專利名稱：骨支架材料及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種可用于骨損傷修復的骨支架材料及其制備方法與應用。
背景技術：
骨組織工程是應用生物學和工程學的原理，研究開發(fā)能夠修復、維持和改善損 傷骨組織功能的生物替代物的一門學科。骨生物材料的開發(fā)與應用是骨組織工程中 研究的重要組成部分，理想的骨生物材料需要良好的生物相容性，合適的降解速度， 合適的孔徑,并能為創(chuàng)傷部位提供足夠的力學支持。目前,骨生物材料主要包括合成 的高分子有機材料，金屬植入材料，陶瓷植入材料及天然骨材料。天然材料主要包括 來源于動物的異種骨移植物，它與人類的骨組織有著相似的結構和組成，因此在骨 損傷修復中發(fā)揮著重要作用。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了一種骨支架材料及其制備方法。
本發(fā)明所提供的骨支架材料按照下述方法制備將松質骨進行脫脂、脫蛋白和
脫細胞處理，得到膠原質量百分含量為(23.35±3.04) g/100g、鈣質量百分含量 為(30.43±2) g/100g和孔徑為200um-500um的骨基質即為骨支架材料。 所述松質骨可直接從商業(yè)途徑獲得，或也可從屠宰的動物中獲得。 其中，可用現(xiàn)有的方法對所述骨垢的松質骨進行脫脂、脫蛋白和脫細胞處理， 如采用丙酮或氯仿和甲醇進行脫脂；采用SDS，胰酶或TitonX—100脫細胞和蛋白。 優(yōu)選采用如下方法對所述骨垢的松質骨進行脫脂、脫蛋白和脫細胞處理將松質骨 浸入氯仿和甲醇混合液體中6 — 24小時，然后再轉入TritonX-lOO和氨水混合溶液 中作用2 — 72小時。
所述的氯仿和甲醇混合液中，氯仿和甲醇的體積比可為1: 1。 所述TritonX-100和氨水混合溶液中，所述TritonX-100的體積百分含量為 0. 1%—2%，氨的質量百分含量為O. 3g/100ml;其中TritonX-100的體積百分含量 具體可為0. 2ml/100ml。
所述骨垢的松質骨在進行脫脂、脫蛋白和脫細胞處理前，可先放入PH為7.4 的磷酸鹽緩沖液中浸泡8-12小時。
上述制備所述的骨支架材料的方法也屬于本發(fā)明的保護范圍。上述骨支架材料與骨形態(tài)發(fā)生蛋白一2形成的復合物也屬于本發(fā)明的保護范
圍。該復合物能較好的發(fā)揮骨誘導效應，促進骨的再生。
本發(fā)明的骨支架材料不僅有合適的孔徑(200um-500um)，通過體外對大鼠成骨
細胞貼付，增殖及生存活力的分析及大鼠皮下包埋后免疫反應的分析發(fā)現(xiàn)該材料有
良好的細胞和組織相容性，力學性能分析顯示有較強的力學強度，合適的體內體外
降解速度，其中的膠原蛋白結合能與膠原特異結合的生長因子后能達到良好的體內
異位成骨效果。這種材料克服了傳統(tǒng)的煅燒骨不能與生長因子特異結合的缺點，也
克服了傳統(tǒng)脫鈣骨力學強度較弱的缺點，為生物材料在骨組織工程中的應用提供了
重要數據。


圖1為CCMBM的結構(A) CCMBM的整體照片，(B和C)掃描電鏡圖。
圖2為CCMBM的生物相容性(A)成骨細胞在CCMBM上培養(yǎng)2天的FDA染色，(B)成骨細胞在CCMBM上培養(yǎng)4天的FDA染色，(C)成骨細胞CCMBM上培養(yǎng)4天的FDA和Hoechest3342雙染色圖(D—F) CCMBM，未處理松質骨和黑橡膠，在大鼠皮下包埋14天后宏觀照片(G—L) CCMBM，未處理松質骨和黑橡膠包埋后在大鼠皮下包埋7天和14天然后切片進行服E染色，(G)CCMBM在大鼠皮下包埋7天，(H)未處理松質骨在大鼠皮下包埋7天，(I)黑橡膠在大鼠皮下包埋7天，(J) CCMBM在大鼠皮下包埋14天，(K)未處理松質骨在大鼠皮下包埋14天，(L)黑橡膠在大鼠皮下包埋14天。
圖3為加載BMP-2后CCMBM的誘骨能力(A)和(D)為實施例1的CCMBM (沒有復合因子的對照)，(B)和(E)為實施例1的CCMBM加天然BMP-2組，(C)和(F)為實施例1的CCMBM加帶有膠原結合區(qū)的BMP-2，細箭頭為實施例1的CCMBM降解區(qū)，粗箭頭為新生組織區(qū)，(D), (E)， (F)為(A)， (B)， (C)的的放大圖。
