專利名稱：：內(nèi)切糖苷酶EndoS用于治療免疫球蛋白G介導(dǎo)的疾病的用途的制作方法內(nèi)切糖苷酶EndoS用于治療免疫球蛋白G介導(dǎo)的疾病的用途發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防由IgG抗體介導(dǎo)的疾病或疾患(例如自身免疫性疾病、移植排斥、手術(shù)后治療和獲得性血友病)的方法。
背景技術(shù)：
：IgG是包括通過二硫鍵結(jié)合在一起的兩個重鏈和兩個輕鏈的異四聚體，形成被柔性并對蛋白酶敏感的鉸鏈區(qū)隔開的三蛋白結(jié)構(gòu)域。兩個相同的Fab部分結(jié)合抗原而單獨(dú)的Fc部分負(fù)責(zé)效應(yīng)功能，包括結(jié)合并活化補(bǔ)體因子Clq和白細(xì)胞上的Fc受體。除了多肽主鏈之外，F(xiàn)c部分在每個重鏈上含有與Asn-297相連的保守的聚糖。這一寡糖具有以核心巖藻糖與最深處的W-乙酰葡糖胺(GlcNAc)相連的復(fù)雜二天線型。這些聚糖位于CH2結(jié)構(gòu)域(重鏈的第二恒定結(jié)構(gòu)域)間的界面上。EndoS是由人類病原體化膿性4連球菌(>S^e/7toco6n'/7少ogt7")分泌的內(nèi)切糖苷酶。EndoS在兩個核心GlcNAc殘基間特異性地水解IgG上天冬酰胺連接的聚糖。與許多相關(guān)的需要糖蛋白底物變性或被糖蛋白底物變性加強(qiáng)的內(nèi)切糖苷酶相比，EndoS只水解天然IgG。迄今沒有發(fā)現(xiàn)EndoS的其他底物。發(fā)明概述本發(fā)明人表明了EndoS在治療和預(yù)防由IgG抗體介導(dǎo)的疾病中是有用的。尤其是發(fā)明人表明了EndoS在人類血液中以及兔體內(nèi)有效地水解IgG，經(jīng)由EndoS的IgG的去糖基化取消了其在小鼠中引起關(guān)節(jié)炎的能力，以及EndoS在致死的TgG促使的特發(fā)性血小板減少性紫癜(TTP)的小鼠模型中具有保護(hù)性作用。病原抗體的EndoS預(yù)處理抑制這一疾病的發(fā)展，而且所述酶還在已出現(xiàn)嚴(yán)重的血小板減少和皮下出血時從已確定的疾病中解救小鼠。根據(jù)本發(fā)明，因此提供了EndoS多肽或編碼EndoS多肽的多核苷酸在制備用于治療或預(yù)防由IgG抗體介導(dǎo)的疾病或疾患的藥物中的用途。本發(fā)明還提供了-EndoS肽，或編碼EndoS多肽的多核苷酸，以用于治療或預(yù)防由IgG抗體介導(dǎo)的疾病或疾患的方法中；-在需要其的受治療者中治療或預(yù)防由IgG抗體介導(dǎo)的疾病或疾患的方法，所述方法包括對受治療者施用治療有效量的EndoS多肽，或編碼EndoS多肽的多核苷酸；以及-離體處理采自患有由IgG抗體介導(dǎo)的疾病或疾患的患者的血液的方法，包括將所述血液與EndoS多肽接觸。附圖簡述圖1A是人類IgGl的結(jié)構(gòu)模型。括號標(biāo)明IgG的結(jié)合抗原的Fab部分和Fc效應(yīng)子部分。箭頭標(biāo)明與重鏈的Asn-297相連的兩個保守的聚糖。圖IB是完全取代的IgG重鏈聚糖的圖示。S2標(biāo)明完全唾液酸化的糖形，GO和括號標(biāo)明GO糖形的范圍。LCA標(biāo)明用于凝集素(lectin)實驗的扁豆(o//z""m)凝集素(agglutinin)的結(jié)合位點(diǎn)而EndoS標(biāo)明所述酶的切割位點(diǎn)。圖2是來自不同化膿性鏈球菌血清型(馬鏈球菌(Xe《M,)和獸疫鏈球菌(S.M(^/7,A/w,a^))的EndoS同系物的ClustalW氨基酸序列比對。抹系名稱、種和M血清型示于左邊。氨基酸同一性和相似性以灰色表示而共有序列在比對下方表示?？虺隽吮Ｊ氐膸锥≠|(zhì)酶基序并用比對下方的星號標(biāo)記活性必需的谷氨酸。圖3是EndoS的a結(jié)構(gòu)i或和來自五/iza/)e^h力g7力附ew^2gYwe/7〃ca的EndoF2以及來自々1纟*斗襲才奉狀斥干菌(CV^y"e6a"en'w淤/wew<iort//)en:M/^7、)的CP40的ClustalW氨基酸序列比對。蛋白名稱示于左邊。以灰色表示氨基酸同一性和相似性而共有序列在比對下方表示?？虺隽吮Ｊ氐膸锥≠|(zhì)酶基序并用比對下方的星號標(biāo)記活性必需的谷氨酸。圖4顯示了EndoS的結(jié)構(gòu)域組織。全長EndoS(SEQIDNO:2)的995個氨基酸的圖示。Ss標(biāo)明信號肽，標(biāo)明了a-結(jié)構(gòu)域中幾丁質(zhì)酶家族18活性位點(diǎn)基序并用箭頭標(biāo)明了產(chǎn)生兩個結(jié)構(gòu)域的SpeB切割位點(diǎn)。圖5顯示了對人類血液中EndoS活性的分析。圖5A顯示了對來自與逐漸增加濃度的重組EndoS(rEndoS)—起孵育的人類血液的純化的IgG的SDS-PAGE分析。圖5B顯示了對來自與逐漸增加濃度的rEndoS—起孵育的人類全血的純化的IgG的LCA凝集素印跡分析。圖5C顯示了對從與逐漸增加濃度的rEndoS—起孵育的人類血液純化的IgG的凝集素印跡的光密度分析。圖6顯示了對兔中EndoS體內(nèi)活性的分析。圖6A顯示了對來自在第一次靜脈內(nèi)注射500昭的rEndoS后于標(biāo)明的時間點(diǎn)從兔采集的血清樣品的純化的IgG的SDS-PAGE(染色)和凝集素印跡分析(LCA印跡)。圖6B顯示了對來自在第二次施用rEndoS后于標(biāo)明的時間點(diǎn)從兔采集的血清樣品的純化的IgG的SDS-PAGE(染色)和凝集素印跡分析(LCA印跡)。圖6C顯示了對來自在第三次施用rEndoS后于標(biāo)明的時間點(diǎn)從兔采集的血清樣品的純化的IgG的SDS-PAGE(染色)和凝集素印跡分析(LCA印跡)。圖7顯示了兔抗體對rEndoS的反應(yīng)。在第一次、第二次和第三次注射rEndoS后于標(biāo)明的時間點(diǎn)從兔采集血清樣品。在蛋白質(zhì)印跡中，將所述血清作為第一抗血清，用于具有SDS-PAGE分離的純化的rEndoS的不同的膜條上。圖7A也顯示了兔抗體對rEndoS的反應(yīng)。血清樣品與圖7的相同。插圖如圖7中的使用第一次注射后的血清樣品作為第一抗血清的蛋白質(zhì)印跡。主圖第一次、第二次和第三次注射后的血清樣品用作使用固定EndoS進(jìn)行的ELISA實驗中的第一抗血清。抗EndoS的IgG的濃度(ng/ml)與第一次注射前的濃度相比出現(xiàn)增加。展示了一個代表性實驗。圖8顯示了對與和不與EndoS孵育并通過10%的SDS-PAGE分離的IgG單克隆抗體(CIIC1和M2139)的SDS-PAGE(染色)和凝集素印跡分析(印跡)。通過考馬斯藍(lán)染色(染色)或通過對用GNL凝集素探測的膜的印跡(印跡)分析凝膠。CIICl(IgG2a)單克隆抗體與EndoS(泳道l)以及不與EndoS(泳道2)孵育；M2139(IgG2b)單克隆抗體與EndoS(泳道3)以及不與EndoS(泳道4)孵育。圖9顯示了來自用正常的和EndoS處理的CII結(jié)合抗體(a)M2139、(b)M2139D、(c)CIICl、(d)CIIC1D和(e)對照處理的大鼠的并染色的關(guān)節(jié)切片(10pm)。；改大倍率為x10。用EndoS去糖基化的抗體標(biāo)明為"D"。對1-2日齡的新生大鼠腹膜內(nèi)注射]mg的CII結(jié)合抗體(正常的和EndoS處理的)?？贵w傳輸二十四小時后將爪解剖并在OCT化合物中用異戊烷和干;水迅速冷凍。用生物素化的抗小鼠k(187.1)抗體和HRP輒合的第二抗體作為檢測系統(tǒng)用標(biāo)準(zhǔn)實驗方案進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。圖10顯示了接受未處理的或EndoS處理的抗CII單克隆抗體的小鼠中關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率(a)和嚴(yán)重度(b)。在0天用9mg未處理的(n-7)或EndoS處理的(11=5)抗CIT單克隆抗體(M2139和CIICl)注射雄性(BALB/cXB10.Q)Fl小鼠組。在第5天用50貼的大腸桿菌(7丄Y//)LPS腹膜內(nèi)注射所有小鼠。將所有小鼠用于計算。誤差條線標(biāo)明平均值土SEM。圖11顯示了接受未處理的或EndoS處理的抗CII單克隆抗體的小鼠中關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率(a)和嚴(yán)重度(b)。在0天用9mg未處理的(11=11)或EndoS處理的(11=12)抗CII單克隆抗體(M2139和CIIC1)注射雄性B10.RIII小鼠。在第5天用50嗎的大腸桿菌LPS腹膜內(nèi)注射所有小鼠。將所有小鼠用于計算。誤差條線標(biāo)明平均值士SEM。圖12顯示了補(bǔ)體成分Clq在(a)使用不同濃度的正常(BALB/cxB10.Q)Fl血清的CII包被的抗體結(jié)合板上；和(b)以0.25。/。的正常(BALB/cxB10.Q)Fl血清直接抗體包被的板上的沉積。誤差條線標(biāo)明平均值土SD。圖13顯示了補(bǔ)體成分C3b在(a)使用不同濃度的正常(BALB/cxB10.Q)F1血清的CII包^皮的抗體結(jié)合板上；和(b)以0.125。/。正常(BALB/cxB10.Q)F1血清直接抗體包被的板上的沉積。誤差條線標(biāo)明平均值士SD。圖14顯示了單克隆抗體的去糖基化對嗜中性粒細(xì)胞(PMNL)氧化猝發(fā)的影響。將正常的(M2139或CIIC1)或去糖基化的(M2139-D或CIIC1-D)單克隆抗體包被在羧化聚苯乙烯微粒(lpm)上。在將來自肝素化的全血樣品的PMNL與抗體包#皮的珠孵育后使用FACS測定它們的氧化猝發(fā)能力。結(jié)果是來自每組中5只小鼠的平均值。使用了具有三種不同基因型的B10.Q小鼠(FcgR+/+、FcgRV-和FcgR+/-)。"培養(yǎng)基，，和"珠"組構(gòu)成兩組不同的陰性對照。PMA組是陽性對照。用RB6-APC輒合物識別PMNL。圖15顯示了在靜脈內(nèi)(第1天和第5天)傳輸9mg的單克隆抗體混合物(M2139和CIICl或M2139D和CIIC1D)的B10.RIII小鼠的血清中通過ELISA測量的抗CII抗體的水平。使用多標(biāo)記計數(shù)儀(VICTOR1420，Wallac)測量平均銪熒光單位。