專(zhuān)利名稱(chēng)：靶向的聚賴(lài)氨酸樹(shù)狀聚體治療劑改性的大分子2的制作方法
專(zhuān)利說(shuō)明靶向的聚賴(lài)氨酸樹(shù)狀聚體治療劑改性的大分子2 發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明總體上涉及分支大分子及其作為成像劑或造影劑的用途。具體而言，本發(fā)明涉及由賴(lài)氨酸或賴(lài)氨酸類(lèi)似物衍生而來(lái)并具有多個(gè)功能部分的樹(shù)狀聚體，本發(fā)明還涉及所述大分子的用途，特別是在治療應(yīng)用中的用途，以及包含其的組合物。

背景技術(shù)：
本說(shuō)明書(shū)對(duì)任何現(xiàn)有出版物(或者由該出版物所得到的信息)或者任何已知事物的引用，不能并且不應(yīng)該成為認(rèn)可或承認(rèn)、或者以任何方式表明這些現(xiàn)有的出版物(或者由該出版物所得到的信息)或者已知的事物形成了本說(shuō)明書(shū)所涉及的致力研究領(lǐng)域中的部分普通常識(shí)。
鑒定用于藥物制備物的新化合物是尋找更可靠和更有效治療的重要部分。然而，同樣重要的是已知藥物的研發(fā)和改進(jìn)，降低與新候選藥物相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)，以及顯著減少使藥物進(jìn)入臨床研發(fā)的進(jìn)展和花費(fèi)。
許多藥物在臨床試驗(yàn)階段失敗，要么是因?yàn)樗鼈兊奈锢硇再|(zhì)(特別是溶解度)使它們難以制備，要么是因?yàn)椴畹闹委熤笖?shù)在高藥物濃度期間(即，在剛剛給藥后)引起毒性作用。其他缺點(diǎn)包括差的吸收，差的生物利用度，不穩(wěn)定性，由于不能靶向藥物而引起的全身副作用，以及一旦給藥后不能控制其生物分布、代謝和腎或肝的清除。類(lèi)似地，目前市場(chǎng)上的一些產(chǎn)品可以就這些方面進(jìn)行改進(jìn)。
已經(jīng)嘗試許多方法來(lái)改善藥物化合物的特征，包括將藥物試劑制成脂質(zhì)體、膠束或聚合物膠束制劑，以及將藥物試劑與親水聚合物主鏈共價(jià)連接。
理想的特征改性劑的特點(diǎn)包括具有明確定義的結(jié)構(gòu)，允許對(duì)目的化合物的吸收、分布、代謝和排泄(ADME)特征(也稱(chēng)為藥代動(dòng)力學(xué))進(jìn)行精確控制，以及能方便地在每個(gè)試劑或結(jié)構(gòu)中攜帶多種化合物。通過(guò)控制其從所述試劑或結(jié)構(gòu)成分中釋放(使身體僅僅與治療血藥濃度的化合物接觸)可以改善目的化合物的毒性。
在最近幾年，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)樹(shù)枝狀大分子或樹(shù)狀聚體在生物技術(shù)和藥物應(yīng)用中的應(yīng)用不斷增加。樹(shù)枝狀大分子是具有稠密分枝結(jié)構(gòu)的一類(lèi)特殊聚合物，其特征在于具有比普通聚合物更高的功能部分濃度/單位分子體積。有三亞類(lèi)樹(shù)枝狀大分子隨機(jī)超支化聚合物；樹(shù)枝狀接枝聚合物和樹(shù)狀聚體(其包括樹(shù)狀分子(dendron))，根據(jù)存在于每一個(gè)樹(shù)枝狀結(jié)構(gòu)中結(jié)構(gòu)控制的相對(duì)程度進(jìn)行分類(lèi)(Fréchet andTomalia″Dendrimers and other Dendritic Polymers″，Wiley andSons，New York，2002)。樹(shù)狀聚體的獨(dú)特性質(zhì)，特別是，諸如它們高程度的分支、多價(jià)、球狀結(jié)構(gòu)以及明確確定的分子量，使它們成為藥物應(yīng)用中有希望的新骨架。在過(guò)去幾十年里，已經(jīng)增加了關(guān)于設(shè)計(jì)和合成生物相容的樹(shù)狀聚體及其在許多生物科學(xué)領(lǐng)域(包括大分子藥物、藥物遞送、生物醫(yī)學(xué)成像和醫(yī)學(xué)設(shè)備)中的應(yīng)用的研究。
樹(shù)枝狀聚合物作為藥物遞送載體和藥物活性劑的潛在利用近年來(lái)已經(jīng)受到越來(lái)越多的關(guān)注。然而，雖然文獻(xiàn)有許多報(bào)道，例如樹(shù)狀聚體組裝的合成方案，樹(shù)狀聚體-藥物相互作用和藥物負(fù)載效率的描述，以及越來(lái)越多的關(guān)于樹(shù)狀聚體與細(xì)胞系相互作用的體外評(píng)價(jià)，但幾乎沒(méi)有描述樹(shù)狀聚體的基本藥代動(dòng)力學(xué)和代謝速率的信息。
此外，制備在血液中循環(huán)足夠長(zhǎng)時(shí)間以在靶位點(diǎn)上聚集，但還可以以合理速率從體內(nèi)排除以避免長(zhǎng)期堆積的樹(shù)狀聚體，仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。此外，樹(shù)狀聚體的組織定位仍然難以預(yù)先預(yù)測(cè)，且需要更多的研究來(lái)確定外周樹(shù)枝狀基團(tuán)對(duì)這些性質(zhì)的影響。另一個(gè)需要研究的領(lǐng)域是藥物從樹(shù)狀聚體的釋放。與致密的球狀樹(shù)枝狀結(jié)構(gòu)相關(guān)的空間位阻使得酶促可切除連接的改造困難。
驚奇地發(fā)現(xiàn)，如本文所述通過(guò)引入一種或多種功能部分，可以顯著改善所述大分子的功效，且對(duì)可能存在的其他功能部分沒(méi)有顯著不利影響，或不干擾可能存在的其他功能部分。
發(fā)明概述 本發(fā)明涉及樹(shù)狀聚體，其具有與其核心部分連接的第一功能部分和至少一個(gè)與所述樹(shù)狀聚體最外層的結(jié)構(gòu)單元(表面結(jié)構(gòu)單元)的表面連接的第二功能部分。特別是，本發(fā)明涉及一種樹(shù)狀聚體，其包含核心和一層或多層賴(lài)氨酸或賴(lài)氨酸類(lèi)似物結(jié)構(gòu)單元，其中所述樹(shù)狀聚體具有與核心部分的氮原子連接的第一功能部分和與結(jié)構(gòu)單元最外層的表面氨基氮原子連接的一個(gè)或多個(gè)第二功能部分。
因此，本發(fā)明的第一個(gè)方面提供了一種大分子，其包含 (i)核心部分，其具有用于與第一功能部分連接的第一氨基氮原子，以及用于與賴(lài)氨酸或賴(lài)氨酸類(lèi)似物構(gòu)造單元連接的至少兩個(gè)其他的氨基氮原子； (ii)第一功能部分，其通過(guò)第一氨基氮原子與所述的核心部分連接； (iii)至少一層賴(lài)氨酸或賴(lài)氨酸類(lèi)似物構(gòu)造單元，其最外層具有用于與一個(gè)或多個(gè)第二功能部分連接的表面氨基氮原子，這些所述的層通過(guò)所述的核心部分的至少兩個(gè)其他氨基氮原子而與所述的核心部分連接；以及 (iv)一個(gè)或多個(gè)第二功能部分，其與賴(lài)氨酸或賴(lài)氨酸類(lèi)似物構(gòu)造單元的最外層的表面氨基氮原子連接； 其中 所述的第一和第二功能部分均包含選自藥學(xué)活性試劑、相互作用試劑和藥代動(dòng)力學(xué)改性劑試劑。
將藥學(xué)活性試劑整合到本發(fā)明的大分子中可以在使用時(shí)為所述試劑提供延長(zhǎng)的釋放特征，或延長(zhǎng)其血漿停留時(shí)間。將藥代動(dòng)力學(xué)改性劑整合到所述大分子中可以在使用時(shí)進(jìn)一步增強(qiáng)所述藥學(xué)活性試劑的釋放特征，或進(jìn)一步延長(zhǎng)其血漿停留時(shí)間。將相互作用試劑(諸如靶向試劑或捕獲試劑)整合到本發(fā)明的大分子中可以在使用時(shí)增加所述大分子在靶細(xì)胞或組織類(lèi)型中的濃度，并有利地增加靶細(xì)胞或組織類(lèi)型中所述大分子的攝取，或靶向所述大分子至所使用的蛋白、DNA或RNA靶，或提供將所述大分子與診斷或醫(yī)療設(shè)備成分的表面連接的更有效的、可重復(fù)的方法。
反過(guò)來(lái)，可以將如上所述不同類(lèi)型的功能部分的兩個(gè)或多個(gè)整合到所述大分子中以提供具有多個(gè)互補(bǔ)功能的大分子。
第二功能部分可以與第一功能部分相同或不同。第二功能部分可以?xún)H與表面氨基氮原子的一個(gè)、一些或全部連接。所述大分子可以?xún)H包含第一和第二功能部分，或可以包含一個(gè)或多個(gè)如本文所定義的第三(和任選地第四和第五)功能部分，其可以任選地與表面氨基連接以提供一種大分子，所述大分子在核心具有第一功能部分和在所述大分子的表面上具有每一種第二和第三(和任選地第四和第五)功能部分的至少一種。第三(和任選地第四和第五)功能部分可以選自藥學(xué)活性試劑、藥代動(dòng)力學(xué)改性劑或相互作用試劑。
所述功能部分可獨(dú)立地與合適的氮原子直接相連，或經(jīng)由可切除或不可切除的連接體連接。
根據(jù)本發(fā)明這個(gè)方面的大分子特別適合呈遞藥學(xué)活性試劑。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，至少第一和/或第二功能部分包含藥學(xué)活性試劑。所述大分子可以在大分子的核心上和/或在大分子表面所選的位點(diǎn)上包括與核心和/或表面結(jié)構(gòu)單元連接的單一藥學(xué)活性試劑或多種藥學(xué)活性試劑(其可以是相同或不同的)。
在該實(shí)施方案的具體實(shí)施例中，藥學(xué)活性試劑與所述大分子的核心部分連接。在其進(jìn)一步的實(shí)施例中，所述藥學(xué)活性試劑是蛋白或多肽。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，至少第一和/或第二功能部分包含藥代動(dòng)力學(xué)改性劑。所述大分子可以在大分子的核心上和/或在大分子表面所選的位點(diǎn)上包括與核心和/或表面結(jié)構(gòu)單元連接的單一藥代動(dòng)力學(xué)改性劑或多種藥代動(dòng)力學(xué)改性劑(其可以是相同或不同的)。
大分子的呈遞可以有利地導(dǎo)致所述大分子性能的改善，所述大分子包括包含藥學(xué)活性試劑的第一功能部分，和至少一種包含藥代動(dòng)力學(xué)改性劑的第二功能部分。
在本發(fā)明其他實(shí)施方案中，提供一種大分子，其中第一功能部分包含靶向試劑(諸如，抗體)，和至少一種包含藥學(xué)活性試劑的第二功能部分。
在本發(fā)明的另一方面，提供制備如上所述大分子的方法，包括下述步驟 (i)提供 (a)樹(shù)狀聚體，其包括 (i)核心部分，其具有用于與第一功能部分連接的第一氨基氮原子，以及用于與賴(lài)氨酸或賴(lài)氨酸類(lèi)似物構(gòu)造單元連接的至少兩個(gè)其他的氨基氮原子； (ii)在第一氨基氮原子上的第一保護(hù)基團(tuán)； (iii)至少一層賴(lài)氨酸或賴(lài)氨酸類(lèi)似物構(gòu)造單元，其最外層具有用于與一個(gè)或多個(gè)第二功能部分連接的表面氨基氮原子，這些所述的層通過(guò)所述的核心部分的至少兩個(gè)其他氨基氮原子而與所述的核心部分連接；以及 (iv)在賴(lài)氨酸或賴(lài)氨酸類(lèi)似物結(jié)構(gòu)單元的最外層的一個(gè)或多個(gè)表面氨基氮原子上的第二保護(hù)基團(tuán)； (b)第一功能部分；和 (c)至少一種第二功能部分； (ii)使用第一保護(hù)基團(tuán)對(duì)其惰性的反應(yīng)條件選擇性地除去第二保護(hù)基團(tuán)； (iii)將至少一種第二功能部分與所述去保護(hù)的表面氨基氮原子連接； (iv)除去第一保護(hù)基團(tuán)； (v)將第一功能部分與所述去保護(hù)的第一氨基氮原子或連接體基團(tuán)連接。
在本發(fā)明的另一方面，提供一種藥物組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的大分子及其藥學(xué)可接受的賦形劑、載體或佐劑。
在另一方面，本發(fā)明提供如本文所述的一種大分子，其用于治療。
如本文所討論的，可以在各種應(yīng)用中利用根據(jù)本發(fā)明該方面的大分子和含有所述大分子的藥物組合物，其中將所述藥學(xué)活性試劑定向或結(jié)合具體的作用位點(diǎn)，或具體的細(xì)胞或組織類(lèi)型，或蛋白、DNA或RNA靶、或底物的能力，或改進(jìn)其藥代動(dòng)力學(xué)的能力。


發(fā)明內(nèi)容
本說(shuō)明書(shū)對(duì)任何現(xiàn)有出版物(或者由該出版物所得到的信息)或者任何已知事物的引用，不能并且不應(yīng)該成為認(rèn)可或承認(rèn)、或者以任何方式表明這些現(xiàn)有的出版物(或者由該出版物所得到的信息)或者已知的事物形成了本說(shuō)明書(shū)所涉及的致力研究領(lǐng)域中的部分普通常識(shí)。
在本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”包括完整的抗體、或衍生物或片段(例如通過(guò)酶或化學(xué)裂解而產(chǎn)生的或者通過(guò)重組而得到的)，或者通過(guò)蛋白質(zhì)表達(dá)技術(shù)或者通過(guò)化學(xué)合成而產(chǎn)生的抗體結(jié)合區(qū)域的模擬物(其保持了特異性的結(jié)合活性)。具體而言，所述的術(shù)語(yǔ)包括單克隆抗體以及由單克隆抗體得到的所有的多種形式，包括但不限于全長(zhǎng)抗體(例如具有完整的Fc區(qū)域)；抗原結(jié)合片段，包括例如Fv、Fab、Fab’和F(ab′)2片段；以及采用重組方法形成的抗體衍生的多肽，例如單鏈抗體。本文所用的術(shù)語(yǔ)、“抗體”以及“多種抗體”是指在例如轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中或者通過(guò)噬菌體展示而形成的人抗體、以及嵌合抗體和人源化的抗體。
在本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中使用的術(shù)語(yǔ)“連接的”是指大分子的化學(xué)成分之間通過(guò)共價(jià)鍵、氫鍵、吸附作用、金屬鍵合、范德華力、離子鍵合、螯合-金屬-螯合連接鍵、配體-受體連接鍵、由肽的類(lèi)似物的DNA和RNA的互補(bǔ)雙鏈而形成的雙鏈體或三鏈體、或者它們的組合而形成的相連。本發(fā)明所包括的具體形式為共價(jià)鍵。所述的連接可以為直接連接，或者通過(guò)一個(gè)或多個(gè)插入部分(例如一個(gè)或多個(gè)橋連、隔離物或連接體部分，這些術(shù)語(yǔ)在本文中可以互換使用)而形成的間接連接。此外，連接基團(tuán)或功能部分或胺可以進(jìn)一步通過(guò)有助于連接的改性劑改性。
在本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中所使用的術(shù)語(yǔ)“所選的連接點(diǎn)”指樹(shù)枝狀大分子聚合物的一個(gè)或多個(gè)氨基，其與樹(shù)枝狀大分子聚合物的其他氨基不同在于其在合成樹(shù)狀聚體聚合物的規(guī)定階段中是唯一有反應(yīng)性的，從而允許功能部分或樹(shù)枝狀基序的連接。這有利于實(shí)現(xiàn)功能部分的表面位置和分布被獲知。因此所選的連接點(diǎn)還可以在核心部分的第一氮原子上或在樹(shù)狀聚體的表面上。
在本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中所使用的術(shù)語(yǔ)“結(jié)合”指給定分子例如被另一配體捕獲(結(jié)合)和抓住(held)從而與靶相互作用的能力，使得所述配體和其靶之間的相互作用是相對(duì)特異性的。實(shí)例包括抗體、或其衍生物和片段與抗體靶(受體)之間的特異性相互作用；或小分子(諸如生物素、葉酸或地高辛)與其各自地靶(受體或抗體)之間的相互作用。
在本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中使用的術(shù)語(yǔ)“衍生物”和“片段”，當(dāng)其使用與多肽(特別是抗體)有關(guān)時(shí)，是指具有相似的氨基酸序列(即，至少80％、85％、90％或95％的同源性)并且至少在一定程度上保持了所述多肽的活性的功能等價(jià)物。
在本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中使用的術(shù)語(yǔ)“賴(lài)氨酸類(lèi)似物”是指具有單一一個(gè)頂部羧基、以及兩個(gè)或三個(gè)伯胺基團(tuán)的分子。在一種情況下，對(duì)于母體賴(lài)氨酸1而言，賴(lài)氨酸類(lèi)似物可以是不對(duì)稱(chēng)的，這種情況被定義為將伯胺與羧酸酯頂部相連的鍵和原子是不同的。在第二種情況下，賴(lài)氨酸類(lèi)似物可以為對(duì)稱(chēng)的，其中對(duì)稱(chēng)被定義為將每個(gè)伯胺與羧酸酯相連的鍵和原子是相同的，并且忽視當(dāng)每個(gè)伯胺進(jìn)一步發(fā)生反應(yīng)時(shí)所潛在性地引入的不對(duì)稱(chēng)情況。
在本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中使用的術(shù)語(yǔ)“樹(shù)狀聚體基序”是指大分子的分離的單元，當(dāng)大分子的一個(gè)分支在所述的鍵(其將所述的構(gòu)造單元或核心的一個(gè)反應(yīng)性胺與所連接的構(gòu)造單元的頂部羧酸酯基團(tuán)相連)處被割斷時(shí)，樹(shù)狀聚體基序?qū)ⅰ懊撾x”。樹(shù)狀聚體基序的頂部羧酸酯基團(tuán)代表了這樣的點(diǎn)，在合成本發(fā)明的大分子的過(guò)程中，樹(shù)狀聚體基序在所述的點(diǎn)處與生長(zhǎng)中的大分子核心連接。
在本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中使用的術(shù)語(yǔ)“構(gòu)造單元”是指在樹(shù)狀聚體基序的組裝過(guò)程中使用的賴(lài)氨酸或賴(lài)氨酸類(lèi)似物。所述的構(gòu)造單元可以為表面以下的構(gòu)造單元，其為構(gòu)造單元的層的一部分或一代，其中所述的構(gòu)造單元具有可以與其他構(gòu)造單元的頂部羧酸酯基團(tuán)進(jìn)一步發(fā)生反應(yīng)的胺。所述的這些層可以依次描述為表面下第一層，其是指與所述的表面層緊密相鄰的第一個(gè)表面下的層；表面下第二層為在所述的表面層以下的第二層；表面下第三層為在所述的表面層以下的第三層；以此類(lèi)推。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“層”或“代”是指與所述的核心部分具有相同程度的連接性的多個(gè)構(gòu)造單元，即具有相同數(shù)量的、將所討論的構(gòu)造單元與所述核心的氨基氮原子連接的構(gòu)造單元。例如，直接與所述的核心部分的氮原子連接、或者通過(guò)連接體基團(tuán)而與所述的核心部分的氮原子連接的構(gòu)造單元被稱(chēng)為第一層或第一代。在其與所述核心部分的氮原子之間具有一個(gè)構(gòu)造單元的構(gòu)造單元被稱(chēng)為第二層或第二代。一層或一代構(gòu)造單元必需包含至少兩個(gè)構(gòu)造單元。對(duì)于所用的構(gòu)造單元而言，每層構(gòu)造單元為同質(zhì)的，然而不同的構(gòu)造單元可用于制備不同的層。因此，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，所述的大分子由一層或多層單一一種構(gòu)造單元(例如賴(lài)氨酸)構(gòu)成。在其他實(shí)施方案中，所述的大分子包含至少兩層構(gòu)造單元，其中至少兩層構(gòu)造單元由不同的構(gòu)造單元構(gòu)成。
術(shù)語(yǔ)“小分子”指任何非肽分子，其分子量至多為約1500道爾頓，諸如從約200至約600，或從約600至約1000，或從約1000至約1500道爾頓。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“表面”用于指樹(shù)狀聚體的構(gòu)造單元的最外層。
在本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中使用的術(shù)語(yǔ)“表面構(gòu)造單元”是指大分子的構(gòu)造單元的最外層，即，沒(méi)有與表面構(gòu)造單元的表面上的胺連接的其他構(gòu)造單元。
在本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中使用的術(shù)語(yǔ)“表面上的胺”或者“表面上的氨基”或者“表面上的氨基氮原子”是指由表面構(gòu)造單元衍生的樹(shù)狀聚體基序的任何最外面的氮。這些表面上的胺代表了用于其他構(gòu)造單元、連接體或功能部分(任選地通過(guò)改性基團(tuán))的連接點(diǎn)。
在本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中所使用的術(shù)語(yǔ)“功能部分”指如本文定義的任何基團(tuán)，其可以直接或間接地連接在所述核心第一氨基氮原子或表面胺處，以實(shí)現(xiàn)所述功能。功能部分的性質(zhì)和數(shù)目可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的分析技術(shù)(包括質(zhì)子/碳NMR、ESI或MALDI質(zhì)譜)來(lái)測(cè)定。
在本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中使用的術(shù)語(yǔ)“胺保護(hù)基團(tuán)”是指這樣的基團(tuán)，就該基團(tuán)而言，其除去過(guò)程具有一定的順序，從而使得這些并非用于切除的基團(tuán)對(duì)切除環(huán)境是惰性的。當(dāng)將保護(hù)基團(tuán)定義為“可溶的”時(shí)，其是指用于除去一個(gè)基團(tuán)的環(huán)境可以影響第二個(gè)基團(tuán)的整體性，而如果第一個(gè)基團(tuán)的整體性有待保持的話，就需要首先除去第二個(gè)基團(tuán)。當(dāng)保護(hù)基團(tuán)被進(jìn)一步定義為“正交(orthogonal)”時(shí)，其是指每個(gè)基團(tuán)對(duì)于除去正交組中的每一個(gè)其他基團(tuán)所需要的切除環(huán)境是惰性的。重要的應(yīng)該注意，當(dāng)采用了合適的反應(yīng)條件時(shí)，保護(hù)基團(tuán)僅為可溶的或者僅為正交的。本領(lǐng)域中描述了多種用于多胺分子的選擇性單保護(hù)的普通方法。此類(lèi)方法在Krapcho and Kuell SyntheticCommun.(1990)202559中有所描述。