圖4為經純化和復性的帶膠原結合區(qū)的BMP-2蛋白進行15% SDS-PAGE檢測泳道M為Marker,泳道1為經純化的表達蛋白(還原條件下)，泳道2為經復性的表達蛋白。
具體實施例方式
現(xiàn)以骨垢的松質骨為例，闡明本發(fā)明的骨支架材料及其制備方法。1、取屠宰牛的大腿骨，分離骨垢的松質骨，將其切成片狀，去除周邊皮質骨以及邊緣密質骨，再將材料切成6X6X20mm的條狀。2、 將步驟l獲得的材料放于PBS緩沖液(pH3.4)中，浸泡8-12小時，期間不斷換液，并攪拌。
3、 脫脂處理將步驟2獲得的材料切成6X6X6mm的塊，放于體積比為l:l的氯仿和甲醇的混合液體中，攪拌6-24小時，然后在所述PBS中反復浸洗。
4J兌細胞和脫蛋白處理將步驟3獲得的材料切成2X6X6鵬的薄片，放于TritonX-100和氨水混合溶液(TritonX-100的終濃度為0. lml/100m1- 2ml/100ml，氨的終濃度為0. 3g/100ml)中作用2小時，攪拌，然后在所述的PBS中浸洗24小時，換液20次。
5.將步驟4獲得的材料在凍干機中凍干過夜，Co60輻照滅菌，得到部分脫蛋白骨基質(CCMBM)。
具體的實驗方法和結果見下述實施例。實施例l、骨支架材料的制備
1、 取屠宰牛的大腿骨，分離骨垢的松質骨，將其切成片狀，去除周邊皮質骨以及邊緣密質骨，再將材料切成6X6X20mm的條狀。
2、 將步驟1獲得的材料放于PBS緩沖液(P^7.4)中，浸泡8-12小時，期間不斷換液，并攪拌。
3、 脫脂處理將步驟2獲得的材料切成6X6X6mm的塊，放于體積比為l:l的氯仿和甲醇的混合液體中，攪拌8小時,然后在所述PBS中反復浸洗。
4J兌細胞和脫蛋白處理將步驟3獲得的材料切成2X6X6腿的薄片，放于TritonX-100和氨水混合溶液(TritonX-100的終濃度為2ml/100ml，氨的終濃度為0.3g/100ml)中作用2小時，攪拌，然后在所述的PBS中浸洗24小時，換液20次。
5.將步驟4獲得的材料在凍干機中凍干過夜，Co60輻照滅菌，得到部分脫蛋白骨基質(CCMBM)。
實施例2、 CCMBM的組成，孔徑及力學強度分析
實施例1得到的CCMBM為白色的多孔材料。使用掃描電子顯微鏡對CCMBM的超微結構進行分析，發(fā)現(xiàn)材料的孔徑為200mn—500um，它有利于細胞長入和營養(yǎng)運輸。為了解獲得的骨基質的組成，對CCMBM的膠原含量和鈣含量進行分析。
其中，測定實施例1的CCMBM的膠原含量的方法如下CCMBM于12mol/l的鹽酸中溶解，ll(TC烘干，按照文獻(Reddy GK， Enwemeka CS. A simplified method forthe analysis of hydroxyproline in biological tissues. Clin Biochem1996:29(3) :225-9.)中描述的方法測定540nm的OD值，以羥脯氨酸為標準物制作標準曲線，測出羥脯氨酸的量，換算為膠原的量。實驗重復三次。
測定鈣含量的方法如下CCMBM溶于0.6mo1/1的鹽酸溶液中，用鈣一甲酚酞絡合滴定法(參考Janssen JW， Helbing AR. Arsenazo III: an improvement of theroutine calcium determination in serum. Eur J Clin Chem Clin Biochem1991:29(3) :197-201.)滴定，計算出鈣含量。實驗重復三次。
結果表明實施例1的CCMBM的膠原含量為(23.35±3.04) g/100g、鈣含量為(30. 43±2) g/100g;
為了解實施例1的CCMBM的力學性能，對CCMBM及未處理的松質骨和脫鈣骨基質進行壓力、最大抗壓力和壓縮能的測試分析。
DBM用來源于屠宰牛的大腿骨的松質骨，松質骨經過丙酮浸泡48小時脫脂，然后在O. 6mol/l鹽酸中浸泡48小時脫鈣，最后凍干得到DBM。
其中，壓力、最大抗壓力、壓縮能測試分析的方法如下使用萬能壓力測試機(CMT8502) ， 6X6X6mm的CCMBM及未處理的松質骨和脫l丐骨基質以25毫米/分鐘的速度垂直施壓，根據壓力一形變的曲線確定最大抗壓力(曲線最高點)，硬度(曲線最大斜率)和壓縮能(最高點到零點之間的面積)。
