專利名稱：：腦膜炎球菌疫苗的制作方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明涉及生物制藥領域，具體地說，本發(fā)明涉及一種腦膜炎球菌疫苗。
背景技術(shù)：
：流行性腦脊髓膜炎(簡稱"流腦")由腦膜炎球菌引起，是人類主要急性呼吸道傳染病之一。根據(jù)莢膜多糖的化學結(jié)構(gòu)，腦膜炎球菌可分為十幾個血清群，其中A、B、C、Y和W135是最主要的流行菌群。接種疫苗是預防流腦的主要途徑。用腦膜炎球菌莢膜多糖制備的疫苗具有一定的預防效果，但它是一種T細胞非依賴性抗原，對2歲以下的嬰幼兒免疫效果很差，而且不能誘生免疫記憶。與載體蛋白偶聯(lián)可以將多糖抗原轉(zhuǎn)變?yōu)門細胞依賴性抗原，不但對嬰幼兒有效，而且能誘生免疫記憶。但是這種多糖蛋白結(jié)合疫苗的生產(chǎn)工藝比較復雜，產(chǎn)量較低，價格較貴，遠遠不能滿足計劃免疫的大規(guī)模需求。因此，有必要研制一種新型的腦膜炎球菌疫苗。專利文獻1WO2006063152A2公開了一種提高TLR8介導的生物活性的免疫剌激組合物，該免疫刺激組合物包含胺類化合物和寡核苷酸，并且該組合物可以作為佐劑聯(lián)合活性病毒、細菌、滅活病毒等材料用于預防肝炎、流腦等疾病。該專利文獻并未給出僅僅使用寡核苷酸作為佐劑可以聯(lián)合活性病毒、細菌、滅活病毒等材料用于預防肝炎、流腦等疾病的技術(shù)啟示，而且其中的免疫刺激組合物是提高TLR8介導的生物活性，對于TLR9介導或其它途徑介導的生物活性是否有影響在該專利文獻中并未提及。專利文獻2WO2004098491A公開了一種使用K、D兩型CpG寡脫氧核苷酸治療和預防生物恐怖劑(bioterrorismagent)所引起的感染的方法。專利文獻3WO2004087203A2公開了一種局部施加水包油型免疫刺激性核苷酸來引起免疫反應的方法。文獻《中華醫(yī)學雜志》第82巻第8期中綜述了CpG寡脫氧核苷酸作為人用疫苗佐劑的初步研究。但是這些文獻均未涉及腦膜炎球菌莢膜多糖與載體蛋白的化學偶聯(lián)物單獨與含有至少一個非甲基化CpG二核苷酸的寡聚脫氧核苷酸(所述寡聚脫氧核苷酸的長度為15-35個核苷酸)的第一佐劑的聯(lián)合作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種腦膜炎球菌疫苗，具體地說，本發(fā)明提供一種提高疫苗的免疫效果、降低疫苗抗原的用量、減少免疫針次和降低疫苗成本的腦膜炎球菌疫苗。為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供一種腦膜炎球菌疫苗，其包含腦膜炎球菌莢膜多糖與載體蛋白的化學偶聯(lián)物和第一佐劑，該第一佐劑為含有至少一個非甲基化CpG二核苷酸的寡聚脫氧核苷酸，其化學本質(zhì)為人工合成的含有CpG二核苷酸的寡聚脫氧核苷酸(簡稱CpG-ODN)，所述寡聚脫氧核苷酸的長度為15-35個核苷酸，優(yōu)選為20-30個核苷酸，更優(yōu)選為20-25個核苷酸。在本發(fā)明的一個實施方案中，每劑疫苗中包含腦膜炎球菌莢膜多糖與載體蛋白的化學偶聯(lián)物優(yōu)選為0.1貼~1mg，并包含第一佐劑10pg10mg。根據(jù)本發(fā)明，更優(yōu)選的是，每劑疫苗中包含第一佐劑100|iglmg。根據(jù)本發(fā)明，所述寡聚脫氧核苷酸其序列中優(yōu)選具有兩個或兩個以上拷貝的5'-NTCGTT-3'基元，且其長度為15~35個核苷酸，其中所述CpG是非甲基化的，并且所述N不代表A或G。更優(yōu)選的是，所述寡聚脫氧核苷酸序列中5'-末端為T，其后為38個，優(yōu)選57個CGTT串聯(lián)重復的寡聚脫氧核苷酸。本發(fā)明的另一個實施方案為TCGTT串聯(lián)重復38次，優(yōu)選57次的寡聚脫氧核苷酸。