專利名稱：：一種復(fù)合型轉(zhuǎn)基因肺癌通用瘤苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種在建立穩(wěn)定表達(dá)人IFN-Y基因和人B7-1基因的A549細(xì)胞株中添加適當(dāng)?shù)南嚓P(guān)免疫增強(qiáng)劑，制備出復(fù)合型肺癌基因瘤苗。
背景技術(shù)：
：在腫瘤免疫過程中，T細(xì)胞的免疫功能起關(guān)鍵作用。可溶性腫瘤抗原經(jīng)抗原提呈細(xì)胞(APQ攝人后加工成短肽，然后經(jīng)組織相容性復(fù)合物(MHC)-II類抗原提呈而激活CD4+T細(xì)胞，通過分泌細(xì)胞因子促進(jìn)CD8+細(xì)胞的特異殺傷作用。而腫瘤細(xì)胞表面的腫瘤抗原在腫瘤細(xì)胞內(nèi)加工為小肽后提呈于表面的MHC-I類分子直接激活CD8+T細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞可能通過多種機(jī)制逃逸T細(xì)胞的免疫監(jiān)視。如在多數(shù)腫瘤中，MHC-I類分子表達(dá)明顯減少或丟失，致使細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)對(duì)腫瘤細(xì)胞上的抗原不能識(shí)別，從而腫瘤細(xì)胞得以逃避宿主的免疫攻擊；共刺激分子是激發(fā)誘導(dǎo)有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答所必需的，但腫瘤細(xì)胞常常缺失協(xié)同刺激分子(B7)這一類共刺激分子，從而使CTLs不能有效地對(duì)腫瘤產(chǎn)生免疫應(yīng)答等。y-干擾素(IFN-y)是細(xì)胞分泌的一類功能性蛋白，具有抗病毒、抑制細(xì)胞分裂、誘導(dǎo)細(xì)胞分化、增強(qiáng)細(xì)胞吞噬功能、誘導(dǎo)細(xì)胞特定基因表達(dá)及調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等作用，特別是具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用和多方面的抗腫瘤效應(yīng)。有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)轉(zhuǎn)，干擾素基因后可使細(xì)胞的MHC-1和MHC-II類分子表達(dá)增高，有利于抗原遞呈和增強(qiáng)免疫應(yīng)答；，干擾素可直接抑制腫瘤細(xì)胞分裂，使腫瘤細(xì)胞生長受到抑制，還可通過影響腫瘤細(xì)胞的分化和抑制腫瘤的血管生成發(fā)揮抗腫瘤的作用。B7是激發(fā)誘導(dǎo)有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答所必需的。很多具有正常免疫力的宿主并不能有效排除體內(nèi)的高免疫原性腫瘤，可能是由于腫瘤細(xì)胞缺乏T細(xì)胞活化的共刺激信號(hào)。B7分子家族及其配基CD28/CTLA-4在協(xié)同刺激信號(hào)的傳遞中起重要作用。而腫瘤細(xì)胞常常缺失B7這一類共剌激分子，從而使CTLs不能有效地對(duì)腫瘤產(chǎn)生免疫應(yīng)答，但如果給該腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染B7基因后，則可有效地激發(fā)T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫。粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落剌激因子(GM-CSF)是由巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，對(duì)DC細(xì)胞的增值分化、細(xì)胞分化、抗原提呈有重要的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而促進(jìn)輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)、效應(yīng)T細(xì)胞(Tc)、自然殺傷細(xì)胞(NK)識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原，在腫瘤部位浸潤，引起系統(tǒng)性抗腫瘤反應(yīng)，殺傷腫瘤；同時(shí)可促進(jìn)CD45RO+T細(xì)胞分化成熟及朗格漢斯細(xì)胞(Langerhans細(xì)胞)協(xié)同刺激因子及黏附分子B7/BB1的表達(dá)，提高其抗原提呈能力；GM-CSF還可以使巨噬細(xì)胞主要組織相容性復(fù)合物-II(MHC-II)的表達(dá)，提高抗原提呈能力。