結果表明實施例1的CCMBM的硬度為32. 05±8. 19N/mm、最大抗壓力為81. 15±25. 16N和壓縮能為104. 04±41. 59N. mm;實施例1中的未處理的松質骨的硬度為75.7士17.4N/腿、最大抗壓力為161.5±23. 3N和壓縮能為173.3±15.37N. ram;由實施例1的松質骨制備的脫鈣骨基質的硬度為3. 04±1. 09N/ram、最大抗壓力為13. 7±6. 71N和壓縮能為30. 825±15. 1N.腦。
壓力測試分析的結果顯示，實施例1的CCMBM的硬度、最大抗壓力和壓縮能都高于脫鈣骨基質，這說明按照上述的方法獲得的骨基質比脫鈣骨基質有更好的抗壓能力。
實施例3、 CCMBM降解特性分析
為了解實施例1的CCMBM的降解特性，對實施例1的CCMBM進行體外降解實驗和體內降解實驗分析。實驗重復三次。體外降解實驗方法如下
將凍干的CCMBM浸泡于pH=7. 4 PBS緩沖液(Hyclone)中，兩天換液一次，在10，20， 30， 40， 50和60天分別取出凍干后稱重，計算剩余質量占原質量的百分比。
6體外降解實驗的結果顯示，實施例1的CCMBM在PBS緩沖液中降解10， 20， 30，40， 50和60天后測定其剩余的質量分別為99. 8±0. 23%、 99. 04±0. 27%、98. 34±0. 21%、 97. 94±0. 52%、 97. 45±0. 62%和96. 23% ±0. 47% 。
體內降解實驗方法為將實施例1的CCMBM在SD大鼠體內包埋60天后，取出，做切片及服E。
體內降解實驗表明，實施例1的CCMBM在SD大鼠體內包埋60天后，剩余材料面積為79%±9.2%。這說明實施例1的CCMBM在體外有較強的穩(wěn)定性，在體內的降解速率適宜。
實施例4、 CCMBM的生物相容性分析
實施例1的CCMBM的生物相容性分析可通成骨細胞在CCMBM上的增殖，存活，CCMBM釋放物質的毒性進行評價。
成骨細胞(ATCC貨號CRL-2593，品名MC3T3-El)與實施例1的CCMBM共培養(yǎng)培養(yǎng)方法如下將成骨細胞接種于60mm直徑的培養(yǎng)皿中，將實施例1的CCMBM放于transwell培養(yǎng)容器中(使液體可在transwell和培養(yǎng)皿中自由交換，但與成骨細胞并無直接接觸，以檢測材料釋放物質對細胞的毒性。用MTT法測定的結果來反應細胞的生長情況，MTT實驗中測出的OD值與細胞數呈線性正相關。
檢測成骨細胞在實施例1的CCMBM上的增殖和存活則直接將成骨細胞接種到實施例1的CCMBM上，進行染色分析。采用熒光素雙醋酸酯(FDA)染色法、Hoechest33342 /FDA雙染色法檢測分析成骨細胞的存活和增殖能力。實驗重復三次。
Hoechest33342 /FDA雙染色法中FDA只染活細胞，Hochest33342可以染全部細胞，因此細胞存活率FDA陽性細胞/Hoechest33342細胞X 100%。
實施例1的CCMBM的FDA染色及Hoechest33342/FDA染色雙法檢測結果顯示成骨細胞在CCMBM上的存活率高達98. 45/100±1. 1/100;
MTT實驗結果表明，與實施例1的CCMBM共培養(yǎng)的成骨細胞的細胞生長情況與單獨培養(yǎng)的0D值相似，值為0.555士0. 077(4天)，0. 829±0. 057 (8天)。單獨培養(yǎng)的成骨細胞的0D值為0. 578±0. 066(4天)，0. 815±0. 054(8天)。上述結果表明，實施例1的CCMBM的釋放物質對細胞的增殖無負面影響。
實施例1的CCMBM、未處理的松質骨和黑橡膠分別包埋到SD大鼠皮下，每只包埋0. 2g， 7天和14天后分別取出做切片和服E染色。結果如圖2 (G-L)所示，實施例1的CCMBM有較少的免疫細胞及血細胞滲漏，而未處理的材料和黑橡膠有較多的免疫細胞入侵和血管滲漏現(xiàn)象。
綜上所述，實施例1的CCMBM比未處理的松質骨和黑橡膠有更好的生物相容性。
實施列5、 CCMBM加載骨形態(tài)發(fā)生蛋白一2后體內誘骨能力的檢測
一、帶有膠原結合區(qū)的BMP-2的制備
1、帶有膠原結合區(qū)的BMP-2原核表達載體的構建
根據已知的人BMP2 (hBMP2)的cDNA序列(GenBank號為:650)設計PCR擴增引物，并在正向引物中引入膠原結合結構域(CBD) "TKKTLRT"(序列表中的SEQID N2: 1)的編碼序列，引物序列如下
hBMP2Fl: 5' -TACCGGTAGCGCGGGCAGTGCTGCGGGTTCTGGCGGTGTCGACCAAGCCAAACAC