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述CpG-ODN的核苷酸序列優(yōu)選為5'-TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3'5'-TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3'5'-TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3'5'-TCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3'5'-TCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3'5'-TCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3'。更優(yōu)選為5'-TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3'。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述寡聚脫氧核苷酸優(yōu)選是硫代修飾的。其中所述硫代寡聚脫氧核苷酸的制備方法是本領域技術(shù)人員所熟知的，例如可以采用固相亞磷酰胺三酯法化學合成。在本發(fā)明的另一個實施方案中，該疫苗優(yōu)選還包含第二佐劑，該第二佐劑為氫氧化鋁、磷酸鋁、無定型鋁或其它任何適用于人用疫苗的佐劑。此處示例性的佐劑僅僅是為了示例性地說明本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制，任何適用于人用疫苗的佐劑都適用于本發(fā)明。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述腦膜炎球菌莢膜多糖與載體蛋白的化學偶聯(lián)物優(yōu)選是腦膜炎球菌血清群A群、C群、Y群和W135群中的一種或多種莢膜多糖與破傷風類毒素或白喉類毒素或其它任何適用于人用疫苗的載體蛋白的化學偶聯(lián)物。此處的破傷風類毒素或白喉類毒素均是示意性地說明本發(fā)明的，并不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制，任何適用于人用疫苗的載體蛋白都適用于本發(fā)明。制造和檢定腦膜炎球菌莢膜多糖的方法和標準是本領域技術(shù)人員所公知的技術(shù)，技術(shù)人員可參考世界衛(wèi)生組織正式頒布并進行過數(shù)次修訂的腦膜炎球菌莢膜多糖制造及檢定規(guī)程(WHOTechnicalReportSeries,No.594,1975,WHOTechnicalReportSeries,No.658，1980,WHOTechnicalReportSeries,No.904，2002)制備腦膜炎球菌多糖。其中莢膜多糖是從不同血清群腦膜炎球菌分別提取和純化的。例如，從A群腦膜炎球菌菌株中制備A群莢膜多糖，從C群腦膜炎球菌菌株中制備C群莢膜多糖，從W135群腦膜炎球菌菌株中制備W135群莢膜多糖，從Y群腦膜炎球菌菌株中制備Y群莢膜多糖。此外，專利文獻CN101007167A(參見說明書第9頁實施例1)更詳細地描述了A、C、W135、Y群腦膜炎球菌莢膜多糖的制備方法。另外，腦膜炎球菌莢膜多糖和載體蛋白的偶聯(lián)方法是本領域技術(shù)人員所公知的技術(shù)，技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明所述和參考世界衛(wèi)生組織正式頒布的并進行過數(shù)次修訂的C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗和b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗(Hib)制造及檢定規(guī)程(WHOTechnicalReportSeries,No.924，2004,WHOTechnicalReportSeries,No.897,2000)制備腦膜炎球菌莢膜多糖與載體蛋白的化學偶聯(lián)物。