專利名稱：細(xì)胞-基質(zhì)微球，制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及細(xì)胞-基質(zhì)(cell-matrix)微球、相關(guān)產(chǎn)品、制備方 法和應(yīng)用。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及制備細(xì)胞-基質(zhì)微球的方法和固定 (immobilizing)活細(xì)胞的方法，培養(yǎng)這些細(xì)胞的方法和工藝；以更有效 和經(jīng)濟(jì)的方式用這些微球作為治療物、作為三維(3D)微載體的方法和 工藝，以及制備生物分子(例如治療性蛋白)的方法和工藝。
背景技術(shù)：
通過(guò)在缺陷部位用微注射針頭進(jìn)行局部注射，基于細(xì)胞的療法提 供了最小侵入性途徑，為組織修復(fù)和再生性醫(yī)療提供了可靠的方法。 然而，在成功地實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用之前，需要解決一些技術(shù)難題，所述技 術(shù)難題與注射的細(xì)胞的定位、長(zhǎng)期存活性、宿主組織整合和功能重塑 有關(guān)(Tatard等，Curr. Drug Targets, 6(1):81畫(huà)96(2005); Tatard等， B腿aterials, 26(17):3727-37(2005); Pittenger和Martin, Circ. Res., 95(1): 9-20(2004); Bonaros等，Panminerva Med. 4(1): 13-23(2004)),也與載 體的可注射性和機(jī)械穩(wěn)定性有關(guān)(Crevensten等，Ann. Biomed Eng., 32(3):430-4(2004))。
微膠嚢化是將細(xì)胞局限在半透膜或類似固體中。它已被使用了許 多年，以在同種異體(allogemc)或異種(xenogenic)細(xì)胞移植中有助于免 疫分離(Uludag等,Adv. Drug Deliv. Rev., 42(l曙2):29-64(2000); Orive 等，Trends Biotechnol., 22(2):87-92(2004))。藻酸鈉在該領(lǐng)域占統(tǒng)治地 位，但也可使用其他材料，例如瓊脂糖(Batorsky等，Biotechnol. Bioeng., 92(4):492-500 (2005))和聚乙二醇(PEG) (Nuttelman等，Matrix Biol, 24(3):208-l8 (2005))。上述材料如果未經(jīng)修飾的話，并不能支持細(xì)胞粘
5連(attachment)和生長(zhǎng)(Grohn等，Biotechniques, 22(5):970-5 (1997); Zimmermann等，Biomaterials, 24(12):2083-96 (2003); Nuttelman等， Matrix Biol., 24(3):208-18 (2005》,因此需要補(bǔ)充天然的細(xì)胞外基質(zhì)(例 如膠原)加以改良(Grohn等，Biotechniques, 22(5):970-5 (1997); Batorsky 等，Biotechnol. Bioeng., 92(4):492-500 (2005))。此外，由于這些系統(tǒng)避 免了遞送的細(xì)胞與宿主組織直接接觸，它們不能使細(xì)胞遷移和滲透。 這阻止了它們用于再生性醫(yī)療和組織工程，而再生性醫(yī)療和組織工程 需要細(xì)胞水平的宿主-移植物整合。天然細(xì)胞外基質(zhì)(例如膠原、纖維 蛋白和透明質(zhì)酸)是支持細(xì)胞生長(zhǎng)的合適材并牛(Yannas,天然材料, Ratner等編，生物材料-醫(yī)用材料入門(Biomaterials Sciences -An introduction to materials in medicine), California, Academic Press, pp. 84-93 (1996))。然而，沒(méi)有針對(duì)這些材料的凝:膠嚢系統(tǒng)，因?yàn)檫@些 材料的機(jī)械和形狀穩(wěn)定性差(Yannas,天然材料，Ratner等編，生物材料 -醫(yī)用材泮牛入門，California, Academic Press, pp.84-93 (1996); Crevensten 等，Ann. Biomed. Eng.， 32(3):430-4 (2004); Zhang等，Appl. Biochem. Biotechnol., 134(1):61-76(2006)),與現(xiàn)有的微膠嚢技術(shù)不相容(Uludag 等，Adv. Drug Deliv. Rev., 42(l-2):29-64 (2000))。