GM-CSF的這些功能表明了其具備成為腫瘤疫苗的良好佐劑。同類腫瘤或自體腫瘤中含有腫瘤特異性抗原(TSA),或腫瘤相關(guān)抗原(TAA),作為佐劑加入腫瘤疫苗可以在多個(gè)位點(diǎn)上誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性針對(duì)自體腫瘤的免疫應(yīng)答反應(yīng)。瘤苗就是針對(duì)腫瘤細(xì)胞逃避肌體免疫監(jiān)視而成瘤的特點(diǎn)，利用腫瘤抗原激發(fā)機(jī)體自身的免疫保護(hù)機(jī)制達(dá)到預(yù)防及治療腫瘤的目的。近來腫瘤疫苗已發(fā)展成為一種重要的腫瘤生物治療手段。與手術(shù)治療、放射治療相比，毒副作用小，特異性高，作用范圍更廣泛。在腫瘤治療研究中越來越引起重視。目前針對(duì)各種腫瘤而設(shè)計(jì)了多種的轉(zhuǎn)基因瘤苗，如將各種細(xì)胞因子轉(zhuǎn)染相關(guān)的腫瘤細(xì)胞以改善腫瘤細(xì)胞的遺傳背景，提高免疫原性，誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種復(fù)合型轉(zhuǎn)基因肺癌通用瘤苗，是在建立穩(wěn)定表達(dá)人IFN-Y基因和人B7-1基因的A549細(xì)胞株中添加適量的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和腫瘤細(xì)胞裂解物，帝U備獲得復(fù)合型轉(zhuǎn)基因肺癌通用瘤苗。所述腫瘤細(xì)胞裂解物為腫瘤細(xì)胞特異性抗原S180(小鼠肉瘤細(xì)胞)裂解物。本發(fā)明提供的復(fù)合型轉(zhuǎn)基因肺癌通用瘤苗通過以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)將穩(wěn)定表達(dá)的A549-IFN卞B7-1細(xì)胞株，用含10%小牛血清的1640培養(yǎng)基、37°C、5%C02進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，收集對(duì)數(shù)生長的細(xì)胞，得穩(wěn)定表達(dá)的A549-IFN卞B7-1細(xì)胞培養(yǎng)懸液；(2)在上述細(xì)胞培養(yǎng)懸液中加入粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和腫瘤細(xì)胞特異性抗原S18Q裂解物，使每0.2ml注射液中含A549-IFN個(gè)B7-1細(xì)胞lxl06，GM-CSF45單位，20pl(200嗎)腫瘤細(xì)胞特異性抗原S咖(小鼠肉瘤細(xì)胞)裂解物；(3)用100mdx50min劑量的Co60照射，得復(fù)合型轉(zhuǎn)基因肺癌通用瘤苗。步驟(1)所述的A549-IFN卞B7-1細(xì)胞株是通過以下已知方法獲得(1)將人IFN-y基因雙酶切裝入pLXSN質(zhì)粒中，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞株，G418篩選得陽性克隆，得A549-IFN-y細(xì)胞株；(2)將人B7-l基因經(jīng)雙酶切裝入pIRESpuro質(zhì)粒，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入A549-IFN-Y細(xì)胞株，puromycin篩選得陽性克隆，得多基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株A549-IFN-，B7-1。其中人IFN-y基因經(jīng)E.CoRI和BamHI酶切；人B7-l基因經(jīng)E.CoRI和BamHI酶切。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)復(fù)合型轉(zhuǎn)基因肺癌通用瘤苗通過添加GM-CSF促進(jìn)各種T細(xì)胞識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原，系統(tǒng)性提高了抗腫瘤反應(yīng)；同時(shí)促進(jìn)DC細(xì)胞抗原提呈能力，使得殺傷腫瘤能力明顯提高。(2)復(fù)合型轉(zhuǎn)基因肺癌通用瘤苗的制備還添加了腫瘤細(xì)胞特異性抗原，提高了免疫原性，在多個(gè)位點(diǎn)上誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性針對(duì)自體腫瘤的免疫應(yīng)答反應(yīng)，增強(qiáng)了機(jī)體殺傷相關(guān)腫瘤的能力。