另外，文獻《中華微生物學和免疫學雜志》2006年26巻11期第1042-1047頁"三種不同載體的C群腦膜炎球菌莢膜多糖-蛋白質(zhì)結(jié)合疫苗比較研究"中就公開了C群腦膜炎球菌莢膜多糖與3種不同載體即破傷風類毒素(TT)、白喉類毒素(DT)和重組銅綠假單胞菌外毒素A(rEPA)結(jié)合形成化學偶聯(lián)物的方法。文獻《西南國防醫(yī)藥》2006年16巻6期第583-585頁"A群腦膜炎球菌多糖蛋白結(jié)合疫苗衍化工藝的研究"中就公開了制備A群腦膜炎球菌莢膜多糖與破傷風類毒素(TT)的結(jié)合物的工藝。文獻《中國生化藥物雜志》2006年27巻5期第267-270頁"C群腦膜炎球菌莢膜多糖結(jié)合疫苗的研制"公開了C群腦膜炎球菌多糖與破傷風類毒素結(jié)合疫苗的制備方法。文獻《微生物學免疫學進展》2005年33巻2期第14-20頁"A群奈瑟氏腦膜炎球菌莢膜多糖-破傷風類毒素結(jié)合疫苗的制備及其免疫原性研究"公開了A群奈瑟氏腦膜炎球菌莢膜多糖-破傷風類毒素結(jié)合疫苗的制備方法。此外，專利文獻CN101007167A(參見說明書第12頁實施例4)更詳細地描述了腦膜炎球菌莢膜多糖和破傷風類毒素的化學偶聯(lián)物的制備方法，在該方法中，先用溴化氰(CNBr)對多糖進行活化處理，再將己二酰肼(ADH)加入活化后的多糖中，形成多糖-ADH衍生物，再經(jīng)過碳二亞胺(EDAC)介導的縮合作用與破傷風類毒素共價結(jié)合，獲得多糖-破傷風類毒素的化學偶聯(lián)物，通過柱層析法分離純化獲得腦膜炎球菌莢膜多糖與破傷風類毒素的化學偶聯(lián)物。腦膜炎球菌莢膜多糖和載體蛋白的偶聯(lián)有多種已知的方法，在此所述的偶聯(lián)方法僅僅是用于說明本發(fā)明?？梢圆捎酶鞣N等同的方法實現(xiàn)本發(fā)明所述的偶聯(lián)過程，因此任何用于莢膜多糖與蛋白載體偶聯(lián)的方法和工藝或者過程都有可能用于實施本發(fā)明。另外，所述腦膜炎球菌疫苗的制備方法是本領域技術(shù)人員所熟知的，例如其制備方法在《醫(yī)學生物制品學》(第2版，第511-539頁，人民衛(wèi)生出版社，2007年10月)中有所描述。在實際使用中，一種簡便的方法為直接將腦膜炎球菌莢膜多糖和載體蛋白的化學偶聯(lián)物與本發(fā)明所述的第一佐劑混合，制得腦膜炎球菌疫苗。本發(fā)明所述的腦膜炎球菌疫苗的劑型和配伍按照藥學領域一般技術(shù)人員所公知的技術(shù)標準來確定。例如本發(fā)明所述的腦膜炎球菌疫苗可以制成注射液、凍干粉針等。另外，本發(fā)明所述的腦膜炎球菌疫苗可以是無防腐劑疫苗?？扇芜x地，所述腦膜炎球菌疫苗也可以包含防腐劑，例如硫柳汞、2-苯氧乙醇、苯甲醇等。這些示例性的防腐劑僅僅是為了說明本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制，任何適用于人用疫苗的防腐劑都適用于本發(fā)明。另外，本發(fā)明所述的腦膜炎球菌疫苗可通過皮內(nèi)注射、皮下注射、肌肉注射接種或者通過粘膜途徑接種。在進行免疫接種時，需要考慮接種者的年齡、給藥途徑等多種因素。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，每劑疫苗中包含所述腦膜炎球菌莢膜多糖與載體蛋白的化學偶聯(lián)物0.1pg1mg，所述第一佐劑10嗎~10mg，更優(yōu)選包含所述第一佐劑100pg1mg。通常接種一至三針。本發(fā)明中用于增強腦膜炎球菌疫苗免疫效果的佐劑是一種具有良好潛在應用前景的新型人用疫苗佐劑，這種佐劑通過免疫細胞上的受體TLR9激活免疫系統(tǒng)，從而增強針對疫苗抗原的特異性免疫應答。