本發(fā)明的大分子由至少一層賴(lài)氨酸或賴(lài)氨酸類(lèi)似物構(gòu)造分子構(gòu)建而成。本發(fā)明所包括的構(gòu)造單元的實(shí)例包括以下這些(其中#表示頂部羧基的羰基殘基) 賴(lài)氨酸*1具有以下結(jié)構(gòu)
甘氨酰-賴(lài)氨酸*2具有以下結(jié)構(gòu)
類(lèi)似物3具有以下結(jié)構(gòu)，其中a為整數(shù)1或2；而b和c獨(dú)立地為整數(shù)1、2、3或4。

類(lèi)似物4具有以下結(jié)構(gòu)，其中a為整數(shù)0、1或2；而b和c獨(dú)立地為整數(shù)2、3、4、5或6。

類(lèi)似物*5具有以下結(jié)構(gòu)，其中a為整數(shù)0、1、2、3、4或5；而b和c獨(dú)立地為整數(shù)1、2、3、4或5。

類(lèi)似物6具有以下結(jié)構(gòu)，其中a為整數(shù)0、1、2、3、4或5；而b和c獨(dú)立地為整數(shù)0、1、2、3、4或5。

類(lèi)似物7具有以下結(jié)構(gòu)，其中a為整數(shù)0、1、2、3、4或5；而b和c獨(dú)立地為整數(shù)1、2、3、4或5。

類(lèi)似物8具有以下結(jié)構(gòu)，其中a為整數(shù)0、1、2、3、4或5；而b、c和d獨(dú)立地為整數(shù)1、2、3、4或5。

類(lèi)似物9具有以下結(jié)構(gòu)，其中a為整數(shù)0、1、2、3、4或5；而b和c獨(dú)立地為整數(shù)1、2、3、4或5。

此外，所述構(gòu)造單元的任何亞甲基可以被亞甲氧基(CH2-O)或亞乙氧基(CH2-CH2-O)替代，前體條件是這種替代不會(huì)導(dǎo)致在所述的構(gòu)造單元內(nèi)形成碳酸酯(-O-C(O)-O-)或氨基甲酸酯(-O-C(O)-N-)部分。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，所述的構(gòu)造單元選自賴(lài)氨酸1、甘氨酰-賴(lài)氨酸2或賴(lài)氨酸類(lèi)似物5
其中a為整數(shù)0、1或2；此外，1、2或5的任何亞甲基可以被亞甲氧基或亞乙氧基替代，前體條件是這種替代不會(huì)導(dǎo)致在所述的構(gòu)造單元內(nèi)形成碳酸酯或氨基甲酸酯部分。
所述構(gòu)造單元的羧酸酯基團(tuán)和胺基可以被衍生，從而增大或減小這些基團(tuán)的活性。可以使用諸如Boc，CBz，4-硝基芐氧基氨基甲酸酯(4-NO2-CBz)Fmoc，Dde，CF3CO2，2-鹵代-CBz，Alloc，Me3SiEtSO2，Troc，o-NO-2PhSO2以及2，4-二硝基苯-磺酰基之類(lèi)的胺保護(hù)基團(tuán)來(lái)保護(hù)(衍生)反應(yīng)性胺基。
通常，游離羧基不具有足夠的反應(yīng)性來(lái)與胺反應(yīng)形成酰胺鍵，這樣優(yōu)選的是提供有助于脫水作用并由此驅(qū)動(dòng)反應(yīng)完成的一些手段。這可以通過(guò)例如“活化”羧基作為?；u化物衍生物或活性酯衍生物來(lái)實(shí)現(xiàn)(The Peptides，Analysis，Synthesis and Biology Vol 1 MajorMethods of Peptide Bond Formation；Academic Press New York 1979eds Gross，E.and Meienhofer，J.，PeptidesChemistry andBiology，Wiley-VCH Weinheim 2002，Sewald，N.and Jakubke，H-D.，The Chemical Synthesis of Peptides Clarendon Press，Oxford 1994，Jones，J.)。
在第一種活化方法中，在脫水反應(yīng)物存在下(如果需要的話，其他活化試劑也可以存在)，使含有羧酸的反應(yīng)物與含有羥基部分的第二種反應(yīng)物發(fā)生反應(yīng)，從而得到這樣的產(chǎn)物，其中含酸部分與含羥基部分通過(guò)酯鍵相連。該產(chǎn)物被稱(chēng)為“活化酯”。選擇含有羥基部分的反應(yīng)物，使得所述的產(chǎn)物酯可以容易地與伯胺發(fā)生反應(yīng)，從而生成氨化物，并釋放出之前所述的含有羥基部分的反應(yīng)物。在一些情況下，活性酯是足夠穩(wěn)定的，從而能夠在使用之前對(duì)其進(jìn)行分離、純化和儲(chǔ)存。
在第二種活化方法中，可以使含有羧基的反應(yīng)物與活化試劑“原位”發(fā)生反應(yīng)，從而形成?；?lèi)物質(zhì)，該物質(zhì)進(jìn)一步與伯胺(其同樣以“原位”方式存在，或者是在合適的先前活化時(shí)間之后加入的)反應(yīng)，從而形成所需的酰胺鍵。
兩種活化方法在PCT/AU2006/001591中都有更詳細(xì)的描述。
樹(shù)狀聚體基序的賴(lài)氨酸或賴(lài)氨酸類(lèi)似物構(gòu)造單元與核心化合物發(fā)生反應(yīng)。所述的核心可以是含有三個(gè)或多個(gè)反應(yīng)性(氨基)氮的任何化合物，其中一個(gè)反應(yīng)性(氨基)氮最終成為用于第一功能部分(第一氨基氮原子)的連接點(diǎn)。應(yīng)該理解，該氮原子可以在樹(shù)狀聚體的構(gòu)建過(guò)程中通過(guò)合適的保護(hù)基團(tuán)來(lái)保護(hù)。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，所述的核心可以通過(guò)使二氨基化合物的一個(gè)氮原子與賴(lài)氨酸或賴(lài)氨酸類(lèi)似物反應(yīng)，從而形成三氨基核心化合物的方法來(lái)制備。然后，所述的二氨基化合物的未反應(yīng)的氨基成為用于連接第一功能部分的氨基，而所述的賴(lài)氨酸或賴(lài)氨酸類(lèi)似物的至少兩個(gè)氨基成為用于所述的構(gòu)造單元的連接點(diǎn)。
適用于與賴(lài)氨酸或賴(lài)氨酸類(lèi)似物(例如本文示例性舉出的那些)反應(yīng)、從而制備出所述的核心部分的二氨基化合物包括
其中a為1-9的整數(shù)，例如1、2、3、4或5；
其中a、b和c獨(dú)立地為整數(shù)1、2、3、4或5，例如2或3；并且d為0-100的整數(shù)，例如1-30，特別是1-5、6-10、11-15、16-20、21-25或26-30；
其中a和b獨(dú)立地為整數(shù)0、1、2、3、4或5；
其中a和c獨(dú)立地為整數(shù)1、2、3、4、5或6；而c為整數(shù)0、1、2、3、4、5或6；
其中a和d獨(dú)立地為整數(shù)1、2、3、4、5或6；而b和c獨(dú)立地為整數(shù)0、1、2、3、4、5或6。
可以使用未經(jīng)過(guò)進(jìn)一步改性(即，與賴(lài)氨酸或賴(lài)氨酸類(lèi)似物發(fā)生反應(yīng))的三氨基化合物，或者可以使該三氨基化合物與賴(lài)氨酸或賴(lài)氨酸類(lèi)似物發(fā)生反應(yīng)來(lái)形成四氨基核心。
三氨基化合物的實(shí)例包括
其中a、b和c獨(dú)立地為整數(shù)1、2、3、4、5或6；
其中a、b和c獨(dú)立地為整數(shù)0、1、2、3、4、5或6；
其中a、b和c獨(dú)立地為整數(shù)0、1、2、3、4、5或6；
其中a、b和c獨(dú)立地為整數(shù)0、1、2、3、4、5或6；而d、e和f獨(dú)立地為整數(shù)1、2、3、4、5或6。
可以使用未經(jīng)過(guò)進(jìn)一步改性(即，與賴(lài)氨酸或賴(lài)氨酸類(lèi)似物發(fā)生反應(yīng))的四氨基化合物，或者可以使該四氨基化合物與賴(lài)氨酸或賴(lài)氨酸類(lèi)似物發(fā)生反應(yīng)來(lái)形成五氨基核心。四氨基化合物的實(shí)例包括
其中a、b、c和d獨(dú)立地為整數(shù)0、1、2、3、4、5或6。

其中a、b、c和d獨(dú)立地為整數(shù)1、2、3、4、5或6。

其中a、b、c和d獨(dú)立地為整數(shù)0、1、2、3、4、5或6；而e、f、g和h獨(dú)立地為整數(shù)1、2、3、4、5或6。
此外，所述核心的任何亞甲基都可以被亞甲氧基或亞乙氧基替代，前提條件是這種替代不會(huì)導(dǎo)致在所述的核心內(nèi)形成碳酸酯部分或氨基甲酸酯部分。
在某些實(shí)施方案中，所述的核心為得自賴(lài)氨酸或賴(lài)氨酸類(lèi)似物與二氨基化合物反應(yīng)的三氨基化合物，其中所述的二氨基化合物選自
其中a為整數(shù)1、2、3、4或5；
其中a、b和c獨(dú)立地為整數(shù)2或3；而d為1-30的整數(shù)；
其中a和d獨(dú)立地為整數(shù)1或2，而b和c獨(dú)立地為整數(shù)0、1或2。
在具體的實(shí)施例中，所述的核心由二氨基化合物(例如化合物11，其中a、b、c和d均為1(NEOEOEN))和賴(lài)氨酸或賴(lài)氨酸類(lèi)似物(例如類(lèi)似物5，其中a、b、和c均為2(Su(NPN)2))構(gòu)成。
在其他實(shí)施方案中，所述的核心為選自以下的三氨基或四氨基化合物，其單獨(dú)或者作為與賴(lài)氨酸或賴(lài)氨酸類(lèi)似物的反應(yīng)產(chǎn)物
其中a、b和c可以相同或不同，并且為1-2的整數(shù)；
其中a、b和c獨(dú)立地為整數(shù)0、1或2；而d、e和f獨(dú)立地為整數(shù)1或2。
或者四氨基化合物
其中a、b、c和d獨(dú)立地為整數(shù)0或1；
其中a、b、c和d獨(dú)立地為整數(shù)1或2；
其中a、b、c和d獨(dú)立地為0、1或2；而e、f、g和h獨(dú)立地為整數(shù)1或2。
賴(lài)氨酸和賴(lài)氨酸類(lèi)似物樹(shù)狀聚體聚合物的制備是公知的，并且在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,289,872和4,410,688的實(shí)施例中有所描述。
通常，所述的樹(shù)狀聚體具有保留了單一一個(gè)反應(yīng)性位點(diǎn)(該位點(diǎn)被保護(hù)(通過(guò)合適的保護(hù)基團(tuán)))的核心，而所述核心的其余氨基位點(diǎn)用于構(gòu)造單元定加入。所述核心的被保護(hù)的反應(yīng)性位點(diǎn)最終用于將單一的實(shí)體(第一功能部分)與大分子的核心連接。
在構(gòu)建所述的樹(shù)狀聚體的過(guò)程中，可以利用胺保護(hù)基團(tuán)，通過(guò)例如使構(gòu)造單元上的兩個(gè)可利用氨基中的僅僅一個(gè)氨基、或構(gòu)造單元上的三個(gè)可利用氨基中的僅僅一個(gè)或兩個(gè)氨基發(fā)生反應(yīng)，或者備選地，使僅在一部分表面構(gòu)造(例如每個(gè)第二或第三構(gòu)造單元、或者三分之二的構(gòu)造單元)單元上的所有氨基發(fā)生反應(yīng)，從而僅使一層或一代中構(gòu)造單元的一部分表面上的胺基進(jìn)一步發(fā)生反應(yīng)。然而，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，在特定層或代中的構(gòu)造單元的每一個(gè)氨基都會(huì)進(jìn)一步與賴(lài)氨酸或賴(lài)氨酸類(lèi)似物構(gòu)造單元發(fā)生反應(yīng)，直到所需數(shù)量的層或代被構(gòu)建完成為止。在這種方式中，例如，當(dāng)使用具有兩個(gè)氨基的構(gòu)造單元時(shí)，層中構(gòu)造單元的數(shù)量為緊鄰下層中構(gòu)造單元的數(shù)量的二倍，而當(dāng)使用具有三個(gè)氨基的構(gòu)造單元時(shí)，層中構(gòu)造單元的數(shù)量為緊鄰下層中構(gòu)造單元的數(shù)量的三倍。
所述功能部分包括藥學(xué)活性試劑、藥代動(dòng)力學(xué)改性劑或相互作用試劑(諸如靶向試劑或捕獲試劑)的殘基。第一和第二功能部分可以是相同或不同的，且任選地，樹(shù)狀聚體的表面還可以攜帶一種或多種不同的其它功能部分，例如，第三、第四或第五功能部分。功能部分可以是單一類(lèi)型試劑(例如，藥物活性試劑)的殘基，或可以包括作為單一實(shí)體的兩種試劑，例如，連接或相連在一起的兩個(gè)藥學(xué)活性試劑，或者與藥代動(dòng)力學(xué)改性劑連接或相連在一起的藥學(xué)活性試劑，或者與靶向試劑連接或相連在一起的藥學(xué)活性試劑。功能部分，例如當(dāng)指第二功能部分時(shí)，認(rèn)為指單一類(lèi)型的功能部分，例如，多個(gè)第二功能部分的每一個(gè)是相同的。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，單一類(lèi)型、或兩種、三種或四種類(lèi)型的功能部分與所有的表面氨基連接。在其它實(shí)施方案中，只有一部分表面氨基，例如，改變結(jié)構(gòu)單元的那些或每個(gè)結(jié)構(gòu)單元的兩個(gè)表面基團(tuán)的一個(gè)或每個(gè)結(jié)構(gòu)單元的三個(gè)表面基團(tuán)的一個(gè)或兩個(gè)具有連接的功能部分。
如本文所使用的，藥學(xué)活性試劑包括任何分子或其前體，或其殘基，其能在給受試者單獨(dú)施用或與另一個(gè)藥學(xué)活性試劑聯(lián)合施用后賦予生理效應(yīng)或反應(yīng)。所述術(shù)語(yǔ)還包括這樣的試劑或其殘基，其自身不賦予生理效應(yīng)或其所需的水平，但與一種或多種其他藥學(xué)試劑聯(lián)合時(shí)，或當(dāng)與樹(shù)狀聚體連接時(shí)提供所需的生理活性。本文包括的藥學(xué)活性試劑可以是天然的，包括天然分子的修飾物和衍生物，或可以是合成的，本文包括的實(shí)例包括小分子、聚合物、(非-樹(shù)枝狀和樹(shù)枝狀的，其中對(duì)于大分子，所述樹(shù)枝狀部分可以具有相同數(shù)目的代或不同數(shù)目的代)、糖、寡糖、多糖、氨基酸、肽、寡肽、多肽、蛋白、糖蛋白、核酸和核苷酸。所包括的具體藥學(xué)活性試劑打算用于治療性或預(yù)防性應(yīng)用。藥學(xué)活性試劑賦予的生理效應(yīng)或反應(yīng)性的實(shí)例包括抑制或刺激生物反應(yīng)，例如通過(guò)與底物結(jié)合，物質(zhì)的置換或加成，有害物質(zhì)的去除和細(xì)胞死亡。
已經(jīng)研發(fā)了基于蛋白的藥物，其為患者提供了顯著的臨床益處，但在許多情況下，這些藥物需要頻繁給藥和大的給藥劑量。這是因?yàn)榈鞍姿幬锏睦砘再|(zhì)導(dǎo)致其快速的腎排泄或代謝清除。有利地是，當(dāng)與本文所述的樹(shù)狀聚體相連時(shí)，可以有利地改變蛋白的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。
因此，在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，大分子的藥學(xué)活性試劑可以是基于氨基酸的，諸如蛋白、糖肽、肽、寡肽、多肽、酶或其衍生物。
所述酶可以選自糖類(lèi)特異性酶、蛋白水解酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶和連接酶。酶的實(shí)例包括天冬酰氨酶、精氨酸酶、精氨酸脫氨基酶、腺苷脫氨基酶、超氧化物歧化酶、內(nèi)毒素酶(endotoxinase)、過(guò)氧化氫酶、胰凝乳蛋白酶、脂肪酶、尿酸酶、腺苷二磷酸酯酶(adenosine diphosphatase)、酪氨酸酶和膽紅素氧化酶。目標(biāo)糖類(lèi)特異性酶包括葡萄糖氧化酶、糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、葡糖醛酸糖苷酶等。
不含多糖部分的肽和蛋白可以使用糖基化轉(zhuǎn)移酶通過(guò)酶催化進(jìn)行糖基化，或例如通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)肽化學(xué)和糖基化氨基酸組分(諸如，N-半乳糖基化天冬酰氨酸)化學(xué)合成。備選地，可以將糖基化位點(diǎn)改造到在體內(nèi)正常以其非糖基化形式產(chǎn)生的蛋白或肽中。
蛋白和肽的實(shí)例包括血紅蛋白，血清蛋白諸如，血液因子包括因子VII、FX、FII、FV，蛋白C，蛋白S，tPA，PAI-1，組織因子FXI、FXII和FXIII，以及其序列FVIII、FIX變體；免疫球蛋白，細(xì)胞因子諸如白細(xì)胞介素、α-、β-、和γ-干擾素、集落刺激因子(包括粒細(xì)胞集落刺激因子)、血小板衍生生長(zhǎng)因子和膦酯酶激活蛋白(phospholipase-activating protein(PUP))。其它蛋白和肽包括胰島素、植物蛋白諸如凝集素和蓖麻毒蛋白，腫瘤壞死因子和相關(guān)等位基因，腫瘤壞死因子的可溶形式、白細(xì)胞介素受體和白細(xì)胞介素受體的可溶形式，生長(zhǎng)因子諸如組織生長(zhǎng)因子，諸如TGFa′s或TGFps和表皮生長(zhǎng)因子、激素、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素、紅細(xì)胞生成素、色素激素(pigmentary hormones)、下丘腦釋放因子、抗利尿激素、催乳素、絨毛膜促性腺激素、促卵泡激素、促甲狀腺激素(thyroid-stimulatinghormone)、組織纖溶酶原激活物等。目的的免疫球蛋白包括IgG、IgE、IgM、IgA、IgD及其片段。
大分子的藥學(xué)活性試劑備選地或另外可以包括水不溶性藥物、水溶性藥物、親脂性藥物或其混合物。
藥學(xué)活性試劑可以列舉為，但不限于選自表1中的一類(lèi)或多類(lèi)。
表1藥學(xué)活性試劑 丙酮血癥制備物合成代謝劑 麻醉劑鎮(zhèn)痛劑 抗酸劑抗關(guān)節(jié)炎劑 抗體 抗驚厥劑 抗真菌劑 抗組胺劑 抗感染劑 抗炎劑 抗代謝劑 抗菌劑 抗有絲分裂劑 殺寄生蟲(chóng)劑 抗原蟲(chóng)劑 抗?jié)儎? 抗病毒藥物行為矯正藥 生物制劑 血液和血液替代品 支氣管擴(kuò)張劑和祛痰劑 癌癥治療和相關(guān)藥物 心血管藥物中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物 利尿劑避孕劑 生長(zhǎng)激素 糖尿病治療 補(bǔ)血藥致育藥物 激素替代治療 生長(zhǎng)促進(jìn)劑 免疫抑制劑止血?jiǎng)? 激素和類(lèi)似物 免疫激活劑 礦物質(zhì)肌肉松弛劑 營(yíng)養(yǎng)食品(Nutraceuticals)和天然產(chǎn)物 營(yíng)養(yǎng)品 眼科劑物 肥胖治療劑 疼痛治療劑骨質(zhì)疏松劑物 蛋白肽和多肽 類(lèi)視黃醇呼吸劑物 止痛劑和鎮(zhèn)定劑 移植產(chǎn)物 尿道酸化劑 類(lèi)固醇 維生素 疫苗和佐劑 本發(fā)明特別適合于這類(lèi)藥物，其甚至在非常小量時(shí)都是非常有活性的，且可實(shí)現(xiàn)其持續(xù)長(zhǎng)期的施用，特別是克服標(biāo)準(zhǔn)劑量的毒性問(wèn)題。非限制性實(shí)例包括紫杉醇和多柔比星。
根據(jù)本發(fā)明的大分子特別可用于促進(jìn)藥物對(duì)炎癥位點(diǎn)的被動(dòng)靶向。由于與炎癥相關(guān)的脈管系統(tǒng)滲透性的增加以及有限的淋巴引流，對(duì)大分子的靶向是可能。因此，在某些實(shí)施方案中，所述藥學(xué)活性試劑是抗炎試劑。
在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的大分子包括作為功能部分的兩種或多種不同的藥學(xué)活性試劑、及其衍生物、其前體或其殘基，以分開(kāi)的部分或一起在單一實(shí)體中。根據(jù)本發(fā)明這一方面的大分子因此可在聯(lián)合療法中有應(yīng)用。
所述的藥學(xué)活性試劑可以是選自下述一種或多種的抗腫瘤試劑利妥昔單抗(rituximab)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、多西他賽(docetaxel)、吉西他濱(gemcitabine)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、伊立替康(irinotecan)、紫杉醇(paclitaxel)、貝伐珠單抗(bevacizumab)、卡鉑、西妥昔單抗(cetuximab)、多柔比星(doxorubicin)、培美曲塞(pemetrexed)、表柔比星(epirubicin)、硼替佐米(bortezomib)、拓?fù)涮婵?topotecan)、阿扎胞苷(azacitidine)、長(zhǎng)春瑞濱(vinorelbine)、米托蒽醌(mitoxantrone)、氟達(dá)拉濱(fludarabine)、多柔比星(doxorubicin)、阿侖珠單抗(alemtuzumab)、卡莫司汀(carmustine)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、伊達(dá)比星(idarubicin)、絲裂霉素(mitomycin)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、順鉑(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、美法侖(melphalan)、砒霜(arsenic)、地尼白介素2(denileukin diftitox)、阿糖胞苷(cytarabine)、左亞葉酸鈣(calcium levofolinate)、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、依托泊苷(etoposide)、西洋檞寄生(viscum album)、美司鈉(mesna)、吉妥珠單抗(gemtuzumab)、奧佐米星(ozogamicin)、白消安(busulfan)、噴司他丁(pentostatin)、克拉屈濱(cladribine)、博萊霉素(bleomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、苯達(dá)莫司汀(bendamustine)、達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)、雷替曲塞(raltitrexed)、長(zhǎng)春新堿(vincristine)、福莫司汀(fotemustine)、磷酸依托泊苷(etoposide phosphate)、卟非姆鈉(porfimer sodium)和長(zhǎng)春花堿(vinblastine)。