-3，
畫P2F2: 5' -CCGCATATGACTAAGAAAACCCTGCGTACTGGTACCGGTAGC-3'hBMP2R: 5， -CCGCTCGAGCTATTAACGACAACCACAACC-3，
提取人的總RNA，反轉錄為cDNA,以此為模板，在引物hBMP2Fl和hBMP2R的引導下進行PCR擴增，30y 1 PCR反應體系為正、反向引物各lpmol/ul、 dNTPs200u mol/ti 1、 Taq酶3ul; PCR反應條件為先94。C預變性5min;然后94。C變性30s， 55。C退火lmin， 72。C延伸lmin，循環(huán)30次；最后72°C延伸10min。反應結束后，對擴增產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果經PCR擴增得到一條長度約400bp的DNA片段。對該片段進行回收并純化后，作為第二次PCR的模板，再在引物hBMP2F2和hBMP2R的引導下進行第二次PCR擴增，PCR反應體系及反應條件同上，擴增結束后，對PCR產物進行1.5X瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果得到一條長度約430bp的條帶，對其進行回收并純化后，用限制性內切酶vWe I和J力o I雙酶切后與經相同酶雙酶切的原核表達載體pET-28a (Novagen)在16。C下，用T4麗A連接酶連接12-24小時，將連接產物轉化大腸桿菌DH5 ct感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，提質粒，對該表達載體多克隆位點區(qū)進行測序，結果插入序列與預期序列相符，具有序列表中SEQ ID N2: 3的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID N2: 3由477個堿基組成，編碼序列表中SEQ ID N2: 2的氨基酸殘基序列，包括CBD區(qū)，linker區(qū)和hBMP2成熟肽編碼區(qū)，在插入區(qū)前還融合一段組氨酸親和標簽，其CBD區(qū)的保守序列為序列表中SEQ ID N2: 2自氨基端第22-28位氨基酸殘基，linker區(qū)為自氨基端第31-43位氨基酸殘基，hBMP2成熟肽為自氨基端第46-159位氨基酸殘基，表明
8得到了正確的含有帶有膠原結合區(qū)的BMP-2編碼序列的重組質粒，命名為
pET-28a-BMP2-h。
2、 帶有膠原結合區(qū)的BMP-2的原核表達
將步驟1構建的原核表達載體pET-28a-BMP2-h轉化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細胞，將篩選到的陽性單克隆轉接于LB液體培養(yǎng)基中，37。C培養(yǎng)12-24小時，再以2%接種比例轉接于100mL LB液體培養(yǎng)基中，37。C培養(yǎng)3小時至OD咖值達到0. 8，加入終濃度為lmM的IPTG，相同條件下繼續(xù)誘導培養(yǎng)4小時。培養(yǎng)結束后，離心收集菌體，用PBS洗滌后再次離心收集菌體，用10mL PBS重懸菌體，超聲破碎菌體，對裂解液進行15% SDS-PAGE檢測，檢測結果表明得到了蛋白粗提液，表達蛋白以包涵體的形式存在。
3、 帶有膠原結合區(qū)的BMP-2的純化和復性
首先將步驟2經超聲破碎的菌體離心收集包涵體。將稀釋復性得到的蛋白溶液進行超濾濃縮處理，然后將蛋白質溶劑體系用50raMMES緩沖液(GIBCO)置換，冷凍干燥后低溫保存。對經純化和復性的表達蛋白進行15% SDS-PAGE檢測，檢測結果如圖4所示(泳道M為Marker，泳道l為經純化的表達蛋白(還原條件下)，泳道2為經復性的表達蛋白)，泳道1的純化結果表明15KD的目的蛋白已經達到相當純度，由于BMP2的活性形式是通過一對二硫鍵形成的二聚體形式，在非還原條件下可看到其二聚體條帶，泳道2的檢測結果表明復性形成的二聚體已達到30%，將經純化的帶有膠原結合區(qū)的BMP-2命名為rhBMP2-h。
二、體內誘骨能力的檢測
