專利名稱：：一種胸腺肽α₁PLGA緩釋微球制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種治療用多肽的藥物制劑，具體涉及到胸腺肽CL1的PLGA緩釋微球制劑及其制備方法和用途，屬于藥物制劑領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：胸腺肽a1(thymosina1，簡稱Ta1)是一種具有免疫功能的多肽，臨床上多用于免疫增強或治療病毒性肝炎，其氨基酸序列為AC-Ser-Asp-A1a-A1a-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-lie-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Va1-Va1-Glu-Glu-A1a-Glu-Asn—-OH分子式C129H215N33055-分子量3108.37現(xiàn)有Tat制劑由于半衰期短治療時間長，需要頻繁給藥，具有病人順應(yīng)性較差而且生物利用度低等缺點。微球制劑通過將胸腺肽Tc^包裹在球體內(nèi)，緩慢、可控的釋放胸腺肽Ta"使患者可以通過注射一次Tal微球制劑，達到較長期的治療目的。PLGA(乳酸-羥基乙酸共聚物)是生物可降解材料，有良好的生物相容性和安全性，體內(nèi)降解為二氧化碳和水，常用于制備注射微球制劑。PLGA可由乳酸和羥基乙酸聚合，或用丙交酯和乙交酯經(jīng)有機錫催化聚合。目前關(guān)于胸腺肽ai微球的報道較多，如朱艷等(胸腺肽a1微球的制備及其評價，藥學(xué)服務(wù)與研究，2005，vol(5)3:248251)將lmgTa1溶于50的純水中作為內(nèi)水相,與濃度為200mg/mL的PLGA(50:50,特異性黏度為19mL/g)的CH2Cb溶液500uL混合,冰浴條件下超聲乳化(400ms/次，IO次)制成初乳,將初乳滴加到一定濃度(3%,w/v)PVA1788水溶液(30mL)中，高速攪拌(1OOOr/min)2min得復(fù)乳，并將其立即用約150mL蒸餾水稀釋，低速攪拌4h，離心收集微球,蒸餾水洗滌3次,冷凍干燥24h。由此制備得到微球的包封率為(85.2±2.2)%、(87.6±3.5)%、(86.6±2.7)%，理論載藥量為1%。朱艷等(胸腺肽al緩釋注射微球的研究，藥學(xué)學(xué)報，vol(42)2:211215')報道取一定量Ta1凍干粉，用10mmol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液100PL將凍干粉溶解作為內(nèi)水相，與PLGA的CH2Cl2溶液(質(zhì)量濃度為200mg/mL)混合，在冰浴條件下超聲乳化(400ms/次，10次)后制成初乳，將初乳快速滴加到含有5%NaCl或10%葡萄糖的3%(w/v)PVA水溶液30mL中，1200rmin"攪拌2min得到復(fù)乳，并將其立即用蒸餾水約100mL稀釋，低速攪拌(400r/min)4h,離心收集微球,蒸餾水洗滌3次，冷凍干燥24h制得微球。ZL02136181.9公開了由3~5mg的胸腺肽a1與10ml5~20%PLGA(25:75，分子量為3000)二氯甲垸溶液制備得到的微球，包封率20。/。左右。ZL200610118413.5公開了由胸腺肽a1與PLGA(25:75~75:25，分子量3000-40000)重量比為0.5:100至5:100的微球，微微球室溫粒徑〈00um。具體公開了微球包封率為87.8%、卯.2°/。，理論載藥量球1%的微球制劑及其制備工藝。