圖16顯示了病原IgG抗體的EndoS預(yù)處理抑制了小鼠中抗體介導(dǎo)的血小板減少。圖片A:雌性BALB/c小鼠(11=3)接受腹膜內(nèi)注射的兔抗小鼠血小板IgG(aPLT-IgG)。每隔一定間隔采集血液樣品并用流式細(xì)胞術(shù)測定血小板計數(shù)。圖片B:用已用GST-EndoS(11=4)或GST(11=4)預(yù)處理的aPLT-IgG注射的BALB/c小鼠的存活標(biāo)繪圖。圖片C:通過流式細(xì)胞術(shù)對來自已接受GST-EndoS預(yù)處理的aPLT-IgG的小鼠的血液樣品測定的隨時間的血小板計凄t。圖17顯示了EndoS從致死的IgG介導(dǎo)的血小板減少解救小鼠。圖片A:用aPLT-IgG注射并且隨后在施用aPLT-IgG3小時后用GST-EndoS(n=8)或GST0=8)處理的BALB/c小鼠的存活標(biāo)繪圖。圖片B:從注射aPLT-Ig24、48或72(僅GST-EndoS處理)小時后GST-EndoS或GST-處理的小鼠純化的IgG的SDS-PAGE分析(染色)和LCA凝集素印跡分析(LCA印跡)。圖片C:在接受GST-EndoS處理的小鼠中每隔一定間隔采集血液樣品并用流式細(xì)胞術(shù)測定血小板計數(shù)。圖片D:注射aPLT-Ig并隨后在出現(xiàn)明顯的腹內(nèi)出血跡象時(施用aPLT-Ig后5-7h)用GST-EndoS(>=7)或GST0=7)處理的BALB/c小鼠的存活標(biāo)繪圖。序列筒述SEQIDNO:1是從化膿性鏈球菌API分離的EndoS的氨基酸序列。SEQIDNO:2是從化膿性鏈球菌API分離的EndoS的氨基酸序列，包括信號序列。SEQIDNO:3是從化膿性鏈球菌API分離的編碼EndoS的核酸序列，包括信號序列。發(fā)明詳述法包括對受治療者施用EndoS多肽或編碼EndoS多肽的多核苷酸。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)EndoS在人類血液中以及兔體內(nèi)水解IgG,經(jīng)由EndoS的IgG的去糖基化取消了其在小鼠中引起關(guān)節(jié)炎的能力，以及EndoS在致死的IgG促使的特發(fā)性血小板減少性紫癜(FTP)的小鼠模型中具有保護(hù)性作用。病原抗體的EndoS預(yù)處理抑制了這一疾病的發(fā)展，而且所述酶還在已出現(xiàn)嚴(yán)重的血小板減少和皮下出血時從已確定的疾病中解救了小鼠。因此，EndoS可用于治療或預(yù)防由IgG抗體介導(dǎo)的疾病或疾患。多肽EndoS多肽優(yōu)選為化膿性鏈球菌EndoS或保留了IgG內(nèi)切糖苷酶活性的化膿性鏈球菌EndoS的變體或片段。所述變體可是來自另一生物體例如另一細(xì)菌的EndoS多肽。所述細(xì)菌優(yōu)選為鏈球菌例如馬鏈球菌、獸疫鏈球菌或優(yōu)選地化膿性鏈球菌。可選地，所述變體可來自假結(jié)核棒狀桿菌例如CP40蛋白；糞腸球菌(7"teracoccw/i7eca/"')例如EndoE蛋白；或五/^^^/汝/"g/amem"gm'ep/,ca(以前稱為月畝月莫膿毒性黃桿菌(^7av(/)t7c&nww2mem'"gosepO'CMW))例"^口EndoF2蛋白。來自不同4匕膿'f生鏈球菌血清型以及來自馬鏈球菌和獸疫鏈球菌的EndoS變體的序列示于圖2。圖3顯示了EndoS的a結(jié)構(gòu)i或和來自￡7/za6w//h"g,'aww'"go,s'e/〃c;a的EndoF2以及來自假結(jié)核棒狀桿菌的CP40的比對。EndoS多肽可含有(a)SEQIDNO:1的氨基酸序列；(b)與SEQTDNO:1的氨基酸序列具有至少50%的同一性并具有IgG內(nèi)切糖苦酶活性的其變體；或(c)具有IgG內(nèi)切糖苷酶活性的其任一片段。優(yōu)選地，所述多肽含有或由SEQIDNO:1的序列組成。SEQIDNO:1是沒有信號序列的成熟形式的EndoS的序列，并相應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸37至995。此外多肽可包含信號序列。因此EndoS多肽可含有(a)SEQIDNO:2的氨基酸序列；(b)與SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少50%的同一性并具有IgG內(nèi)切糖苷酶活性的其變體；或(c)具有IgG內(nèi)切糖苷酶活性的其任一片段。EndoS多肽可由SEQIDNO:2中所示的序列組成。變體多肽是氨基酸序列與SEQIDNO:1或SEQIDNO:2中的序列不同但保留了與EndoS相同的本質(zhì)特征或基本功能性的那些多肽。因此變體多肽可顯示出IgG內(nèi)切糖苷酶活性。通常，與SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸序列具有大于約50%、55%或65%的同一性，優(yōu)選至少70%、至少80%、至少90%并尤其優(yōu)選至少95%、至少97%或至少99%的同一性的多肽被認(rèn)為是所述蛋白的變體。只要所述肽保留了EndoS的基本功能性，這些變體可包含等位基因的變體和蛋白序列中單個氨基酸或氨基酸組的缺失、修飾或添加?？稍赟EQIDNO:1或SEQIDNO:2中所示序列的至少100、至少250、至少500、至少750、至少800、至少850、至少900、至少950、至少955或更多連續(xù)氨基酸的區(qū)域上或更優(yōu)選地在SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的全長上測量SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的變體的同一性?？墒褂萌魏芜m合的算法計算氨基酸同一性。例如UWGCG包提供了可用來計算同源性(例如在其默認(rèn)設(shè)置上使用)的BESTFIT程序(Devereux等人(1984)WMc/e,c^c/AWewar/12，387-395)。PILEUP和BLAST算法可用于計算同源性或比對(lineup)序列(例如鑒定相等或相應(yīng)的序列(通常在他們的默認(rèn)設(shè)置上))，例如，如AltschulS.F.(1993)JMolEvol36:290-300;Altschul,S，F(xiàn)等人(1990)JMolBiol215:403-10中所描述的。進(jìn)行BLAST分析的軟件是可通過NationalCenterforBiotechnologyInformation(美國國家生物技術(shù)信息中心)(http:〃麗w.ncbi.nlm.nih.gov/)公開獲得的。這一算法包括首先在查詢序列中通過鑒定長度W的短字(其在與數(shù)據(jù)庫序列中同等長度的字比對時匹配或滿足某個正值的閾值分T)鑒定高分序列對(HSP)。T被稱為相鄰字得分閾值(Altschul等人，同上)。這些最初的相鄰字匹配(hits)起到用于開始搜索以找到含有它們的HSP的種子的作用。只要累積的比對得分可增加就將字匹配沿每一個序列向兩個方向延伸。當(dāng)累積的比對得分從其達(dá)到的最大值下降數(shù)量X;由于一個或多個負(fù)分殘基比對的積累，累積得分變?yōu)榱慊蛞韵?；或到達(dá)任一個序列的末端時，停止字匹配在每個方向上的延伸。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定了比對的敏感度和速度。BLAST程序使用字長(W)11,BLOSUM62得分矩陣(參見Henikoff和Henikoff(1992)Prac.Ato/./JcW.USA89:10915-10919)比對(B)50，期望值(E)10，M=5,N=4和對比兩條鏈為默認(rèn)值。BLAST算法在兩序列間進(jìn)行相似性的統(tǒng)計分析；參見，例如Karlin和Altschul(1993)7>oc.爿cadUSA90:5873-5787。由BLAST算法提供的一個相似性尺度是最小和概率(P(N)),其提供了在兩個多核苷酸或氨基酸序列之間的匹配隨機(jī)發(fā)生的概率的標(biāo)示。例如，如果在一序列和另一序列的比較中最小和概率小于約1，優(yōu)選地小于約O.l，更優(yōu)選地小于約0.01并且最優(yōu)選地小于約0.001，那么認(rèn)為第一序列與第二序列相似。通常變體序列相差至少l、2、3、5、10、20、30、50、100或更多突變(其可是氨基酸的取代、缺失或插入)。例如，可形成從1至100、2至50、3至30或5至20個氨基酸的取代、缺失或插入。修飾的多肽通常保留作為IgG特異性內(nèi)切糖苷酶的活性。取代優(yōu)選地是(例如依照下表的)保守的取代。第二列中同一區(qū)中的氨基酸以及優(yōu)選地第三列中同一行中的氨基酸可互相取代<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>SEQIDNO:1的氨基酸序列的變體優(yōu)選地含有SEQIDNO:1的殘基191至199,即SEQIDNO:1的Leu-191、Asp-192、Gly-193、Leu-194、Asp-195、Val-196、Asp-197、Val-198和Glu-199(其對應(yīng)于SEQIDNO:2的殘基227至235，即SEQIDNO:2的Leu-227、Asp-228、Gly-229、Leu-230、Asp隱231、Val-232、Asp隱233、Val-234和Glu-235)。這些氨基酸構(gòu)成了以谷氨酸結(jié)尾的完美的幾丁質(zhì)酶家族18活性位點(diǎn)。幾丁質(zhì)酶活性位點(diǎn)中的谷氨酸對酶促活性來說是必須的。因此最優(yōu)選地，SEQIDNO:1的變體含有SEQIDNO:1的Glu-199而SEQIDNO:2的變體含有SEQIDNO:2的Glu-235。假如SEQIDNO:1的變體含有SEQTDNO:1的Glu-199,那么所述變體可含有具有一個或多個保守性耳又代的SEQIDNO:1的殘基191至199?？蛇x擇地，假如SEQIDNO:2的變體含有SEQIDNO:2的Glu-235,那么所述變體可含有具有一個或多個保守性取代的SEQIDNO:2的殘基227至235。用于本發(fā)明的EndoS多肽的片段通常為至少10例如至少20、30、40、50或更多個氨基酸長度直至100、200、250、300、500、750、800、850、900、950或955個氨基酸長度，只要其保持EndoS的IgG內(nèi)切糖苷酶活性。