(3)本發(fā)明設(shè)計(jì)合理，抗腫瘤作用強(qiáng)，具有較大范圍的腫瘤生物治療的醫(yī)藥用途。圖1為本發(fā)明的實(shí)施例的pLXSN—IFN-y質(zhì)粒酶切電泳鑒定。圖2為本發(fā)明的實(shí)施例的pIRESpuro—B7-l質(zhì)粒酶切電泳鑒定。具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述實(shí)施例1A549-IFN個(gè)B7-1細(xì)胞株的制備(1)將基因兩端帶有E.CoRI和BamHI酶切序列的人IFN-y基因(中科院生物化學(xué)研究所)(genebank，HUGOGeneNomenclatureCommittee,HPRD:00957，MIM:147570)和pLXSN質(zhì)粒(中科院生物化學(xué)研究所)分別加入E.CoRI和BamHI內(nèi)酶，37°C酶切1小時(shí)，酶切產(chǎn)物分別經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化，兩個(gè)純化產(chǎn)物經(jīng)T4DNA連接酶24。C，1小時(shí)反應(yīng)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，Amp+培養(yǎng)基篩選陽性克隆，挑半個(gè)單菌落于5mLSOB液體培養(yǎng)基中，37°C300ipm，6小時(shí)，質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒，經(jīng)E.CoRI和BamHl酶切，電泳鑒定(參見圖1)。鑒定證明含pLXSN—IFN-y的陽性單菌落的另一半與5mLSOB液體培養(yǎng)基370C，300rpm，6小時(shí)擴(kuò)增，擴(kuò)增菌體加到200mLLB液體培養(yǎng)基中37°C300rpm，12小時(shí)，大量質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒，即得pLXSN—IFN-y質(zhì)粒。圖1中1:MARK,lkbDNALadder;2:pLXSN質(zhì)粒；3:鑒定pLXSN—IFN-Y質(zhì)粒。(2)IFN-Y轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞將A549細(xì)胞(購自中科院上海細(xì)胞所細(xì)胞庫)鋪入6孔培養(yǎng)板中，每孔用含7%胎牛和7%小牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，37°C，5%0)2培養(yǎng)24小時(shí)，鋪入的細(xì)胞量為23xl()S個(gè)，細(xì)胞貼壁。將2ingpLXSN—IFN-Y質(zhì)粒、40pllipofectamine脂質(zhì)體混合，加無血清的1640培養(yǎng)基至100(iL，室溫靜止15-30分鐘，形成DNA-lipofectamine脂質(zhì)體的混合物。將培養(yǎng)A549細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液去除，加入無血清1640培養(yǎng)液800^L，同時(shí)加入200^iLDNA-lipofectamine脂質(zhì)體的混合物，混勻，于37。C、5%0)2下培養(yǎng)6小時(shí)后，吸掉上層液體，每孔加入5mL1640完全培養(yǎng)液過夜(IO小時(shí)以上)，做細(xì)胞恢復(fù)。(3)轉(zhuǎn)IFN-Y基因陽性細(xì)胞篩選每孔加入不同濃度的(0.2%-0.6%)G418進(jìn)行篩選。兩周后篩選出具有G418抗性的A549轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株，艮卩A549-IFN-y細(xì)胞株。(4)將基因兩端帶有E.CoRl和BamHl酶切序列的人B7-l基因(中科院生物化學(xué)研究所)(genebank，HUGOGeneNomenclatureCommittee，HPRD:00202，MIM:112203)和pIRESpuro質(zhì)粒(中科院生物化學(xué)研究所)分別加入E.CoRl和BamHl內(nèi)酶，37。C酶切l(wèi)小時(shí)，酶切產(chǎn)物分別經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化，兩個(gè)純化產(chǎn)物經(jīng)T4DNA連接酶24。