就包封率和載藥量的關(guān)系進行舉例說明一方面，在相同制劑條件下，100個單位體積PLGA比50個單位體積PLGA更能將1個單位體積的胸腺肽cm包封完全，使制備和生產(chǎn)時投入的胸腺肽cm更多的被載入藥物，提高胸腺肽c^的包封率，實現(xiàn)藥物制劑的經(jīng)濟化生產(chǎn)。另一方面，高劑量PLGA的投入必然導(dǎo)致微球載藥量的下降，即由100個單位體積PLGA包封得到的胸腺肽ai微球的載藥量必然小于50個單位體積PLGA包封得到微球載藥量(載藥量-微球中藥物的重量/微球重量)。鑒于PLGA的售價較高，約為12-25美元/g，較大量PLGA的使用必然提高藥品生產(chǎn)成本，同時要求較高的生產(chǎn)設(shè)備容量和設(shè)備負載率，并需要使用大量的動力，消耗大量能源，不適合節(jié)能減排和建設(shè)集約型社會的方向。朱艷(胸腺肽alphal長效注射微球的研究[C]，第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)位論文)報道隨著藥物與PLGA比例的增加，微球的載藥量相應(yīng)提高，微球的包封率降低。微球制劑是一種非常復(fù)雜的劑型，制藥界迫切需要解決微球制備工藝中載藥量和包封率此消彼長的問題，實現(xiàn)具有高載藥量和高包封率的微球制劑及其制備工藝。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種胸腺肽a!的PLGA緩釋微球，其中胸腺肽cx,與PLGA的含量比例為0.510:100，PLGA的粘度范圍為0.41.2dl/g。進一步的，胸腺肽ai與PLGA的含量比例為19:100，PLGA的粘度范圍為0.5-0.94dl/g。更進一步的胸腺肽ai與PLGA的含量比例為1.5~8:100，PLGA的粘度范圍為0.55~0.75dl/g。所述PLGA，優(yōu)選聚乳酸與羥基乙酸的比例為50:50的PLGA。此外，本發(fā)明還公開了一種制備胸腺肽a,PLGA緩釋微球的方法，包括下列步驟組成(1)將處方量的Tal,溶于pH6.58.0的緩沖溶液中；得水相，備用；(2)將處方量的PLGA溶于二氯甲烷，得油相，備用；(3)將水相注入油相中，乳化5-20分鐘，得初乳(W/O),備用；(4)將初乳投入含PVA以及NaCl或葡萄糖的低于初乳溫度的水溶液中，攪拌，再加入相同溫度、含相同PVA以及NaCl或葡萄糖濃度的水溶液中，攪拌112小時；(5)過濾、洗滌，冷凍干燥，得微球。本發(fā)明進一步公開了一種制備胸腺肽aPLGA緩釋微球的方法，包括-(1)將處方量的Tal溶于pH7.4的磷酸鹽緩沖液中，使Tal的濃度為25~100mg/ml，得水相，備用；(2)將處方量的PLGA溶于二氯甲垸中，使PLGA的濃度為50500mg/ml，得油相，備用；(3)在10-25。C條件下，將乳化機轉(zhuǎn)速調(diào)至1500-8000轉(zhuǎn)/分，將水相注入油相中，乳化，得油包水型初乳，備用；(4)將含1~10%PVA，以及l(fā)~10%NaCl或葡萄糖的水溶液冷至低于初乳的溫度以下，攪拌轉(zhuǎn)速300-2000轉(zhuǎn)/分的條件下，將初乳加入其中，攪拌，再加入相同溫度，相同濃度的PVA以及NaCl或葡萄糖的水溶液中攪拌1~12小時；停止攪拌，過100-200目篩，過濾，洗滌，抽干，冷凍干燥，得微球。低包封率造成胸腺肽a,的大量流失和浪費;低的載藥量造成實際單位重量PLGA能負載胸腺肽ai的量非常少，而患者為了達到治療目的一般需要注射一定量的胸腺肽ap這就意味著需要大量注射該微球，造成注射時巨大的痛苦和高額的醫(yī)療費用支出；同時低載藥量的微球勢必消耗大量的PLGA，使生產(chǎn)難度、能源消耗與制造成本大幅升高。