優(yōu)選地，用于本發(fā)明的EndoS多肽的片段包含SEQIDNO:1的殘基191至199，即SEQIDNO:1的Leu-191、Asp-192、Gly-193、Leu畫194、Asp-195、Val匿196、Asp-197、Val-198和Glu-199(SEQIDNO:2的殘基227至235，即SEQIDNO:2的Leu-227、Asp-228、Gly-229、Leu-230、Asp-231、Val-232、Asp-233、Val-234和Glu-235)。SEQIDNO:2的優(yōu)選片段由SEQIDNO:2的氨基酸37至995即SEQIDNO:1組成，其相應(yīng)于去除信號肽后的由化膿性鏈球菌分泌的EndoS形式。本發(fā)明的另一個優(yōu)選片段由SEQIDNO:1的氨基酸1至409(SEQIDNO:2的氨基酸37至445)組成，其相應(yīng)于通過鏈球菌半胱氨酸蛋白酶SpeB切割產(chǎn)生的EndoS的酶學(xué)活性a結(jié)構(gòu)域。用于本發(fā)明的多肽可被化學(xué)修飾，例如翻譯后修飾。例如它們可一皮糖基化、磷酸化或含有修飾的氨基酸殘基。它們可通過添加組氨酸殘基以幫助它們純化或通過添加信號序列以促進(jìn)對細(xì)胞膜的插入來修飾。這些修飾的多肽屬于本文所用的術(shù)語"多肽"的范圍。通常，依照本發(fā)明使用的多肽表現(xiàn)出免疫球蛋白內(nèi)切糖苷酶活性尤其是IgG內(nèi)切糖苷酶活性。優(yōu)選地，所述多肽水解IgG的天冬酰胺連接的聚糖的P-l,4-二-7V-乙酰殼二糖核。優(yōu)選地，所述活性是對IgG特異性的。內(nèi)切糖普酶活性可通過適當(dāng)?shù)臏y定方法測定。例如可將測試多肽與IgG在適當(dāng)?shù)臏囟壤?7。C醉育。之后可通過SDSPAGE分析起始材料和反應(yīng)產(chǎn)物。通常如果測試多肽具有IgG內(nèi)切糖普酶活性，則IgG重鏈的分子量被減少約3kDa。另一種用于測定測試多肽是否具有IgG內(nèi)切糖苷酶活性的測定是經(jīng)由使用扁豆凝集素(LCA),可選擇地使用辣根過氧化物酶和過氧化物酶底物的糖基化IgG的檢測。通常，如果測試多肽具有IgG內(nèi)切糖苷酶活性，則糖類信號被減小。另一種用于測定測試多肽是否具有IgG內(nèi)切糖苷酶活性的測定是通過將測試多肽與純化的IgG的Fc片段孵育，之后用lOmM二硫蘇糖醇還原樣品并用質(zhì)i普法(MALDI-TOF)分析。通常如果測試多肽具有IgG內(nèi)切糖普酶活性，則單體IgG的Fc的質(zhì)量被減少1417±14Da。多肽的內(nèi)切糖苷酶活性可通過抑制研究被進(jìn)一步表征。多肽的內(nèi)切糖苷酶活性通常是IgG特異性的，因為當(dāng)與這些免疫球蛋白在允許切割I(lǐng)gG的條件下孵育時，所述多肽不能降解其他類型的Ig,即IgM、IgA、IgD和IgE。EndoS多肽具有水解待治療的受治療者中存在的IgG分子的能力。因此，當(dāng)受治療者是人類時，EndoS多肽能夠水解人類IgG。EndoS能夠水解所有四個亞類的人類IgG(IgGw)。在優(yōu)選的實施方案中，EndoS多肽具有水解人類、獼猴、小鼠、大鼠、兔、馬、山羊、犬和豬IgG的能力。用于本發(fā)明的多肽可以M本上分離的形式。應(yīng)當(dāng)理解的是多肽可與不千擾所述多肽的預(yù)期作用的載體或稀釋劑混合并依舊被認(rèn)為是基本上分離的。用于本發(fā)明的多肽還可以是大致純化的形式，在這種情況下其將通常在制品中含有所述多肽，其中制品中多于50%,例如多于80%、90%、95%或99%重量的多肽是本發(fā)明的多肽。用于本發(fā)明的多肽可從表達(dá)EndoS多肽或EndoS多肽變體的任何適當(dāng)?shù)纳矬w中分離。通常，EndoS多肽從適當(dāng)?shù)逆溓蚓腅ndoS表達(dá)菌林，優(yōu)選地化膿性鏈球菌的菌抹中分離。適當(dāng)?shù)纳矬w和菌林可通過許多技術(shù)鑒定。例如，最初可測試化膿性鏈球菌菌抹的m/必基因的存在?？梢岳鏢EQIDNO:1、2或3為基礎(chǔ)設(shè)計多核苷酸引物或探針。之后可通過使用了這樣的引物的PCR或通過探針與所述化膿性鏈球菌菌林的基因組DNA雜交證實"基因的存在?？赏ㄟ^測定培養(yǎng)物上清液中IgG內(nèi)切糖香酶活性或通過使用針對EndoS的抗體進(jìn)行免疫檢測來鑒定表達(dá)活性EndoS或其變體的鏈球菌菌林。已被證實為表達(dá)活性EndoS的鏈球菌菌抹是化膿性鏈球菌Ml血清型菌林AP1和SF370、馬鏈球菌菌抹4047和獸疫鏈球菌菌抹H70。此外，在下列化膿性鏈球菌菌抹中發(fā)現(xiàn)了m/^V基因Ml血清型菌抹SSI-1和MGAS5005、M2血清型菌4朱MGAS10270、M3血清型菌4朱MGAS315、M4血清型菌抹MGAS10750、M5血清型菌抹Manfredo、M6血清型菌抹MGAS10394、M12血清型菌抹MGAS9429、M18血清型菌抹MGAS8232、M28血清型菌抹MGAS6180和M49血清型菌林591。從表達(dá)的化膿性鏈球菌培養(yǎng)物或從表達(dá)EndoS的其他細(xì)胞的培養(yǎng)物分離和純化EndoS通常是以IgG內(nèi)切糖苷酶活性為基礎(chǔ)的。優(yōu)選地純化方法包括^J臾銨沉淀步驟和離子交換層析步驟。根據(jù)一種方法，通過加入逐漸增加量的石充酸銨分級培養(yǎng)基。硫酸銨的量可為10%至80%。優(yōu)選地用50%的硫酸銨分級培養(yǎng)基，并將所得上清液用70%的硫酸銨進(jìn)一步沉淀。之后粒狀沉淀的多肽可經(jīng)歷離子交換層析，例如通過MonoQ柱上的FPLC?？蓽y定洗脫級分的IgG內(nèi)切糖苷酶活性并收集峰值活性的級分?？赏ㄟ^SDSPAGE分析級分?？蓪⒓壏仲A存于-80。C。在可選擇的純化EndoS的方法中，使用GST基因融合系統(tǒng)(Amersham-PharaiaciaBiotech,Uppsala，Sweden)在大腸桿菌中表達(dá)沒有信號序列的EndoS(即，具有SEQIDNO:1的序列)。使用具有5awHI位點(diǎn)(下劃線的)的引物5'-ACT-GGG-ATC-CCG-GAG-GAG-AAG-ACT-3'和具有ZZoI位點(diǎn)(下劃線的)引物5'隱TTA-ATC隱TCG-AGG-TTG-CTA隱TCT-AAG-3'從化膿性鏈球菌基因組DNA擴(kuò)增覆蓋mf必序列的堿基304至3232的2929堿基對的PCR產(chǎn)物。將這一片段用SawHI和消化并連接至pGEX-5X-3產(chǎn)生用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)pLys的質(zhì)粒pGEXwfoS。用O.lmM異丙基卩-D-硫代半乳糖吡喃糖苷誘導(dǎo)pGEXwcfo57BL21(DE3)pLys。誘導(dǎo)后，用BugBusterTM(Novagen)裂解細(xì)菌并在谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠(Glutathione-Sepharose)上純化GST-EndoS融合蛋白。才艮據(jù)實驗方案(Amersham-PharmaciaBiotech)使用因子Xa去除GST標(biāo)記并用Xarrest瓊脂糖(Novagen)去除剩余的因子Xa。這產(chǎn)生了均質(zhì)的重組EndoS(rEndoS)的制品，如通過SDS-PAGE和使用EndoS特異性抗體的蛋白質(zhì)印跡所估定的。體內(nèi)實馬全之前通過0.2的過濾器(Millipore)滅菌過濾蛋白樣品。將純化的EndoS蛋白于-8(TC貯存于磷酸鹽緩沖鹽水中。本發(fā)明使用的多肽還可被制備為這些分離的多肽的片段。此外，還可合成性地或通過重組的方法制得所述EndoS多肽。例如，可通過用含有與適當(dāng)?shù)目刂菩蛄锌刹僮鞯叵噙B的編碼所述多肽的核苷酸序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染培養(yǎng)中的哺乳動物細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞，提取并純化由細(xì)胞產(chǎn)生的EndoS多肽來生產(chǎn)重組EndoS多肽。用于本發(fā)明的多肽的氨基酸序列可被修飾以含有非天然存在的氨基酸或增加化合物的穩(wěn)定性。當(dāng)通過合成的方法生產(chǎn)多肽時，可在生產(chǎn)過程中引入這些氨基酸。多肽還可在合成或重組生產(chǎn)后被修飾。還可用D-氨基酸生產(chǎn)用于本發(fā)明的多肽。在這樣的情況中，氨基酸將以C至N的反向的順序連接。對于生產(chǎn)這種多肽來說，這在本領(lǐng)域中是常規(guī)的。在本領(lǐng)域中許多側(cè)鏈修飾是已知的而且可用于EndoS多肽的側(cè)鏈，只要多肽保留IgG內(nèi)切糖苷酶活性。多核苷酸編碼EndoS多肽或變體的多核苷酸可用于治療或預(yù)防由病原IgG抗體介導(dǎo)的疾病或疾患。特別地，多核苷酸可包括或由下列物質(zhì)組成(a)SEQIDNO:3的編碼序列；(b)由于遺傳密碼而對于如(a)中所定義的序列為簡并的序列；(c)與如(a)或(b)中所定義的序列具有至少60%同一性并編碼具有IgG內(nèi)切糖苷酶活性的多肽的序列；或(d)如(a)、(b)或(c)中所定義的序列中的任何一個的片段，其編碼具有TgG內(nèi)切糖苷酶活性的多肽。通常，多核苷酸是DNA。但多核苷酸可以是RNA多核苷酸。多核苷酸可以是單鏈或雙鏈并可包括合成的或修飾的核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸通?？膳cSEQIDNO:3的編碼序列或編碼序列的互補(bǔ)序列在顯著高于背景的水平上雜交。例如，由于DNA文庫中存在的其他DNA，可發(fā)生背景雜交。本發(fā)明的多核苷酸和SEQIDNO:3的編碼多核苷酸和SEQIDNO:3的編碼序列之間相互作用強(qiáng)度的至少10倍，優(yōu)選地至少100倍?？赏ㄟ^例如放射性標(biāo)記探針(諸如用32P)測量相互作用強(qiáng)度。通常可使用中至高嚴(yán)格度的條件實現(xiàn)選擇性的雜交。但可在本領(lǐng)域已知的任何適合的條件下進(jìn)行這種雜交(參見Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆實驗室手冊)，1989)。例如，如果需要高嚴(yán)格度，那么適合的條件包括于60'C直到65。C下從0.1至0.2xSSC。