所述藥學(xué)活性試劑可以是表1中所列舉類(lèi)別中的任何兩種或多種和/或上面所列的抗腫瘤試劑的組合，作為單一實(shí)體(當(dāng)適當(dāng)時(shí))或作為分開(kāi)的功能部分。
示例性組合包括，但不限于下述組合化療藥物；抗炎藥物和抗關(guān)節(jié)炎藥物；肥胖治療劑和糖尿病治療劑；生長(zhǎng)激素和生長(zhǎng)促進(jìn)劑；肌肉松弛劑和抗炎劑；呼吸藥物和支氣管擴(kuò)張劑或抗菌劑；化療劑和維生素等。
本文包括的另一組藥學(xué)活性試劑是這樣的分子或其殘基，其自身可能不一定提供任何所需的或有意義的生理活性，但當(dāng)與樹(shù)狀聚體的表面或核心連接時(shí)，或當(dāng)與一種或多種其它藥學(xué)活性試劑聯(lián)合(分開(kāi)地、順序地或作為均質(zhì)組合物)施用時(shí)，賦予生理效應(yīng)。
國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朠CT/AU95/00350(WO 95/34595)(其內(nèi)容以引用方式并入本文)描述了一類(lèi)抗病毒化合物，其包括具有多個(gè)表面基團(tuán)的樹(shù)狀聚體聚合物，其中至少一個(gè)表面基團(tuán)具有與其鍵合或相連的含陰離子或陽(yáng)離子的部分(或端基)，特別時(shí)含磺酸的部分、含羧酸的部分或含三甲基銨的部分。國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朠CT/AU97/00447(WO98/03573)(其內(nèi)容以引用方式并入本文)描述了含陰離子或陽(yáng)離子的樹(shù)狀聚體聚合物在預(yù)防性或治療性抑制人或非人動(dòng)物患者中血管生成的用途。與樹(shù)狀聚體聚合物的表面連接或鍵合的含陰離子或陽(yáng)離子的部分(或端基)包括由含磺酸的部分、含羧酸的部分、含磷酸或膦酸的部分、含硼酸的部分、含神經(jīng)氨酸或唾液酸的部分、或含在其4-或其它位置上進(jìn)行修飾的神經(jīng)氨酸或唾液酸的部分。
本文包括所述陰離子或陽(yáng)離子部分(及其藥學(xué)可接受的鹽)為藥學(xué)活性試劑的實(shí)例。所述試劑的兩個(gè)具體實(shí)例包括-CO-3，5，-Ph(SO3Na)2、COCH2O-3，6-Naph(SO3Na)2。
在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述第一功能部分包括藥學(xué)活性試劑。在其他實(shí)施例中，所述第二功能部分包括藥學(xué)活性試劑。在其他實(shí)施例中，所述第一功能部分包括藥學(xué)活性試劑且所述第二功能部分包括不同的藥學(xué)活性試劑。在其他實(shí)施例中，所述第二和第三功能部分包括藥學(xué)活性試劑。
藥代動(dòng)力學(xué)改性劑包括任何這樣的分子或其殘基，其可以修飾或調(diào)節(jié)藥學(xué)活性試劑或攜帶所述藥學(xué)活性試劑的樹(shù)狀聚體的藥代動(dòng)力學(xué)特征，包括吸收、分配、代謝和/或排泄。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，選擇所述藥代動(dòng)力學(xué)改性劑以延長(zhǎng)藥學(xué)活性試劑或大分子的血漿半衰期。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，至少一種功能部分是藥學(xué)活性試劑且另一種功能部分是藥代動(dòng)力學(xué)部分。
所述的藥代動(dòng)力學(xué)改性劑可以包括多氟代烴、脂肪酸、脂質(zhì)、寡糖和多糖、脫氧膽酸(膽汁酸)或聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇，及其烷基加帽形式，或聚乙基噁唑啉(polyethyloxazoline)(例如PEOX)基序。
預(yù)期當(dāng)藥學(xué)活性試劑(諸如多肽或小分子藥物)與至少一種藥代動(dòng)力學(xué)改性劑(諸如，PEG基團(tuán))聯(lián)合呈遞時(shí)，本發(fā)明的大分子將是特別有用的。在一個(gè)實(shí)施方案中，PEG分子可以與核心連接，且第二功能部分是呈遞在大分子剩余表面上的小分子藥物或多肽。任選地，第二功能部分可以是小分子藥物和其他藥代動(dòng)力學(xué)改性劑部分的組合，作為單一功能部分或不連續(xù)的功能部分。
所述PEG基團(tuán)可以包括相對(duì)短的乙二醇鏈，例如包括下述的一種或多種的PEG基團(tuán)
備選地，所述第二功能部分可以包含聚谷氨酸類(lèi)型的結(jié)構(gòu)。聚谷氨酸基團(tuán)是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈兺ǔＴ隗w內(nèi)具有很好的耐受性并且是水溶性的。
可以修飾和定制PEG、聚乙基噁唑啉基團(tuán)或聚谷氨酸基團(tuán)的百分比和/或PEG、聚谷氨酸或聚乙基噁唑啉基團(tuán)的大小以適合不同的藥學(xué)活性試劑。
先前的研究已顯示在靜脈內(nèi)施用后，未加帽的3H標(biāo)記的聚-L-賴(lài)氨酸大分子快速代謝成游離的賴(lài)氨酸。然而，令人吃驚地是，已經(jīng)確定了大分子的PEG化降低蛋白水解酶和血清蛋白對(duì)所述樹(shù)狀聚體的識(shí)別，并抑制吞噬細(xì)胞的清除(phagocytic clearance)，從而延長(zhǎng)血漿循環(huán)時(shí)間。此外，PEG化可以增加大分子的流體力學(xué)體積，從而降低腎清除率。
例如，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)3H標(biāo)記的PEG化的賴(lài)氨酸大分子的血漿半衰期和尿排除程度取決于分子量。與較小的樹(shù)狀聚體(即，＜20kD)相比，較大的PEG化的大分子(即，＞30kD)相對(duì)慢地從血漿向尿中清除。盡管這一事實(shí)，即較小的大分子復(fù)合物顯示與血漿成分相互作用的跡象，導(dǎo)致較大分子量種類(lèi)的產(chǎn)生。這些復(fù)合物的去除是快速的，且在尿中只有完整的大分子被回收。因此，顯而易見(jiàn)的是，通過(guò)任何方式增加大小并不一定導(dǎo)致大分子的血漿周期的延長(zhǎng)。發(fā)現(xiàn)較大的大分子在肝和脾中累積。然而，這在長(zhǎng)的時(shí)間周期內(nèi)發(fā)生且累積的量低于劑量的10％。
在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，其中第一功能部分與大分子相連，作為第二功能部分的PEG或PEOX相對(duì)于第一功能部分可以構(gòu)成不同的量。優(yōu)選地，PEG或PEOX部分與其它功能部分的比例在128∶1至2∶1，諸如64∶1至4∶1，且特別是32∶1至8∶1的范圍內(nèi)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，其中PEG或PEOX功能部分在所選的連接點(diǎn)處連接，PEG或PEOX部分與其它功能部分的比例優(yōu)選在1∶2至1∶128，更優(yōu)選為1∶4至1∶64，和最優(yōu)選為1∶8至1∶32的范圍內(nèi)。
可以降低單個(gè)PEG或PEOX基團(tuán)的相對(duì)大小以降低或消除對(duì)藥學(xué)活性試劑的干擾。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，PEG基團(tuán)是相對(duì)單分散性的，且選自200和10,000道爾頓之間的分子量，更優(yōu)選PEG基團(tuán)選自在300和5000道爾頓之間的分子量，且最優(yōu)選地在500和3500道爾頓之間的分子量。
PEG化還可以提高化合物的溶解度，并由此可以有助于連接在大分子表面上的其它不溶藥物的溶解度。
此外，可以將藥代動(dòng)力學(xué)改性部分整合到大分子中以降低非特異性結(jié)合。這可以通過(guò)增加候選物與所述部分結(jié)合的特異性的相互作用部分，或通過(guò)通常稱(chēng)為具有“防污(anti-fouling)”性質(zhì)(因?yàn)槠涫共幌胍蚍翘禺愋越Y(jié)合最小化)的部分。如本文所述的，PEG是這樣一種部分，其例如能降低非特異性血清蛋白對(duì)大分子的識(shí)別。
由此本發(fā)明提供這樣的方式，通過(guò)其能改造具有高毒性、或差的溶解度或兩者的藥物以提供一種媒介物，所述媒介物將提供藥物的可控釋放以維持在治療性但不是毒性血漿水平上的長(zhǎng)期藥物濃度。
根據(jù)本發(fā)明的大分子可有利地包含一種或多種功能部分，其能選擇性地與其它分子相互作用，諸如通過(guò)結(jié)合或其它連接(“相互作用”)。所述功能部分的存在由此可以允許大分子被靶向或濃縮至體內(nèi)或體外的具體細(xì)胞類(lèi)型或組織類(lèi)型，或蛋白(例如，受體或酶)，多糖或DNA或RNA靶，或被另一分子捕獲以促進(jìn)所述大分子與表面的連接。具體實(shí)例包括血凝素和細(xì)胞表面受體的抗體和其他配體(包括小分子)。相互作用可以通過(guò)任何類(lèi)型的鍵合或連接(包括共價(jià)鍵、離子鍵和氫鍵、范德華力)發(fā)生。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述相互作用試劑是肽或多肽抗體。有利地是，通過(guò)所述抗體與其底物的選擇性結(jié)合，所述抗體通過(guò)與所述靶結(jié)合優(yōu)先將大分子定向或濃縮至適當(dāng)?shù)捏w內(nèi)或體外靶(諸如細(xì)胞表面受體或多糖)。這種小分子在本文中還被稱(chēng)為“靶向試劑”。
在另一實(shí)施方案中，所述相互作用功能部分是非肽小分子。有利地是，所述小分子通過(guò)與所述靶相互作用優(yōu)先將大分子定向或濃縮至適當(dāng)?shù)捏w內(nèi)或體外靶(諸如受體或其它小分子)。這種小分子在本文中被進(jìn)一步稱(chēng)為“捕獲試劑”。
本發(fā)明特別適合于藥學(xué)活性試劑的靶向，其中藥學(xué)活性試劑是小的藥物分子。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，相互作用部分可以通過(guò)第一氨基氮原子與核心相連，且第二功能部分是在大分子表面上的小分子藥物。任選地，第二功能部分可以是小分子藥物和部分的組合，所述部分修飾所述小分子藥物和/和大分子的藥代動(dòng)力學(xué)，諸如PEG、PEOX或聚谷氨酸，作為不連續(xù)的功能部分或作為聯(lián)合單一類(lèi)型的功能部分。
一些不同的細(xì)胞表面受體用作用于結(jié)合的靶，并優(yōu)選地，提高對(duì)大分子的攝取。特別的是，用于本發(fā)明的受體及其相關(guān)配體包括，但不限于葉酸受體、腎上腺素能受體、生長(zhǎng)激素受體、促黃體激素受體、雌激素受體、表皮生長(zhǎng)因子受體、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(例如，F(xiàn)GFR2)、IL-2受體、CFTR和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)受體。
葉酸是一種維生素，其是核苷酸堿基生物合成的關(guān)鍵，因此在增殖細(xì)胞中需要大量葉酸。在癌細(xì)胞中，這種對(duì)葉酸增加的需要經(jīng)常反映在葉酸受體的過(guò)表達(dá)中，所述葉酸受體負(fù)責(zé)運(yùn)輸葉酸穿過(guò)細(xì)胞膜。相反，減少的葉酸載體(而不是葉酸受體)促進(jìn)正常細(xì)胞中葉酸的攝取。葉酸受體在許多人癌癥中被上調(diào)，包括惡性的卵巢癌、腦癌、腎癌、乳腺癌、骨髓細(xì)胞癌和肺癌，且細(xì)胞表面上葉酸受體的密度似乎隨著癌癥的發(fā)展而增加。
葉酸受體對(duì)腫瘤細(xì)胞的相對(duì)特異性，且特別是對(duì)晚期腫瘤細(xì)胞的相對(duì)特異性，表示葉酸受體的配體(葉酸)可以成為將化療劑靶向腫瘤的有用的候選物。葉酸受體與葉酸受體配體-化療藥物綴合物相互作用的特異性通過(guò)某些未轉(zhuǎn)化的上皮細(xì)胞和惡性轉(zhuǎn)化的上皮細(xì)胞之間的葉酸受體的細(xì)胞表面表達(dá)模式的差異，進(jìn)一步得到增強(qiáng)。在未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中，所述葉酸受體優(yōu)先在細(xì)胞的頂膜表面上表達(dá)，其面向體腔且不能接近血液中存在的試劑。然而，經(jīng)轉(zhuǎn)化后，細(xì)胞喪失極性且受體能接近循環(huán)系統(tǒng)中靶向葉酸受體的藥物。因此，葉酸或葉酸衍生物可能是本發(fā)明大分子的一種有用的結(jié)合(捕獲)部分。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，相互作用部分是抗體(靶向試劑)形式的肽或多肽，且可以被合成為在N或C端上具有多個(gè)鄰接的組氨酸殘基(聚組氨酸基序)、半胱氨酸標(biāo)簽、或其組合，以促進(jìn)與去保護(hù)樹(shù)狀聚體的反應(yīng)。
可以表達(dá)與N或C端，優(yōu)選N端的聚組氨酸基序融合的靶向肽和抗體?？梢岳盟龅哪┒司劢M氨酸基序，通過(guò)鎳復(fù)合物使靶向肽與本發(fā)明造影劑的樹(shù)狀聚體進(jìn)行綴合，其中所述鎳離子作為樹(shù)狀聚體上或在延伸自樹(shù)狀聚體的連接體端上的表面基團(tuán)存在，其與氨三乙酸部分絡(luò)合。備選地，聚組氨酸基序可用于使用鎳親和樹(shù)脂的一步純化，且任選地通過(guò)包含腸激酶或內(nèi)肽酶切割識(shí)別位點(diǎn)而從純化分子中除去。所述純化方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是熟知的。
更優(yōu)選地，可以表達(dá)與N或C端，優(yōu)選N端的半胱氨酸尾部融合的靶向肽或抗體。半胱氨酸含有高度親核的硫醇基團(tuán)，可在硫醇特異性反應(yīng)基團(tuán)(諸如氯代、溴代或碘代乙酰氨基團(tuán)或馬來(lái)酰亞胺部分)存在下利用所述硫醇基團(tuán)以形成硫醚鍵；或在二硫化物交換反應(yīng)中與反應(yīng)性二硫化物部分(諸如2-吡啶基二硫代部分)形成二硫鍵；在任一種情況下，導(dǎo)致靶向多肽或抗體與樹(shù)狀聚體連接。這些硫醇反應(yīng)性基團(tuán)將在樹(shù)狀聚體材料中提供，通過(guò)適當(dāng)?shù)难苌噭?諸如，活化的鹵代乙酸或者甘氨酸或3-氨基丙酸的馬來(lái)酰亞胺衍生物，或者活化的3-(2-吡啶基二硫代)丙酸)與大分子的一種或多種選擇性去保護(hù)的表面胺反應(yīng)。
還可以表達(dá)具有半胱氨酸和組胺酸尾部組合的靶向肽或抗體。所述半胱氨酸和組胺酸尾部可以在彼此相對(duì)的端分別表達(dá)(例如，N端半胱氨酸尾部和C端組氨酸尾部)，或兩者都在N或C端表達(dá)。
大分子可以進(jìn)一步在各種應(yīng)用中利用以修飾設(shè)備的表面，其中經(jīng)修飾的設(shè)備捕獲或結(jié)合具體分子、細(xì)胞或組織類(lèi)型，或者蛋白、DNA或RNA靶的能力，或者修飾其非特異性生物相互作用的能力是有利的。在使用時(shí)，合適相互作用試劑的存在可以提供更有效和可重復(fù)的將大分子與診斷或醫(yī)學(xué)設(shè)備組件的表面相連的方法。反之，由于大分子經(jīng)限定和控制的性質(zhì)，所述設(shè)備的組件將具有更好的可重復(fù)性。
所述相互作用試劑可以是下述之一反應(yīng)性的化學(xué)部分、過(guò)渡金屬的螯合試劑或高親合性的的配體-受體對(duì)的配體配偶體，例如生物素-鏈霉親和素或地高辛-“抗-地高辛抗體”(Mudgett-Hunter M，Margolies M N，Ju A，Haber E.J Immunol.1982；1291165-1172)。
本發(fā)明所包括的示例性大分子可以根據(jù)下式方便地示出 [第一功能部分]核心[構(gòu)造單元]m[第二功能部分]p[第三功能部分]q 其中 所述的核心、構(gòu)造單元和功能部分如本文所述； m表示構(gòu)造單元(包括表面和表面以下的層)或大分子的總數(shù)。例如，在每層都包含具有2個(gè)氨基的構(gòu)造單元的情況下，m為2-32的整數(shù)，例如2、4、8、16或32； p表示第二功能部分的數(shù)量，其中所述的第二功能部分與構(gòu)造單元表面(最外)層上的氨基氮原子連接。例如，在每層都包含具有2個(gè)氨基的構(gòu)造單元的情況下，p為1-64的整數(shù)，例如2、4、8、16、32或64；和 q表示第三功能部分的數(shù)量，其中所述的第三功能部分與構(gòu)造單元表面(最外)層上的氨基氮原子連接。例如，在每層都包含具有2個(gè)氨基的構(gòu)造單元的情況下，q為0-63的整數(shù)，例如pa dn q不大于64。
本發(fā)明包括的功能部分的具體組合在下表中表示。
第一功能部分第二功能部分第三功能部分 相互作用試劑藥學(xué)活性試劑- 相互作用試劑藥代動(dòng)力學(xué)改性劑- 相互作用試劑藥代動(dòng)力學(xué)改性劑藥學(xué)活性試劑 藥學(xué)活性試劑(例如，蛋白)藥學(xué)活性試劑(例如，藥物)- 藥學(xué)活性試劑藥代動(dòng)力學(xué)改性劑- 藥學(xué)活性試劑(例如，蛋白)藥代動(dòng)力學(xué)改性劑藥學(xué)活性試劑(例如，藥物) 藥代動(dòng)力學(xué)改性劑藥學(xué)活性試劑- 藥代動(dòng)力學(xué)改性劑相互作用試劑- 藥代動(dòng)力學(xué)改性劑相互作用試劑藥學(xué)活性試劑 術(shù)語(yǔ)“連接體”在本文中是指起到將功能部分與表面上的氨基原子或核心氨基原子相連的作用的任何化學(xué)實(shí)體。本發(fā)明所包括的示例性的連接體包括諸如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚芳基(polyaryl)、肽、烷基和烯基鏈、以及糖類(lèi)(單糖、寡糖和多糖)之類(lèi)的聚合物。
在具體的實(shí)施方案中，所述的連接體包含PEG鏈，例如1-100亞乙氧基重復(fù)單元，例如2-20或20-40的重復(fù)單元。
可以使用基于PEG的長(zhǎng)鏈基團(tuán)作為連接體部分。例如，可以按照與普通肽相似的方法來(lái)使用PEG肽，不同之處在于PEG部分提供了額外的體內(nèi)穩(wěn)定性以及用于載體的物質(zhì)。通常，PEG肽用于將藥物與抗體載體綴合，并且具有以下優(yōu)點(diǎn)在暴露酶切除位點(diǎn)的同時(shí)增大抗體與藥物之間的距離；降低綴合體的免疫原性；增加血液循環(huán)的時(shí)間以及增大所述復(fù)合體的溶解性。在綴合體內(nèi)化并且活性藥物在經(jīng)過(guò)酶的作用而釋放(其不必以游離藥物的形式釋放)以后，觀察到阿霉素與多卡米星(Duocarmycin)衍生物的抗增殖作用。
在將連接體部分用于將功能部分與所述大分子的核心或表面上的胺相連的情況下，可以在連接體部分與樹(shù)狀聚體的合適的胺發(fā)生反應(yīng)之前或者之后來(lái)進(jìn)行連接體與功能部分之間的反應(yīng)。
因此，可以采用多種方法來(lái)使用連接體，從而將第一功能部分與所述的核心相連。在第一種方法中，可以將連接體與所述的核心相連，而將第一功能部分與連接體相連。備選地，可以首先將連接體與功能部分相連，然后與所述的核心相連。在第三種方法中，所述的核心和功能部分這二者都可以與連接體或連接體成分相連，隨后使兩個(gè)連接體一起反應(yīng)，從而在所述的核心和第一功能部分之間形成連接體部分。
類(lèi)似地，可以采用多種方法來(lái)使用連接體，從而將第二(或者第三或第四)功能部分與所述樹(shù)狀聚體的表面相連。可以使連接體與所述樹(shù)狀聚體的表面上的氨基氮原子相連，然后將第二(或者第三或第四)功能部分與連接體相連。備選地，可以首先將連接體與功能部分相連，然后與表面上的氨基氮原子相連。如上文所述，可以將連接體部分或其成分與表面上的氨基氮原子以及第二(或者第三或第四)功能部分這二者相連，隨后使兩個(gè)連接體或成分發(fā)生反應(yīng)，從而在所述的表面與功能部分之間形成連接體部分。
此外，可以將連接體部分引入到根據(jù)本發(fā)明的大分子的合成中，例如在構(gòu)造單元之間。如上文所述，可以將連接體與表面上的氨基氮原子或形成下一層的構(gòu)造單元相連，或者與這二者均相連，從而最終在構(gòu)造單元之間形成連接體。
實(shí)施用于將一個(gè)或多個(gè)連接體部分引入到樹(shù)狀聚體或樹(shù)狀聚體基序上(在所述的表面上或者在核心中)的反應(yīng)，從而確保在具有連接體部分的大分子的所有脫保護(hù)表面上的胺能夠完全反應(yīng)。通常，上述過(guò)程通過(guò)使用過(guò)量的所選連接體部分來(lái)完成。
可以在連接體與功能部分發(fā)生反應(yīng)之前，使連接體與脫保護(hù)樹(shù)狀聚體基序或大分子發(fā)生。在其他實(shí)施方案中，與大分子相連的連接體可以反之帶有保護(hù)基團(tuán)，而該保護(hù)基團(tuán)需要脫保護(hù)從而能夠與功能分子發(fā)生反應(yīng)。
優(yōu)選的是，胺保護(hù)基團(tuán)選自Boc，CBz，4-硝基芐氧基氨基甲酸酯(4-NO2-CBz)Fmoc，Dde，CF3CO2，2-鹵代-CBz，Alloc，Me3SiEtSO2，Troc，o-NO-2PhSO2以及2，4-二硝基苯-磺?；?，并且優(yōu)選的是選自Boc，CBz，4-硝基芐氧基氨基甲酸(4-NO2-CBz)，F(xiàn)moc 2-鹵代-CBz，Aloc以及Me3SiEtSO2。