本發(fā)明發(fā)明人在科研實踐中，為解決包封率升高和載藥量下降，或者載藥量升高包封率下降的問題耗費了大量的人力物力和時間。由本發(fā)明的技術(shù)方案制備得到的胸腺肽cn微球，在大幅升高載藥量的同時仍保持了極高的胸腺肽ai包封率，具有突出的實質(zhì)性特點和顯著的進步。以下以具體的例子進行說明，但并不對本發(fā)明進行限制。說明書附h實施例l制備的微球的釋放度曲線圖2:實施例2制備的微球的釋放度曲線圖3:實施例3制備的微球的釋放度曲線圖4:實施例4制備的微球的釋放度曲線圖5:實施例5制備的微球的釋放度曲線圖6:實施例6制備的微球的釋放度曲線圖7:實施例7制備的微球的釋放度曲線圖8:實施例8制備的微球的釋放度曲線圖9:實施例9制備的微球的釋放度曲線具體實施方式實施例lTall.OgPLGA(50/50)(0.95~1.2dl/g)26.0g制備工藝在常溫條件下將處方量的Tal，加入到30mlpH7.4的磷酸鹽緩沖液中，使其完全溶解，得水相，備用；將處方量的PLGA在常溫條件下，加入到400ml二氯甲烷中，使之完全溶解，得油相，備用；在10-25'C條件下，將乳化機轉(zhuǎn)速調(diào)至2000-2800轉(zhuǎn)/分，將水相注入油相中，乳化5-10分鐘，得初乳(0/W)，備用；將含3%PVA，5%NaCl的水溶液800ml冷至l(TC以下，將攪拌機轉(zhuǎn)速調(diào)至500-1000轉(zhuǎn)/分，加入初乳，攪拌2分鐘，再加入相同溫度的含3%PVA，5%NaCl的水溶液200ml，得復(fù)乳(W/O/W),在1200~1800轉(zhuǎn)/分條件下攪拌3小時，過IOO目篩，抽濾、抽干，用蒸餾水洗滌2次，抽干，冷凍干燥，得微球。實施例2Tall.OgPLGA(50/50)(0.40~0.56dl/g)32.0g制備工藝在常溫條件下將處方量的Tal，加入到30mlpH7.4的磷酸鹽緩沖液中，使其完全溶解，得水相，備用；將處方量的PLGA在常溫條件下，加入到100ml二氯甲烷中，使之完全溶解，得油相，備用；在10-25。C條件下，將乳化機轉(zhuǎn)速調(diào)至2500-3200轉(zhuǎn)/分，將水相注入油相中，乳化5-10分鐘，得初乳(OAV)，備用；將含2。/。PVA，5。/。NaCl的水溶液1600ml冷至1(TC以下，將攪拌機轉(zhuǎn)Jl調(diào)至500-1000轉(zhuǎn)/分，加入初乳，攪拌2分鐘，再加入相同溫度的含2%PVA，3%NaCl的水溶液400ml，得復(fù)乳(W/O/W),在500~1000轉(zhuǎn)/分條件下攪拌3小時，過IOO目篩，抽濾、抽干，用蒸餾水洗漆2次，抽干，冷凍干燥，得微球。實施例3Tall.OgPLGA(65/35)(0.55~0.75dl/g)30.0g制備工藝在常溫條件下將處方量的Tal，加入到20mlpH7.4的磷酸鹽緩沖液中，使其完全溶解，得水相，備用；將處方量的PLGA在常溫條件下，加入到200ml二氯甲烷中，使之完全溶解，得油相，備用；在10-25'C條件下，將乳化機轉(zhuǎn)速調(diào)至3200-3800轉(zhuǎn)/分，將水相注入油相中，乳化5-10分鐘，得初乳(0/W)，備用；將含2。/。PVA，2。/。NaCl的水溶液2500ml冷至10。C以下，將攪拌機轉(zhuǎn)速調(diào)至600-1200轉(zhuǎn)/分，加入初乳，攪拌5分鐘，再加入相同溫度的含2%PVA，2°/。