如果需要較低的嚴(yán)格度，那么適合的條件包括于6(TC下2xSSC?？赏ㄟ^核苦酸耳又代(例如/人1、2或3至10、25、50、100、200、500或750個取代)》務(wù)飾SEQIDNO:3的編碼序列?？赏ㄟ^一個或多個插入和/或缺失和/或通過任一或兩端的延伸可選擇地或另外地修飾SEQIDNO:3的多核香酸。還可包括附加序列例如信號序列。修飾的多核苦酸通常編碼具有IgG特異性內(nèi)切糖苷酶活性的多肽。如例如上文表中所示，可進(jìn)行簡并取代和/或進(jìn)行當(dāng)修飾的序列被翻譯時產(chǎn)生保守性氨基酸取代的取代。能夠與SEQIDNO:3的DNA編碼序列的互補(bǔ)序列選擇性地雜交的核香酸序列通常與SEQIDNO:3的編碼序列在至少20，優(yōu)選地至少30,例如至少40、至少60、至少100、至少200、至少500，更優(yōu)選地至少750個相連核苷酸的區(qū)域中或最優(yōu)選地在SEQIDNO:3的全長或編碼具有SEQIDNO:1或2中所示序列的多肽的SEQIDNO:3長度中具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的序列同一性?？赏ㄟ^任何適合的方法(例如如前文描述的)測定序列同一性?？捎蒙衔奶峒暗男蛄型恍猿潭群妥钚〈笮〉娜魏谓M合定義本發(fā)明的多核香酸，同時更嚴(yán)格的組合(即在較長的長度上較高的序列同一性)是優(yōu)選的。因此，例如和在500個核苷酸上具有至少95%序列同一性的多核苷酸一樣，在60,優(yōu)選地100個核苷酸上具有至少90%序列同一性的多核苷酸形成本發(fā)明的一個方面。多核苷酸片段優(yōu)選地為至少20，例如至少25、至少30或至少50個核苷酸長度。通常它們將多達(dá)100、150、250或500個核苷酸長度。片段可長于500個核普酸長度，例如多達(dá)600、700、800、900、1000、1500、2000、2500或3000個核苷酸長度，或者甚至直到缺少SEQIDNO:3編碼序列的很少的核苷酸例如5、10或15個核苷酸。用于本發(fā)明的多核苷酸。還可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)克隆它們。多核苷酸通常以分離和/或純化的形式提供。通常，通過合成的方法生產(chǎn)短的多核苷酸，所述方法包括一次一個核香酸的逐步制備所需核酸序列。在本領(lǐng)域中，使用自動化技術(shù)完成這一方法的技術(shù)是很容易獲得的。通常使用重組方法例如用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))克隆技術(shù)生產(chǎn)較長的多核苷酸。這包括制備需要克隆的基因區(qū)域的一對引物(例如約15-30個核香酸)，將引物與從細(xì)菌細(xì)胞獲得的DNA相接觸，在發(fā)生所需區(qū)域的擴(kuò)增的條件下進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，分離擴(kuò)增的片段(例如通過在瓊脂糖凝膠上純化反應(yīng)混合物)并回收擴(kuò)增的DNA?？蓪⒁镌O(shè)計為含有適當(dāng)?shù)南拗菩悦缸R別位點(diǎn)，以便可將擴(kuò)增的DNA克隆至適合的克隆載體中。這些技術(shù)可被用來獲得本文描述的m/oS基因序列的全部或部分。盡管通常本文所提及的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的，還是特別引用了Sambrook等人(1989)。如本文所描述的EndoS多核苷酸在用于本發(fā)明的多肽的生產(chǎn)中有用，其可在體外、體內(nèi)或離體進(jìn)行。多核苷酸本身可用作治療劑或可用于重組蛋白合成。通常將用于本發(fā)明的多核苷酸并入重組的可復(fù)制載體中。載體可用于在相容的宿主細(xì)胞中復(fù)制核酸。因此可通過將EndoS多核苷酸引入可復(fù)制載體，將所述載體引入相容的宿主細(xì)胞并在發(fā)生載體復(fù)制的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞來制備用于本發(fā)明的多核苷酸。宿主細(xì)胞可以是例如大腸桿菌細(xì)胞。優(yōu)選地載體是含有編碼EndoS多肽的核酸序列的表達(dá)載體。這種表達(dá)載體通常在分子生物學(xué)領(lǐng)域中被常規(guī)地構(gòu)建并可例如包括使用質(zhì)粒DNA和適當(dāng)?shù)钠鹗济艽a子、啟動子、增強(qiáng)子和其他元件，例如諸如加A信號，它們?yōu)槭沟鞍妆磉_(dá)所必需的并以正確方向安置。對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說其他適合的載體是清楚的。作為這一方面進(jìn)一步的實例我們引用Sambrook等人(1989)。優(yōu)選地，載體中用于本發(fā)明的多核香酸被可操作地連接于能夠提供通過宿主細(xì)胞表達(dá)編碼序列的控制序列，即載體是表達(dá)載體。術(shù)語"可操作地連接"意指毗鄰，其中所描述的組分所處的關(guān)系允許它們以它們預(yù)期的安置"可操作地連接"于編碼序列的調(diào)節(jié)序列例如啟動子。載體可以是例如具有復(fù)制起點(diǎn)、可選擇地表達(dá)所述多核苷酸的啟動子和可選擇地所述啟動子的調(diào)節(jié)子的質(zhì)粒、病毒或噬菌體載體。載體通常適應(yīng)于體內(nèi)使用。啟動子和其他表達(dá)調(diào)節(jié)信號可選擇為與針對其設(shè)計表達(dá)的宿主細(xì)胞相容?？墒褂貌溉閯游飭幼永鏟-肌動蛋白啟動子。組織特異性啟動子是尤其優(yōu)選的。還可使用病毒啟動子例如莫洛尼氏鼠白血病病毒長末端重復(fù)序列(MMLVLTR)、勞斯肉瘤病毒(RSV)LTR啟動子、SV40啟動子、人類巨細(xì)胞病毒(CMV)IE啟動子、腺病毒、HSV啟動子(諸如HSV正啟動子)或HPV啟動子，尤其是HPV上游調(diào)節(jié)區(qū)(URR)。本領(lǐng)域中可容易地獲得病毒啟動子。載體可進(jìn)一步包括側(cè)翼于所述多核苷酸的序列，產(chǎn)生含有與真核基因組序列優(yōu)選哺乳動物基因組序列同源的序列的多核苷酸。這將允許將本發(fā)明的多核苷酸通過同源重組引入真核細(xì)胞的基因組。特別是，含有具有側(cè)送至哺乳動物細(xì)胞的病毒載體。適合的病毒載體的其他實例包括單純皰疹病毒載體和包括慢病毒、腺病毒、腺伴隨病毒和HPV病毒的逆轉(zhuǎn)錄病毒。使用這些病毒的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體例如可用于穩(wěn)定地整合多核普酸，導(dǎo)致多核苷酸進(jìn)入宿主基因組。相比之下復(fù)制缺陷型腺病毒載體保持游離并因此允許瞬時表達(dá)。疾病和疾患EndoS多肽或多核苦酸可用于治療或預(yù)防由病原IgG抗體介導(dǎo)的疾病或疾患。本領(lǐng)域中所熟知的是許多不同的疾病和疾患的發(fā)病機(jī)理涉及IgG抗體。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)可使用EndoS多肽或多核苷酸抑制這類疾病中病原IgG抗體的作用。所述疾病或疾患可以是自身免疫性疾病。這類疾病包括艾迪生病、斑殼、強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosingspondilitis)、抗磷脂綜合征、再生障礙性貧血、自身免疫性胃炎、自身免疫性聽力喪失、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性肝炎、自身免疫性甲狀旁腺功能減退癥、自身免疫性垂體炎、自身免疫性內(nèi)耳病、自身免疫性淋巴增生綜合征、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性睪丸炎、自身免疫性多內(nèi)分泌腺病、白塞氏病、大皰性類天皰瘡、心肌病、慢性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病、丘-施二氏綜合;f正(Churg-Strausssyndrome)、腹月空疾病(coeliacdisease)、克羅恩病、CREST綜合征、德戈斯病(Degosdisease)、獲得性大皰性表皮松解癥、原發(fā)性混合型冷球蛋白血癥、巨細(xì)胞動脈炎、腎小球腎炎、古德帕斯丘綜合征、格雷夫斯病、格林-巴利綜合征(Guillan-Barresyndrome)、橋本曱狀腺炎、特發(fā)性血小板減少性紫癜、炎癥性腸病、川崎病、梅尼埃綜合征、混合性結(jié)締組織病、莫倫氏潰瘍、多發(fā)性硬化、重癥肌無力、落葉型天皰瘡、尋常型天皰瘡、惡性貧血、結(jié)節(jié)性多動脈炎、1型多腺體自身免疫性綜合征(PAS-1)、2型多腺體自身免疫性綜合征(PAS-2)、3型多腺體自身免疫性綜合征(PAS-3)、多肌炎/皮肌炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎、雷諾氏綜合征、賴特爾綜合征、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病、硬皮病、舍格倫綜合征(Sj6gren'ssyndrome)、亞急性甲狀腺炎、交感性眼炎、系統(tǒng)性紅斑狼疾、高安氏動脈炎(Takayasu'sarteritis)、1型糖尿病、白癜風(fēng)、伏格特-'J、柳-原田疾病(Vogt-Koyanagi證Haradadisease)或韋格納氏肉芽腫病。優(yōu)選地，所述自身免疫性疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡或特發(fā)性血小板減少性紫癜。疾病或疾患可是哮喘。哮喘可是急性或慢性哮喘。IgG活化補(bǔ)體系統(tǒng)中的經(jīng)典途徑。因此EndoS多肽和多核苷酸可用于治療其中補(bǔ)體活化對患者有害的疾病和疾患。例如EndoS多肽和多核苷酸可用于治療移植引起的病癥例如移植排斥(諸如急性或慢性的同種異體移植物排斥或異種移植物排斥)和移植物抗宿主病。移植引起的病癥可由于患者中組織或器官的移植而發(fā)生。EndoS多肽和多核苷酸也可用于手術(shù)后治療，例如經(jīng)歷過心臟旁路手術(shù)的患者的治療中。此外，EndoS多肽和多核苷酸可用于治療獲得性血友病，即除去已產(chǎn)生對凝血因子的自身抗體的血友病患者中的IgG。