根據(jù)所連接的功能部分的需要，連接體可以為可切除的或者為不可切除的?？梢詫?duì)可切除的連接體加以設(shè)計(jì)，使得其可以被酶促切除，并且例如可用于靶向表達(dá)所述酶的組織的大分子中。備選地，酸性不穩(wěn)定的連接體可以為優(yōu)選的，使得與其相連的化合物可以在酸性條件(例如在缺氧組織中)下被釋放。
連接體部分可以包括經(jīng)選擇使其主鏈變硬化(stiffen)的重復(fù)單元，或者可以為部分交聯(lián)的，從而使主鏈變硬化。
連接體可以通過(guò)使該連接體中具有合適的穩(wěn)定或不穩(wěn)定的基團(tuán)而制成可切除的或不可切除的。連接體中合適的可切除的和不可切除的基團(tuán)的實(shí)例包括 i)氨基化合物連接體 酰胺鍵的性質(zhì)在確定游離藥物是否由綴合體中釋放出來(lái)中是重要的。例如，藥物(例如多柔比星)與載體通過(guò)酰胺鍵綴合形成了綴合體，該綴合體是水解穩(wěn)定的，并且在體外不能發(fā)揮任何抗癌作用。通過(guò)酰胺鍵而直接與載體鍵合的藥物還不容易被切除形成游離藥物，但是如果載體本身是可降解的，則所述的藥物可以被切除形成藥物-氨基酸。由載體(通過(guò)直接的氨基化合物連接體鍵合)中釋放出游離藥物僅能夠在稀少的環(huán)境中取得，其中在所述的環(huán)境下，所述的藥物本身是類(lèi)肽分子，并且藥物與載體之間的鍵為可酶切的。
ii)腙、肟和亞胺連接體 對(duì)于將藥物從載體上切除而言，腙、肟和亞胺鍵不需要酶的存在。在低pH(例如在腫瘤血管外的空間中或者在溶酶體內(nèi))環(huán)境下，所述的連接體能夠在C＝N鍵處被水解切除。通常使用的腙、肟和亞胺連接體得自連接體的腙、肟和胺部分分別與藥物活性部分的羰基(酮或醛)所進(jìn)行的反應(yīng)。所述的連接體還可以通過(guò)改變?cè)贑＝N鍵部分周?chē)耐榛臄?shù)量，或者通過(guò)使用吸電子的部分(增大酸性不穩(wěn)定性)或者供電子(降低酸性不穩(wěn)定性)部分進(jìn)行取代，從而減慢水解的速率。
iii)酯連接體 可以制備酸不穩(wěn)定且可代謝的酯連接體。已經(jīng)使用原酸酯來(lái)使PEG與結(jié)合陰離子膜載體的脂質(zhì)綴合。所述的綴合體在酸性條件(pH4-6)下的穩(wěn)定性取決于酯或原酸酯連接體的結(jié)構(gòu)。通常，α-甲氧基-ω-{N-(2-十八烷氧基-[1，3]二氧戊環(huán)-4-基)甲基氨基}-聚乙二醇110在pH4和5下均顯示出良好的穩(wěn)定性，α-甲氧基-ω-{N-(2-膽甾醇氧基-[1，3]二氧戊環(huán)-4-基)甲基氨基}-聚乙二醇110在pH5下是非常穩(wěn)定的，但是在pH4下會(huì)適度的不穩(wěn)定，α-甲氧基-ω-{N-(2-甲基-s-十八烷氧基-[1，3]二氧戊環(huán)-5-基)-氨基}-聚乙二醇110以及α-甲氧基-ω-{N-2-(3-羥丙基-膽甾醇基氨基甲酸酯)-2-甲基-[1，3]二氧戊環(huán)-5-基-氨基}-聚乙二醇110是不穩(wěn)定的。就與小分子綴合的簡(jiǎn)單酯而言，與單酯(其比二硫化物更穩(wěn)定，但是比酰胺鍵不穩(wěn)定)相比，二酯的功能性提供了更多的代謝切除位點(diǎn)。
iv)肽連接體 到目前為止，肽連接體是所有可切除的連接體中最通用的，這是因?yàn)榭梢允褂冒被岬脑S多不同組合來(lái)控制切除的速率和切除的酶類(lèi)。但是，這些連接體具有與其作為藥物和載體的綴合體用途有關(guān)的兩個(gè)問(wèn)題1)它們通?？梢员槐椴既淼姆翘禺愋噪拿盖谐?，并由此可以在非腫瘤分布位點(diǎn)處形成非特異性的藥物毒性；以及2)切除可以在所述的連接體位點(diǎn)處進(jìn)行，這會(huì)形成仍保持與藥物分子鍵合的氨基酸。這種情況可能會(huì)妨礙藥物分子的化療效果。備選地，所結(jié)合的氨基酸不會(huì)改變藥物的藥理學(xué)作用，但會(huì)影響其藥物動(dòng)力學(xué)。然而，這些切除作用可以通過(guò)在肽連接體(其與藥物分子直接結(jié)合)中選擇合適的氨基酸(例如脯氨酸)來(lái)控制。
通常，將組織蛋白酶B可切除的連接體設(shè)計(jì)成在藥物綴合體經(jīng)過(guò)溶酶體系統(tǒng)的內(nèi)吞作用之后切除，這是因?yàn)榻M織蛋白酶位于溶酶體中，而在細(xì)胞質(zhì)中不存在。內(nèi)吞作用通常在載體(其通常為直接針對(duì)癌特異性細(xì)胞表面受體的抗體或者癌特異性細(xì)胞表面受體的配體的抗體)與細(xì)胞膜結(jié)合后被引發(fā)。
非特異性蛋白酶(即，對(duì)具體的肽序列為非特異性的蛋白酶)可以在PEG化的大分子發(fā)生充分的外滲并在腫瘤組織中累積之后由該P(yáng)EG化的大分子上切除藥物。
關(guān)于肽切除的速率的以下指導(dǎo)指出，a＞b的情況表明a的切除速率大于b的切除速率。對(duì)于用作活性藥物與樹(shù)狀聚體末端氮之間的連接體的肽序列而言末端Cys＞非末端CysGly＞末端Gly＝末端，GlyPheGly＞末端GlyGlyGly和末端GlyGlyGlyPhe＝末端GlyProGly。
注意CysGly鍵由GSH還原。相對(duì)于其他肽鍵而言，GlyGlyGly鍵通常非常穩(wěn)定。二肽的切割通常對(duì)具體蛋白酶是特異性的，并且可以根據(jù)腫瘤細(xì)胞內(nèi)所包含的多種蛋白酶的表達(dá)來(lái)控制。
v)二硫化物連接體 二硫化物連接體是如今使用的最不穩(wěn)定的連接體，并且在體外發(fā)生快速還原性切除。然而，它們的體內(nèi)穩(wěn)定性通常高于它們的體外穩(wěn)定性。它們可以在含硫氨基酸之間通過(guò)二硫化物鍵或者在非肽類(lèi)二硫化物鍵之間形成。它們還對(duì)機(jī)體內(nèi)的其他親核硫醇顯示出較高的反應(yīng)性，因此顯示出快速的血漿清除作用。
連接體切除性的一般概述 在循環(huán)中，連接體切除性的順序如下 二硫化物＞長(zhǎng)鏈肽≥酯＞腙≥四肽(GlyGlyGlyPhe)＝三肽(GlyPheGly＞GlyGlyGly＝GlyProGly)≈或＞二肽(AlaVal、AlaPro、GlyPro、PheLeu、Val-Cys)＞戊二醛＝氨基化合物。
多種連接體的穩(wěn)定性是基于它們所綴合(即，酶與連接體的易接近性)的基團(tuán)、綴合體在所需活性的位點(diǎn)處的表現(xiàn)(即，細(xì)胞吸收或細(xì)胞外累積)以及綴合體的性質(zhì)(即，酯對(duì)比氨基化合物)的。二硫化物綴合體與所述的當(dāng)前系統(tǒng)的體內(nèi)表現(xiàn)被認(rèn)為是相對(duì)不可預(yù)測(cè)的。雖然長(zhǎng)鏈肽更容易被蛋白酶所接近，從而被快速切除，但是它們?cè)诜翘禺愋晕稽c(diǎn)處被切除的太快，從而導(dǎo)致釋放出不具有生物學(xué)活性的藥物活性肽/氨基酸種類(lèi)。
基于C＝N的連接體(腙、肟和亞胺)、酯或肽綴合體的切除至少要在多天內(nèi)發(fā)生，這允許綴合體在腫瘤組織中累積。每種連接體都具有它的優(yōu)點(diǎn)，但是酯或腙連接體是優(yōu)選的。將藥物活性物質(zhì)與大分子相連的酯鍵提供了可快速切除的鍵，雖然這種切除并非是靶位點(diǎn)特異性的，但是這種切除會(huì)釋放出游離的藥物活性物質(zhì)。與酯相比，形成腙鍵的綴合體在普通的循環(huán)中是更穩(wěn)定的，并且在腫瘤位點(diǎn)處通過(guò)水解C＝N鍵而以更高的特異性進(jìn)行切割。但是，所述的藥物活性分子需要通過(guò)引入羰基部分或肼部分來(lái)進(jìn)行改性，從而形成腙。
在一些實(shí)施方案中，所述的連接體部分可以包含兩個(gè)反應(yīng)性基團(tuán)，F(xiàn)′和Y′，它們通過(guò)一個(gè)或多個(gè)碳或雜原子(優(yōu)選的是通過(guò)烴主鏈)相連。所述的反應(yīng)性基團(tuán)F′可以是活化的，從而與反應(yīng)性胺部分(例如核心上或者樹(shù)狀聚體基序表面層或表面以下的層上的那些)發(fā)生反應(yīng)。通常，所述的反應(yīng)性基團(tuán)F′為羧基或其殘基。其他的功能部分Y′為包含保護(hù)基團(tuán)的胺，或者是對(duì)該部分進(jìn)行選擇使得其具有特異的反應(yīng)性，該反應(yīng)性與所需功能部分(其與核心上或者樹(shù)狀聚體基序表面層或表面以下的層連接)的反應(yīng)性基團(tuán)是互補(bǔ)的。Y′的典型實(shí)例包括胺基、羥基、硫醇、烯基或炔基、腈、鹵化物、羧酸酯或疊氮基團(tuán)。
除了上文所述的連接體以外，根據(jù)本發(fā)明可以使用光切除性(photocleabable)連接體。例如，可以使用光切除性異雙功能連接體。光切除性異雙功能連接體可以為溶于水的或者溶于有機(jī)溶劑的。光切除性異雙功能連接體包含可以與胺或醇發(fā)生反應(yīng)的活化的酯、以及可以與硫醇基發(fā)生反應(yīng)的環(huán)氧化物基團(tuán)。在酯與環(huán)氧化物基團(tuán)之間為3，4-二甲氧基-6-硝基苯基光異構(gòu)基團(tuán)(photoisomerisationgroup)，當(dāng)該光異構(gòu)基團(tuán)暴露于近紫外光(365nm)中時(shí)，其釋放出完整形式的胺或醇。因此，當(dāng)使用所述的連接體將藥學(xué)活性成分與大分子相連時(shí)，該藥學(xué)活性成分可以通過(guò)將靶區(qū)域暴露與近紫外光而以生物學(xué)活性或可活化形式釋放。
在其他實(shí)施方案中，大分子的制備可以進(jìn)一步包括對(duì)胺基和/或連接體和/或功能部分進(jìn)行改性的步驟，從而有助于功能部分與胺直接連接，或者通過(guò)可切除或不可切除的連接體連接。
因此，在大分子表面或核心中的胺基可以通過(guò)改性劑基團(tuán)來(lái)進(jìn)行改性，從而有助于與連接體或功能部分的連接。備選地或此外，可以對(duì)連接體進(jìn)行改性，從而有助于與表面或核心中的胺基相連接。
用于與功能部分連接的連接體的末端可以通過(guò)改性劑基團(tuán)來(lái)進(jìn)行改性，從而有助于與功能部分的連接。備選地或此外，功能基團(tuán)可以通過(guò)改性劑基團(tuán)來(lái)進(jìn)行改性，從而有助于與連接體連接，或者直接與表面或核心中的胺基連接。
在具體的實(shí)施方案中，用于與第一功能部分和/或第一功能部分連接的核心上的第一氨基氮原子、和/或第一功能部分被進(jìn)一步修飾，從而有助于第一功能部分與核心的連接。
可以對(duì)氨基(表面上的或核心中的)部分和/或連接體和/或功能部分進(jìn)行改性，從而允許任一功能部分與氨基原子通過(guò)連接體相連，其中所述的功能部分通過(guò)使用能夠?qū)瘜W(xué)部分進(jìn)行誘導(dǎo)的基團(tuán)而衍生得到，其中所述的化學(xué)部分選自鹵代乙酰胺、馬來(lái)酰亞胺或其他硫醇反應(yīng)性部分、反應(yīng)性硫醇或可互換的二硫化物部分、脂肪族或芳香族醛、酮、烷氧基胺、肼、疊氮化物、炔、低聚組氨酸陣列和任何肽陣列、次氮基三乙酸基團(tuán)、任何羧酸酯或其反應(yīng)性殘基(例如活化酯)；能夠與有機(jī)鹵化物發(fā)生反應(yīng)的化學(xué)部分，例如有機(jī)甲錫烷基(organostannyl group)、丙烯酸酯、硼酸(或酯)以及通過(guò)金屬催化的偶聯(lián)反應(yīng)而生成的有機(jī)炔(分別命名為Stille、Heck、Suzuki和Sonogashira)，能夠進(jìn)行酶連接(例如通過(guò)使用谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶)的任何部分，以及天然形成化學(xué)連接的任何部分。用于衍射，從而引入改性劑的方法是本領(lǐng)域已知的。
更優(yōu)選的是，所述的化學(xué)改性劑可以選自以下的物質(zhì) (i)馬來(lái)酰亞胺
(ii)鹵代乙酰胺(X＝Cl、Br和I)
(iii)酰肼
(iv)烷氧基胺
(v)3-(2-吡啶基二硫代硫代)丙酸酯
在某些實(shí)施方案中，可以對(duì)表面上或核心中的胺進(jìn)行改性，從而允許通過(guò)使用包含化學(xué)部分的基團(tuán)衍生的功能部分的連接，其中所述的化學(xué)部分選自鹵代乙酰胺(haloacetamide)、馬來(lái)酰亞胺或其他硫醇反應(yīng)性部分、可反應(yīng)的硫醇或可互換的二硫化物部分、醛、酮、烷氧基胺部分、肼、疊氮化物、炔、低聚組氨酸陣列、次氮基三乙酸基序。
在優(yōu)選的方法中，除去所選的胺(例如核心胺)的保護(hù)基團(tuán)，并使這種胺在可以形成酰胺鍵的條件下與鹵代乙酸衍生物或馬來(lái)酰亞胺衍生物(例如3-馬來(lái)酰亞胺丙酸或4-馬來(lái)酰亞胺丁酸)發(fā)生反應(yīng)。用于將含硫醇的肽和蛋白質(zhì)與所述的硫醇活性基團(tuán)偶聯(lián)的一般方法在Hermanson，G.T.Bioconjugate Techniques(Academic Press 1996)中有所描述，并且該文獻(xiàn)被本文所引用。
用于將大分子與諸如肽和抗體之類(lèi)的分子共價(jià)偶聯(lián)的一般方法在本領(lǐng)域的技術(shù)水平范圍內(nèi)。此類(lèi)方法在Hermanson，G.T，Bioconjugate Techniques(Academic Press 1996)(該文獻(xiàn)被本文所引用)，Blatter et al，Biochem.，24；1517(1985)和Jue et al，Biochem.，175399(1978)中有所描述。用于將包含相鄰組氨酸殘基的肽或蛋白質(zhì)與包含次氮基三乙酸基序的大分子或固體支持物(通過(guò)與鎳絡(luò)合)相連的方法在Hochuli et al J.Chromatogr，1987 411 177，Sigal et al Anal.Chem.1996 68 490和Gershon et al J.Immunol.Meth，1995 183 65中有所描述。上文所引述的文獻(xiàn)均以引用方式全文并入本文。
本發(fā)明的大分子可以通過(guò)分支(devergent)或匯聚(convergent)樹(shù)狀聚體合成來(lái)制備。分支和匯聚的合成是本領(lǐng)域已知的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的大分子通過(guò)分支合成構(gòu)建，其中所加入的構(gòu)造單元的最后一層(表面)可以任選地具有被保護(hù)的氨基，和/或帶有氨基(其具有已經(jīng)連接的功能部分，或者經(jīng)改性劑改性)，和/或帶有連接體部分(其用于隨后連接功能部分)。
備選地，在匯聚合成方法中，包含多于一個(gè)單一構(gòu)造單元的樹(shù)狀聚體基序或楔(wedge)可以與樹(shù)狀聚體的核心或表面上的氨基連接。此外，樹(shù)狀聚體基序的表面上的氨基可以任選地被保護(hù)，和/或可以已經(jīng)具有一個(gè)或多個(gè)連接的功能基團(tuán)，和/或被改性劑改性，和/或帶有用于功能部分的相似部分。
本發(fā)明的另一方面還包括組合物，其包括本文所述的大分子以及其藥學(xué)可接受的賦形劑、載體或佐劑。
本發(fā)明進(jìn)一步提供本文所述的大分子在療法中的用途。
待治療的受試者包括哺乳動(dòng)物受試者人、靈長(zhǎng)類(lèi)、家畜動(dòng)物(包括牛、馬、綿羊、豬和山羊)、寵物(包括狗、貓、兔、豚鼠)、以及捕獲的野生動(dòng)物。此外，還包括了諸如兔、小鼠、大鼠、豚鼠和倉(cāng)鼠之類(lèi)的實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物，這是因?yàn)樗鼈兛梢蕴峁┓奖愕臏y(cè)試系統(tǒng)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，還可以包括諸如鳥(niǎo)、兩棲動(dòng)物和魚(yú)之類(lèi)的非哺乳動(dòng)物種類(lèi)。
在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的大分子，當(dāng)根據(jù)所需給藥方案進(jìn)行施用時(shí)，至少部分達(dá)到所需的治療或預(yù)防效果，包括下述的一種或多種減輕正在治療的具體障礙或病癥的癥狀、預(yù)防或延遲正在治療的具體障礙或病癥的發(fā)作、抑制正在治療的具體障礙或病癥的進(jìn)展、或者停止或完全逆轉(zhuǎn)正在治療的具體障礙或病癥的發(fā)作或進(jìn)展。
活性成分可以以單一劑量或一系列劑量施用。雖然單獨(dú)施用活性成分是可能的，但優(yōu)選將其以組合物(優(yōu)選以藥物組合物)與一種或多種藥學(xué)可接受佐劑一起呈遞。
所述組合物的制劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，例如，參見(jiàn)Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th Edition，MackPublishing，1990。組合物可以包含任何合適的載體、稀釋劑或賦形劑。這些包括所有常規(guī)的溶劑、分散介質(zhì)、填充物、固體載體、包衣、抗真菌和抗細(xì)菌試劑、皮滲透劑、表面活性劑、等滲試劑和吸收劑等。將理解本發(fā)明的組合物還可以包括其他補(bǔ)充的生理學(xué)活性劑。
在與組合物的其他成分相容并對(duì)受試者無(wú)害方面，載體必須是藥學(xué)可接受的。組合物包括適合口服、直腸、鼻內(nèi)、局部(包括皮膚、口腔和舌下)、陰道或腸胃外(包括皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)和皮內(nèi))施用。組合物可以方便地以單一劑量形式，且可以通過(guò)藥學(xué)領(lǐng)域中熟知的任何方法制備。所述方法包括將活性成分與構(gòu)成一種或多種輔助成分的載體相連接的步驟。通常，組合物通過(guò)將活性成分與液體載體或細(xì)分的固體載體或兩者均一和緊密連接而制備，然后形成產(chǎn)品(如果需要的話)。
適合于口服施用的本發(fā)明的組合物可以作為各自含有預(yù)定量活性成分的不連續(xù)單元(諸如膠囊、小袋或片劑)；作為粉末或顆粒；作為在水性或非水性溶液中的溶液或懸浮液；或作為水包油的液體乳液或油包水的液體乳液。
片劑可以通過(guò)任選與一種或多種助劑壓制或模制制備。壓制片劑可以通過(guò)下述方式制備在合適的機(jī)器中壓制自由流動(dòng)(free-flowing)形式的活性成分(諸如，粉末或顆粒)，任選與粘合劑(例如，惰性稀釋劑)、防腐性崩解劑(例如，羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷酮、交聯(lián)的羧甲基纖維素鈉)、表面活性劑或分散劑混合?？梢酝ㄟ^(guò)在合適機(jī)器中對(duì)用惰性液體稀釋劑濕潤(rùn)的粉末化合物的混合物進(jìn)行壓模得到模制片劑。任選地，可以對(duì)所述片劑進(jìn)行包衣或劃痕(scored)，且可以制備所述片劑以提供其中活性成分的慢的或受控的釋放，例如以各種比例使用羥丙基甲基纖維素以提供所需的釋放特征。可以任選提供具有腸衣包衣的片劑從而提供在腸部分而不是胃部分中的釋放。
適合于在口中局部施用的組合物包括在調(diào)味基質(zhì)(通常為蔗糖和阿拉伯樹(shù)膠或黃蓍膠)中包含活性成分的錠劑；在惰性基質(zhì)(諸如，凝膠和甘油，或蔗糖和阿拉伯樹(shù)膠)中包含活性成分的軟錠劑；和在合適的液體載體中包含活性成分的漱口水。
適合給皮膚局部施用的組合物可以包括溶于或懸浮于任何合適載體或基質(zhì)的化合物，且可以為洗液、凝膠、霜?jiǎng)⒑齽?、軟膏等形式。合適的載體包括礦物油、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯、乳化蠟、山梨醇酐單硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蠟、鯨蠟硬脂醇(cetearyl alcohol)、2-辛基十二烷醇、芐醇和水。經(jīng)皮遞送的裝置(諸如，貼劑)也可以用于施用本發(fā)明的化合物。
直腸施用的組合物可以是具有合適的基質(zhì)(例如，可可脂、甘油、凝膠或聚乙二醇)的栓劑。
適合陰道施用的組合物可以是除了活性劑外，還含有在本領(lǐng)域中已知適當(dāng)?shù)妮d體的陰道栓劑、衛(wèi)生棉條、霜?jiǎng)⒛z、糊劑、泡沫或噴霧制劑。
適合腸胃外施用的組合物包括水性和非水性等滲無(wú)菌注射溶液，其可以含有抗氧化劑、緩沖溶液、殺菌劑和溶質(zhì)，使得組合物與目的接受者的血液等滲透壓；以及水性和非水性無(wú)菌懸浮液，其可以包括懸浮劑和增稠劑。組合物可以以單一劑量或多劑量密封容器(例如，安瓿和小瓶)，且可以?xún)?chǔ)存在冷凍干燥(凍干)的條件下，在即刻使用之前只需加入無(wú)菌液體載體，例如，注射用水。臨時(shí)的注射溶液和懸浮液可以由之前提到類(lèi)型的無(wú)菌粉末、顆粒和片劑制備。
優(yōu)選的單位劑量組合物包含如上所述的活性成分的每日劑量或單元，每日次劑量，或其適當(dāng)部分。
應(yīng)該理解，除了上面特別提到的活性成分外，本發(fā)明的組合物可以包含本領(lǐng)域中的其他常規(guī)試劑，考慮到目的組合物的類(lèi)型，例如，適合口服施用的那些可以包括其他試劑，如粘合劑、甜味劑、增稠劑、調(diào)味劑、崩解劑、包衣試劑、防腐劑、潤(rùn)滑劑和/或延時(shí)劑。合適的甜味劑包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿司帕坦或糖精。合適的崩解劑包括玉米淀粉、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、黃原膠、膨潤(rùn)土、褐藻酸或瓊脂。合適的調(diào)味劑包括薄荷油、冬青油、櫻桃調(diào)味劑、桔子調(diào)味劑或樹(shù)莓調(diào)味劑。合適的包衣試劑包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或其酯的聚合物或共聚物、蠟、脂肪醇、玉米醇溶蛋白、蟲(chóng)膠或谷蛋白。合適的防腐劑包括苯甲酸鈉、維生素E、α-生育酚、抗壞血酸、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯或亞硫酸氫鈉。合適的潤(rùn)滑劑包括硬脂酸鎂、硬脂酸、油酸鈉、氯化鈉或滑石。合適的延時(shí)劑包括單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