通過向疫苗中加入本發(fā)明所述的疫苗佐劑，可以提高疫苗的免疫效果，從而降低疫苗抗原的用量并減少免疫針次，最終降低疫苗成本。圖la為示出CpG-ODN能夠增強小鼠對A群腦膜炎球菌多糖蛋白結(jié)合疫苗的免疫應答(初次免疫后第4周)的圖。圖lb為示出CpG-ODN能夠增強小鼠對A群腦膜炎球菌多糖蛋白結(jié)合疫苗的免疫應答(加強免疫后第2周)的圖。圖2為示出CpG-ODN能夠增強小鼠對A群腦膜炎球菌多糖蛋白結(jié)合疫苗免疫應答的持久性的圖。圖3a為示出CpG-ODN能夠降低A群腦膜炎球菌多糖蛋白結(jié)合疫苗的抗原用量(初次免疫后第4周)的圖。圖3b為示出CpG-ODN能夠降低A群腦膜炎球菌多糖蛋白結(jié)合疫苗的抗原用量(加強免疫后第2周)的圖。圖4a為示出CpG-ODN能夠增強小鼠對C群、Y群和W135群腦膜炎球菌多糖蛋白結(jié)合疫苗的免疫應答(初次免疫后第4周)的圖。圖4b為示出CpG-ODN能夠增強小鼠對C群、Y群和W135群腦膜炎球菌多糖蛋白結(jié)合疫苗的免疫應答(加強免疫后第2周)的圖。圖5為示出不同CpG-ODN能夠增強小鼠對A群腦膜炎球菌多糖蛋白結(jié)合疫苗的免疫應答(加強免疫后第2周)的圖。具體實施例方式以下結(jié)合附圖通過具體實施方式的描述對本發(fā)明作進一步說明，但這并非是對本發(fā)明的限制，本領域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進，但是只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。實施例1.CpG-ODN能夠增強小鼠對A群腦膜炎球菌莢膜多糖和破傷風類毒素的化學偶聯(lián)物的免疫應答按照專利文獻CN101007167A(參見說明書第9~12頁實施例1和實施例4)中所述的方法制備A群腦膜炎球菌莢膜多糖以及A群腦膜炎球菌莢膜多糖和破傷風類毒素的化學偶聯(lián)物(以下簡稱為"Ag")。在所述化學偶聯(lián)物中，多糖含量為106pg/ml，載體蛋白含量為269pg/ml。本實施例中所使用的CpG-ODN由本發(fā)明人設計，序列如下5'-TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3'，委托上海生工生物技術(shù)公司人工合成，并進行全鏈硫代修飾，聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)純化，溶于生理鹽水，-20^冰箱中保存?zhèn)溆?。本實施例中所使用的小鼠為Balb/c小鼠，雌性，68周，購自中國醫(yī)學科學院實驗動物中心。將Balb/c小鼠分為四組，分別為"Ag組"、"Ag+Al組"、"Ag+CpG組"和"Ag+Al+CpG組"，每組小鼠8只，每只小鼠經(jīng)左后肢腓腸肌注射試液100W進行免疫。各組所使用的試液如表1所示。其中，Al(OH)3溶液是通過下述方法制備的取5%硫酸鋁溶液250ml，在強烈攪拌下加入5%氫氧化鈉溶液100ml，用生理鹽水離心洗滌沉淀2次，然后使其懸浮于生理鹽水中使體積達250ml。Ag用量均按多糖含量計算。表1組別試液Ag組2.2pg的Ag，溶劑為磷酸鹽緩沖液(PBS溶液)(pH7.0)Ag+Al組2.2pg的、經(jīng)1mg/ml的Al(OH)3吸附的AgAg+CpG組2.2pg的Ag和10pg的CpG-ODN混合而得的腦膜炎球菌疫苗，溶劑為PBS溶液(pH7.0)Ag+Al+CpG組2.2|ig經(jīng)1mg/ml的Al(OH)3吸附的Ag和10pg的CpG-ODN混合而得的腦膜炎球菌疫苗初次免疫后第4周以同樣方式加強免疫一次。在初次免疫后第4周和加強免疫后第2周分別采血并分離出血清，使用PBS溶液(pH7.0)對該血清進行2倍系列稀釋，按照下述方法測定腦膜炎球菌多糖特異性IgG抗體滴度。