C，lhr反應(yīng)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，Amp+培養(yǎng)基篩選陽性菌落，挑半個(gè)單克隆于5mLSOB液體培養(yǎng)基中，37°C，300rpm，6小時(shí)，質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)E.CoRI和BamHl酶切，經(jīng)電泳鑒定(參見圖2)。鑒定證明含pIRESpuro—B7-l的陽性單菌落的另一半于5mLSOB液體培養(yǎng)基37。C，300rpm，6小時(shí)擴(kuò)增，擴(kuò)增菌體加到200mLLB液體培養(yǎng)基中37。C300rpm，12小時(shí)，大量質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒，即得pIRESpuro—B7-l質(zhì)粒。圖2中1:MARK,lkbDNALadder;2:pIRESpuro質(zhì)粒；3:鑒定pIRESpuro—B7-l質(zhì)粒。(5)人B7-1基因轉(zhuǎn)染A549-IFN-Y細(xì)胞將A549-IFN^細(xì)胞鋪入6孔培養(yǎng)板中，每孔用含7%胎牛和7°/。小牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，37°C，5%<:02培養(yǎng)24小時(shí)，鋪入的細(xì)胞量為2-3xl()S個(gè)，細(xì)胞貼壁。將pIRESpuro—B7-l質(zhì)粒與lipofectamine脂質(zhì)體以l:20(含2嗎質(zhì)粒40pl脂質(zhì)體)的比例混合，加無血清的1640培養(yǎng)基至100nL，室溫靜止15-30分鐘，形成DNA-lipofectamine脂質(zhì)體的混合物。將培養(yǎng)A549-IFN-Y細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液去除，加入無血清1640培養(yǎng)液800pL，同時(shí)加入200nLDNA-lipofectamine脂質(zhì)體的混合物，混勻，培養(yǎng)6小時(shí)后，吸掉上層液體，每孔加入5mL1640完全培養(yǎng)液過夜(IO小時(shí)以上)，做細(xì)胞恢復(fù)。(6)轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞篩選每孔加入嘌呤霉素(puromycin)lmg/mL進(jìn)行篩選。兩周后篩選出具有嘌吟霉素抗性的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株，即A549-IFN-，B7-1細(xì)胞株。實(shí)施例2A549-IFN-Y細(xì)胞株基因表達(dá)的測定用ELISA試劑盒分別測定A549細(xì)胞株和A549-IFN-Y細(xì)胞株IFN-Y總的表達(dá)量和細(xì)胞外的分泌量。取對(duì)數(shù)生長期的A549細(xì)胞株和A549-IFN-Y細(xì)胞株，1640無血清培養(yǎng)液洗三次，收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)，每個(gè)細(xì)胞株分成2組，每組細(xì)胞濃度為lxl06個(gè)細(xì)胞/mL。于37。C無血清培養(yǎng)中培養(yǎng)24小時(shí)，第l組凍融三次，離心，取上清液，用ELISA試劑盒測定IFN-Y含量，即細(xì)胞IFN-Y總表達(dá)量；第2組取細(xì)胞外培養(yǎng)液，用ELISA試劑盒測定IFN-Y含量，即IFN-Y向細(xì)胞外分泌的量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表l所示。表1.八549細(xì)胞株和八549-正>11細(xì)胞株1>^7含量的測定*<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*為一式三份的平均數(shù)實(shí)施例3A549-IFN于B7-1細(xì)胞株B7-1基因表達(dá)測定A549-IFN-Y-B7-1細(xì)胞株B7-1基因表達(dá)測定分別收集lxl(/個(gè)A549細(xì)胞和A549-IFN-Y-B7-1細(xì)胞，采用間接免疫熒光法，用FITC標(biāo)記的鼠抗人單克隆抗體，流式細(xì)胞儀測B7—1分子的表達(dá)變化。表2.A549-IFN個(gè)B7-1細(xì)胞株B7-l基因表達(dá)量的測定*<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>如表2結(jié)果可見，A549-IFN-y-B7-1細(xì)胞B7-l分子表達(dá)為78.5%，是原A549細(xì)胞株B7—1分子表達(dá)(11.6%)的5.9倍。