可以以與其他治療劑類(lèi)似的方式給哺乳動(dòng)物(包括人)施用治療有效量的本發(fā)明的藥物組合物。治療有效量旨在包括當(dāng)根據(jù)所需給藥方案施用時(shí)，至少部分達(dá)到所需的如上治療或預(yù)防效果的量。施用的劑量和施用模式取決于多種因素，包括年齡、體重、性別、患者情況和遺傳因素，并在本文所述的實(shí)驗(yàn)測(cè)定各種劑量再進(jìn)行成像后，最終由醫(yī)務(wù)人員決定。通常，診斷靈敏度或治療功效所需的劑量為約0.001至50,000μg/kg，優(yōu)選在0.01至25.0μg/kg的寄主體重之間。最佳劑量將根據(jù)本文公開(kāi)的內(nèi)容通過(guò)經(jīng)驗(yàn)確定。
將理解功能部分，特別是藥學(xué)活性試劑可以以藥學(xué)可接受的鹽或前藥存在。術(shù)語(yǔ)“前藥”以其最廣泛的含義使用，且包括在體內(nèi)酶促或水解轉(zhuǎn)變?yōu)楸景l(fā)明化合物的那些衍生物。所述衍生物對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是容易發(fā)生的，例如包括，游離的硫醇或羥基被轉(zhuǎn)變成酯的化合物，諸如乙酸酯、或硫酯或其中游離氨基被轉(zhuǎn)變成酰胺。對(duì)本發(fā)明化合物進(jìn)行酰化，例如以制備酯和酰胺前藥的步驟在本領(lǐng)域中是熟知的，且可以包括在合適催化劑或堿的存在下用適當(dāng)?shù)聂人?、酸酐或氯化物處理所述化合物。還包括羧酸(羧基)基團(tuán)的酯。合適的酯為C1-6烷基酯；C1-6烷氧基甲基酯，例如甲氧基甲基或乙氧基甲基；C1-6烷酰氧基甲基酯，例如，新戊酰氧基甲基；酞基酯；C3-8環(huán)烷氧羰基C1-6烷基酯，例如，1-環(huán)己基羰基氧乙基；1，3-二氧雜環(huán)戊烯-2-酮基甲基酯，例如，5-甲基-1，3-二氧雜環(huán)戊烯-2-酮基甲基；和C1-6烷氧羰基氧乙酯，例如，1-甲氧基羰氧乙基。氨基官能團(tuán)的前藥包括氨基化合物(例如，參見(jiàn)Adv.BioSci.，1979，20，369，Kyncl，J.等)，烯胺(例如，參見(jiàn)J.Pharm.Sci.，1971，60，1810，Caldwell，H.等)，席夫堿(例如，參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No 2,923,661 and Antimicrob.Agents Chemother.，1981，19，1004，Smyth，R.等)，噁唑烷(例如，參見(jiàn)J.Pharm.Sci，1983，72，1294，Johansen，M.等)，曼尼希堿(例如，參見(jiàn)J.Pharm.Sci.1980，69，44，Bundgaard，H.等and J.Am.Chem.Soc，1959，81，1198，Gottstein，W.等)，羥基甲基衍生物(例如，參見(jiàn)J.Pharm.Sci，1981，70，855，Bansal，P.等)和N-(酰氧基)烷基衍生物和氨基甲酸酯(例如，參見(jiàn)J.Med.Chem.，1980，23，469，Bodor，N.等，J.Med.Chem.，1984，27，1037，F(xiàn)irestone，R.等，J.Med Chem.，1967，10，960，Kreiger，M.等，美國(guó)專(zhuān)利No 5,684,018和J.Med Chem.，1988，31，318-322，Alexander，J.等)。其他選擇和制備合適前藥的常規(guī)步驟是本領(lǐng)域中已知的，例如描述于WO 00/23419；Design of Prodrugs，H.Bundgaard，Ed.，Elsevier Science Publishers，1985；Methods in Enzymology，42309-396，K.Widder，Ed，Academic Press，1985；A Textbookof Drug Design and Development，Krogsgaard-Larsen and H.Bundgaard，Eds，Chapter 5，p113-191(1991)；Advanced DrugDelivery Reviews，8；1-38(1992)；Journal of PharmaceuticalSciences，77；285(1988)，H.Bundgaard等；Chem Pharm Bull，32692(1984)，N.Kakeya等和The Organic Chemistry of Drug Desig andDrug Action，Chapter 8，pp352-401，Academic press，Inc.，1992。
合適的藥學(xué)可接受的鹽包括，但不限于藥學(xué)可接受的無(wú)機(jī)酸(諸如，鹽酸、硫酸、磷酸、硝酸、碳酸、硼酸、氨基磺酸和氫溴酸)的鹽，或藥學(xué)可接受的有機(jī)酸(諸如，乙酸、丙酸、丁酸、酒石酸、馬來(lái)酸、羥基馬來(lái)酸、反丁烯二酸、馬來(lái)酸、檸檬酸、乳酸、粘酸、葡萄糖酸、苯甲酸、琥珀酸、草酸、苯乙酸、甲烷磺酸、甲基苯磺酸、苯磺酸、水楊酸、對(duì)氨基苯磺酸、天冬氨酸、谷氨酸、依地酸、硬脂酸、棕櫚酸、油酸、月桂酸、泛酸、丹寧酸、抗壞血酸、芬地酸(fendizoic)、4-4′-亞甲基二-3-羥基-2-奈甲酸、o-(p-羥基苯甲酰)苯甲酸、4′-4″-二羥基三苯基甲烷-2-羧酸和戊酸)的鹽。堿鹽包括，但不限于與藥學(xué)可接受的陽(yáng)離子(諸如鈉、鉀、鋰、鈣、鎂、銨和烷基銨)形成的那些。含氮的堿性基團(tuán)可以用試劑諸如低級(jí)烷基鹵化物(諸如甲基、乙基、丙基和丁基氯，溴化物和碘化物)或二烷基磺酸酯(諸如二甲基磺酸酯和二乙基磺酸酯))進(jìn)行季銨化。
應(yīng)當(dāng)理解在說(shuō)明書(shū)中公開(kāi)和定義的本發(fā)明延伸至文本或附圖
中提到的或從文本或附圖來(lái)看顯而易見(jiàn)的各個(gè)特征中的兩個(gè)或多個(gè)的所有備選組合。所有這些不同組合構(gòu)成了本發(fā)明各個(gè)備選方面。
現(xiàn)在將參考下述實(shí)施例來(lái)更詳細(xì)地描述本發(fā)明。然而應(yīng)該理解，下述說(shuō)明僅僅是說(shuō)明性的，不應(yīng)以任何方式認(rèn)為是對(duì)上述本發(fā)明一般性的限制。
實(shí)施例 現(xiàn)在，參照以下的非限定性示意性實(shí)施例和附圖來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述。
為了鑒定本發(fā)明所述的多種單個(gè)化合物，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出命名系統(tǒng)。該命名法用于簡(jiǎn)化化合物的描述，并且用于替代復(fù)雜的IUPAC名稱(chēng)(使用該名稱(chēng)可能易于出錯(cuò)并難以解釋)。
所述大分子樹(shù)狀聚體的命名利用了以下縮寫(xiě)


其他縮寫(xiě)如下 縮寫(xiě)全稱(chēng) PyBop 六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧-三-吡咯烷基 -磷鎓 DIPEA N，N-二異丙基乙胺 TEA 三乙胺 DCC 1，3-二環(huán)己基碳化二亞胺 HOBt1-羥基苯并三唑水合物 DMAP4-(二甲基胺)吡啶 NHS N-羥基琥珀酰亞胺 TFA 三氟乙酸 DCM 二氯甲烷 EtOAc 乙酸乙酯 MeOH甲醇 MeCN乙腈 DMF 二甲基甲酰胺 DMSO二甲亞砜 PBS 磷酸緩沖鹽溶液 TLC 薄層色譜 HPLC高效液相色譜 MS 質(zhì)譜 MTX氨甲蝶呤 THF四氫呋喃 HPLC和MS設(shè)備的詳細(xì)情況 HPLC-具有2996二極管陣列檢測(cè)器(Diode Array Detector，DAD)的Waters 2795 MS-具有ESI探針的Waters ZQ4000，其中輸入流被分流，從而使進(jìn)入MS的量為約50μL/min。
如所述的那樣，在正、負(fù)電噴霧離子化模式下獲得質(zhì)譜數(shù)據(jù)。使用Maximum Entropy運(yùn)算法(MaxEnt)(其由MassLynx軟件v4.0執(zhí)行，該軟件由Waters Corporation提供)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行去卷積。在實(shí)驗(yàn)內(nèi)容中報(bào)告的數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)于對(duì)理論零帶電狀態(tài)去卷積后所觀察到的數(shù)值。所有的PEG試劑獲自商購(gòu)來(lái)源并按收到時(shí)的狀態(tài)進(jìn)行使用。
實(shí)施例1 β-乳球蛋白-MAL-(CH2)2CONH-PEG1100-CO-NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[PEG570]32 i.芐氧基羰基氨基-3，6-氧雜-8-氨基辛烷[CBz]NEOEOEN 在20分鐘內(nèi)，向由2，2′-(次乙二氧基)二乙基苯胺(4.45g，30mmol)和TEA(0.7mL，50mmol)在MeCN(50mL)中形成的溶液中滴加由N-(芐氧基羰氧基)琥珀酰亞胺(1.2g，5.0mmol)在MeCN(10mL)中形成的溶液。一旦該加入過(guò)程完成，便在室溫下對(duì)所得的溶液攪拌過(guò)夜。真空除去乙腈，并將得到的無(wú)色殘余物再次溶解于水(50mL)中。用DCM(3×25mL)洗滌所得的水性溶液，并在真空下還原合并的有機(jī)提取物。將殘余物溶解于2M HCl(25mL)中，并用二乙醚(3×25mL)洗滌。然后，將水層用NaOH中和至pH 7，并在真空下蒸發(fā)至干態(tài)。將所得的殘余物加入到EtOAc(25mL)中，并過(guò)濾，然后在Na2SO4上干燥。真空除去溶劑后得到無(wú)色油狀物(840mg，2.9mmol，60％)。ESI MS(+ve)283[M+H]+；C14H22N2O4[M+H]+的計(jì)算m/z283.34。
ii.2-({2-[(叔丁氧羰基)氨基]丙基}氨基)丙基氨基甲酸叔丁酯 在室溫下，將由二亞丙基三胺(171g，1.32mol)在THF(200mL)中形成的溶液在1h內(nèi)滴加到由叔丁基-1H-咪唑-1-羧酸酯(444g，2.64mol)在THF(1.2L)中形成的溶液中。將所得的溶液回流4h，然后在室溫下攪拌過(guò)夜。在真空下除去THF，并將殘余物溶解于DCM(2L)中。將DCM溶液首先用NaOH(2M，2×1L)洗滌，然后用10％w/v檸檬酸(2×1L)洗滌。將水性檸檬酸溶液用NaOH(4M，直至pH 14)堿化，再用DCM(3×600mL)萃取，然后將合并的DCM提取物真空濃縮，從而得到澄清的油狀物，該油狀物通過(guò)冷卻而固化，從而得到白色固體(346g，80％)。
iii.HO-Su(NPN)2[Boc]2 將2-({2-[(叔丁氧羰基)氨基]丙基}氨基)丙基氨基甲酸叔丁酯(208.5g，0.63mol)和甲苯(900mL)裝入裝配有頂置式攪拌器的3L容器中。一次性加入琥珀酸酐(63g，0.63mol)，并將所得溶液在60℃下加熱過(guò)夜。將混合物冷卻至室溫，然后加入二乙醚(1×200mL)，并過(guò)濾出固體。將該固體用二乙醚(2×200mL)洗滌，然后進(jìn)行干燥，從而得到白色固體(230g，91％)。
iv.[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Boc]2 向由[CBz]NEOEOEN(Example li)(440mg，1.6mmol)在DMF(4mL)中形成的溶液中加入TEA(0.22mL，1.6mmol)和PNPO-Su(NPN)2-Boc2(950mg，1.8mmol)。將所得溶液在室溫下攪拌過(guò)夜。真空除去溶劑，并將殘余物溶解于EtOAc(250mL)中。將該溶液用鹽水(125mL)、1MNa2CO3(3×50mL)、水(125mL)和1M KHSO4洗滌，再用鹽水(125mL)進(jìn)行二次洗滌，然后在Na2SO4上干燥。將溶液真空濃縮，并通過(guò)硅膠色譜(MeOH/DCM梯度)純化，從而得到澄清的粘性油狀物(165mg，0.23mmol，15％)。ESI MS(+ve)496[M+H]+；C24H41N5O6[M+H]+的計(jì)算m/z496.61。
v.[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][NH2.TFA]2 以將溶液的溫度保持為5℃或低于5℃的速率加入經(jīng)冰冷卻的TFA(50mL，0.73mol)中。移走冰浴，并將該溶液在室溫下攪拌5h。然后，以將混合物保持在5℃以下的速率，加入經(jīng)冷卻的和冰冷卻的水(100mL)。真空蒸發(fā)揮發(fā)物，并將水加入到油狀殘余物中。然后，將該溶液真空濃縮，并用更多的水(2×100mL)重復(fù)上述過(guò)程。將所得的油狀物溶解于水(50mL)中，并將所得的溶液過(guò)濾并冷凍干燥，從而得到[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][NH2.TFA]2(17.1g)的無(wú)色玻璃狀固體。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ(ppm)1.90(外觀五重峰，J＝6.6Hz，2H)；1.99(m，2H)；2.57(m，2H)；2.65(m，2H)；2.89(t，J＝6.6Hz，2H)；3.00(t，J＝7.5Hz，2H)3.30-3.38(復(fù)合體，6H)；3.42-3.58(復(fù)合體，6H)；3.61(s，4H)；5.08(s，2H)；7.25-7.40(復(fù)合體，5H)；HPLC(親水/TFA)Rt＝8.0min；ESI MS(+ve)496.2[M+H]+；C24H42N5O6+[M+H]+的計(jì)算m/z496.3。
vi.[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]2[Boc]4 在室溫下，將由DBL-OPNP(12.8g，17.7mmol)在DMF(80mL)中形成的溶液加入到由[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][NH2.TFA]2(19.5g，35.4mmol)和TEA(17.9g，0.177mol)在DMF(80mL)中形成的溶液中。經(jīng)過(guò)16h的攪拌后，加入由甘氨酸(1.50g，29.0mmol)在水(50mL)中形成的溶液，并持續(xù)攪拌16h。真空除去揮發(fā)物，并將殘余物溶解于EtOAc(200mL)中，然后將該溶液依次用5％w/v Na2CO3(10×50mL)、鹽水(50mL)和1M HCl(2×50mL)洗滌，再用鹽水(50mL)洗滌。將所得的EtOAc溶液干燥(Na2SO4)，并過(guò)濾，然后真空除去溶劑，從而得到無(wú)色油狀產(chǎn)物(20.74g)。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ(ppm)1.15-1.95(復(fù)合體，16H)；1.43(s，18H)；1.44(s，18H)；2.51(m，2H)；2.64(m，2H)；3.02(t，J 6.6Hz，4H)；3.17(ma，2H)；3.25-3.45(復(fù)合體，8H)；3.48-3.58(復(fù)合體，4H)；3.61(s，4H)；5.08(s，2H)；7.25-7.40(復(fù)合體，5H)。HPLC(疏水/TFA)Rt＝8.6min；ESI MS(+ve)1153.0[M+H]+；C56H98N9O16+[M+H]+的計(jì)算m/z1152.7。
vii.[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]2[NH2.TFA]4 將[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]2[Boc]4(20.74g，18.0mmol)溶解于乙酸(50mL)中，并將經(jīng)攪拌的溶液在冰浴中冷卻。以將溶液的溫度保持在5℃或5℃以下的速率，加入冰冷卻的TFA(50mL，0.73mol)。移走冰浴，并將所得溶液在室溫下攪拌5h。然后，將該溶液冷卻至5℃，并以將所得混合物保持在低于5℃的速率下加入冰冷的水(100mL)中。真空蒸發(fā)揮發(fā)物，并將水(100mL)加入到殘余油狀物中。然后將所得的溶液真空濃縮，并用更多的水(2×100mL)重復(fù)上述過(guò)程。將油狀物溶解于水(50mL)中，然后將溶液過(guò)濾并冷凍干燥，從而得到[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]2[NH2.TFA]4(25.1g)，其為淺黃色玻璃狀固體。1H-NMR(300MHz，D2O)δ(ppm)1.44(m，4H)；1.70(m，6H)；1.86(m，6H)；2.50(m，2H)；2.64(m，2H)；2.99(t，J 7.2Hz，2H)；3.12-3.47(復(fù)合體，12H)；3.52-3.63(復(fù)合體，12H)；3.95(m，2H)；5.12(s，2H)；7.32-7.50(復(fù)合體，5H)；HPLC(親水/TFA)Rt＝10.4min；ESI MS(+ve)752.4[M+H]+；C36H66N9O8+[M+H]+的計(jì)算m/z752.5。
viii.[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]4[Boc]8 在室溫下，將由DBL-OPNP(16.8g，13.9mmol)在DMF(100mL)中形成的溶液加入到由[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]2[NH2.TFA]4(33.98g，61.3mmol)和TEA(13.5g，0.134mol)在DMF(100mL)中形成的溶液中。攪拌11h后，加入1M的甘氨酸水性溶液(10mL)；在1h和1.5h后，再次加入等量的甘氨酸溶液。再持續(xù)攪拌2h，然后真空蒸發(fā)揮發(fā)物。將殘余物溶解于EtOAc(200mL)中，并將所得溶液依次用0.5M HCl(2×50mL)，10％w/v Na2CO3(6×50mL)和鹽水(50mL)洗滌。將EtOAc溶液干燥(Na2SO4)，并過(guò)濾，然后真空除去溶劑，從而得到所需的無(wú)色油狀產(chǎn)物(26.26g，91％)。1H-NMR(300MHz，d6-DMSO)δ(ppm)1.00-1.75(復(fù)合體，112H)；2.32(m，2H)；2.47(m，2H)；2.75-3.50(復(fù)合體，32H)；3.75-3.90(復(fù)合體，4H)；4.10-4.25(復(fù)合體，2H)；5.01(s，2H)；6.38(br.m，1H)；6.60-6.95(復(fù)合體，8H)；7.25(m，1H)；7.28-7.39(復(fù)合體，5H)；7.60-8.05(復(fù)合體，7H)。HPLC(Hydrophobic/TFA)Rt＝15.2min；ESI MS(+ve)1033.8[M+2H]2+/2；C100H179N17O282+[M+2H]2+/2的計(jì)算m/z1033.7。
ix.[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]4[NH2.TFA]8 將[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]4[Boc]8(24.52g，11.9mmol)溶解于乙酸(108mL)中，并將經(jīng)攪拌的溶液在冰浴中冷卻，直到乙酸開(kāi)始凍結(jié)為止。然后，以將溶液的溫度保持在10℃或10℃以下的速率下加入TFA(108mL，1.40mol)。然后，移出冰浴，并將所得溶液在室溫下攪拌15h。真空蒸發(fā)乙酸和TFA，并將水(100mL)加入到殘余的油狀物中。然后，將溶液真空濃縮，并使用更多的水(3×100mL)重復(fù)上述過(guò)程。將所得的油狀物溶解于水(100mL)中，并將溶液過(guò)濾，然后冷凍干燥，從而得到[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]4[NH2.TFA]8(29.2g)的無(wú)色玻璃狀固體。1H-NMR(300MHz，D2O)δ(ppm)1.25-2.05(復(fù)合體，40H)；2.53(m，2H)；2.65(m，2H)；2.95-3.10(復(fù)合體，8H)；3.10-3.45(復(fù)合體，16H)；3.55-3.75(復(fù)合體，8H)；3.95(t，J 6.6Hz，2H)；4.06(t，J 6.6Hz，2H)；4.20-4.30(復(fù)合體，2H)；5.15(s，2H)；7.35-7.55(復(fù)合體，5H)；HPLC(親水/甲酸鹽)Rt＝8.4min；ESIMS(+ve)1265.1[M+H]+，633.0[M+2H]2+/2；C60H114N17O12+[M+H]+的計(jì)算m/z1264.9，C60H115N17O122+[M+2H]2+的計(jì)算m/z633.0。
x.[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]8[Boc]16 在室溫下，將由DBL-OPNP(48.2g，87.2mmol)在DMF(120mL)中形成的溶液加入到由[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]4[NH2.TFA]8(25.83g，11.87mmol)和Et3N(23.9g，0.228mol)在DMF(150mL)中形成的溶液中。在攪拌19h后，加入由甘氨酸(3.27g，43.6mmol)在水(80mL)中形成的溶液。持續(xù)攪拌2h，然后真空蒸發(fā)揮發(fā)物。將殘余物溶解于EtOAc(200mL)中，并將溶液依次用5％w/v Na2CO3(1×100mL；4×50mL)和1M HCl(2×50mL)洗滌，再用鹽水(50mL)洗滌。將EtOAc溶液干燥(Na2SO4)，并進(jìn)行熱過(guò)濾，然后真空除去溶劑，從而得到所需的產(chǎn)物，其為黃色玻璃狀固體(27.12g，59％)。在波紋濾紙上沉淀出一部分產(chǎn)物，然后將該材料溶解于甲醇中，再進(jìn)行過(guò)濾并真空除去甲醇，從而得到額外的產(chǎn)物(9.02g，20％)，其為黃色泡沫。對(duì)這兩部分產(chǎn)物進(jìn)行分析，從而得到了一組相同的1H-NMR和ESI MS數(shù)據(jù)。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ(ppm)1.00-1.75(復(fù)合體，232H)；2.51(m，2H)；2.65(m，2H)；2.75-3.50(復(fù)合體，40H)；3.50-3.65(復(fù)合體，8H)；3.90-4.50(復(fù)合體，14H)；5.08(s，2H)；7.25-7.40(復(fù)合體，5H)。HPLC(疏水/TFA)Rt＝19.7min；ESI MS(+ve)1947.3[M+2H]2+/2，1298.3[M+3H]3+/3；C188H339N33O522+[M+2H]2+/2的計(jì)算m/z1946.8，C188H340N33O523+[M+3H]3+/3的計(jì)算m/z1298.2。