通常受治療者是哺乳動物受治療者例如小鼠、大鼠或靈長類動物(例如絨猴或猴)。受治療者可以是人類或非人類的動物。當(dāng)受治療者是實驗室動物例如小鼠、大鼠或靈長類動物時，可處理動物以誘導(dǎo)由病原IgG抗體介導(dǎo)的疾病或疾患。例如可使用Nandakumar等人描述的小鼠抗CII抗體誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CAIA)模型(Am.J.Pathol.163(5):1827-1837，2003)或這種模型的修飾形式。治療和預(yù)防本發(fā)明提供了EndoS多肽和多核苷酸治療或預(yù)防由病原IgG抗體介導(dǎo)的疾病或疾患的用途。治療可以是治療性或預(yù)防性的。為預(yù)防所述疾病或疾患的一種或多種癥狀的發(fā)作，可對個體施用EndoS多肽或多核香酸。在這一實施方案中，受治療者可是無癥狀的。受治療者可具有對所述疾病的遺傳易感性。將預(yù)防有效量的多肽或多核苷酸施用于這樣的個體。預(yù)防有效量是預(yù)防疾病或疾患的一種或多種癥狀的發(fā)作的量。EndoS多肽或多核普酸的治療有效量是對改善疾病或疾患的一種或多種癥狀有效的量。優(yōu)選地，待治療的個體是人類?？赏ㄟ^任何適合的方法對受治療者施用EndoS多肽或多核苷酸?？赏ㄟ^腸內(nèi)或腸胃外的途徑例如經(jīng)由口、口腔、膽門、肺、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、局部或其他適當(dāng)?shù)氖┯寐肪€施用所述多肽或多核芬酸?？梢灾T如對特定部位的靶向治療的方式對受治療者施用EudoS多肽或多核苷酸。例如可將EndoS多肽直接施用于器官移植的部位。可將EndoS多肽局部地例如在關(guān)節(jié)內(nèi)或一個或多個關(guān)節(jié)注射。對于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的預(yù)防或治療來說，對關(guān)節(jié)局部施用EndoS是尤其優(yōu)選的?？蓪ndoS多肽與特異性結(jié)合軟骨的試劑軛合。對于EndoS多核苷酸來說，可使用編碼EndoS多肽的表達(dá)載體直接將EndoS表達(dá)于特定的組織，例如通過使用組織特異性啟動子或RNAi。本文提及的任何多肽和多核普酸的制劑將取決于例如多肽或多核苦酸的性質(zhì)和待治療的疾患的因素。可以不同的劑型施用多肽或多核苷酸。它可是口服(例如片劑、糖錠(troche)、錠劑(lozenge)、水性或油狀懸浮液、可分散的粉劑或粒劑)、腸胃外、皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、胸骨內(nèi)、經(jīng)皮或通過輸注技術(shù)施用的。還可將多肽或多核苷酸作為栓劑施用。醫(yī)生能夠確定每個特定的患者所需要的施用路線。通常將多肽或多核苷酸與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑一起配制以便使用，而且這可使用制藥領(lǐng)域中的常規(guī)方法實現(xiàn)。藥物載體或稀釋劑可是例如等滲溶液。例如固體口服形式可含有(與活性化合物一起的)稀釋劑，諸如乳糖、葡萄糖、蔗糖、纖維素、玉米淀粉或馬鈴薯淀粉；潤滑劑，諸如硅石、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂或硬脂酸4丐和/或聚乙二醇；粘合劑，諸如淀粉、阿拉伯膠、明膠、甲基纖維素、羧曱基纖維素或聚乙烯吡咯烷酮；崩解劑(disaggregatingagent),諸如淀粉、海藻酸、海藻酸鹽或淀粉乙醇酸鈉；泡騰混合物；著色劑；甜味劑；潤濕劑諸如卵磷脂、聚山梨醇酯、十二烷基^5危酸鹽(laurylsulphate);以及通常無毒并且藥理上無活性的用于藥物制劑的物質(zhì)?？梢砸阎姆椒ǎ缤ㄟ^混合、?；浩?、包糖衣或薄膜包衣過程制備這樣的藥物制品。用于口服施用的液體分散體可是糖漿、乳劑和懸浮液。糖漿可含有作為載體的例如蔗糖或蔗糖與甘油和/或甘露醇和/或山梨醇。懸浮液和乳劑可含有作為載體的例如天然樹膠、瓊脂、海藻酸鈉、果膠、甲基纖維素、羧曱基纖維素或聚乙烯醇。用于肌肉內(nèi)注射的懸浮液或溶液可含有(與活性化合物一起的)藥學(xué)上可接受的載體，例如無菌水、橄欖油、油酸乙酯、二醇諸如丙二醇以及如果需要，適量的鹽酸利多卡因。用于靜脈內(nèi)或輸注的溶液可含有作為載體的例如無菌水或優(yōu)選地它們可是無菌的、含水的、等滲的鹽水溶液的形式。對于栓劑，傳統(tǒng)的粘合劑和載體可包括例如聚亞烷基二醇或甘油三酸酯；這種栓劑可從含有0.5°/。至10%、優(yōu)選地1%至2%范圍內(nèi)的活性組分的混合物形成?？诜苿┌ㄏ窭缢幬锛壍母事洞?、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂以及類似物這樣的通常使用的賦形劑。這些組合物采取溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊、持續(xù)釋放制劑或粉劑的形式并含有凍干燥時，冷凍千燥的材料可在施用前復(fù)原為例如懸浮液。優(yōu)選地在緩沖液中實現(xiàn)復(fù)原。用于對患者口服施用的膠嚢、片劑和丸劑可具有腸溶包衣，包括例如Eudragit"S"、Eudragit"L'，、醋酸纖維素、醋酸鄰苯二甲酸纖維素或羥丙基曱基纖維素。還可使用適于通過無針注射(例如經(jīng)皮)遞送的藥物組合物。施用治療有效量的多肽或多核苷酸?？筛鶕?jù)不同的參數(shù)，尤其是根據(jù)所使用的多肽或多核苷酸；待治療的患者的年齡、體重和疾患；施用路線和所需的治療方案確定劑量。再一次地，醫(yī)生能夠確定任何特定患者所需的施用路線和劑量。依照特異性抑制劑的活性，待治療的受治療者的年齡、體重和疾患，疾病的類型和嚴(yán)重度以及施用的頻率和路線，典型的日劑量是從約0.1至50mg/kg體重，優(yōu)選地從約0.1mg/kg至10mg/kg體重。優(yōu)選地日劑量水平為5mg至2g。上文描述的EndoS核苷酸序列和含有這樣的序列的表達(dá)載體也可用作如上文概括的藥物制劑。優(yōu)選地，以可在待治療個體的細(xì)胞中表達(dá)的表達(dá)栽體的形式提供核酸，例如RNA或DNA,尤其是DNA。疫苗可含有棵露的核苷酸序列或與陽離子的脂質(zhì)、聚合物或靶向系統(tǒng)結(jié)合的核苷酸序列?？赏ㄟ^任何可用的技術(shù)遞送疫苗。例如可通過針注射，優(yōu)選地皮內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi)地引入核酸。可選擇地，可使用核酸遞送設(shè)備例如粒子介導(dǎo)的基因遞送直接穿過皮膚遞送核酸?？蓪ζつw或通過例如鼻內(nèi)、口、陰道內(nèi)或直腸內(nèi)施用對粘膜表面局部地施用核酸?？赏ㄟ^幾種已知的轉(zhuǎn)染技術(shù)(例如包括使用轉(zhuǎn)染劑的那些)增強(qiáng)核酸構(gòu)建體的攝入。這些劑的實例包括陽離子劑例如磷酸4丐和DEAE-Dextran(DEAE-葡聚糖)以及脂質(zhì)轉(zhuǎn)染劑例如lipofectam和transfectam?？筛淖兇┯玫暮怂岬膭┝?。通常以lpg至lmg,優(yōu)選地對粒子介導(dǎo)的基因遞送來說lpg至10貼以及對其他路線來說10嗎至lmg的核酸范圍施用核酸。本發(fā)明還提供了離體處理采自患有由病原IgG抗體介導(dǎo)的疾病或疾患的患者的血液的方法，其包括將血液與EndoS多狀接觸。因此EndoS可被用于血液的體外處理。EndoS可用于處理血液的一種或多種組分例如血漿或血清。本文描述的離體方法可對已從患者身體取出的血液實施。在與EndoS多肽接觸后可將血液或血液產(chǎn)品可選擇地返回到患者。下列實施例示例性說明本發(fā)明實施例1:在人類血液中EndoS有效地水解IgG為了在作為抗病理IgG的治療劑時有效，在人類全血環(huán)境中EndoS需要在低濃度時有活性。為了研究這一點(diǎn)，如以前所描述的生產(chǎn)并純化沒有信號序列(即具有SEQIDNO:1的序歹'J)的重組EndoS(rEndoS)(Collin&Ols紐，2001,Infect.Immun.69:7187-7189)。將逐漸增加纟冬濃度的(0、0.31、0.63、1.25、2.5、5、10和20嗎/ml)的rEndoS在500^1的來自健康志愿者的肝素化的人類血液中于37t:翻滾(endoverend)旋轉(zhuǎn)孵育1小時。將樣品于4。C以720xg離心10分鐘，之后用蛋白G瓊脂糖凝膠依照制造商的使用說明(GEHealthcareBiosciences,Uppsala，Sweden)純化血漿中的IgG。與之前關(guān)于IgG結(jié)合蛋白蛋白H(來自化膿性鏈球菌)和蛋白A(來自金黃色葡萄5求菌(5V"http://7少/o"x:a"m/reRV))的發(fā)現(xiàn)(Collin&Ols^n2001，EMBOJ.20:3046-3055)—致，完全糖基化的IgG和EndoS處理的IgG在對蛋白G的結(jié)合效力上沒有差別。在10%的SDS-PAGE上分離純化的IgG,用考馬斯染色或電印跡至PVDF(Tmmobilon-P,Millipore，Bedford,MA)上。用5貼/ml生物素化的扁豆凝集素(LCA)和l昭/ml的鏈霉抗生物素-，束才艮過氧4b物酶(VectorLaboratories,Burlingame,CA)禾口SuperSignalWestPico過氧化物酶底物(Pierce,Rockford，IL)檢測糖基化的IgG。用ChemidocXRS成像系統(tǒng)和QuantityOne圖像分析軟件(Bio-Rad,Hercules,CA)分析膜。這些實驗顯示逐漸增加濃度的EndoS逐漸將IgG重鏈轉(zhuǎn)變?yōu)樾×思s3kDa的表觀分子量并且在2.5-5嗎/ml以上濃度的rEndoS時幾乎看不到完整大小的重鏈(圖5A)。對同樣的樣品進(jìn)行的LCA凝集素印跡實驗顯示逐漸增加濃度的rEndoS逐漸產(chǎn)生較低的糖信號并且事實上在2.5-5嗎/ml以上濃度的rEndoS時沒有信號(圖5B)。先前顯示過缺乏凝集素信號與如由質(zhì)譜法分析的完全的IgG聚糖水解很好地對應(yīng)(Collin&Fischetti,2004，J.Biol.Chem.279:22558-22570)。此外峰密度分析顯示在大約5將/ml的rEndoS濃度的背景水平時變平的劑量響應(yīng)曲線(圖5C)。