓灰質(zhì)炎病毒接種于Vero細(xì)胞(例如非洲綠猴腎細(xì)胞)培養(yǎng)體系中以收獲病毒原液，將病毒原液超濾濃縮并通過超速離心法或者柱層析法進(jìn)行純化，最后使用滅活劑(例如福爾馬林)滅活。此處該方法僅僅是為了示例性地說明本發(fā)明，如果需要，也可采用其它合適的細(xì)胞、滅活劑等進(jìn)行代替?？蛇x擇地，其它任何可以滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒的方法也適用于本發(fā)明。滅活的脊髓灰質(zhì)炎疫苗的制備方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在實際使用中，一種簡便的方法為直接將上述滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗抗原與本發(fā)明所述的第一佐劑混合，制得本發(fā)明所述滅活的脊髓灰質(zhì)炎疫苗°本發(fā)明所述的滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗的劑型和配伍按照藥學(xué)領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)來確定。例如本發(fā)明所述的滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗可以制成注射液、凍干粉針等。另外，本發(fā)明所述的滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗可以是無防腐劑疫苗?？扇芜x地，所述滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗也可以包含防腐劑，例如硫柳汞、2-苯氧乙醇、苯甲醇等。這些示例性的防腐劑僅僅是為了說明本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制，任何適用于人用疫苗的防腐劑都適用于本發(fā)明。另外，本發(fā)明所述的滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗可通過皮內(nèi)注射、皮下注射、肌肉注射接種或者通過粘膜途徑接種。在進(jìn)行免疫接種時，需要考慮接種者的年齡、給藥途徑等多種因素。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，每劑疫苗中包含所述滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒0.1nglmg，所述第一佐劑10|ug~10mg，更優(yōu)選包含所述第一佐劑100ng~lmg。通常接種一至三針。本發(fā)明中用于增強(qiáng)滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗免疫效果的佐劑是一種具有良好潛在應(yīng)用前景的新型人用疫苗佐劑，這種佐劑通過免疫細(xì)胞上的受體TLR9激活免疫系統(tǒng)，從而增強(qiáng)針對疫苗抗原的特異性免疫應(yīng)答。通過向疫苗中加入本發(fā)明所述的疫苗佐劑，可以提高疫苗的免疫效果，從而降低疫苗抗原的用量，最終降低疫苗成本。圖la為示出CpG-ODN能夠增強(qiáng)小鼠對SabinII型滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗的免疫應(yīng)答的圖，該圖示出的是SabinII型脊髓灰質(zhì)炎病毒特異性IgG抗體滴度。圖lb為示出CpG-ODN能夠增強(qiáng)小鼠對SabinII型滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗的免疫應(yīng)答的圖，該圖示出的是SabinII型脊髓灰質(zhì)炎病毒特異性中和抗體滴度。圖2a為示出CpG-ODN能夠降低SabinII型滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗的抗原用量的圖，該圖示出的是SabinII型脊髓灰質(zhì)炎病毒特異性IgG抗體滴度。圖2b為示出CpG-ODN能夠降低SabinII型滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗的抗原用量的圖，該圖示出的是SabinII型脊髓灰質(zhì)炎病毒特異性中和抗體滴度。圖3為示出不同CpG-ODN能夠增強(qiáng)小鼠對SabinII型滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗的免疫應(yīng)答的圖，該圖示出的是SabinII型脊髓灰質(zhì)炎病毒特異性IgG抗體滴度。圖4為示出CpG-ODN能夠增強(qiáng)小鼠對SabinI型滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗的免疫應(yīng)答的圖，該圖示出的是SabinI型脊髓灰質(zhì)炎病毒特異性中和抗體滴度。