證明轉(zhuǎn)染成功，并高表達(dá)B7—l蛋白。實(shí)施例4復(fù)合型轉(zhuǎn)基因肺癌通用瘤苗制備(1)將穩(wěn)定表達(dá)的A549-IFN-，B7-1細(xì)胞株經(jīng)含10%小牛血清的1640培養(yǎng)基，在37。C，5。/。C02培養(yǎng)，收集對(duì)數(shù)生長的細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基洗細(xì)胞3次，計(jì)數(shù)，得穩(wěn)定表達(dá)的A549-IFN-y-B7-1細(xì)胞培養(yǎng)懸液。(2)在上述細(xì)胞培養(yǎng)懸液中加入粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落剌激因子(GM-CSF)和腫瘤細(xì)胞特異性抗原S18。裂解物，使每0.2ml注射液中含A549-IFN個(gè)B7-1細(xì)胞lxl06，GM-CSF45單位，20|11(200嗎)S咖腫瘤細(xì)胞特異性抗原(小鼠肉瘤細(xì)胞裂解物)。(3)用100radx50min劑量的Co60照射，得復(fù)合型轉(zhuǎn)基因肺癌通用瘤苗。實(shí)施例5小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)(1)動(dòng)物抑瘤實(shí)驗(yàn)NIH純種小鼠購自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心(合格證醫(yī)動(dòng)字22-9601018)，雄性，健康，體重為18-20g隨機(jī)分為6組，每組10只。每組于第ld，6d,14d分別進(jìn)行三次預(yù)防注射復(fù)合型轉(zhuǎn)基因肺癌通用瘤苗0.2ml/只小鼠，于第15d接種S180(購置浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，每只小鼠右前肢皮下接種0.5xl04個(gè)S180腫瘤細(xì)胞/0.2ml生理鹽水液。第21d和第28d進(jìn)行兩次治療注射瘤苗0.2m1/只小鼠。在實(shí)驗(yàn)中設(shè)生理鹽水為空白對(duì)照組，A549-IFN-，B7-1細(xì)胞、A549細(xì)胞為平行組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示；表4為添加適量免疫佐劑后瘤苗抑瘤作用;表5顯示在瘤苗中添加適量的S^腫瘤細(xì)胞特異性抗原后的抑瘤作用；表6顯示復(fù)合型轉(zhuǎn)基因肺癌通用瘤苗的抑瘤作用。表3.a549-ifn個(gè)b7-1細(xì)胞的抑瘤作用<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注ip為腹腔注射實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)照組生理鹽水組和A549組抑瘤率為10X，這是因?yàn)樾∈笠驗(yàn)樽⑸涞耐饨绱碳ひ鹆藱C(jī)體的免疫反應(yīng)，增加了對(duì)腫瘤的抵抗力；接種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞(A549-IFN-y-B7-1)的小鼠抑瘤率大于80%，說明轉(zhuǎn)基因細(xì)胞有明確的抑瘤作用。表4.添加免疫佐劑后轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的抑瘤實(shí)驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表4實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，添加GM-CSF為免疫佐劑的注射治療抑瘤率達(dá)90。/。，明顯提高了治療小鼠的抗瘤性，有效劑量為每注射物中含45單位GM-CSF。表5添加S，腫瘤細(xì)胞特異性抗原后轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的抑瘤作用<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注抗原量為小鼠S180裂解物的總蛋白的含量表5實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，添加S^)腫瘤細(xì)胞特異性抗原的注射治療抑瘤率達(dá)90%，較單一的A549-IFN-Y-B7-1細(xì)胞的抑瘤作用有明顯提高，有效劑量為腫瘤細(xì)胞特異性抗原S,8o裂解物總蛋白200pg。表6.