這些結(jié)果表明5ng/ml的rEndoS在1小時內(nèi)完全水解了人類血液中的IgG庫。假定IgG血漿濃度為10mg/ml，這將意味著以1:2000的rEndoS:IgG比率在1小時內(nèi)完全水解IgG。因此，在如人類血液這樣復(fù)雜的環(huán)境中，rEndoS顯示出對功能上重要的IgG聚糖的顯著有效的水解。實施例2:在兔中EndoS有效地水解IgG為了進(jìn)一步證實EndoS作為治療劑的用途，研究了在活體動物的循環(huán)中EndoS的IgG聚糖水解活性。相應(yīng)于約1:2000的rEndoS:IgG比率(假定rEndoS僅在血液中分布)，用lmg的rEndoS靜脈內(nèi)注射體重約3kg的Swedishlo叩兔。動物沒有顯示疾病跡象。在0、1、2、4、6、8和12小時以及第1、2、3、4、5、6、8和10天采集血清樣品。如前文對人類血液描述過的用SDS-PAGE和凝集素印跡分析來分析血清IgG的糖基化狀況。這些實驗顯示，在注射前，IgG重鏈的表觀分子量與完全糖基化完整的兔IgG相當(dāng)(圖6A，染色、0小時以及IgG)。相比之下，rEndoS注射后1小時已經(jīng)有IgG重鏈向小約3kDa的蛋白條帶的部分轉(zhuǎn)變。rEndoS注射后4小時IgG重鏈被完全轉(zhuǎn)變?yōu)檩^小表觀分子量形式并且這一結(jié)果被維持直到注射后第10天的最后的樣品(圖6A,染色，4小時至第10天)。相同樣品的凝集素印跡分析顯示在rEndoS注射后6-8小時IgG重鏈糖信號幾乎消失并且這一結(jié)果被維持直到第10天，此時凝集素信號只有輕微增力口(圖6A，LCA印跡)。為了了解rEndoS在已經(jīng)暴露于酶的動物中是否有活性，在第一次注射后第35天用lmg的rEndoS進(jìn)行第二次注射。再一次地，動物看起來沒有受注射影響并且如上文采集并分析血清樣品。SDS-PAGE顯示在第二次注射前IgG重鏈變?yōu)榕c完全糖基化的對照兔IgG重鏈一樣(圖6B，0小時，IgG)。l小時后，IgG重鏈部分地向小3kDa的表觀分子量轉(zhuǎn)變，而6-8小時后TgG重鏈被完全轉(zhuǎn)變并且這一轉(zhuǎn)變被維持直到這一第二次施用后的第10-14天(圖6B,染色，1小時至第14天)。凝集素印跡分析顯示在rEndoS注射后1-2小時IgG重鏈糖信號幾乎消失并且這一結(jié)果被維持直到笫8天，此時凝集素信號有輕微增加并在第10和14天之間進(jìn)一步輕微增加(圖6B，LCA印跡，第1-14天)。為了研究rEndoS在已經(jīng)兩次靜脈內(nèi)暴露于rEndoS的動物中是否仍然有活性，在第一次注射后130天用lmg的rEndoS進(jìn)行第三次注射。再一次地，動物沒有受注射影響并且如上文采集并分析血清樣品。SDS-PAGE顯示在第三次注射前，IgG重鏈變?yōu)榕c完全糖基化的對照兔IgG重鏈一樣(圖6C，O小時，IgG)。l小時后，IgG重鏈部分地向小3kDa的分子量轉(zhuǎn)變，并且這一轉(zhuǎn)變被維持直到這一第三次施用后的第8-10天(圖6C，染色，1小時至第14天)。凝集素印跡分析顯示在第三次rEndoS注射后一小時IgG重鏈糖信號消失并且這一結(jié)果被維持直到第5天，此時凝集素信號有輕微增加并在第6和14天之間進(jìn)一步增加(圖6C，LCA印跡，第1-14天)?？傮w來看，這些結(jié)果表明低濃度的EndoS于體內(nèi)有效地水解了全兔IgG庫上的重鏈聚糖。此外，之前靜脈內(nèi)暴露于EndoS沒有顯著影響EndoS的體內(nèi)酶促活性。實施例3:盡管有針對EndoS酶的抗體但EndoS在兔中是有活性的由于在注射第二次和第三次時EndoS具有完全的活性，因此確定這是由于對酶的免疫應(yīng)答是沒有或低水平的還是具有不干擾酶促活性的抗EndoS的特異性抗體是令人感興趣的。自從已知健康個體和用化膿性鏈球菌感染的那些個體都有抗EndoS的抗體(Akesson等人，2004,J.Infect.Dis.189:797-804)以來，這是尤其令人感興趣的。為了研究這一點(diǎn)，在10%SDS-PAGE上分離純化的rEndoS并電印跡至被切割為1.5mn的條的PVDF上。將條與來自第一次、第二次和第三次注射的所有血清樣品的1:500的稀釋液孵育，之后用過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體(Pierce)孵育。如上文對凝集素印跡描述過的將條用化學(xué)發(fā)光顯影。這一實驗顯示在第一次注射前已有與rEndoS反應(yīng)的抗體(圖7，第一次注射，0小時)。注射后10天對rEndoS的反應(yīng)性上僅有輕微增加(圖7，第一次注射和圖7A插圖)，但是在注射后6和8小時之間有個反應(yīng)性缺口(圖7，第一次注射)。這一發(fā)現(xiàn)的一種可能的原因是結(jié)合于rEndoS的特異性抗體被復(fù)合并被網(wǎng)狀內(nèi)皮組織系統(tǒng)從循環(huán)中除去。恰好在第二次注射rEndoS前，抗rEndoS的反應(yīng)性與第一次注射前相當(dāng)或略高，并且在注射后的最初3天中反應(yīng)性沒有增加(圖7，第二次注射，0小時-第3天)。第二次注射后從第4天到第14天，抗rEndoS的反應(yīng)性逐漸增加(圖7，第二次注射，第4天-14天)。第三次注射rEndoS前，抗rEndoS的反應(yīng)性比第二次注射前略高，并且反應(yīng)性在注射后的第一天中沒有增加(圖7，第三次注射，0小時-1天)。第三次注射后從第2天到第14天，抗rEndoS反應(yīng)性增加(圖7,第三次注射，第2-14天)，盡管高信號水平使測定增加的水平變得困難?？紤]到來自第二次和第三次注射后獲得的樣品的蛋白質(zhì)印跡中的非常高的信號水平，還通過ELISA分析了全部三次注射之前和之后的樣品。對于ELISA實驗，用2昭的EndoS包被微量滴定板(Nunc,Roskilde，Denmark)，之后用溶于PBS中的20mg/ml的牛血清白蛋白封閉。將來自EndoS注射前和注射后0.5、1、5和10天的動物的血清以1:100至1:200,000的系列稀釋用作第一抗血清。過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體(Pierce)用作第二抗體而ABTS(Roche,IN)作為過氧化物酶底物。通過用系列稀釋的多克隆兔1gG(Sigma)如上文包被微量滴定板并用過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體為第二抗體生成兔IgG的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在Victor3多標(biāo)記讀數(shù)器(Perkin-Elmer，Waltham，MS)中于405nm分析板。ELISA實驗證實了恰好在第二次注射EndoS前，抗EndoS反應(yīng)性與第一次注射前相當(dāng)或略高，并在注射后5天時反應(yīng)性仍舊沒有增加(圖7A，第一次和第二次注射)。第二次注射后從第5至10天，抗EndoS反應(yīng)性逐漸增加(圖7A，第二次注射，第5-10天)。在第三次注射EndoS前，ELISA數(shù)據(jù)證實抗EndoS反應(yīng)性比第二次注射前略高，并且在注射后第一天中反應(yīng)性沒有增加(圖7A,第三次注射，第0-1天)。第三次注射后從第5至10天，ELISA數(shù)據(jù)顯示抗EndoS反應(yīng)性顯著增加(圖7A，第三次注射，第5-10天)。這些結(jié)果表明在未暴露的動物中存在針對EndoS的抗體并且在兔中重復(fù)靜脈內(nèi)暴露時rEndoS產(chǎn)生免疫應(yīng)答。但是在三次連續(xù)的施用期間這些抗體沒有千擾rEndoS在循環(huán)中的活性。此外重復(fù)的施用沒有影響酶的大約12小時的循環(huán)時間(定義為檢測EndoS的能力)，如通過對來自兔血清樣品的EndoS的免疫沉淀和蛋白質(zhì)印跡分析所分析的。實施例4:EndoS切割CII特異性單克隆抗體進(jìn)行了與和不與EndoS孵育的并用10%的SDS-PAGE分離的IgG單克隆抗體(CIICl和M2139)的SDS-PAGE和凝集素印跡分析并將結(jié)果示于圖8。EndoS特異性地水解免疫球蛋白(IgG)的天冬酰胺連接的聚糖的P-1,4-二-N-乙酰殼二糖核。用EndoS除去糖側(cè)鏈之后，IgG分子量降低。在染色的凝膠圖片中可清楚地看到用EndoS處理的IgG樣品和未處理的IgG之間Y-鏈大小的差異。為了證實IgG的大小變化是由EndoS活性而不是由蛋白水解性的降解導(dǎo)致的并且產(chǎn)生Y-鏈上的聚糖部分的去除，進(jìn)行了凝集素印跡分析。來自雪花蓮(Ga/朋A仏vwrafc)(GNL)的凝集素優(yōu)先識別存在于y-鏈上二天線型聚糖中的a-1,3甘露糖殘基。當(dāng)與EndoS孵育時，使用GNL凝集素的相同樣品的凝集素印跡分析顯示出顯著下降的信號。相比之下，在不存在EndoS的情況下孵育時，y-鏈依舊是糖基化的。這些數(shù)據(jù)表明EndoS具有從小鼠IgG的Y-鏈除去含有a-1,3甘露糖的結(jié)構(gòu)的能力。實施例5:去糖基化的抗體在體內(nèi)結(jié)合于軟骨進(jìn)行這一實驗以了解從II型膠原蛋白(CII)特異性IgG單克隆抗體(mAb)除去糖部分是否影響其在體內(nèi)對n型膠原蛋白的結(jié)合能力。用lmg的CII結(jié)合抗體(正常的和EndoS處理的)腹膜內(nèi)注射1-2日齡的新生大鼠。抗體傳輸二十四小時后將爪解剖并在OCT化合物中用異戊烷和千冰迅速冷凍。用生物素化的抗小鼠k(187.1)抗體和HRP軛合的第二抗體作為檢測系統(tǒng)用標(biāo)準(zhǔn)實驗方案進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。結(jié)果示于圖9。EndoS處理和未處理的抗體在體內(nèi)對關(guān)節(jié)軟骨的結(jié)合模式上沒有差別。實施例6:通過抗CII單克隆抗體的去糖基化的關(guān)節(jié)炎致病力(arthritogenicitv)喪失CII特異性單克隆抗體在小鼠中誘導(dǎo)了急性型關(guān)節(jié)炎，即Nandakumar等人(2003)中描述的所謂的膠原蛋白抗體誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CAIA)。