圖5為示出CpG-ODN能夠增強(qiáng)小鼠對SabinIII型滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗的免疫應(yīng)答的圖，該圖示出的是SabinIII型脊髓灰質(zhì)炎病毒特異性中和抗體滴度。具體實施例方式以下結(jié)合附圖通過具體實施方式的描述對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但這并非是對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進(jìn)，但是只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。實施例1.滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒的制備細(xì)胞采用非洲綠猴腎傳代細(xì)胞系(Vero細(xì)胞系)。該細(xì)胞由日本學(xué)者于1963年從非洲綠猴腎中分離得到。第112代被送至美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，經(jīng)過鑒定，該細(xì)胞無致腫瘤性，無細(xì)菌、霉菌和支原體污染，無病毒污染，適于用來生產(chǎn)生物制品。北京生物制品研究所于1988年12月從美國ATCC獲得117代Vero細(xì)胞(編號為CCL81)二方瓶，立即作為原始種子凍存于液態(tài)氮中。從一支原始種子傳代擴(kuò)增制備了主細(xì)胞庫，一支主種子庫細(xì)胞傳代擴(kuò)增又制備了工作細(xì)胞庫。主細(xì)胞庫和工作細(xì)胞庫的檢定都符合世界衛(wèi)生組織(WHO)關(guān)于動物細(xì)胞制備生物制品規(guī)程《Recommendationsfortheuseofanimalcellsasinvitrosubstratesfortheproductionofbiologicals》的要求。病毒SabinI型、SabinII型、SabinIII型病毒均由WHO制備并提供。用以上病毒經(jīng)Vero細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增一代，建立了工作種子批的毒種。工作種子批的毒種通過了中國藥品生物制品檢定所的復(fù)核檢定。細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)蘇工作庫細(xì)胞，將一支安瓶的細(xì)胞復(fù)蘇并擴(kuò)增到一個15L的轉(zhuǎn)瓶中，培養(yǎng)4至6天后，按照1:6的分種比例傳出6個轉(zhuǎn)瓶，如此傳代擴(kuò)增至50至200個15L的轉(zhuǎn)瓶。培養(yǎng)方式可在15升的轉(zhuǎn)瓶中進(jìn)行，培養(yǎng)液為含5%小牛血清的199培養(yǎng)基(可購自上海卓康生物科技有限公司)，培養(yǎng)溫度為37。C。病毒接種細(xì)胞培養(yǎng)三至五天后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)上清，接種I、II、III型病毒的工作種子批病毒。病毒接種量為0.1MOI，培養(yǎng)溫度為3336。C，培養(yǎng)時間為72~120小時。病毒維持液為含人血清白蛋白0.1。/。的MEM培養(yǎng)基(可購自上海麥莎生物科技有限公司)。病毒收獲當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時，收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清。澄清過濾用1.20.22微米的濾器過濾全部收獲的上清。病毒液濃縮用截留分子量為300KD的超濾膜超濾濃縮病毒液，濃縮倍數(shù)為20-50倍。凝膠過濾純化用pH6.5-7.5的PBS溶液平衡的Sepharose6FF介質(zhì)進(jìn)行純化病毒液，收集外水體積。通過凝膠過濾純化，雜蛋白去除率可達(dá)95%以上。離子交換層析將凝膠過濾純化后的病毒液進(jìn)行離子交換層析。介質(zhì)采用DEAE-SepharoseFFTM(弱陰離子交換介質(zhì))，平衡液為pH6.5-7.5、含有0.05-0.15M氯化鈉的PBS溶液，洗脫液為pH6.5-7.5、含有0.2-0.5M氯化鈉的PBS溶液。滅活將層析后的病毒液用0.22微米濾膜過濾。加入l:4000(甲醛pH7.0的PBS溶液)的甲醛溶液，置于336。C下滅活12天。實施例2CpG-ODN能夠增強(qiáng)小鼠對SabinII型滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗的免疫應(yīng)答本實施例中使用的滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒是按照實施例1所述的方法制備的，下文中簡稱為Ag。本實施例中所使用的CpG-ODN由本發(fā)明人設(shè)計，序列如下5'-TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3'，委托上海生工生物技術(shù)公司人工合成，并進(jìn)行全鏈硫代修飾，聚丙烯酰胺凝膠電泳純化，溶于生理鹽水，-20匸冰箱中保存?zhèn)溆?。