xi.[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]8[NH2.TFA]16 將[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]8[Boc]16(25.75g，6.62mmol)溶解于乙酸(122mL)中，并將經(jīng)攪拌的溶液在冰浴中冷卻直到乙酸開(kāi)始凍結(jié)為止。移除冰浴，并小心加入TFA直到乙酸剛好溶解。將經(jīng)攪拌的溶液再次放置在冰浴中，然后以將所得溶液的溫度保持在10℃或10℃以下的速率加入剩余的TFA(所用的TFA的總量為108mL，1.40mol)。移除冰浴，并將溶液在室溫下攪拌17h。將該溶液在冰上冷卻，然后加入到冰冷的水(400mL)中，同時(shí)確保所得溶液的溫度被保持在10℃以下。真空蒸發(fā)發(fā)揮成分，并將水(250mL)加入到所得的油狀殘余物中。然后，將所得溶液真空濃縮，并使用更多的水(2×250mL)重復(fù)上述過(guò)程。將最終的油狀物溶解于水(200mL)中，并將溶液過(guò)濾，然后冷凍干燥，從而得到[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]8[NH2.TFA]16(27.6g)的無(wú)色玻璃狀固體。1H-NMR(300MHz，D2O)δ(ppm)1.25-1.65(復(fù)合體，40H)；1.65-2.05(復(fù)合體，48H)；2.50(m，2H)；2.62(m，2H)；2.95-3.05(復(fù)合體，16H)；3.05-3.45(復(fù)合體，24H)；3.55-3.70(復(fù)合體，8H)；3.94(t，J 6.6Hz，4H)；4.05(t，J 6.6Hz，4H)；4.15-4.30(復(fù)合體，4H)；4.30-4.40(復(fù)合體，2H)；5.13(s，2H)；7.35-7.50(復(fù)合體，5H)；HPLC(親水/TFA)Rt＝8.9min；ESIMS(+ve)763.9[M+3H]3+/3，573.4[M+4H]4+/4；C108H212N33O203+[M+3H]3+的計(jì)算m/z764.2，C108H213N33O204+[M+4H]4+的計(jì)算m/z573.4。
xii.[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[Boc]32 在室溫下，將ca.2-3g份的DBL-OPNP(27.66g，59.2mmol)加入到由[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]8[NH2.TFA]16(13.83g，3.36mmol)和TEA(13.1g，0.129mol)在DMF(150mL)中形成的溶液中。在攪拌17h后，加入由甘氨酸(2.22g，29.6mmol)在水(50mL)中形成的溶液。持續(xù)攪拌3h，然后將溶液加入到經(jīng)快速攪拌的水(400mL)中。從所得的沉淀出的橡膠中倒出上清液體。將橡膠狀材料溶解于DMF(100mL)中，并將溶液緩慢加入到由片冰(500g)和水(500mL)形成的經(jīng)充分?jǐn)嚢璧幕旌衔镏?。通過(guò)過(guò)濾收集沉淀的白色固體，并將其再次懸浮于5％w/v Na2CO3中，進(jìn)行超聲波處理，再進(jìn)行過(guò)濾。將所得的固體用水(4×100mL)充分洗滌，并干燥，從而得到所需的產(chǎn)物(22.10g，87％)，其為淺褐色粉末。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ(ppm)1.10-1.95(復(fù)合體，472H)；2.52(m，2H)；2.65(m，2H)；2.95-3.10(復(fù)合體，30H)；3.10-3.30(復(fù)合體，30H)；3.30-3.45(復(fù)合體，12H)；3.45-3.65(復(fù)合體，8H)；3.80-4.15(復(fù)合體，16H)；4.20-4.45(復(fù)合體，14H)；5.09(s，2H)；7.25-7.40(復(fù)合體，5H)。由于不溶于HPLC流動(dòng)相中，所以不能得到該產(chǎn)物的HPLC和ESI MS數(shù)據(jù)。相反，除去Boc基團(tuán)，并由衍生的的聚三氟乙酸鹽來(lái)得到這些數(shù)據(jù)。
xiii.[NH2]EOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[Boc]32 將活性碳(28mg)上10％w/w的鈀炭和甲酸銨(6mg，95mol)加入到由[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[Boc]32(348mg，46.13mol)在DMF(4.5mL)和水(0.5mL)中形成的溶液中。在氮?dú)庀聰嚢杷龌旌衔?6小時(shí)，然后通過(guò)0.54μm的過(guò)濾器。在真空下濃縮該溶液，然后溶于甲醇中并再次在真空中濃縮得到[NH2]EOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[Boc]32，為玻璃狀固體(433mg)。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ(ppm)1.10-1.90(復(fù)雜，474H)；2.52(m，4H)；2.67(m，4H)；2.95-3.45(復(fù)合物，80H)；3.55(m，8H)；3.63(s，8H)；3.85-4.50(復(fù)合物，28H)。HPLC(樣品不溶于LC相容的溶劑中)。在1H-NMR中CBz信號(hào)的缺失證實(shí)產(chǎn)物的形成。
xiv.[p-NO2-CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[Boc]32 向[NH2]EOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[Boc]32(287mg，0.038mmol)在DMF(3ml)中形成的溶液中加入DIPEA(20uL，0.116mmol)，然后在攪拌下加入4-硝基苯甲基氯甲酸酯(12mg)。在氮?dú)庀?，室溫?cái)嚢杷鋈芤?6小時(shí)。真空下除去揮發(fā)物得到所需產(chǎn)物(294mg)。TLC(10％MeOH/DCM)證實(shí)反應(yīng)完全。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ(ppm)1.10-1.90(復(fù)合物，474H)；2.52(m，4H)；2.67(m，4H)；2.95-3.45(復(fù)合物，80H)；3.55(m，8H)；3.63(s，8H)；3.85-4.50(復(fù)合物，28H)；7.55(d，2H)；8.25(d，2H)。HPLC(樣品不溶于LC相容的溶劑中)。
xv.[p-NO2-CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[NH2.TFA]32 在室溫下，向[p-NO2-CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[Boc]32(294mg，0.038mmol)在DCM(4mL)中形成的經(jīng)攪拌的溶液中加入TFA(1mL)。室溫下攪拌所述溶液16小時(shí)。在真空中除去揮發(fā)物，并將殘余物溶于1∶1 MeCN/H2O(5mL)中。在真空下除去溶劑。重復(fù)該步驟兩次。用將殘余物與乙醚(20mL)一起研磨，通過(guò)慢慢倒出(decanting)除去溶劑。在真空下干燥殘余物得到產(chǎn)物(354mg)，為白色泡沫狀狀物。HPLC(親水/TFA)Rt＝5.59min；ESI MS(+ve)4386[M+H+]；C204H399N66O38+[M]+的計(jì)算m/z4384.77。
xvi.[p-NO2-CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[PEG570]32 向m-dPEG570-NHS(1.24g，1.805mmol)在DMF(0.5mL)中形成的經(jīng)攪拌的溶液中逐滴加入[p-NO2-CBz]EOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[NH2.TFA]32(410.4mg，0.052mmol)和TEA(572μL，4.103mmol)在DMF(0.5mL)形成的溶液。在氮?dú)庀拢覝財(cái)嚢杷鋈芤?6小時(shí)。在真空下除去揮發(fā)物并將殘余物溶于50mL水中，在Centramate(10KDa膜，100mL樣品池(sample reservoir))上通過(guò)切向流過(guò)濾進(jìn)行純化。將滯留物濃縮至干得到所需產(chǎn)物(906mg，78％)，為油狀殘余物。HPLC(親水/TFA)Rt＝10.76min。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ(ppm)1.10-1.90(復(fù)合物，Lys(3×CH2)，184H)；2.20-2.70(復(fù)合物，Lys(N-CH2)，64H)；3.0-3.20(復(fù)合物，58H)；3.35(s，PEG-OMe，96H)；3.40-3.90(復(fù)合物，PEG-CH2，1536H)；4.10-4.40(寬的單峰，36H)；7.60(d，J＝8.38Hz，ArH，2H)；8.20(d，J＝8.33Hz，ArH，2H)。
xvii.[NH2]EOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[PEG570]32 該反應(yīng)按與實(shí)施例1xiii相同的方式進(jìn)行；使用[p-NO2-CBz]EOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[PEG570]32(347mg，0.0153mmol)和甲酸銨(68mg，1.08mmol)，活性碳上10％w/w的鈀(320mg)在DMF(6.4mL)和水(0.6mL)中。在反應(yīng)完成后，產(chǎn)生玻璃狀固體產(chǎn)物(310mg，90％)。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ(ppm)1.10-1.90(復(fù)合物，Lys(3×CH2)，184H)；2.20-2.70(復(fù)合物，Lys(N-CH2)，64H)；3.0-3.20(復(fù)合物，58H)；3.35(s，PEG-OMe，96H)；3.40-3.90(復(fù)合物，PEG-CH2，1536H)；4.10-4.40(寬的單峰，36H)。HPLC(親水/TFA)Rt＝10.69min；ESI MS(+ve)22，472[M+4H+]；C1028H1995N65O450+[M]+的計(jì)算m/z22，468.01。
xviii.MAL-(CH2)2CONH-PEG1100-CO-NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[PEG570]32 向MAL-PEG1100-NHS(1.25mg，0.895μmol)在DCM(0.5mL)中形成的經(jīng)攪拌的溶液中逐滴加入[NH2]EOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[PEG570]32(20.1mg，0.895μmol)和TEA(5μL)在DCM(0.5mL)中形成的溶液中。在氮?dú)庀?，室溫?cái)嚢杷鋈芤?6小時(shí)。在減壓下除去揮發(fā)物，使用產(chǎn)物(21mg)，無(wú)需進(jìn)一步純化。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ(ppm)1.10-1.90(復(fù)合物，Lys(3×CH2)，184H)；2.20-2.70(復(fù)合物，Lys(N-CH2)，64H)；3.0-3.20(復(fù)合物，58H)；3.35(s，PEG-OMe，96H)；3.40-3.90(復(fù)合物，PEG-CH2，1628H)；4.10-4.40(寬的單峰，36H)；6.82(br s，MAL，2H).HPLC(親水/TFA)Rt＝10.72min。
xix.β-乳球蛋白-MAL-(CH2)2CONH-PEG1100-CO-NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[PEG570]32 將MAL-(CH2)2CONH-PEG1100-CO-NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[PEG570]32(13.0mg，10當(dāng)量)在PBS緩沖溶液(pH 7.64，250mL)中形成的溶液加入牛β-乳球蛋白B(1mg，pH 7.64，250mL)的PBS緩沖溶液中。然后振蕩混合物16小時(shí)(600rpm，26℃)并通過(guò)SDS-PAGE(12％Tris-Glycine Gel，200mV，60min)進(jìn)行分析，用考馬斯亮藍(lán)和BaI2染色。由用考馬斯亮藍(lán)染色的SDS-PAGE觀察到所需的樹(shù)狀聚體-蛋白結(jié)構(gòu)，并且其出現(xiàn)在相對(duì)蛋白MW標(biāo)記的適當(dāng)MW處。
實(shí)施例2 β-乳球蛋白-NHCO-PEG570-NHCO(CH2)2-CO-NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[PEG570]32 i HO2C-(CH2)2CO-NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[PEG570]32 向琥珀酸酐(5mg，0.047mmol)在DMF(0.5mL)中形成的經(jīng)攪拌的溶液中加入[NH2]EOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[PEG570]32(實(shí)施例1xvii)(53mg，2.36μmol)和TEA(14μL)在DMF(0.5mL)中形成的溶液，室溫下攪拌所述溶液16小時(shí)。在真空下除去揮發(fā)物，并將殘余物溶于水中，在Centramate(10KDa膜)上通過(guò)切向流過(guò)濾進(jìn)行純化。將滯留物濃縮至干得到所需產(chǎn)物(69mg)，為油狀殘余物。HPLC(親水/TFA)Rt＝10.83min.1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ(ppm)1.10-1.90(復(fù)合物，Lys(3×CH2)，184H)；2.20-2.70(復(fù)合物，Lys(N-CH2)+琥珀酰(CH2)2，68H)；3.0-3.20(復(fù)合物，58H)；3.35(s，PEG-OMe，96H)；3.40-3.90(復(fù)合物，PEG-CH2，1536H)；4.10-4.40(寬的單峰，36H)。
ii t-BuO2C-PEG570-NHCO(CH2)2-CO-NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[PEG570]32 在0℃下，向HO2C-(CH2)2CO-NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[PEG570]32(30.6mg，1.36μmol)，H2N-PEG570-CO2t-Bu(22mg，0.033mmol)和TEA(8μL)在DCM(0.5mL)中形成的經(jīng)攪拌的溶液中加入DCC(6.2mg，0.03mmol)和HOBt(4.6mg，0.034mmol)在DMF(0.5mL)中形成的溶液中。在0℃下，攪拌所述溶液10分鐘，然后使其到達(dá)室溫并在氮?dú)庀略贁嚢?6小時(shí)。在真空下除去揮發(fā)物并將殘余物溶于水中，在Centramate(10KDa膜)上通過(guò)切向流過(guò)濾進(jìn)行純化。將滯留物濃縮至干得到所需產(chǎn)物(29.5mg)，為油狀殘余物。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ(ppm)1.10-1.90(復(fù)合物，Lys(3×CH2)+tBu，193H)；2.20-2.70(復(fù)合物，Lys(N-CH2)+琥珀酰(CH2)2，68H)；3.0-3.20(復(fù)合物，58H)；3.35(s，PEG-OMe，96H)；3.40-3.90(復(fù)合物，PEG-CH2，1582H)；4.10-4.40(寬的單峰，36H)。
iii HO2C-PEG570-NHCO(CH2)2-CO-NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[PEG570]32 在室溫下，向t-BuO2C-PEG570-NHCO(CH2)2-CO-NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[PEG570]32(29.5mg，1.27μmol)在DCM(2ml)中形成的經(jīng)攪拌的溶液中加入TFA(0.5ml)；室溫下攪拌所述溶液2小時(shí)。將反應(yīng)混合物濃縮至干，并將殘余物溶于5mL 1∶1 MeCN/H2O中，然后在真空下除去溶劑。將其溶于1∶1 MeCN/H2O中，然后完全除去溶劑，重復(fù)兩次以上(33.2mg)。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ(ppm)1.10-1.90(復(fù)合物，Lys(3×CH2)，184H)；2.20-2.70(復(fù)合物，Lys(N-CH2)+琥珀酰(CH2)2，68H)；3.0-3.20(復(fù)合物，58H)；3.35(s，PEG-OMe，96H)；3.40-3.90(復(fù)合物，PEG-CH2，1582H)；4.10-4.40(寬的單峰，36H)。
iv NHS-CO-PEG570-NHCO(CH2)2-CO-NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[PEG570]32 向HO2C-PEG570-NHCO(CH2)2-CO-NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[PEG570]32(33.2mg，1.43μmol)和DIPEA(11μL，0.063mmol)在DCM(2ml)中形成的經(jīng)攪拌的溶液中加入固體狀的DCC(12.2mg，0.059mmol)，室溫下攪拌所述溶液10分鐘。加入于DCM(0.5ml)中的NHS(5.2mg，0.045mmol)，并在氮?dú)庀?，室溫?cái)嚢杷鋈芤?6小時(shí)。在真空下除去揮發(fā)物，將DCM(2mL)加入到殘余物中，通過(guò)4.5μm的過(guò)濾器過(guò)濾懸浮液，在真空下除去溶劑(31.7mg)。使用該材料無(wú)需進(jìn)一步純化。
v.β-乳球蛋白-NHCO-PEG570-NHCO(CH2)2-CO-NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[PEG570]32 在PBS緩沖溶液(pH 7.64，250mL)中的NHS-CO-PEG570-NHCO(CH2)2-CO-NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[PEG570]32(相對(duì)蛋白為10當(dāng)量)與牛β-乳球蛋白B(pH 7.64)反應(yīng)。振蕩所述反應(yīng)混合物16小時(shí)(600rpm，26℃)，并通過(guò)SDS-PAGE(12％ Tris-Glycine Gel，200mV，60min)進(jìn)行分析，用考馬斯亮藍(lán)和BaI2染色。由用考馬斯亮藍(lán)染色的SDS-PAGE觀察到所需的樹(shù)狀聚體-蛋白結(jié)構(gòu)，并且其出現(xiàn)在相對(duì)蛋白MW標(biāo)記的適當(dāng)MW處。
實(shí)施例3 HSA-MAL-(CH2)2CONH-PEG1100-CO-NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[PEG570]32 在PBS緩沖溶液(pH 7.64，250mL)中的MAL-(CH2)2CONH-PEG1100-CO-NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[PEG570]32(實(shí)施例1xviii)(相對(duì)蛋白為10當(dāng)量)與人血清白蛋白(pH 7.64)反應(yīng)。振蕩所述反應(yīng)混合物16小時(shí)(600rpm，26℃)，并通過(guò)SDS-PAGE(12％Tris-Glycine Gel，200mV，60min)進(jìn)行分析，用考馬斯亮藍(lán)和BaI2染色。由用考馬斯亮藍(lán)染色的SDS-PAGE觀察到所需的樹(shù)狀聚體-蛋白結(jié)構(gòu)，并且其出現(xiàn)在相對(duì)蛋白MW標(biāo)記的適當(dāng)MW處。
實(shí)施例4 NDP-2-MSH-CH2CO NEOEOEN[Su(NPN)2][GlyLys]2[ε-CBz]2[Lys]2[PEG570]4 i.HO-Su(NPN)2[CBz]2 在65℃下加熱(NPN)2[CBz]2(20.0g，0.05mol)和琥珀酸酐(6.0g，0.06mol，1.2當(dāng)量)于甲苯(180mL)中的混合物16小時(shí)。冷卻反應(yīng)至室溫，過(guò)濾白色固體并用甲基叔丁醚(3×100mL)洗滌得到高產(chǎn)率的產(chǎn)物23.54g(94％)。