實驗分三組天然BMP2組、帶有膠原結合區(qū)的BMP-2 (rhBMP2-h)組和對照組。首先將實施列1的CCMBM制成lcmX lcmX 0. lcm的正方形薄片，將5mg實施例1的CCMBM用總量為0. 3聽1的BMP-2 (sigma， B3555)溶液浸泡(天然BMP2組)，同時將5mg實施例1的CCMBM用總量為0. 3nmo1的rhBMP2-h溶液浸泡(rhBMP2-h組)，使實施例1的CCMBM與天然BMP-2和帶有膠原結合區(qū)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白一2(rhBMP2-h)結合，對照組只加載PBS，冷凍干燥后備用。
選用成年雄性SD大鼠，背部皮下包埋制備好的上述加載不同蛋白的CCMBM材料塊。包埋8周后，取出包埋物，切片并進行HE染色，結果如圖3所示，加載天然BMP2的實驗組植入的CCMBM材料塊及組織學切片觀察結果，由于BMP-2本身具有異位誘骨能力，啟動了一定的骨化過程，誘導了少量間充質細胞向骨系細胞分化，因而分泌出少量膠原基質和鈣離子沉積于材料之上，其組織學切片顯示有少量編織骨(woven bones， WB)形成。rhBMP2-h的實驗組的CCMBM材料塊及組織學切片觀察結果，改造過的rhBMP2-h與CCMBM的膠原具有特異的結合作用，且作用力較強，植入體內不易擴散稀釋，始終在作用位點保持較高的濃度，誘導大量間充質細胞向骨系細胞分化。分化形成的骨系細胞又可以分泌出大量新的膠原基質和l丐離子沉積在原有CCMBM材料上，原材料降解釋放出的rhBMP2-h又有部分可能結合在新形成的膠原上，組織學切片顯示有板層骨(lamella bones, LB)形成，并可見骨基質(bone marrows)形成。
上述結果表明復合物CCMBM/BMP-2和CCMBM/rhBMP2-h包埋到大鼠背部皮下，能產生較好的異位骨形成。序列表
〈110〉煙臺正海生物技術有限公司〈120〉骨支架材料及其制備方法與應用
<130>
<160〉3
<210〉1<211〉7〈212〉 PRT<213〉人工序列
〈400>1
Thr Lys Lys Thr Leu Arg Thr1 5
<210>2<211〉159<212>PRT<213〉人工序列
<400〉2
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
15 10 15
Arg Gly Ser His Met Thr Lys Lys Thr Leu Arg Thr Gly Thr Gly Thr
20 25 30
Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Gly Val Asp Gin Ala Lys35 40 45His Lys Gin Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu
50 55 60
Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp lie Val Ala Pro 65 70 75 80
Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu
85 90 95
Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala lie Val Gin Thr Leu Val
100 105 110
Asn Ser Val Asn Ser Lys lie Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu
115 120 125
Leu Ser Ala lie Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val
130 135 140
Leu Lys Asn Tyr Gin Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg
<210〉3 <211〉477 <212>DNA 〈213〉人工序列
〈400〉3
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60
atgactaaga aaaccctgcg tactggtacc ggtagcgcgg gcagtgctgc gggttctggc 120