本實施例中所使用的小鼠為Balb/c小鼠，雌性，68周，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。將Balb/e小鼠分為四組，分別為"Ag組"、"Ag+Al組"、"Ag+CpG組"和"Ag+Al+CpG組"，每組小鼠8只，每只小鼠經(jīng)左后肢腓腸肌注射試液100pl進(jìn)行免疫。各組所使用的試液如表1所示。其中，Al(OH)3溶液是通過下述方法制備的取5%硫酸鋁溶液250ml，在強(qiáng)烈攪拌下加入5%氫氧化鈉溶液100ml，用生理鹽水離心洗滌沉淀2次，然后使其懸浮于生理鹽水中使體積達(dá)250ml。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>免疫后第4周采血，分離出血清，并按照如下方法測定SabinII型脊髓灰質(zhì)炎病毒特異性IgG抗體滴度和中和抗體滴度。IgG抗體滴度的測定方法使用SabinII型滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒包被96孔酶標(biāo)板，每孔200ng，4T過夜；使用PBS溶液(pH7.0)洗板3次后，在37"C下使用1%的牛血清白蛋白PBS溶液(pH7.0)封閉l小時；使用PBS溶液(pH7.0)對上述待檢血清進(jìn)行2倍系列稀釋，在使用PBS溶液(pH7.0)洗板3次后加入稀釋后的血清，37°C下作用l小時；使用PBS溶液(pH7.0)洗板3次后加入1:10000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(購自美國SIGMA公司)，每孔100pl，37T作用1小時；使用PBS溶液(pH7.0)洗板3次后使用鄰苯二胺(OPD)顯色，2M硫酸終止反應(yīng)，使用分光光度計測定4卯nm處吸光度值OD490并確定終點滴度(臨界值設(shè)為O.IO)。結(jié)果見圖la。特異性中和抗體滴度的測定方法將每組8只小鼠的血清等量量取出并混合均勻，使用0.22nm濾器除菌過濾；在96孔細(xì)胞板上用RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液(可購自美國Gibco公司)從1:10開始將血清進(jìn)行2倍系列稀釋，每個稀釋度做8個孔。稀釋完成后，在每個孔中均加入100TCIDso的SabinII型脊髓灰質(zhì)炎病毒，室溫放置1小時；每孔加入"104個Hep2細(xì)胞；37。C培養(yǎng)8天后記錄細(xì)胞病變孔數(shù)，并根據(jù)Reed-Muench法(參見文獻(xiàn)ReedL&MuenchH.Asimplemethodofestimating50percentend-points.Am.J.Hyg.,1938，27:第493頁)計算特異性中和抗體滴度。結(jié)果見圖lb。圖la所示結(jié)果為免疫后第4周SabinII型脊髓灰質(zhì)炎病毒特異性IgG抗體滴度。與不使用佐劑的"Ag組"相比，"Ag+CpG組"與"Ag+Al組"均能夠使特異性抗體滴度增加3倍左右。Al(OH)3與CpG-ODN聯(lián)合使用具有最強(qiáng)的疫苗佐劑活性，可使特異性抗體滴度增加IO倍以上。圖lb所示結(jié)果為免疫后第4周SabinII型脊髓灰質(zhì)炎病毒特異性中和抗體滴度。與不使用佐劑的"Ag組"相比，"Ag+CpG組"與"Ag+Al組"均能夠使特異性中和抗體滴度增加2-3倍左右。Al(OH)3與CpG-ODN聯(lián)合使用具有最強(qiáng)的疫苗佐劑活性，可使特異性中和抗體滴度增加6倍左右。上述結(jié)果表明(1)CpG-ODN能夠增強(qiáng)小鼠對SabinII型滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗的免疫應(yīng)答；(2)CpG-ODN作為SabinII型滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗的佐劑，既可單獨使用，也可與其它疫苗佐劑如Al(OH)3聯(lián)合使用。實施例3.CpG-ODN能夠降低SabinII型滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗的抗原用量按照與實施例2相同的方法對Balb/c小鼠進(jìn)行免疫，進(jìn)而檢測特異性IgG抗體滴度和中和抗體滴度，以測定CpG-ODN對SabinII型滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗的抗原用量的影響，不同之處在于滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗的抗原用量分別為原倍劑量(10pg的Ag/小鼠)、四分之一劑量(2.5pg的Ag/小鼠)和十六分之一劑量(0.625pg的Ag/小鼠)。結(jié)果分別見圖2a和2b。圖2a所示結(jié)果為免疫后第4周SabinII型脊髓灰質(zhì)炎病毒特異性IgG抗體滴度。由圖2a可見，"Ag+CpG組"只需四分之一劑量的Ag即可達(dá)到"Ag組"原倍抗原劑量的免疫效果。"