ii.PNPO-Su(NPN)2[CBz]2 在室溫下，向4-硝基苯酚(1.91g，13.7mmol)和HO-Su(NPN)2[CBz]2(13.7mmol)于EtOAc(150mL)的經(jīng)攪拌的溶液中加入DCC(2.97g，14.4mmol)在EtOAc(50mL)中形成的溶液。在室溫下攪拌混合物過(guò)夜，過(guò)濾并用K2CO3(1.0M)、鹽水1∶1(3×300mL)洗滌，干燥(MgSO4)，過(guò)濾并濃縮，得到7.80g PNPO-Su(NPN)2[CBz]2。
iii.[Boc]NEOEOEN[Su(NPN)2][CBz]2 向[Boc]NEOEOEN(3g，12mmol)在1∶1 DMF/DMSO(60mL)中形成的溶液中加入PNPO-Su(NPN)2[CBz]2(7.5g，12mmol)在DMSO(30mL)中形成的溶液和TEA(3.4mL，240mmol)。室溫下攪拌所述溶液15小時(shí)。在真空下濃縮所述溶液并重新溶于水(300mL)中。用EtOAc(3×300mL)洗滌水性溶液并用Na2SO4干燥合并的有機(jī)洗滌液。真空下除去溶劑，通過(guò)硅膠色譜(3％MeOH/DCM)純化原油得到[Boc]NEOEOEN[Su(NPN)2][CBz]2，為無(wú)色粘性油(8.2g，93％)。HPLC(親水/TFA)Rt＝9.20min；ESIMS(+ve)730.3[M+1H]；C37H55N5O10)的計(jì)算m/z729.9。
iv.[Boc]NEOEOEN[Su(NPN)2][NH2]2 向[Boc]NEOEOEN[Su(NPN)2][CBz]2(500mg，0.68mmol)在三氟乙醇(13mL)中形成的溶液中加入碳上的10％w/w鈀(723mg，34mmol)。在氫氣氣氛在大氣壓下攪拌懸浮液15小時(shí)。然后通過(guò)0.2μm的過(guò)濾器過(guò)濾懸浮液，在真空下濃縮濾液得到[Boc]NEOEOEN[Su(NPN)2][NH2]2(250mg，80％)，為無(wú)色的油。
HPLC(親水/TFA)Rt＝4.50min.ESI MS(+ve)462.5[M+H+]；C21H43N5O6的計(jì)算m/z461.6。
v.MeO-GlyLys[ε-CBz][α-Boc] 在室溫下，向MeOGly.HCl(12.56g，0.11mol)和DMF(200mL)的經(jīng)攪拌懸浮液中緩慢加入TEA(42mL，0.30mol)。將活性酯，PNPO-α-Boc-ε-CBz-Lys(50.15g，0.10mol)以2-3g的份數(shù)加入到所述懸浮液中。在室溫下攪拌嫩黃色混合物18小時(shí)。在真空下除去揮發(fā)物并將所得的殘余物在EtOAc(200mL)，10％ Na2CO3(100mL)和水(175mL)之間分配。依次用5％ Na2CO3(4×200ml)、0.25M HCl(3×50mL)和鹽水(1×50mL)洗滌有機(jī)層，干燥(MgSO4)，過(guò)濾并濃縮得到無(wú)色油狀產(chǎn)物(44.39g，98％)。HPLC(疏水/甲酸酯)Rt＝5.22min。ESI MS(+ve)452.02[M+H]+；C22H33N3O7的計(jì)算m/z451.52。
vi.MeO-GlyLys[ε-CBz][α-NH2.TFA] 向MeO-GlyLys[ε-CBz][α-Boc](43.4g，96.03mmol)在乙酸(150mL)中形成的冷凍的經(jīng)攪拌的溶液中分批加入無(wú)水TFA(總共170mL)。在室溫下攪拌反應(yīng)5小時(shí)。在減壓下除去揮發(fā)物；用甲醇(5×200mL)共沸來(lái)除去殘余的TFA和乙酸。得到淺黃色的油狀產(chǎn)物(46.04g)。HPLC(親水/甲酸酯)12.33min；ESI MS(+ve)352[M+H]+；C17H25N3O5的計(jì)算m/z351.40。
vii.MeO-GlyLys[ε-CBz][α-Lys][Boc]2 在室溫下，向MeO-GlyLys[ε-CBz][α-NH2.TFA](96mmol)在DMF(200mL)中形成的經(jīng)攪拌的溶液中加入TEA(33.5mL，0.24mol)，然后加入DBL-OPNP(49.4g，0.106mol)。在室溫下攪拌所述溶液17小時(shí)。將甘氨酸(3.98g，53mmol)在水(50mL)中形成的溶液加到粗反應(yīng)產(chǎn)物中并繼續(xù)攪拌18個(gè)小時(shí)。加入水(200mL)，并通過(guò)過(guò)濾收集黃色沉淀，然后重懸浮于5％Na2CO3(200mL)；攪拌1.5小時(shí)。通過(guò)過(guò)濾收集粗產(chǎn)物并重懸浮于水(3×200mL)中，通過(guò)過(guò)濾收集固體，空氣干燥得到細(xì)的黃色粉末狀的產(chǎn)物(61.07g，94％)。HPLC(疏水/甲酸酯)Rt＝7.90min；ESI MS(+ve)680.15[M+H]+；C33H53N5O10的計(jì)算m/z679.82。
viii.MeO-GlyLys[ε-CBz][α-Lys][NH2.TFA]2 在0℃下，向MeO-GlyLys[ε-CBz][α-Lys][Boc]2(4g，7.36mmol)在乙酸(15mL)中形成的經(jīng)攪拌懸浮液中逐滴加入TFA(15mL)。使混合物回溫至室溫，并在室溫下攪拌過(guò)夜。除去溶劑并將殘余物溶于水(100ml)中，并過(guò)濾。凍干濾液得到無(wú)色的油(4.4g)。HPLC/(親水/TFA)Rt＝5.03min；ESI MS(+ve)＝480[M+H+]；C23H37N5O6的計(jì)算m/z479.5。
ix.MeO-GlyLys[ε-CBz][α-Lys][PEG570]2 向MeO-GlyLys[ε-CBz][α-Lys][NH2.TFA]2(735mg，1.04mmol)在DMF(無(wú)水，20ml)中形成的經(jīng)攪拌懸浮液中加入TEA(1.5mL，5當(dāng)量/胺)，然后加入m-dPEG570-NHS(1.5g，1.05當(dāng)量/胺)在DMF(10mL)中形成的溶液。室溫下攪拌混合物過(guò)夜。除去所述溶劑并在硅膠柱(0.063-0.04mm，洗脫液7％-30％MeOH/DCM)上純化殘余物得到所需產(chǎn)物(1.0g)，為無(wú)色的油狀物。HPLC(親水/TFA)Rt＝7.87min；ESI MS(+ve)828[M+2xNH4]2+，811[M+2H]2+，541[M+3H]3+；C75H137N5O32的計(jì)算m/z1620.9。
x.HO-GlyLys[ε-CBz][α-Lys][PEG570]2 向MeO-GlyLys[ε-CBz][α-Lys][PEG570]2(1.0g，0.62mmol)于THF(20mL)中形成的經(jīng)攪拌懸浮液中加入1M LiOH(2mL)。在室溫下攪拌混合物3小時(shí)；然后用1M HCl酸化至pH 6。除去溶劑，并將殘余物溶于水中，凍干得到無(wú)色固體狀產(chǎn)物。HPLC(親水/TFA)Rt＝7.61min；ESI MS(+ve)821[M+(2xNH4)]2+，804[M+2H]2+，536[M+3H]3+；C74H135N5O32的計(jì)算m/z1606.9。
xi.[Boc]NEOEOEN[Su(NPN)2][GlyLys]2[ε-CBz]2[Lys]2[PEG570]4 在0℃下，向[Boc]NEOEOEN[Su(NPN)2][NH2]2(實(shí)施例4iv)(100mg，0.22mmol)和HO-GlyLys[ε-CBz][α-Lys][PEG570]2(700mg，0.44mmol)在DMF(無(wú)水，9mL)中形成的經(jīng)攪拌的溶液中加入PyBop(250mg)和DI PEA(160μL)。在室溫下攪拌混合物過(guò)夜。在真空下除去揮發(fā)物，得到殘余物，所述殘余物在硅膠柱(0.063-0.04mm，洗脫液10％-30％ MeOH/DCM)上進(jìn)行色譜分析得到600mg無(wú)色油狀產(chǎn)物。HPLC(親水/TFA)Rt＝9.18min；ESI MS(+ve)886[M-Boc+4H]4+，729[M+5H]5+，709[M-Boc+5H]5+；使用變換計(jì)算對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行去卷積得到3638.9[M+H]+；C169H309N15O68的計(jì)算m/z3639.3。
xii.[TFA.NH2]EOEOEN[Su(NPN)2][GlyLys]2[ε-CBz]2[Lys]2[PEG570]4 將[Boc]NEOEOEN[Su(NPN)2][GlyLys]2[ε-CBz]2[Lys]2[PEG570]4懸浮于20％TFA/DCM中，并室溫下攪拌1小時(shí)。除去揮發(fā)物得到產(chǎn)物。
xiii.[ClCH2CO]NEOEOEN[Su(NPN)2][GlyLys]2[ε-CBz]2[Lys]2[PEG570]4 向[TFA.NH2]EOEOEN[Su(NPN)2][GlyLys]2[ε-CBz]2[Lys]2[PEG570]4在緩沖溶液(100mL 0.1M Na2HPO4；100mL 0.1M HCl，pH～8.5)中形成的溶液中加入氯乙酰氯。攪拌2小時(shí)，通過(guò)HPLC/MS可檢測(cè)到產(chǎn)物[ClCH2CO]NEOEOEN[Su(NPN)2][GlyLys]2[ε-CBz]2[Lys]2[PEG570]4。
xiv.NDP-2-MSH-CH2CO NEOEOEN[Su(NPN)2][GlyLys]2[ε-CBz]2[Lys]2[PEG570]4 向過(guò)量的巰基-NDP-α-MSH(巰基-Ser-Tyr-Ser-Nle-His-DPhe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2)加入新鮮制備的[ClCH2CO]NEOEOEN[Su(NPN)2][GlyLys]2[ε-CBz]2[Lys]2[PEG570]4在0.1M正磷酸氫鈉/0.1M HCl(pH 8.5)緩沖溶液中形成的溶液。在室溫下攪拌16小時(shí)后，通過(guò)HPLC-MS應(yīng)該在反應(yīng)混合物中檢測(cè)到綴合的產(chǎn)物。
實(shí)施例5 [生物素]NEOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]16[COCH2O-3，6-Naph(SO3Na)2]32 i.[生物素]NEOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]16[Boc]32 將PyBOP(20mg，0.04mmol)加入到[NH2]EOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]16[Boc]32(實(shí)施例1xiii)(109mg，0.015mmol)在DMF/DMSO(1∶1)(3ml)中形成的經(jīng)攪拌的溶液中。逐漸加入生物素-NHS酯(13mg，0.38mmol)和DIPEA(40μL，0.23mmol)在DMF/DMSO(1∶1)(2mL)中形成的溶液。在室溫下攪拌混合物16小時(shí)。將反應(yīng)混合物到入MeCN(300mL)中，形成沉淀。通過(guò)過(guò)濾收集沉淀，并在真空中干燥得到白色固體狀的[生物素]NEOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]16[Boc]32(119mg，106％)。HPLC(疏水/TFA)Rt＝10.9min；ESI MS(+ve)m/z＝1910.02(M-4H)4+；1528.33(M-5H)5+.使用最大熵計(jì)算對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行去卷積得到MW＝7638[M+]；C366H665N67O100S(H form)[M+]的計(jì)算m/z7636.76。
ii.[生物素]NEOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]16[NH2.TFA]32 將TFA和DCM(1∶1)(2mL)的溶液逐滴加入到[生物素]NEOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]16[Boc]32(56mg，0.007mmol)在DCM(3mL)中形成的經(jīng)攪拌懸浮液中。室溫下攪拌混合物14小時(shí)。在減壓下除去溶劑并將殘余物與乙醚(3×10mL)一起研磨。在真空下干燥產(chǎn)物得到白色固體狀的[生物素]NEOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]16[NH2.TFA]32。HPLC(親水/TFA)Rt＝4.35min；ESI MS(+ve)m/z＝1478.96(M-3H)3+；1109.38(M-4H)4+；887.70(M-5H)5+；739.84(M-6H)6+。使用最大熵計(jì)算對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行去卷積得到MW＝4433[M+]，(H form)；C206H409N67O36S(H form)[M+]的計(jì)算m/z4433.01。
iii.[生物素]NEOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]16[COCH2O-3，6-Naph(SO3Na)2]32 將PyBOP(0.26g，0.50mmol)加入到[生物素]NEOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]16[NH2.TFA]32(56mg，0.007mmol)在DMF/DMSO(1∶1)(6mL)中形成的經(jīng)攪拌的溶液中。逐漸加入HOCOCH2O-3，6-Naph(SO3Na)2(0.21g，0.53mmol)和DIPEA(0.4mL，2.30mmol)在DMF/DMSO(1∶1)(5mL)中形成的溶液。室溫下攪拌混合物16小時(shí)。將反應(yīng)混合物倒入水(0.2L)中并過(guò)濾。在Centramate(2K膜，0.5L樣品池)上通過(guò)切向流過(guò)濾進(jìn)行純化。在最初用Milli-Q水(5L)洗滌后，用兩等分試樣的1M Na2SO4(100mL)洗滌滯留物，期間通過(guò)Milli-Q水洗滌(1L)隔開(kāi)，然后繼續(xù)過(guò)濾直至濾液pH為中性(約5L)。在真空下濃縮滯留物，冷凍干燥得到白色固體狀的[生物素]NEOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]16[COCH2O-3，6-Naph(SO3Na)2]32(80mg，68％)。HPLC/MS(離子配對(duì))Rt＝8.74min；ESI MS(-ve)m/z＝1544.32(M-10H)10-；1403.91(M-11H)11-；1286.51(M-12H)12-；1187.62(M-13H)13-；1102.86(M-14H)14-；1029.21(M-15H)15-；964.96(M-16H)16-；907.83(M-17H)17-；857.56(M-18H)18-；812.29(M-19H)19-；771.62(M-20H)20-；734.82(M-21H)21-；701.41(M-22H)22-；670.74(M-23H)23-；642.88(M-24H)24-；617.15(M-25H)25-；593.49(M-26H)26-；571.50(M-27H)27-。使用最大熵計(jì)算對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行去卷積得到MW＝15453[M-](H form)；C590H665N67O292S65(H form)[M-]的計(jì)算m/z15451。
實(shí)施例6 [生物素]NEOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]16[CO-3，5-Ph(SO3Na)2]32 將PyBOP(0.23g，0.44mmol)加入到[生物素][NEOEOEN(Su(NPN)2][Lys]16[NH2.TFA]32(實(shí)施例5ii)(48mg，0.006mmol)在DMF/DMSO(1∶1)(6mL)總形成的經(jīng)攪拌的溶液中。逐漸加入4-磺基苯甲酸(0.12g，0.60mmol)和DIPEA(0.3mL，1.72mmol)在DMF/DMSO(1∶1)(5mL)形成的溶液。在室溫下攪拌混合物16小時(shí)。將反應(yīng)混合物倒入水(0.2L)中并過(guò)濾。在Centramate(1K膜，0.5L樣品池)上通過(guò)切向流過(guò)濾進(jìn)行純化。在最初用Milli-Q水(5L)洗滌后，用兩等分試樣的1M Na2CO3(100mL)洗滌滯留物，期間通過(guò)Milli-Q水洗滌(1L)隔開(kāi)，然后繼續(xù)過(guò)濾直至濾液pH為中性(約5L)。在真空下濃縮滯留物，冷凍干燥得到白色固體狀的[生物素]NEOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]16[Ph-3，5-(SO3Na)2]32(103mg，123％)。HPLC/MS(離子配對(duì))Rt＝8.60min；ESI MS(-ve)m/z＝919.70(M-14H)14-；858.30(M-15H)15-；804.56(M-16H)16-；757.08(M-17H)17-；715.01(M-18H)18-；677.48(M-19H)19-；643.61(M-20H)20-。使用最大熵計(jì)算對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行去卷積得到MW＝12889[M-](H form)；(C430H537N67O260S65)(H form)[M-]的計(jì)算m/z12888。
實(shí)施例7 [生物素]NEOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]8[COCH2O-3，6-Naph(SO3Na)2]16 i.[生物素]NEOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]8[Boc]16 將PyBOP(20mg，0.04mmol)加入到[NH2]EOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]8[Boc]16(實(shí)施例7i)(55mg，0.015mmol)在DMF(1∶1)(3mL)中形成的經(jīng)攪拌的溶液中。逐漸加入生物素-NHS酯(13mg，0.38mmol)和DIPEA(20μL，0.12mmol)在DMF(1mL)中形成的溶液中。室溫下攪拌混合物16小時(shí)。將反應(yīng)混合物倒入MeCN(0.2L)中，形成沉淀。通過(guò)過(guò)濾收集沉淀并在真空下干燥得到白色固體狀的[生物素]NEOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]8[Boc]16(34mg，58％)。HPLC(疏水/TFA)Rt＝8.27min；ESI MS(+ve)m/z＝1328.87[(M-3H)3+]；996.98[(M-4H)4+].使用變換計(jì)算對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行去卷積得到MW＝3984[M+]；C190H345N35O52S(H form)[M+]的計(jì)算m/z3984.10. ii.[生物素]NEOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]8[NH2.TFA]16 將TFA和DCM(1∶1)(2mL)的溶液逐滴加入到[生物素]NEOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]8[Boc]16(34mg，0.009mmol)在DCM(3mL)中形成的經(jīng)攪拌懸浮液中。在室溫下攪拌混合物14小時(shí)。在減壓下除去溶劑并將殘余物與乙醚(3×10mL)一起研磨。在真空下干燥產(chǎn)物得到白色固體狀的[生物素]NEOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]8[NH2.TFA]16。HPLC(親水/TFA)Rt＝4.27min；ESI MS(+ve)m/z＝1191.87[(M-2H)2+]；795.03[(M-3H)3+]；596.44[(M-4H)4+]；477.23[(M-5H)5+]。使用最大熵計(jì)算對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行去卷積得到MW＝2382[M+](H form)；C110H217N35O20S(H form)[M+]的計(jì)算m/z2382.22。
iii.[生物素]NEOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]8[COCH2O-3，6-Naph(SO3Na)2]16 將PyBOP(0.16g，0.31mmol)加入到[生物素]NEOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]8[NH2.TFA]16(20mg，0.009mmol)在DMF/DMSO(1∶1)(4mL)中形成的經(jīng)攪拌的溶液中。逐漸加入HOCOCH2O-3，6-Naph(SO3Na)2(0.12g，0.28mmol)和DIPEA(0.2mL，1.15mmol)在DMF/DMSO(1∶1)(2ml)中形成的溶液。在室溫下攪拌混合物16小時(shí)。將反應(yīng)混合物倒入水(0.25L)中并過(guò)濾。在Centramate(2K膜，0.5L樣品池)上通過(guò)切向流過(guò)濾進(jìn)行純化。在最初用Milli-Q水(5L)洗滌后，用兩等分試樣的1M Na2CO3(100mL)洗滌滯留物，期間通過(guò)Milli-Q水洗滌(1L)隔開(kāi)，然后繼續(xù)過(guò)濾直至濾液pH為中性(約5L)。在真空下濃縮滯留物，冷凍干燥得到白色固體狀的[生物素]NEOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]8[COCH2O-3，6-Naph(SO3Na)2]16(69mg，94％)。HPLC/MS(離子配對(duì))Rt＝10.8min；ESI MS(-ve)m/z＝1314.25(M-6H)6-；1126.54(M-7H)7-；985.30(M-8H)8-；875.91(M-9H)9-；787.96(M-10H)10-；716.35(M-11H)11-；656.60(M-12H)12-；605.97(M-13H)13-；562.90(M-14H)14-；525.03(M-15H)15-。使用最大熵計(jì)算對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行去卷積得到MW＝7891[M-](H form)；C302H345N35O148S33(H form)[M-]的計(jì)算m/z7891.39.CE(pH 9)；Rt＝8.00min75.5％的純度。