使用A群腦膜炎球菌莢膜多糖包被96孔酶標板，每孔500ng，4"C過夜；使用PBS溶液(pH7.0)洗板3次后，在37'C下使用1%的牛血清白蛋白PBS溶液(pH7.0)封閉1小時；使用PBS溶液(pH7.0)洗板3次后加入上述經(jīng)2倍系列稀釋的待檢血清，37'C下作用l小時；使用PBS溶液(pH7.0)洗板3次后加入1:10000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG(購自美國SIGMA公司)，每孔100^d，37t:作用1小時；使用PBS溶液(pH7.0)洗板3次后使用鄰苯二胺(OPD)顯色，2M硫酸終止反應，用分光光度計測定490nm處吸光度值OD490并確定終點滴度(臨界值設為O.IO)。結(jié)果見圖la和圖lb。圖la和圖lb所示結(jié)果分別為初次免疫后第4周和加強免疫后第2周的多糖特異性IgG抗體滴度。由此可見，雖然初次免疫后"Ag+CpG組"與"Ag組"特異性抗體滴度無顯著性差異(P>0.05)，但加強免疫后"Ag+CpG組"的特異性抗體滴度顯著高于"Ag組"的特異性抗體滴度(P<0.001)。Al(OH)3與CpG-ODN聯(lián)合使用具有最強的疫苗佐劑活性，無論是初次免疫還是加強免疫，均可使特異性抗體滴度增加IO倍左右。上述結(jié)果表明(1)CpG-ODN能夠增強小鼠對腦膜炎球菌莢膜多糖和破傷風類毒素的化學偶聯(lián)物的免疫應答；(2)CpG-ODN作為腦膜炎球菌莢膜多糖和破傷風類毒素的化學偶聯(lián)物的佐劑，既可單獨使用，也可與其它疫苗佐劑如Al(OH)3聯(lián)合使用。實施例2.CpG-ODN能夠增強小鼠對A群腦膜炎球菌莢膜多糖和破傷風類毒素的化學偶聯(lián)物免疫應答的持久性按照與實施例1相同的方法對Balb/c小鼠進行免疫，進而檢測腦膜炎球菌莢膜多糖特異性IgG抗體滴度，以評價CpG-ODN在小鼠中對A群腦膜炎球菌莢膜多糖和破傷風類毒素的化學偶聯(lián)物免疫應答持久性的影響，不同之處在于初次免疫后第4周和第39周以同樣方式分別加強免疫一次，并在初次免疫后第4周、第6周、第10周、第14周、第21周、第39周和第41周分別采血并分離血清，按照實施例1所述的方法檢測腦膜炎球菌多糖特異性IgG總抗體。結(jié)果見圖2。由圖2可見，從初次免疫后第6周至第21周，"Ag+CpG組"和"Ag+Al+CpG組"的特異性抗體滴度均顯著高于不加佐劑的"Ag組"(P<0.05)。雖然在第39周上述三者之間特異性抗體滴度無顯著性差異(P>0.05)，但在第41周(即第二次加強免疫后兩周)"Ag+CpG組"和"Ag+Al+CpG組"能夠產(chǎn)生較好的回憶反應，特異性抗體滴度均為"Ag組"的四倍以上。上述結(jié)果表明CpG-ODN單獨或聯(lián)合Al(OH)3作為腦膜炎球菌莢膜多糖和破傷風類毒素的化學偶聯(lián)物的佐劑，能夠誘生較好的免疫持久性和回憶反應。實施例3.CpG-ODN能夠降低A群腦膜炎球菌莢膜多糖和破傷風類毒素的化學偶聯(lián)物的用量按照與實施例1相同的方法對Balb/c小鼠進行免疫，進而檢測腦膜炎球菌莢膜多糖特異性IgG抗體滴度，以測定CpG-ODN對A群腦膜炎球菌莢膜多糖和破傷風類毒素的化學偶聯(lián)物的用量的影響，不同之處在于腦膜炎球菌莢膜多糖和破傷風類毒素的化學偶聯(lián)物的用量不同，其用量分別為原倍劑量(2.2pg的Ag/小鼠)、四分之一劑量(0.55ng的Ag/小鼠)和十六分之一劑量(0.14)ig的Ag/小鼠)。結(jié)果見圖3a和圖3b。圖3a和圖3b所示結(jié)果分別為初次免疫后第4周和加強免疫后第2周的多糖特異性IgG抗體滴度。由此可見，無論是初次免疫還是加強免疫，"Ag+CpG組"只需四分之一劑量的Ag即可達到"Ag組"原倍抗原劑量的免疫效果；"Ag+Al+CpG組"的免疫應答最強，只需十六分之一劑量的Ag即可達到"Ag組"原倍抗原劑量的免疫效果。上述結(jié)果表明CpG-ODN單獨或聯(lián)合A1(0H)3作為腦膜炎球菌莢膜多糖和破傷風類毒素的化學偶聯(lián)物的佐劑，能夠大大降低其用量。