NaCl的水溶液400ml，得復(fù)乳(W/0/W)，在600~1200轉(zhuǎn)/分條件下攪拌3小時，過IOO目篩，抽濾、抽干，用蒸餾水洗滌2次，抽干，冷凍干燥，得微球。實施例4Tall.OgPLGA(85/15)(0.55~0.75dl/g)38.5g甘露醇l.Og制備工藝在常溫條件下將處方量的Tal和甘露醇，加入到35mlpH7.4的磷酸鹽緩沖液中，使其完全溶解，得水相，備用；將處方量的PLGA在常溫條件下，加入到400ml二氯甲垸中，使之完全溶解，得油相，備用；在10-25。C條件下，將乳化機轉(zhuǎn)速調(diào)至3800-4300轉(zhuǎn)/分，將水相注入油相中，乳化5-10分鐘，初乳(0/W)，備用；將含2。/。PVA，2。/。NaCl的水溶液3500ml冷至l(TC以下，將攪拌機轉(zhuǎn)速調(diào)至600-1200轉(zhuǎn)/分，加入初乳，攪拌5分鐘，再加入相同溫度的含2%PVA，2%NaCl的水溶液1500ml，得復(fù)乳(W/0/W)，在600-1200轉(zhuǎn)/分條件下攪拌3小時，過IOO目篩，抽濾、抽干，用蒸餾水洗滌2次，抽干，冷凍干燥，得微球。實施例5Tall.OgPLGA(50/50)(0.76~0.94dl/g)32.0gPEG-60001.0g制備工藝在常溫條件下將處方量的Tal和PEG-6000,加入到40mlpH7.4的磷酸鹽緩沖液中，使其完全溶解，得水相，備用；將處方量的PLGA在常溫條件下，加入到280ml二氯甲烷中，使之完全溶解，得油相，備用；在10-25'C條件下，將乳化機轉(zhuǎn)速調(diào)至4000-4500轉(zhuǎn)/分，將水相注入油相中，乳化5-10分鐘，初乳(OAV)，備用；將含2%PVA，2%NaCl的水溶液4000ml冷至10°C以下，將攪拌機轉(zhuǎn)速調(diào)至600-1200轉(zhuǎn)/分，加入初乳，攪拌5分鐘，再加入相同溫度的含2%PVA，2%NaCl的水溶液2000ml，得復(fù)乳(W/0/W)。在600-1200轉(zhuǎn)/分條件下攪拌3小時，過100目篩，抽濾、抽干，用蒸餾水洗滌2次，抽干，冷凍干燥，得微球。實施例6Tall.OgPLGA(25/75)(0.76~0.94dl/g)11.Og制備工藝在常溫條件下將處方量的Tal和甘露醇，加入到30mlpH7.4的磷酸鹽緩沖液中，使其完全溶解，得水相，備用；將處方量的PLGA在常溫條件下，加入到280ml二氯甲烷中，使之完全溶解，得油相，備用；在10-25'C條件下，將乳化機轉(zhuǎn)速調(diào)至4000-4500轉(zhuǎn)/分，將水相注入油相中，乳化5-10分鐘，初乳(0/W)，備用；將含2%PVA，1.5%NaCl的水溶液3000ml冷至10°C以下，將攪拌機轉(zhuǎn)速調(diào)至600-1200轉(zhuǎn)/分，加入初乳，攪拌5分鐘，再加入相同溫度的含2°/。PVA，1.5%NaCl的水溶液lOOOml，得復(fù)乳(W/O/W)。在600-1200轉(zhuǎn)/分條件下攪拌3小時，過IOO目篩，抽濾、抽干，用蒸餾水洗滌2次，抽干，冷凍干燥，得微球。實施例7Tall.OgPLGA(50/50)(0.76~0.94dl/g)28.0g制備工藝在常溫條件下將處方量的Tal，加入到30mlpH7.4的磷酸鹽緩沖液中，使其完全溶解，得水相，備用；將處方量的PLGA在常溫條件下，加入到450ml二氯甲烷中，使之完全溶解，得油相，備用；在10-25X:條件下，將乳化機轉(zhuǎn)速調(diào)至4000-4500轉(zhuǎn)/分，將水相注入油相中，乳化5-10分鐘，初乳(0/W)，備用；將含3°/。