實(shí)施例8 [p-NO2-CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]2[Su(NPN)2(PEG1100)(MTX-α-OtBu)]4 在0℃下，向Su(NPN)2(PEG1100)(MTX-α-OtBu)(75mg，41.2μmol)和[p-NO2-CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]2[NH2.TFA]4(8.4mg，8.2μmol)在DMF(3.0mL)中形成的經(jīng)攪拌的混合物中加入PyBop(23mg，44μmol)和DIPEA(29μL，0.16mmol)。將混合物在0℃下放置30分鐘，然后回溫至室溫過(guò)夜。除去溶劑并通過(guò)PREP HPLC(Waters XTerra Prep RP18 10μm，19×250mm，5-45％ ACN/H2O，然后保持15-55min，0.1％TFA，Rt＝58min)純化粗產(chǎn)物得到40mg(74％)所需產(chǎn)物，為粘性黃色油狀物。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ(ppm)1.48(s，OtBu，36H)，1.54-1.95(復(fù)合物，Lys(3×CH2)+NPN(2×CH2)，32H)；2.05-2.32(復(fù)合物，Glu(CH2)，8H)；2.34-2.78(復(fù)合物，琥珀酰(CH2)2+PEG-CH2+Glu(CH2)，36H)；3.06-3.48(復(fù)合物，NPN(4×CH2)+PEG-Me+N-Me+Lys(N-CH2)，68H)；3.50-4.06(復(fù)合物，PEG-OCH2，388H)；4.20-4.28(復(fù)合物，Lys(α-CH)，2H)，4.40-4.48(復(fù)合物，Glu(α-CH)，4H)；4.94(s，N-CH2，8H)；5.20(s，CBz-CH2，2H)；6.87(d，8.7Hz，MTX，8H)；7.58(d，8.4Hz，p-NO2-CBz，2H)；7.78(d，8.7Hz，MTX，8H)；8.20(d，8.4Hz，p-NO2-CBz，2H)；8.68(s，MTX，4H)。HPLC(親水/TFA)Rt＝9.58min；ESI MS(+ve)8,019[M+H+]；C372H645N54O134[M+H+]的計(jì)算m/z 8,018.38。
實(shí)施例9 [CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]4[Su(NPN)2(PEG570)(MTX-α-OtBu)]8 在0℃下，向Su(NPN)2(PEG570)(MTX-α-OtBu)(36mg，27.8μmol)和[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]4[NH2.TFA]8(6.0mg，2.8μmol)在DMF(2.0mL)中形成的經(jīng)攪拌的混合物中加入PyBop(16mg，30.6μmol)和DIPEA(16μL，89μmol)。將混合物在0℃下放置30分鐘，然后回溫至室溫過(guò)夜。除去溶劑并通過(guò)PREP HPLC(Waters XTerra Prep RP18 10μm，19×250mm，5-45％MeCN/H2O，然后保持15-55min，0.1％TFA，Rt＝58min)純化粗產(chǎn)物得到17mg(53％)所需產(chǎn)物，為粘性黃色油狀物。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ(ppm)1.16-1.56(復(fù)合物，Lys(3×CH2)+NPN(2×CH2)+OtBu，150H)；2.02-2.27(復(fù)合物，Glu(CH2)，16H)；2.30-2.75(復(fù)合物，琥珀酰(CH2)2+PEG-CH2+Glu(CH2)，68H)；3.00-3.42(復(fù)合物，NPN(4×CH2)+PEG-Me+N-Me+Lys(N-CH2)，134H)；3.43-3.88(復(fù)合物，PEG-OCH2，380H)；4.04-4.32(復(fù)合物，Lys(α-CH)，7H)，4.34-4.50(復(fù)合物，Glu(α-CH)，8H)；4,91(s，N-CH2，16H)；5.03(s，CBz-CH2，2H)；6.83(d，8.7Hz，MTX，16H)；7.28(br s，CBz，5H)；7.75(d，8.7Hz，MTX，16H)；8.64(s，MTX，8H)。HPLC(親水/TFA)Rt＝9.41min；ESI MS(+ve)11，477.42[M+H+]；C540H890N105O164[M+H+]的計(jì)算m/z 11,477.44。
備選/關(guān)鍵中間體 實(shí)施例10 [CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[NH2.TFA]32 將[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[Boc]32(實(shí)施例1xii)(389mg，51.6μmol)溶于乙酸(1.9mL)中并在冰浴中冷卻攪拌的溶液直至乙酸開(kāi)始凍結(jié)。除去冰浴并小心加入TFA直至所述乙酸恰好融化。再次將攪拌的溶液置于冰浴中并加入剩下的TFA(所使用的TFA的總量為1.9mL，24.8mmol)。除去冰浴并在室溫下攪拌所述溶液21小時(shí)。在真空下蒸發(fā)TFA和乙酸并將水(5mL)加入到油殘余物中。然后在真空下濃縮所述溶液并用更多的水(2×5mL)重復(fù)該步驟。將最終的油溶于水(5mL)中，過(guò)濾溶液并冷凍干燥得到[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[NH2.TFA]32(397mg，96％)，為無(wú)定形白色固體。1H-NMR(300MHz，D2O)δ(ppm)1.20-1.65(復(fù)合物，92H)；1.65-1.85(復(fù)合物，62H)；1.85-2.05(復(fù)合物，30H)；2.51(m，2H)；2.61(m，2H)；2.95-3.10(復(fù)合物，34H)；3.10-3.45(復(fù)合物，38H)；3.55-3.70(復(fù)合物，8H)；3.94(t，J＝6.6Hz，8H)；4.05(t，J＝6.6Hz，8H)；4.15-4.28(復(fù)合物，8H)；4.28-4.39(復(fù)合物，6H)；5.00(s，2H)；7.32-7.49(復(fù)合物，5H)；HPLC(親水/TFA)Rt＝8.8min；ESI MS(+ve)1447.8[M+3H]3+/3，1086.1[M+4H]4+/4，868.9[M+5H]5+/5，724.3[M+6H]6+/6；C204H404N65O363+[M+3H]3+的計(jì)算m/z1447.1，C204H405N65O364+[M+4H]4+的計(jì)算m/z1085.6，C204H406N65O365+[M+5H]5+的計(jì)算m/z868.6，C204H407N65O366+[M+6H]6+的計(jì)算m/z724.0。
實(shí)施例11 [CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2]2[Boc]4 向[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Boc]2(11.8g，17mmol)于乙酸(25mL)的溶液中加入TFA(25mL)。攪拌所述溶液10個(gè)小時(shí)然后用水(100mL)淬滅。在真空下除去溶劑并將所得的油狀殘余物溶于水(50mL)中，通過(guò)4.5μm的過(guò)濾器過(guò)濾，然后冷凍干燥。在DMF(100mL)中溶解冷凍干燥的材料并向該溶液中加入TEA(19mL)和PNPO-Su(NPN)2-Boc2(20.7g，21mmol)在DMF(100mL)中形成的溶液。然后室溫下攪拌所述溶液過(guò)夜。然后向所述溶液中加入甘氨酸(2g)在水(120mL)中形成的溶液。在室溫下攪拌合并的溶液16個(gè)小時(shí)。在真空下除去溶劑并將所得黃色沉淀重新溶于EtOAc(200mL)中。然后用水(50mL)，0.5M HCl(50mL)和1M Na2CO3(4×50mL)洗滌該溶液。然后用Na2SO4干燥所述有機(jī)層并在真空下除去溶劑。然后通過(guò)硅膠色譜純化所得的黃色油得到澄清的粘性油(18.5g，14mmol，82％)。ESI MS(+ve)562[(M+2H+-2Boc)/2]；C64H111N11O18[M+H]的計(jì)算m/z1323.63。
實(shí)施例12 [CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2]4[Boc]8 向[CBz]NEOEOEN[Su(NPN2]2[Boc]4(12.8g，9.7mmol)在乙酸(50mL)中形成的溶液中加入TFA(50mL)。在室溫下攪拌該溶液過(guò)夜，然后真空除去溶劑得到澄清的粘性油。將所述油溶于DMF(75mL)并向該溶液中加入TEA(28mL)和PNPO-Su(NPN)2-[Boc]2(25.7g，47mmol)的漿液。室溫下攪拌所述反應(yīng)混合物過(guò)夜。向所述反應(yīng)混合物中加入甘氨酸(2g)在水(60mL)中形成的溶液。攪拌合并的溶液16個(gè)小時(shí)。真空下除去溶劑并將所得的黃色沉淀重新溶于EtOAc(400mL)。然后用水(50mL)、0.5M HCl(2×50mL)和1M Na2CO3(5×50mL)洗滌所述溶液。然后用Na2SO4干燥有機(jī)層并在真空下除去溶劑得到黃色泡沫狀物(24g，9.3mmol，96％)。然后通過(guò)硅膠色譜(MeOH/DCM梯度)純化該材料的一部分(22.5g)得到白色泡沫狀物(15g，5.8mmol，66％)。ESI MS(+ve)1289[(M+2H+)/2]；760[(M+3H+-3Boc)/3]；C124H219N23O34[M+H]的計(jì)算m/z2577.3。
實(shí)施例13 [CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2]8[Boc]16 向1∶1乙酸/TFA(100ml)溶液中加入[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2]4[Boc]8(12g，4.7mmol)。室溫下攪拌反應(yīng)混合物20個(gè)小時(shí)。真空下除去溶劑并在DMF(150mL)中重新溶解澄清的殘余物。向該溶液中加入TEA(42mL)和在DMF(75mL)的PNPO-Su(NPN)2-Boc2(24.9g，45mmol)的漿液。室溫下攪拌反應(yīng)混合物過(guò)夜。真空下除去溶劑并將所得的黃色沉淀重新溶于EtOAc(2L)中。然后用鹽水(2×50mL)、1M Na2CO3(2×1mL)洗滌該溶液。真空下除去溶劑得到黃色的油。ESI MS(+ve)1695[(M+3H+)/3]；1272[(M+4H+)/4]；1018[(M+5H+)/5]；C244H435N47O66[M+H]的計(jì)算m/z5084.3。
權(quán)利要求
1.一種大分子，其包含
(i)核心部分，其具有用于與第一功能部分連接的第一氨基氮原子，以及用于與賴(lài)氨酸或賴(lài)氨酸類(lèi)似物構(gòu)造單元連接的至少兩個(gè)其他的氨基氮原子；
(ii)第一功能部分，其通過(guò)所述的第一氨基氮原子與所述的核心部分連接；
(iii)至少一層賴(lài)氨酸或賴(lài)氨酸類(lèi)似物構(gòu)造單元，其最外層具有用于與一個(gè)或多個(gè)第二功能部分連接的表面氨基氮原子，這些所述的層通過(guò)所述的核心部分的至少兩個(gè)其他氨基氮原子而與所述的核心部分連接；以及
(iv)一個(gè)或多個(gè)第二功能部分，其與賴(lài)氨酸或賴(lài)氨酸類(lèi)似物構(gòu)造單元的最外層的表面氨基氮原子連接；
其中
所述的第一和第二功能部分均包含選自藥學(xué)活性試劑、相互作用試劑和藥代動(dòng)力學(xué)改性劑試劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的大分子，其中所述的構(gòu)造單元選自
賴(lài)氨酸*1，其具有以下結(jié)構(gòu)
甘氨酰-賴(lài)氨酸*2，其具有以下結(jié)構(gòu)
類(lèi)似物3，其具有以下結(jié)構(gòu)，其中a為整數(shù)1或2；而b和c獨(dú)立地為整數(shù)1、2、3或4，
類(lèi)似物4，其具有以下結(jié)構(gòu)，其中a為整數(shù)0、1或2；而b和c獨(dú)立地為整數(shù)2、3、4、5或6，
類(lèi)似物*5，其具有以下結(jié)構(gòu)，其中a為整數(shù)0、1、2、3、4或5；而b和c獨(dú)立地為整數(shù)1、2、3、4或5，
類(lèi)似物6，其具有以下結(jié)構(gòu)，其中a為整數(shù)0、1、2、3、4或5；而b和c獨(dú)立地為整數(shù)0、1、2、3、4或5，
類(lèi)似物7，其具有以下結(jié)構(gòu)，其中a為整數(shù)0、1、2、3、4或5；而b和c獨(dú)立地為整數(shù)1、2、3、4或5，
類(lèi)似物8，其具有以下結(jié)構(gòu)，其中a為整數(shù)0、1、2、3、4或5；而b、c和d獨(dú)立地為整數(shù)1、2、3、4或5，
類(lèi)似物9，其具有以下結(jié)構(gòu)，其中a為整數(shù)0、1、2、3、4或5；而b和c獨(dú)立地為整數(shù)1、2、3、4或5，
其中，所述構(gòu)造單元的任何亞甲基都可以被亞甲氧基(CH2-O)或亞乙氧基(CH2-CH2-O)替代，前體條件是這種替代不會(huì)導(dǎo)致在所述的構(gòu)造單元內(nèi)形成碳酸酯(-O-C(O)-O-)或氨基甲酸酯(-O-C(O)-N-)部分。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的大分子，其中所述的構(gòu)造單元選自賴(lài)氨酸1、甘氨酰-賴(lài)氨酸2或賴(lài)氨酸類(lèi)似物5
其中a為整數(shù)0、1或2，并且其中1、2或5的任何亞甲基可以被亞甲氧基或亞乙氧基替代，前體條件是這種替代不會(huì)導(dǎo)致在所述的構(gòu)造單元內(nèi)形成碳酸酯或氨基甲酸酯部分。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任意一項(xiàng)中的大分子，其中所述的核心為三氨基化合物，該化合物得自賴(lài)氨酸或賴(lài)氨酸類(lèi)似物與二氨基化合物的一個(gè)氨基氮原子的反應(yīng)，其中所述的二氨基化合物選自
其中a為1-9的整數(shù)，例如1、2、3、4或5，
其中a、b和c獨(dú)立地為整數(shù)1、2、3、4或5，例如2或3；而d為0-100的整數(shù)，例如1-30，特別是1-5、6-10、11-15、16-20、21-25或26-30，
其中a和b獨(dú)立地為整數(shù)0、1、2、3、4或5，
其中a和c獨(dú)立地為整數(shù)1、2、3、4、5或6，并且其中c為整數(shù)0、1、2、3、4、5或6，
其中a和d獨(dú)立地為整數(shù)1、2、3、4、5或6，并且其中b和c獨(dú)立地為整數(shù)0、1、2、3、4、5或6。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的大分子，其中所述的二氨基化合物選自
其中a為整數(shù)1、2、3、4或5，
其中a、b和c獨(dú)立地為整數(shù)2或3；而d為1-30的整數(shù)，
其中a和d獨(dú)立地為整數(shù)1或2；而b和c獨(dú)立地為整數(shù)0、1或2。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的大分子，其中所述的核心得自化合物11和類(lèi)似物5，在化合物11中a、b、c和d均為1，而在類(lèi)似物5中a、b和c均為2。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-4的任意一項(xiàng)中的大分子，其中所述的核心為三氨基化合物或四氨基化合物，或者四氨基化合物或五氨基化合物，其中所述的四氨基化合物或五氨基化合物得自賴(lài)氨酸或賴(lài)氨酸類(lèi)似物與三氨基化合物或四氨基化合物的一個(gè)氨基氮原子的反應(yīng)，其中所述的三氨基化合物和所述的四氨基化合物選自
其中a、b和c獨(dú)立地為整數(shù)1、2、3、4、5或6，
其中a、b和c獨(dú)立地為整數(shù)0、1、2、3、4、5或6，
其中a、b和c獨(dú)立地為整數(shù)0、1、2、3、4、5或6，
其中a、b和c獨(dú)立地為整數(shù)0、1、2、3、4、5或6；而d、e和f獨(dú)立地為整數(shù)1、2、3、4、5或6，
其中a、b、c和d獨(dú)立地為整數(shù)0、1、2、3、4、5或6，
其中a、b、c和d獨(dú)立地為整數(shù)1、2、3、4、5或6，
其中a、b、c和d獨(dú)立地為整數(shù)0、1、2、3、4、5或6；而e、f、g和h獨(dú)立地為整數(shù)1、2、3、4、5或6。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的大分子，其中所述的三氨基化合物或四氨基化合物選自
其中a、b和c可以相同或不同，并且為整數(shù)1至2，
其中a、b和c獨(dú)立地為整數(shù)0、1或2；而d、e和f獨(dú)立地為整數(shù)1或2，
或者四胺化合物
其中a、b、c和d獨(dú)立地為整數(shù)0或1，
其中a、b、c和d獨(dú)立地為整數(shù)1或2，
其中a、b、c和d獨(dú)立地為整數(shù)0、1或2；而e、f、g和h獨(dú)立地為1或2。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8的任意一項(xiàng)中的大分子，其包含1、2、3、4或5層構(gòu)造單元。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的大分子，其包含2、3或4層構(gòu)造單元。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10的任意一項(xiàng)中的大分子，其在所述的表面上進(jìn)一步包含至少一個(gè)第三功能部分。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11的任意一項(xiàng)中的大分子，其中每個(gè)表面氨基氮原子均與功能部分連接。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12的任意一項(xiàng)中的大分子，其中所述第一功能部分包括藥學(xué)活性試劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13的任意一項(xiàng)中的大分子，其中所述第二功能部分包括藥學(xué)活性試劑。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的大分子，其中所述藥學(xué)活性試劑是肽。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-12的任意一項(xiàng)中的大分子，其中第一和/或第二，和/或任選地第三功能部分包括藥代動(dòng)力學(xué)改性劑。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的大分子，其中所述藥代動(dòng)力學(xué)改性劑是聚乙二醇。
18.根據(jù)權(quán)利要求1的大分子，其中第一和/或第二功能部分是相互作用試劑。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-12的任意一項(xiàng)中的大分子，其具有如表1所定義的功能部分的組合。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-19的任意一項(xiàng)中的大分子，其中一種或多種功能部分通過(guò)連接體與所述的核心或表面氨基氮原子連接。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的大分子，其中所述連接體是具有1-100個(gè)重復(fù)單元的聚乙二醇連接體。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-21的任意一項(xiàng)中的大分子，其中第一核心或表面氮原子和/或任何連接體和/或所述的功能部分通過(guò)改性基團(tuán)改性，從而有助于連接。
23.根據(jù)權(quán)利要求21的大分子，其中改性劑基團(tuán)可以選自馬來(lái)酰亞胺、鹵代乙酰胺、酰肼、烷氧基胺或3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯。
24.一種組合物，其包括根據(jù)權(quán)利要求1-23的任意一項(xiàng)中的大分子，及其至少一種可藥用的賦形劑、載體或佐劑。
25.根據(jù)權(quán)利要求1的大分子在治療中的用途。
全文摘要
本發(fā)明總體上涉及分支大分子及其作為成像劑或造影劑的用途。具體而言，本發(fā)明涉及由賴(lài)氨酸或賴(lài)氨酸類(lèi)似物衍生而來(lái)并具有多個(gè)功能部分的樹(shù)狀聚體，本發(fā)明還涉及所述大分子的用途，特別是在治療應(yīng)用中的用途，以及包含其的組合物。
文檔編號(hào)A61K38/07GK101516969SQ200780035348
公開(kāi)日2009年8月26日 申請(qǐng)日期2007年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月11日
發(fā)明者G·Y·克里普納, C·C·威廉姆斯, B·D·凱利, S·A·漢德森, 吳澤民, P·拉茲諾 申請(qǐng)人:星藥股份有限公司