ggtgtcgacc aagccaaaca caaacagcgg aaacgcctta agtxcagctg taagagacac 180
cctttgtacg tggacttcag tgacgtgggg tggaatgact ggattgtggc tcccccgggg 240
tatcacgcct tttactgcca cggagaatgc ccttttcctc tggctgatca tctgaactcc 300
actaatcatg ccattgttca gacattggtc aactctgtta actctaagat tcctaaggca 360
tgctgtgtcc cgacagaact cagtgctatc tcgatgctgt accttgacga gaatgaaaag 420
gttgtattaa agaactatca ggacatggtt gtggagggtt gtggttgtcg ttaatag 47權利要求
1、一種骨支架材料，是將松質骨進行脫脂、脫蛋白和脫細胞處理得到的膠原質量百分含量為(23.35±3.04)g/100g、鈣質量百分含量為(30.43±2)g/100g和孔徑為200um-500um的骨基質。
2、 根據權利要求1所述的骨支架材料，其特征在于所述松質骨按照如下方法 進行脫脂、脫蛋白和脫細胞處理將松質骨浸入氯仿和甲醇混合液體中6-24小時， 優(yōu)選為8小時；然后再轉入TritonX-100和氨水混合溶液中作用2-72小時，優(yōu)選為 24小時。
3、 根據權利要求2所述的骨支架材料，其特征在于所述氯仿和甲醇混合液中，氯仿和甲醇的體積比為l: 1。
4、 根據權利要求2或3所述的骨支架材料，其特征在于所述TritonX-IOO和 氨水混合溶液中，所述TritonX-100的體積百分含量為0. 1%-2%，氨的質量百分含量 為0. 3%。
5、 制備權利要求1-4中任一所述的骨支架材料的方法，是將松質骨進行脫脂、 脫蛋白和脫細胞處理，得到的膠原質量百分含量為(23.35士3.04)g/100g、鈣質量百 分含量為(30. 43±2)g/100g和孔徑為200um-500um的骨基質即為骨支架材料。
6、 根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述松質骨按照如下方法進行脫 脂、脫蛋白和脫細胞處理將松質骨浸入氯仿和甲醇混合液體中6-24小時，優(yōu)選為8 小時；然后再轉入TritonX-100和氨水混合溶液中作用2-72小時，優(yōu)選為8小時。
7、 根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述氯仿和甲醇混合液中，氯仿 和甲醇的體積比為l: 1。
8、 根據權利要求6或7所述的方法，其特征在于所述TritonX-100和氨水混 合溶液中，所述TritonX-100的體積百分含量為0. 1%-2%，氨的質量百分含量為0. 3%。
9、 一種骨支架材料，是權利要求1-4中任一所述的骨支架材料與骨形態(tài)發(fā)生蛋 白一2形成的復合物。
10、 權利要求l、 2、 3、 4或9所述骨支架材料在制備骨支架中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種骨支架材料及其制備方法。本發(fā)明所提供的骨支架材料，是將骨垢的松質骨進行脫脂、脫蛋白和脫細胞處理得到的膠原質量百分含量為(23.35±3.04)g/100g、鈣質量百分含量為(30.43±2)g/100g、孔徑為200um-500um的骨基質。其中，脫脂、脫蛋白和脫細胞的處理方法是將松質骨浸入氯仿和甲醇混合液體中6-24小時，優(yōu)選為8小時；再轉入TritonX-100和氨水混合溶液中作用2-72小時，優(yōu)選為8小時。該方法獲得的骨基質材料其力學抗壓性能有明顯的提高，有較好的體外穩(wěn)定性，并能在體內逐步降解，有良好的細胞和組織相容性。同時，獲得的骨基質上的膠原蛋白質可與骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2結合，結合后的復合物能較好的發(fā)揮骨誘導效應。
文檔編號A61L27/56GK101496914SQ20081005756
公開日2009年8月5日 申請日期2008年2月3日 優(yōu)先權日2008年2月3日
發(fā)明者孫先昌, 群 董, 趙燕南, 馬百聚 申請人:煙臺正海生物技術有限公司