PVA，5%NaCl的水溶液6000ml冷至10°C以下，將攪拌機轉(zhuǎn)速調(diào)至600-1200轉(zhuǎn)/分，加入初乳，攪拌5分鐘，再加入相同溫度的含2%PVA，2%NaCl的水溶液2000ml，得復(fù)乳(W/0/W)，在6001200轉(zhuǎn)/分條件下攪拌3小時，過100目篩，抽濾、抽干，用蒸餾水洗滌2次，抽干，冷凍干燥，得微球。實施例8Tall.OgPLGA(75/25)(0.76~0.94dl/g)30.0g甘露醇l.Og制備工藝在常溫條件下將處方量的Tal，加入到35mlpH7.4的磷酸鹽緩沖液中，使其完全溶解，得水相，備用；將處方量的PLGA在常溫條件下，加入到500ml二氯甲垸中，使之完全溶解，得油相，備用；在10-25'C條件下，將乳化機轉(zhuǎn)速調(diào)至4000-4500轉(zhuǎn)/分，將水相注入油相中，乳化5-10分鐘，初乳(0/W)，備用；將含2y。PVA，8°/。葡萄糖的水溶液6000ml冷至10'C以下，將攪拌機轉(zhuǎn)速調(diào)至600-1200轉(zhuǎn)/分，加入初乳，攪拌5分鐘，再加入相同溫度的含2°/。PVA，8°/。葡萄糖的水溶液2000ml，得復(fù)乳(W/0/W)，在600~1200轉(zhuǎn)/分條件下攪拌3小時，過100目篩，抽濾、抽干，用蒸餾水洗滌2次，抽干，冷凍干燥，得微球。實施例9Tall.OgPLA(0.26~0.54dl/g)59.0g制備工藝在常溫條件下將處方量的Tal，加入到30mlpH7.4的磷酸鹽緩沖液中，使其完全溶解，得水相，備用；將處方量的PLA在常溫條件下，加入到200ml二氯甲烷中，使之完全溶解，得油相，備用；在10-25'C條件下，將乳化機轉(zhuǎn)速調(diào)至3500-4000轉(zhuǎn)/分，將水相注入油相中，乳化5-10分鐘，得初乳(0/W)，備用；將含3°/。PVA，5°/。NaCl的水溶液3500ml冷至10°C以下，將攪拌機轉(zhuǎn)速調(diào)至600-1200轉(zhuǎn)/分，加入初乳，攪拌5分鐘，再加入相同溫度的含3%PVA,5%NaCl的水溶液1500ml，得復(fù)乳(W/0/W)，在6001200轉(zhuǎn)/分條件下攪拌3小時過100目篩，抽濾、抽干，用蒸餾水洗滌2次，抽干，冷凍干燥，得微球。以下分別按照所述方法進行微球載藥量和包封率、釋放度、有機溶劑殘留的測定。微球中Tal含量測定方法精密稱定微球約20mg，加入0.5mlCH2Cl2，渦旋使之溶解，加入2.5mlpH7.4的磷酸鹽緩沖液，渦旋3分鐘使之溶解，3000r/min離心7分鐘，靜置，取上清液備用，下層液體加入2.5mlpH7.4的磷酸鹽緩沖液，渦旋3分鐘，3000r/min離心7分鐘，靜置，取上清液備用，將兩次所得上清液合并，.即為供試品，取供試品進行HPLC測定，計算Tal含量。微球包封率的測定將實際測定的Tal含量除以Tal投料量再乘以100%，即得微球包封率。微球載藥量的測定將實際測定的Tal含量除以參與測定的實際微球的量再乘以100%,即得微球包封率。釋放度的測定方法試驗樣品根據(jù)本發(fā)明實施例方法制備的樣品。試驗試劑含0.2%吐溫80PH7.4的磷酸鹽緩沖液試驗儀器水浴恒溫振蕩器、離心機。試驗條件溫度37°C±0.5°C試驗方法精密稱取實驗樣品約12mg置于10ml的具塞離心試管中，加5ml釋放介質(zhì)(含0.2%吐溫80PH7.4的磷酸鹽緩沖液)，置于水浴恒溫振蕩器中保持一定的溫度按時取樣。取樣方法離心、棄取上清液、干燥48h，按Tal含量測定方法測定剩余固體的含量。