此外，由圖3a中"Ag+Al+CpG組"中十六分之一的Ag劑量的抗體滴度和圖3b中"Ag組"原倍抗原劑量的抗體滴度的比較可知，"Ag+Al+CpG組"十六分之一的Ag劑量免疫一次的抗體滴度不低于"Ag組"原倍抗原劑量免疫兩次的抗體滴度，提示本發(fā)明所述的CpG-ODN與其它疫苗佐劑如A1(0H)3聯(lián)合使用，可以減少免疫針次。綜合實施例1、2和3中的結(jié)果，CpG-ODN作為佐劑能夠提高本發(fā)明所述的腦膜炎球菌疫苗的免疫效果，從而降低疫苗Ag的用量并減少免疫針次，最終降低疫苗成本。實施例4.CpG-ODN能夠增強小鼠對C群、Y群和W135群腦膜炎球菌莢膜多糖和破傷風類毒素的化學偶聯(lián)物的免疫應答按照專利文獻CN101007167A(參見說明書第9~12頁實施例1和實施例4)中所述的方法制備C群、Y群和W135群腦膜炎球菌莢膜多糖以及C群、Y群和W135群腦膜炎球菌莢膜多糖和破傷風類毒素的化學偶聯(lián)物，下文中簡稱為"Ag"。按照與實施例1相同的方法對Balb/c小鼠進行免疫，進而檢測腦膜炎球菌莢膜多糖特異性IgG抗體滴度，以評價CpG-ODN在小鼠中對C群、Y群和W135群腦膜炎球菌莢膜多糖和破傷風類毒素的化學偶聯(lián)物的免疫應答的影響，不同之處在于分別使用C群、Y群和W135群腦膜炎球菌莢膜多糖和破傷風類毒素的化學偶聯(lián)物來代替A群腦膜炎球菌莢膜多糖和破傷風類毒素的化學偶聯(lián)物。結(jié)果見圖4a和圖4b。圖4a和圖4b所示結(jié)果分別為初次免疫后第4周和加強免疫后第2周的多糖特異性IgG抗體滴度。由此可見，雖然初次免疫后單獨使用CpG-ODN不能增強免疫應答，表現(xiàn)為"Ag+CpG組"與"Ag組"的特異性抗體滴度無顯著性差異(P>0.05)，但加強免疫后前者的特異性抗體滴度明顯高于后者的特異性抗體滴度(P<0.001)。Al(OH^與CpG-ODN聯(lián)合使用具有最強的疫苗佐劑活性，無論是初次免疫還是加強免疫，均可使特異性抗體滴度增加IO倍左右。上述結(jié)果表明CpG-ODN也能夠增強針對C群、Y群和W135群腦膜炎球菌莢膜多糖和破傷風類毒素的化學偶聯(lián)物的免疫應答。實施例5.不同CpG-ODN能夠增強小鼠對A群腦膜炎球菌莢膜多糖和破傷風類毒素的化學偶聯(lián)物的免疫應答按照與實施例1相同的方法對Balb/c小鼠進行加強免疫，進而檢測腦膜炎球菌莢膜多糖特異性IgG抗體滴度，以測定不同CpG-ODN序列在小鼠中對A群腦膜炎球菌莢膜多糖和破傷風類毒素的化學偶聯(lián)物的免疫效果的影響，不同之處在于CpG-ODN分別為表2所述的核苷酸序列T2T6。圖5所示為加強免疫后第2周血清中腦膜炎球菌多糖特異性IgG總抗體滴度，與不使用佐劑的對照組相比，上述任意一種CpG-ODN均可增強腦膜炎球菌莢膜多糖和破傷風類毒素的化學偶聯(lián)物的免疫效果，使多糖特異性抗體滴度增加5倍左右。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>序列表<110>北京生物制品研究所〈120>腦膜炎球菌疫苗<130>F卜071632-59<160>6<170>PatentInversion3.3<210>1<211>21〈212>DNA〈213〉Artificial〈220><223>人工序列<400>1tcgttcgttcgttcgttcgtt21<210>2〈211>25<212>DNA<213〉Artificial<220><223>人工序列<400>2tcgttcgttcgttcgttcgttcgtt25<210>3〈211>29〈212>DNA<213>Artificial<220>〈223>人工序列<400>3tcgttcgttcgttcgttcgttcgttcgtt29<210>4〈211>20<212>DNA〈213>Artificial<220〉<223〉人工序列〈400>4tcgtttcgtttcgtttcgtt20〈210>5<211