Ag+Al+CpG組"的免疫應(yīng)答最強(qiáng)，只需十六分之一劑量的Ag即可超過"Ag組"原倍抗原劑量的免疫效果。圖2b所示結(jié)果為免疫后第4周SabinII型脊髓灰質(zhì)炎病毒特異性中和抗體滴度。由圖2b可見，"Ag+CpG組"四分之一劑量的Ag誘生的中和抗體滴度為"Ag組"原倍抗原劑量的2倍。"Ag+Al+CpG組"的免疫應(yīng)答最強(qiáng)，十六分之一劑量的Ag誘生的特異性中和抗體滴度高于"Ag組"原倍抗原劑量的特異性中和抗體滴度。上述結(jié)果表明CpG-ODN單獨或聯(lián)合A1(0H)3作為SabinII型滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗的佐劑，能夠增強(qiáng)其免疫原性并大大降低其抗原用量o實施例4.不同CpG-ODN能夠增強(qiáng)小鼠對SabinII型滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗的免疫應(yīng)答按照與實施例2相同的方法對Balb/c小鼠進(jìn)行免疫，進(jìn)而檢測特異性IgG抗體滴度，以測定不同CpG-ODN序列在小鼠中對SabinII型滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗的免疫效果的影響，不同之處在于CpG-ODN分別為表2所述的核苷酸序列T2T6。圖3所示為免疫后第4周SabinII型脊髓灰質(zhì)炎病毒特異性IgG抗體滴度，與不使用佐劑的對照組相比，上述任意一種CpG-ODN均可使特異性抗體滴度增加3-4倍。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實施例5.CpG-ODN能夠增強(qiáng)小鼠對SabinI型滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗的免疫應(yīng)答按照與實施例2相同的方法對Balb/c小鼠進(jìn)行免疫，進(jìn)而檢測特異性中和抗體滴度，以評價CpG-ODN在小鼠中對SabinI型滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗的免疫應(yīng)答的影響，不同之處在于用SabinI型滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒來代替SabinII型滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒，而且抗原用量分別為原倍劑量(2.5pg的Ag/小鼠)、四分之一劑量(0.625)Lig的Ag/小鼠)和十六分之一劑量(0.156pg的Ag/小鼠)。圖4為免疫后第4周SabinI型脊髓灰質(zhì)炎病毒特異性中和抗體滴度。由圖4可見，"Ag+CpG組"原倍劑量的Ag誘生的特異性中和抗體滴度為"Ag組"相同抗原劑量的Ag誘生的特異性中和抗體滴度的2倍左右。"Ag+Al+CpG組"的免疫應(yīng)答最強(qiáng)，四分之一劑量的Ag誘生的特異性中和抗體滴度為"Ag組"原倍抗原劑量的Ag誘生的特異性中和抗體滴度的2倍左右。上述結(jié)果表明CpG-ODN單獨或聯(lián)合Al(OH)3作為SabinI型滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗的佐劑，能夠增強(qiáng)其免疫原性并大大降低其抗原用量。實施例6.CpG-ODN能夠增強(qiáng)小鼠對SabinIII型滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗的免疫應(yīng)答按照與實施例2相同的方法對Balb/c小鼠進(jìn)行免疫，進(jìn)而檢測特異性中和抗體滴度，以評價CpG-ODN在小鼠中對SabinIII型滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗的免疫應(yīng)答的影響，不同之處在于用SabinIII型滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒來代替SabinII型滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒，而且抗原用量為原倍劑量(2.5pg的Ag/小鼠)、四分之一劑量(0.625pg的Ag/小鼠)和十六分之一劑量(0.156ng的Ag/小鼠)。圖5為免疫后第4周SabinIII型脊髓灰質(zhì)炎病毒特異性中和抗體滴度。由圖5可見，"Ag+CpG組"四分之一劑量的Ag誘生的特異性中和抗體滴度高于"Ag組"原倍抗原劑量的Ag誘生的特異性中和抗體滴度。"Ag+Al+CpG組"的免疫應(yīng)答最強(qiáng)，十六分之一劑量的Ag誘生的特異性中和抗體滴度為"Ag組"原倍抗原劑量的Ag誘生的特異性中和抗體滴度的13倍左右。上述結(jié)果表明CpG-ODN單獨或聯(lián)合Al(OH)3作為SabinIII型滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗的佐劑，能夠增強(qiáng)其免疫原性并大大降低其抗原用量。