CAIA類節(jié)炎耳又決于補(bǔ)體成分，F(xiàn)qR，效應(yīng)細(xì)胞因子TNF-a和IL-ip以及取決于嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。CAIA用于本研究中以了解通過EndoS處理將IgG去糖基化的重要性。使用含有兩種抗體結(jié)合于Jl表位(551-564;GERGAAGIAGPK)的M2139mAb(IgG2b)和結(jié)合于II型膠原蛋白的Cl1(359-363;ARGLT)的CTICl(TgG2a)的單克隆抗體混合物誘導(dǎo)急性型關(guān)節(jié)炎，CAIA。為了測定去除糖側(cè)鏈?zhǔn)欠裼绊憂型膠原蛋白的病原單克隆抗體誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的能力，將用EndoS處理或或未處理的這一單克隆抗體的混合物注射入小鼠中。在0天用9mg未處理(11=7)或EndoS處理的(『5)抗CII單克隆抗體(M2139和CIIC1)注射雄性(BALB/cXB10.Q)Fl小鼠組。第5天時用50叱的大腸桿菌LPS腹膜內(nèi)注射所有小鼠。關(guān)節(jié)炎發(fā)生率(a)和平均關(guān)節(jié)炎得分(b)示于圖10。如可從圖10a和10b見到的，在早期顯示為對膠原蛋白抗體誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CATA)高度易感的(BALB/cXB10.Q)Fl小鼠中出現(xiàn)了臨床關(guān)節(jié)炎的完全抑制。因此，明顯是通過EndoS從IgG的Y-鏈去除糖取消了其關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)能力(關(guān)節(jié)炎致病力)。為了證實通過除去IgG的糖側(cè)鏈的單克隆抗體的關(guān)節(jié)炎致病力的喪失，在具有另一種遺傳背景BIO.RIII的小鼠中誘導(dǎo)了CAIA。在0天用9mg的未處理的(n=ll)或EndoS處理的(n=12)的抗CII單克隆抗體(M2139和CIIC1)注射雄性B10.RIII小鼠。在第5天時用50嗎的大腸桿菌LPS腹膜內(nèi)注射所有小鼠。關(guān)節(jié)炎發(fā)生率(a)和平均關(guān)節(jié)炎得分(b)示于圖11。如從圖ll所看到的，在B10.RIII小鼠中，與未處理的mAb混合物相比，由EndoS處理的mAb混合物誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率和嚴(yán)重度顯著下降。實施例7:體外經(jīng)由CH反應(yīng)性單克隆抗體的補(bǔ)體活化為了了解為什么從IgG的Y-鏈除去糖降低或取消了mAb的臨床關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)能力，用EndoS處理或未處理的抗體進(jìn)行體外實驗以評估它們誘導(dǎo)補(bǔ)體活化的能力。圖12顯示了在與I型膠原蛋白(a)或直接與塑料表面(b)結(jié)合的mAb上沉積的第一補(bǔ)體成分Clq。在通過EndoS處理(M2139D)和未處理(M2139)的抗體的補(bǔ)體系統(tǒng)的活化之間沒有差別。C1IC(EndoS處理和未處理的)mAb根本沒有活化補(bǔ)體。Gll(IgG2b)和L243(IgG2a)是結(jié)合于無關(guān)抗原的對照單克隆抗體。圖13顯示了補(bǔ)體成分C3的切割產(chǎn)物(C3b)在與II型膠原蛋白(a)或直接與塑料表面(b)結(jié)合的mAb上的沉積。在通過EndoS處理(M2139D)和未處理(M2139)的抗體的補(bǔ)體系統(tǒng)的活化之間沒有差別。CIIC1(EndoS處理和未處理的)mAb根本沒有活化補(bǔ)體。Gll(IgG2b)和L243(IgG2a)是結(jié)合于無關(guān)抗原的對照單克隆抗體。實施例8:CII特異性單克隆抗體的去糖基化對嗜中性粒細(xì)胞(PMNL)氧化猝發(fā)的影響為了測定在糖基化和去糖基化抗體在誘導(dǎo)多形核白細(xì)胞PMNL(嗜中性粒細(xì)胞)的氧化猝發(fā)的能力上是否有功能性差異，將聚苯乙烯微粒用EndoS處理和未處理的抗體包被并和來自具有三種不同基因型(FcgR+/+、FcgR-A和FcgR+/-)的小鼠的全血孵育。之后用FACS(熒光激活細(xì)胞分選術(shù))分析進(jìn)行氧化猝發(fā)測定。用RB6抗體識別PMNL。結(jié)果示于圖14。糖基化和去糖基化的抗體之間的氧化猝發(fā)的活化沒有差別。實施例9:小鼠爪的組織學(xué)為了檢查來自接受糖基化或EndoS處理的mAb的小鼠的爪的關(guān)節(jié)的組織學(xué)狀態(tài)，用標(biāo)準(zhǔn)的蘇木精-伊紅染色給來自用9mg未處理的、去糖基化的或未處理和EndoS處理的抗體混合物的等量混合物注射的(BALB/cxB10.Q)F1小鼠(n二3-4)的福爾馬林固定的脫鈣關(guān)節(jié)的6pm切片染色。結(jié)果表明在來自用糖基化抗體注射的小鼠的關(guān)節(jié)中出現(xiàn)大量的細(xì)胞浸潤以及軟骨和骨的糜爛。相比之下，用EndoS處理的抗體注射的小鼠爪僅顯示較小的骨糜爛并且沒有大量的細(xì)胞浸潤。在這些小鼠中軟骨看上去是正常的。實施例10:體內(nèi)正常和去糖基化抗體的清除率為了測定去糖基化抗體的減小的關(guān)節(jié)炎致病力是否是由于這些抗體與糖基化抗體相比從小鼠中早期并且提高的清除率，用在第1和5天從B10.RITI小鼠收集的血清進(jìn)行通過ELTSA(酶聯(lián)免疫吸附測定)的II型膠原蛋白結(jié)合抗體的分析。結(jié)果示于圖15。用糖基化和EndoS處理的mAb注射的小鼠的血清中存在的抗體水平之間沒有差異，表明去糖基化的抗體從小鼠的正常的清除率水平。實施例11:通過去糖基化抗體的免疫復(fù)合體的形成我們想要確定除對FcyR分子的結(jié)合差異之外，糖基化和EndoS處理的抗體之間是否存在任何的顯著差異。最有可能的是在抗體傳輸關(guān)節(jié)炎模型中最初的觸發(fā)事件中的第一步驟是軟骨表面上或滑膜中膠原蛋白-IgG免疫復(fù)合體的形成。膠原蛋白表位位于在軟骨表面上形成的重復(fù)結(jié)構(gòu)中，因此可能的是兩種不同的抗體可在關(guān)節(jié)表面上形成多體復(fù)合體，以通過最佳的補(bǔ)體活化或通過與FcyR負(fù)載細(xì)胞結(jié)合來促進(jìn)關(guān)節(jié)炎致病力。為了研究穩(wěn)定的免疫復(fù)合體形成的問題，在瓊脂糖上進(jìn)行抗體的單向免疫擴(kuò)散。將以lmg/ml溶于含有0.05%疊氮鈉的PBS的大鼠CII浸潤至1%的瓊脂糖(低成膠溫度瓊脂糖26-3CTC)凝膠中。將25ul的lmg/ml濃度的抗體對每孔上樣。用考馬斯藍(lán)對凝膠染色。結(jié)果顯示去糖基化的抗體與糖基化的mAb相比沒有形成穩(wěn)定的免疫復(fù)合體。對形成穩(wěn)定免疫復(fù)合體的這種無能力可能是對去糖基化抗體喪失關(guān)節(jié)炎致病力的另一種解釋。實施例12:EndoS從致死的抗體介導(dǎo)的血小板減少中解救小鼠證實EndoS在體內(nèi)有效地水解IgG聚糖并且動物耐受所述酶的施用之后，我們研究了EndoS治療嚴(yán)重的TgG介導(dǎo)的疾病的用途。所選擇的疾病模型是免疫性血小板減少性紫癜(ITP)的小鼠模型。在這一模型中，腹膜內(nèi)注射對抗小鼠血小板的多克隆兔IgG(aPLT-IgG)，導(dǎo)致嚴(yán)重的血小板減少、出血和在較高劑量的IgG時的最終的死亡?？剐∈笱“宓耐每寡迨菑腎nter-CellTechnologies(J叩iter,FL)購得。使用蛋白G瓊脂糖凝膠從這一血清分離IgG級分。通過SDS-PAGE分析確認(rèn)蛋白純度并用AdvancedProteinAssayReagent(高級蛋白測定試劑)(Cytoskeleton，Denver,CO)測定蛋白濃度。對使用預(yù)處理的IgG的實驗，將純化的兔抗小鼠血小板lgG(aPLT-lgG)以1:500的酶比底物比率用純化的GST-EndoS或GST于37。C粹育24小時，之后在谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠(GEHealthcare)上除去GST-EndoS和GST。如上文所述通過SDS-PAGE和使用LCA的凝集素印跡確認(rèn)IgG聚糖的水解。在標(biāo)準(zhǔn)的光照和溫度條件下安置雌性BALB/c小鼠(約重20g)并用標(biāo)準(zhǔn)的實驗室食物和水隨意喂食。將溶于0.25mlPBS的1.2mg抗小鼠血小板IgG(未處理、EndoS處理或GST處理的)通過腹膜內(nèi)注射(i.p.)施用于動物。監(jiān)測動物粘膜與皮膚的出血、身體活動、從組中的孤立并記錄存活時間。在即將注射兔抗小鼠血小板IgG之前以及在實驗過程中每隔一定間隔從小鼠收集血液樣品。從預(yù)熱的尾靜脈將5^1全血收集至含有45卩l(xiāng)1溶于PBS的0.1M檸檬酸鈉/檸檬酸(pH6.5)的管中。用流式細(xì)胞術(shù)確認(rèn)這些血液樣品中的血小板群。用倉鼠抗小鼠CD-61PE(BDBiosciences,SanJose，CA)于室溫標(biāo)記樣品10分鐘。將lO^il的SPHEROa彩色校準(zhǔn)粒子(BDBiosciences)加至每一個試管以使得能夠計數(shù)。用Utilysea(DakoCytomation,Glostr叩，Denmark)裂解紅細(xì)胞群并在FacsCalibur流式細(xì)胞計(BDBiosciences)上以對數(shù)模式分析樣品。通過在Neubauer室中人工計數(shù)來延續(xù)紅細(xì)胞裂解后血液樣品中的血小板數(shù)目計算。在預(yù)實驗(pilotexperiment)中，用1.2mg的aPLT-IgG注射三只雌性BALB/c小鼠并如上文描述的用流式細(xì)胞術(shù)和顯微鏡方法觀察隨時間的血小板計數(shù)。這顯示出所有三只小鼠迅速發(fā)生血小板減少并在aPLT-Ig施用后24小時內(nèi)發(fā)生死亡(圖16A)。接下來，我們測試了在對小鼠施用前用GST-EndoS或作為對照的GST預(yù)處理aPLT-IgG是否對疾病的發(fā)生和存活率有任何影響。