>25<212〉DNA〈213〉Artificial〈220〉<223>人工序列<400>5tcgtttcgtttcgtttcgtttcgtt25<210>6<211>30〈212〉DNA〈213>Artificial〈220〉<223>人工序列〈400〉6tcgtttcgtttcgtttcgtttcgtttcgtt30權(quán)利要求1、一種腦膜炎球菌疫苗，其特征在于，包含腦膜炎球菌莢膜多糖與載體蛋白的化學偶聯(lián)物；以及第一佐劑，該第一佐劑為含有至少一個非甲基化CpG二核苷酸的寡聚脫氧核苷酸，所述寡聚脫氧核苷酸的長度為15-35個核苷酸。2、如權(quán)利要求1所述的腦膜炎球菌疫苗，其特征在于，每劑疫苗中包含所述腦膜炎球菌莢膜多糖與載體蛋白的化學偶聯(lián)物0.1Hg1mg,所述第——佐齊廿10|Jg10mg。3、如權(quán)利要求2所述的腦膜炎球菌疫苗，其特征在于，每劑疫苗中包含所述第一佐劑100[ig~lmg。4、如權(quán)利要求1所述的腦膜炎球菌疫苗，其特征在于，所述寡聚脫氧核苷酸的長度為20-30個核苷酸。5、如權(quán)利要求4所述的腦膜炎球菌疫苗，其特征在于，所述寡聚脫氧核苷酸的長度為20-25個核苷酸。6、如權(quán)利要求1所述的腦膜炎球菌疫苗，其特征在于，所述寡聚脫氧核苷酸的核苷酸序列為5'-TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3'5'-TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3'5'-TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3'5'-TCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3'5'-TCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3'5'-TCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3'。7、如權(quán)利要求6所述的腦膜炎球菌疫苗，其特征在于，所述寡聚脫氧核苷酸的核苷酸序列為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>。8、如權(quán)利要求1-7中任一項所述的腦膜炎球菌疫苗，其特征在于，所述寡聚脫氧核苷酸是硫代修飾的。9、如權(quán)利要求1-7中任一項所述的腦膜炎球菌疫苗，其特征在于，該疫苗還包含第二佐劑，該第二佐劑為氫氧化鋁、磷酸鋁、無定型鋁或其它任何適用于人用疫苗的佐劑。10、如權(quán)利要求1-7中任一項所述的腦膜炎球菌疫苗，其特征在于，所述腦膜炎球菌莢膜多糖與載體蛋白的化學偶聯(lián)物是腦膜炎球菌血清群A群、C群、Y群和W135群中的一種或多種莢膜多糖與破傷風類毒素、白喉類毒素或其它任何適用于人用疫苗的載體蛋白的化學偶聯(lián)物。全文摘要本發(fā)明涉及一種腦膜炎球菌疫苗，其包含腦膜炎球菌莢膜多糖與載體蛋白的化學偶聯(lián)物和第一佐劑，該第一佐劑為含有至少一個非甲基化CpG二核苷酸的寡聚脫氧核苷酸，長度為15-35個核苷酸。本發(fā)明中用于增強腦膜炎球菌疫苗免疫效果的佐劑是一種具有良好潛在應用前景的新型人用疫苗佐劑，其化學本質(zhì)為人工合成的含有CpG二核苷酸的寡聚脫氧核苷酸。這種佐劑通過免疫細胞上的受體TLR9激活免疫系統(tǒng)，從而增強針對疫苗抗原的特異性免疫應答。通過向疫苗中加入本發(fā)明所述的疫苗佐劑，可以提高疫苗的免疫效果，從而降低疫苗抗原的用量并減少免疫針次，降低疫苗成本。文檔編號A61K47/48GK101559225SQ20081009451公開日2009年10月21日申請日期2008年4月18日優(yōu)先權(quán)日2008年4月18日發(fā)明者王瀟瀟,許洪林申請人:北京生物制品研究所