序列表〈110〉北京生物制品研究所<120>脊髓灰質(zhì)炎疫苗〈130>F卜071631-59<160>6〈170>Paterrtlnversion3.3〈210>1<211>21<212>DNA<213>Artificial<220>〈223>人工序列<400>1tcgttcgttcgttcgttcgtt21〈210>2〈211>25〈212〉DNA<213>Artificial<220>〈223〉人工序列〈400>2tcgttcgttcgttcgttcgttcgtt25<210>3〈211>29<212>■〈213>Artificia〈220>〈223>人工序列<400>3tcgttcgttcgttcgttcgttcgttcgtt29〈210>4〈211>20<212>DNA〈213>Artificial<220><223>人工序列<400>4tcgtttcgtttcgtttcgtt20〈210>5<2"〉25<212>DNA<213>Artificial〈220><223〉人工序列〈400>5tcgtttcgtttcgtttcgtttcgtt25<210>6<211>30<212>DNA<213〉A(chǔ)rtificial<220><223>人工序列〈400〉6tcgtttcgtttcgtttcgtttcgtttcgtt30權(quán)利要求1、一種脊髓灰質(zhì)炎疫苗，其特征在于，包含滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒；以及第一佐劑，該第一佐劑為含有至少一個非甲基化CpG二核苷酸的寡聚脫氧核苷酸，該寡聚脫氧核苷酸的長度為15-35個核苷酸。2、如權(quán)利要求1所述的脊髓灰質(zhì)炎疫苗，其特征在于，每劑疫苗中包含滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒0.1pg~lmg，并包含第一佐劑10jxg10mg。3、如權(quán)利要求2所述的脊髓灰質(zhì)炎疫苗，其特征在于，每劑疫苗中包含第一佐劑100pg1mg。4、如權(quán)利要求1所述的脊髓灰質(zhì)炎疫苗，其特征在于，所述寡聚脫氧核苷酸的長度為20-30個核苷酸。5、如權(quán)利要求4所述的脊髓灰質(zhì)炎疫苗，其特征在于，所述寡聚脫氧核苷酸的長度為20-25個核苷酸。6、如權(quán)利要求1所述的脊髓灰質(zhì)炎疫苗，其特征在于，所述寡聚脫氧核苷酸的核苷酸序列為5'-TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3'5'-TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3'5'-TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3'5'-TCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3'5'-TCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3'5'-TCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3'。7、如權(quán)利要求6所述的脊髓灰質(zhì)炎疫苗，其特征在于，所述寡聚脫氧核苷酸的核苷酸序列為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>8、如權(quán)利要求1-7中任意一項所述的脊髓灰質(zhì)炎疫苗，其特征在于，所述寡聚脫氧核苷酸是硫代修飾的。9、如權(quán)利要求1-7中任意一項所述的脊髓灰質(zhì)炎疫苗，其特征在于，該疫苗還包含第二佐劑，該第二佐劑為氫氧化鋁、磷酸鋁、無定型鋁或其它任何適用于人用疫苗的佐劑。10、如權(quán)利要求1-7中任意一項所述的脊髓灰質(zhì)炎疫苗，其特征在于，所述脊髓灰質(zhì)炎病毒為血清型I型、II型、III型毒株或其組全文摘要本發(fā)明涉及一種脊髓灰質(zhì)炎疫苗，其包含滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒作為抗原和第一佐劑，該第一佐劑為含有至少一個非甲基化CpG二核苷酸的寡聚脫氧核苷酸，該寡聚脫氧核苷酸的長度為15-35個核苷酸。本發(fā)明中用于增強(qiáng)滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗免疫效果的佐劑是一種具有良好潛在應(yīng)用前景的新型人用疫苗佐劑，其化學(xué)本質(zhì)為人工合成的含有CpG二核苷酸的寡聚脫氧核苷酸。這種佐劑通過免疫細(xì)胞上的受體TLR9激活免疫系統(tǒng)，從而增強(qiáng)針對疫苗抗原的特異性免疫應(yīng)答。通過向疫苗中加入本發(fā)明所述的疫苗佐劑，可以提高疫苗的免疫效果，從而降低疫苗抗原的用量，最終降低疫苗成本。文檔編號A61P31/14GK101559224SQ20081009451公開日2009年10月21日申請日期2008年4月18日優(yōu)先權(quán)日2008年4月18日發(fā)明者軍周,楊春亭,許洪林申請人:北京生物制品研究所