(0.5h直接測定水溶液中Tq含量)取樣時間0.5h、ld、5d、7d、10d、15d有機溶劑殘留參照藥典方法試驗數(shù)據(jù)表(一)各實施例制備的微球的實際載藥量、包封率等數(shù)據(jù)實施例實際載藥量(%)理論載藥量(%)包封率(%)平均粒徑(Pm)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實施例19制備的微球的釋放度曲線見圖l一9。權(quán)利要求1、一種胸腺肽α1的PLGA緩釋微球，其特征在于胸腺肽α1與PLGA的含量比例為0.5～10∶100，PLGA的粘度范圍為0.4～1.2dl/g。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的微球，其特征在于胸腺肽a,與PLGA的含量比例為1~9:100，PLGA的粘度范圍為0.5-0.94dl/g。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的微球，其特征在于胸腺肽ai與PLGA的含量比例為1.5~8:100，PLGA的粘度范圍為0.550.75dl/g。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的微球制劑，其特征在于PLGA中聚乳酸與羥基乙酸的比例為50:50。5、一種制備如權(quán)利要求l、2、3、4任一項所述微球的方法，包括下列步驟組成(1)將處方量的Tal，溶于pH6.58.0的緩沖溶液中；得水相，備用；(2)將處方量的PLGA溶于二氯甲垸，得油相，備用；(3)將水相注入油相中，乳化5-20分鐘，得初乳(0/W)，備用；(4)將初乳投入含PVA以及NaCl或葡萄糖的低于初乳溫度的水溶液中，攪拌，再加入相同溫度、含相同PVA以及NaCl或葡萄糖濃度的水溶液中，攪拌112小時；(5)過濾、洗滌，冷凍干燥，得微球。6、權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于(1)將處方量的Tal溶于pH7.4的磷酸鹽緩沖液中，使Tal的濃度為25~100mg/ml，得水相，備用；(2)將處方量的PLGA溶于二氯甲烷中，使PLGA的濃度為30~500mg/ml,得油相，備用；(3)在10-25。C條件下，將乳化機轉(zhuǎn)速調(diào)至1500-8000轉(zhuǎn)/分，將水相注入油相中，乳化，得W/0型初乳，備用；(4)將含"10。/。PVA,以及110e/。NaCI或葡萄糖的水溶液冷至低于初乳的溫度以下，攪拌轉(zhuǎn)速300-2000轉(zhuǎn)/分的條件下，將初乳加入其中，攪拌，再加入相同溫度，相同濃度的PVA以及NaCl或葡萄糖的水溶液中攪拌1~12小時，得水包油包水型的復(fù)乳，在300-2000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下攪拌；停止攪拌，過100-200目篩，過濾，洗滌，抽干，冷凍干燥，得微球。全文摘要本發(fā)明涉及一種胸腺肽α1的PLGA緩釋微球制劑及其制備方法和用途，由本發(fā)明的技術(shù)方案制備得到的胸腺肽α₁微球，在大幅升高載藥量的同時仍保持了極高的胸腺肽α₁包封率，具有突出的實質(zhì)性特點和顯著的進步。文檔編號A61K38/17GK101653598SQ200810045838公開日2010年2月24日申請日期2008年8月19日優(yōu)先權(quán)日2008年8月19日發(fā)明者劉金花,兵葉,勇武,華毛,毅謝,銳鮑,梅黃申請人:成都地奧九泓制藥廠