復(fù)合型轉(zhuǎn)基因肺癌通用瘤苗的抑瘤作用<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示復(fù)合型轉(zhuǎn)基因肺癌通用瘤苗制備具有明顯高于單一轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的抑瘤作用，瘤苗抑瘤率可達(dá)100%。顯現(xiàn)了GM-CSF和腫瘤細(xì)胞特異性抗原S湖裂解物在該腫瘤治療中加強(qiáng)了小鼠肌體的針對(duì)性的免疫應(yīng)答。以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實(shí)施例子。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例子，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。權(quán)利要求1.一種復(fù)合型轉(zhuǎn)基因肺癌通用瘤苗，其特征是通過在建立穩(wěn)定表達(dá)人IFN-γ基因和人B7-1基因的A549細(xì)胞系中添加免疫增強(qiáng)劑制備獲得，所述免疫增強(qiáng)劑為粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子和腫瘤細(xì)胞特異性抗原S180裂解物，所述瘤苗具體通過以下步驟獲得(1)將穩(wěn)定表達(dá)的A549-IFN-γ-B7-1細(xì)胞株用1640全培養(yǎng)基擴(kuò)增培養(yǎng)，收集對(duì)數(shù)生長的細(xì)胞；(2)在上述細(xì)胞懸液中加入粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子和腫瘤細(xì)胞特異性抗原S180裂解物，使每0.2ml注射液中含A549-IFN-γ-B7-1細(xì)胞1×106，GM-CSF45單位，20μl(200ng)腫瘤細(xì)胞特異性抗原S180裂解物；(3)用100rad×50min劑量的Co60照射，得復(fù)合型轉(zhuǎn)基因肺癌通用瘤苗。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種復(fù)合型轉(zhuǎn)基因肺癌通用瘤苗，其特征是步驟(l)所述的含擴(kuò)增培養(yǎng)是用10%小牛血清的1640培養(yǎng)基，在37。C，5。/。CO2進(jìn)行。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種復(fù)合型轉(zhuǎn)基因肺癌通用瘤苗，其特征是步驟(1)所述的A549-IFN個(gè)B7-1細(xì)胞株是通過以下方法獲得(1)將人IFN-y基因雙酶切裝入pLXSN質(zhì)粒中，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞株，G418篩選得陽性克隆，得A549-IFN-y細(xì)胞株；(2)將人B7-l基因經(jīng)雙酶切裝入pIRESpuro質(zhì)粒，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入A549-IFN-Y細(xì)胞株，puromycin篩選得陽性克隆，得A549-IFN卞B7-1細(xì)胞株，其中人IFN-y基因經(jīng)E.CoRI和BamHI酶切；人B7-l基因經(jīng)E.CoRI和BamHI酶切。全文摘要本發(fā)明提供一種復(fù)合型轉(zhuǎn)基因肺癌通用瘤苗，是在建立穩(wěn)定表達(dá)人IFN-γ基因和人B7-1基因的A549細(xì)胞系中添加適量的GM-CSF和腫瘤細(xì)胞特異性抗原S₁₈₀裂解物制備獲得，每0.2ml注射液中含A549-IFN-γ-B7-1細(xì)胞1×10⁶，GM-CSF45單位，20μl(200ng)裂解物。本發(fā)明提供的肺癌通用瘤苗設(shè)計(jì)合理，可促進(jìn)各種T細(xì)胞識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原，系統(tǒng)性提高了抗腫瘤反應(yīng)；同時(shí)促進(jìn)DC細(xì)胞抗原提呈能力，明顯提高殺傷腫瘤能力；并在多個(gè)位點(diǎn)上誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性針對(duì)自體腫瘤的免疫應(yīng)答反應(yīng)，增強(qiáng)了機(jī)體殺傷相關(guān)腫瘤的能力。文檔編號(hào)A61K48/00GK101288773SQ20081006197公開日2008年10月22日申請(qǐng)日期2008年6月6日優(yōu)先權(quán)日2008年6月6日發(fā)明者于曉虹,劉祥麟,鋒史申請(qǐng)人:浙江大學(xué)