用GST-EndoS處理的aPLT-IgG注射的所有動物(n=4)沒有發(fā)生疾病的任何征兆都存活了，而用GST處理的aPLT-Ig注射的所有動物(n=4)發(fā)生嚴(yán)重的皮下出血并在24小時內(nèi)死亡(圖16B)。這代表在兩組動物中統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異(p二0.0082)。此外，通過流式細(xì)胞術(shù)的每日血小板計數(shù)分析顯示GST-EndoS處理的aPLT-IgG對小鼠血小板計數(shù)沒有明顯的影響，而GST處理的aPLT-IgG導(dǎo)致了血小板計數(shù)的迅速下降(圖16C)。這些實驗證明aPLT-IgG的離體EridoS處理取消了IgG抗體的致病力，這一結(jié)果與EndoS的體內(nèi)活性一起促使我們?nèi)パ芯渴欠窨稍诩膊“l(fā)作后對小鼠施用EndoS以阻止致死的血小板減少的發(fā)展。用1.2mg的aPLT-IgG注射小鼠(n=8只/組)，之后在施用aPLT-lg后3小時腹膜內(nèi)注射100|ig的GST-EndoS或GST。所有用GST處理的動物(8/8)在兩天內(nèi)死亡，而只有2/8的用GST-EndoS處理的動物死亡(圖17A)。這代表了在組之間存活率的統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異(p=0.003)。來自GST-EndoS或GST處理的小鼠的總IgG的SDS-PAGE和凝集素印跡分析顯示在GST-EndoS處理的動物中aPLT-IgG處理后24、48和72小時重鏈聚糖被完全水解，而GST處理的動物中的IgG是完全糖基化的直到在24小時死亡發(fā)生(圖17B)。此外如流式細(xì)胞術(shù)所分析的血小板計數(shù)顯示aPLT-IgG的施用誘導(dǎo)了血小板計數(shù)的迅速下降，但是在GST-EndoS處理的小鼠中血小板計數(shù)開始穩(wěn)步上升并在2-3天后達(dá)到正常值(圖17C)。為了進(jìn)一步質(zhì)詢我們的假設(shè)，我們試圖模擬ITP患者的臨床情況。當(dāng)這些患者尋求醫(yī)療幫助時，血小板計數(shù)常常非常低并且已顯露出皮下和其他的出血并發(fā)癥。因此我們在小鼠(11=14)中用oPLT-IgG誘導(dǎo)疾病但直到在aPLT-IgG注射后5-7小時動物表現(xiàn)出明顯可見的皮膚血腫才開始用GST-EndoS或GST處理。在這些實驗中，5/7的用GST-EndoS處理的小鼠存活并恢復(fù)，而所有(7/7)用GST處理的小鼠在兩天內(nèi)死亡，再次代表了在兩組之間存活率的統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異(p=0.0015)(圖17D)?？傊覀兊慕Y(jié)果證明了小鼠中aPLT-IgG的致病特性取決于抗體的糖基化狀態(tài)，并且EndoS在離體和體內(nèi)都強(qiáng)烈地降低了抗血小板IgG抗體的致病力?？偟膩碚f，在用EndoS酶預(yù)處理病原抗體時和在疾病過程中早期或晚期施用EndoS時，EndoS對血小板計數(shù)和存活率都具有顯著的積極影響。據(jù)發(fā)明人所知，將IgG聚糖的體內(nèi)水解用作自身免疫性疾病的實驗性治療尚屬首次。由于發(fā)明人先前發(fā)現(xiàn)IgG的EndoS水解抑制所有亞類的IgG與FcR的結(jié)合并且還減少了補(bǔ)體活化，因此EndoS的積極影響的機(jī)制從理論觀點(diǎn)上講是非常清楚的。尤其令人感興趣的是EndoS不僅抑制IgG與FcR結(jié)合，并且還可通過水解重鏈聚糖釋放已經(jīng)與FcR結(jié)合的IgG。還應(yīng)注意到的是似乎有一種IgG-FcR相互作用沒有像其他相互作用那樣受到影響；在某些條件下EndoS水解的IgG比未水解的IgG與人類FcRllb的確結(jié)合得更好(數(shù)據(jù)未顯示)。由于IgG與FcRllb的相互作用已經(jīng)顯示出對用于治療自身免疫性疾患的靜脈內(nèi)注射免疫球蛋白(IV1G)的抗炎活性來說是重要的，因此在抗炎活性的背景下這可能具有相關(guān)性。沒有被任何假設(shè)束縛，發(fā)明人提出EndoS在一定條件下可通過直接抑制病原IgG與活化的FcR的結(jié)合和向通過FcRllb介導(dǎo)的抑制活性的轉(zhuǎn)變而具有雙倍的抗炎活性。力的替代方案，尤其是鑒于幾項最近的研究證實IgG聚糖為IgG效應(yīng)調(diào)節(jié)的關(guān)鍵。這包括發(fā)明人自己的關(guān)于這一聚糖的EndoS水解幾乎取消了通過經(jīng)典通路的補(bǔ)體活化并且減低了對白細(xì)胞上Fc受體的結(jié)合的發(fā)現(xiàn)?；诎l(fā)明人的觀察結(jié)果，顯示EndoS可用于治療其中IgG抗體起到病原作用的疾患，包括如本文通過ITP示例性說明的自身免疫性疾病和急性的抗體介導(dǎo)的器官同種異體移植物排斥。權(quán)利要求1.EndoS多肽或編碼EndoS多肽的多核苷酸在制備用于治療或預(yù)防由IgG抗體介導(dǎo)的疾病或疾患的藥物中的用途。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述EndoS多肽包括(a)SEQIDNO:1的氨基酸序列；(b)與SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少50%的同一性并具有IgG內(nèi)切糖普酶活性的其變體；或(d)具有IgG內(nèi)切糖苷酶活性的其任一片段。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其中所述多肽由SEQIDNO:1中所示的序列組成。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述多核苷酸包括(a)SEQIDNO:3的編碼序列；(b)由于遺傳密碼而對于如(a)中所定義的序列為簡并的序列；(c)與如(a)或(b)中所定義的序列具有至少60%同一性并編碼具有IgG內(nèi)切糖苷酶活性的多肽的序列；或(d)如(a)、(b)或(c)中所定義的序列中的任何一個的片段，所述片段編碼具有IgG內(nèi)切糖苷酶活性的多肽。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其中所述多核苷酸由SEQIDNO:3中所示的核酸序列組成。6.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項所述的用途，其中所述疾病或疾患是自身免疫性疾病、移植排斥、手術(shù)后治療或獲得性血友病。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其中所述自身免疫性疾病是艾迪生病、斑殼、強(qiáng)直性脊柱炎、抗磷脂綜合征、再生障礙性貧血、自身免疫性胃炎、自身免疫性聽力喪失、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性肝炎、自身免疫性甲狀旁腺功能減退癥、自身免疫性垂體炎、自身免疫性內(nèi)耳病、自身免疫性淋巴增生綜合征、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性睪丸炎、自身免疫性多內(nèi)分泌腺病、白塞氏病、大皰性類天皰癡、心肌病、慢性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病、丘-施二氏綜合征、腹腔疾病、克羅恩病、CREST綜合征、德戈斯病、獲得性大皰性表皮松解癥、原發(fā)性混合型冷球蛋白血癥、巨細(xì)胞動脈炎、腎小球腎炎、古德帕斯丘綜合征、格雷夫斯病、格林-巴利綜合征、橋本甲狀腺炎、特發(fā)性血小板減少性紫癜、炎癥性腸病、川崎病、梅尼埃綜合征、混合性結(jié)締組織病、莫倫氏潰瘍、多發(fā)性硬化、重癥肌無力、落葉型天皰瘡、尋常型天皰瘡、惡性貧血、結(jié)節(jié)性多動脈炎、1型多腺體自身免疫性綜合征(PAS-1)、2型多腺體自身免疫性綜合征(PAS-2)、3型多腺體自身免疫性綜合征(PAS-3)、多肌炎/皮肌炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎、雷諾氏綜合征、賴特爾綜合征、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病、硬皮病、舍格倫綜合征、亞急性甲狀腺炎、交感性眼炎、系統(tǒng)性紅斑狼痤、高安氏動脈炎、l型糖尿病、白癜風(fēng)、伏格特-小柳-原田疾病或韋格納氏肉芽腫病。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其中所述自身免疫性疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其中所述自身免疫性疾病是系統(tǒng)性紅斑狼癡。10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其中所述自身免疫性疾病是特發(fā)性血小板減少性紫癜。11.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其中所述移植排斥是同種異體移植物排斥或異種移植物排斥。12.—種EndoS多肽或編碼EndoS多肽的多核苷酸，其在用于治療或預(yù)防由IgG抗體介導(dǎo)的疾病或疾患的方法中使用。13.—種在需要其的受治療者中治療或預(yù)防由IgG抗體介導(dǎo)的疾病或疾患的方法，所述方法包括對所述受治療者施用治療有效量的EndoS多肽或編碼EndoS多肽的多核芬酸。14.一種離體處理采自患有由IgG抗體介導(dǎo)的疾病或疾患的患者的血液的方法，其包括將所述血液與EndoS多肽接觸。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述血液在其與所述EndoS多肽接觸后被返回到所述患者。全文摘要本發(fā)明提供了EndoS多肽或編碼EndoS多肽的多核苷酸在制備用于治療或預(yù)防由IgG抗體介導(dǎo)的疾病或疾患的藥物中的用途。文檔編號A61K38/47GK101605557SQ200780051249公開日2009年12月16日申請日期2007年12月12日優(yōu)先權(quán)日2006年12月13日發(fā)明者K·S·南達(dá)庫瑪,L·博喬克,R·霍默達(dá),烏納·莎儂,阿恩·奧爾森,馬迪亞斯·科林申請人:漢莎醫(yī)藥有限公司