現(xiàn)有的微膠嚢技術(shù)包括用油相形成乳液，用定制(custom-made)微 滴生成器在攪拌的收集浴液(b ath)中生成含細(xì)胞的微滴，或用微注射器 將細(xì)胞注射到預(yù)先形成的基質(zhì)微球或微嚢中(Grohn等，Biotechniques, 22(5):970-5 (1997); Batorsky等，Biotechnol. Bioeng., 92(4):492誦500 (2005))。然而，當(dāng)基質(zhì)材料濃度低時(shí)，這些方法會(huì)遇到問(wèn)題，或者對(duì) 于例如膠原凝膠或透明質(zhì)酸凝膠而言形狀和機(jī)械穩(wěn)定性差。首先，形 成的細(xì)胞-基質(zhì)微滴或乳液難以抵抗在乳化過(guò)程中攪拌或在液體收集 浴液中攪拌產(chǎn)生的剪切應(yīng)力。其次，在加入細(xì)胞-基質(zhì)相之后立即需要 攪拌，以在乳化過(guò)程中與油相充分混合，并且在微滴產(chǎn)生過(guò)程中防止 細(xì)胞-基質(zhì)微滴融合在一起。如果基質(zhì)的相變需要較長(zhǎng)時(shí)間，并且分裂 微球，會(huì)使細(xì)胞-基質(zhì)微球得不到足夠的形成時(shí)間，導(dǎo)致膠嚢化效率降 低。
生物技術(shù)普遍采用具有生物合成能力的活的生物體進(jìn)行有用生物 分子(例如治療性蛋白)的大的、工業(yè)規(guī)^t的生產(chǎn)。雖然大腸桿菌和酵母已被用于此目的，但所得到的分子可能與天然產(chǎn)物不同，因?yàn)檫@ 些微生物缺少同時(shí)(CO-)和在后修飾機(jī)制。因此，對(duì)蛋白和疫苗而言， 哺乳動(dòng)物細(xì)胞是特別好的來(lái)源。在懸液中培養(yǎng)細(xì)胞可獲得高的效率、 降低成本，有利于大量生產(chǎn)治療性蛋白。然而，不是所有細(xì)胞都能在 懸液中成功生長(zhǎng)，只有例如雜交瘤和腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞才可以。微載體 技術(shù)已被開(kāi)發(fā)了幾十年，以通過(guò)提供顯著增加的表面積實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的
3D培養(yǎng)，這對(duì)于貼壁依賴型真核細(xì)胞是特別有利的。早至70年代微 載體就已被用于大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)。第一代微載體CYTODEX (帶有 陽(yáng)離子表面的葡聚糖微球)通過(guò)顯著提高細(xì)胞結(jié)合的總表面積，被用 于擴(kuò)大細(xì)胞培養(yǎng)。該技術(shù)在80年代得到發(fā)展，包括了膠原包被的葡聚 糖微珠，使細(xì)胞更好地粘附和生長(zhǎng)，得到更高產(chǎn)率。有這樣一個(gè)趨勢(shì)， 即用細(xì)胞的天然細(xì)胞外基質(zhì)包被固體微載體或與之混合，例如膠原包 被的藻酸微珠(Grohn等，Biotechniques, 22(5):970-5 (1997))、明膠 (gelatm)包被的聚乳酸-乙醇酸(PLGA)微珠(Voigt等，Tissue Eng.， 8(2):263-72 (2002))和明膠-幾丁質(zhì)組合物微珠(Li等，Biotechnol. Lett, 26(11):879-83 (2004)),或者與主導(dǎo)細(xì)胞粘附(adhesion)和粘連的天然肽 序列交聯(lián)，例如RGD修飾的聚乙二醇(Nuttelman等，Matrix Biol., 24(3):208-18 (2005))，以促進(jìn)細(xì)胞粘附和生長(zhǎng)。這導(dǎo)致開(kāi)發(fā)出了新一代 的微載體CULTISPHER ,該微載體或者是實(shí)心的(Liu等，Cell Transplant, 13(7-8): 809-16 (2004))或者是多孑L的(Bancel和Hu, Biotechnol. Prog., 12(3)398-402 (1996))明膠微珠；以及CELLAGEN , 它是多孔的膠原微珠(Overstreet等，In Vitro Cell Dev. Biol. Anim., 39(5-6):228-34 (2003))。然而，這些系統(tǒng)使用了技術(shù)上要求高的制備微 珠的技術(shù)，使得商業(yè)制造的成本很高。微珠的制造必須與細(xì)胞粘附過(guò) 程分離，因?yàn)榇蠖鄶?shù)微珠制造系統(tǒng)采用了細(xì)胞無(wú)法存活的嚴(yán)苛的條件， 例如高溫、凍干、有機(jī)溶劑提取和化學(xué)交聯(lián)處理。此外，細(xì)胞粘連過(guò) 程是微載體培養(yǎng)系統(tǒng)的限速步驟(Sun等，J. Biosci, Bioeng.,卯(l):32-6
多孔微珠中:Bancel l Hu, Biotechnol. hog. , 12(3):398:02 (1996^)。因 此，使用天然細(xì)胞外基質(zhì)材料的簡(jiǎn)化的微珠制備過(guò)程會(huì)提高微載體培 養(yǎng)系統(tǒng)的效率、降低成本，所述簡(jiǎn)化的微珠制備過(guò)程不需要嚴(yán)苛的生產(chǎn)條件和長(zhǎng)時(shí)間的細(xì)胞粘連過(guò)程。
人們 一 般認(rèn)為3D培養(yǎng)為以不加限制的方式(Geserick等， Biotechnol. Bioeng., 69(3)266-74 (2000))、 大量地(Durrschmid等， Biotechnol. Bioeng., 83(6):681-6 (2003))快速繁殖細(xì)胞提供了平臺(tái)。然 而，活躍地、未受限地繁殖的細(xì)胞的生產(chǎn)率通常^[艮低，因?yàn)檫@些細(xì)胞 在它們的組織特異性微環(huán)境之外可能不會(huì)以最高速率來(lái)合成蛋白，而 且在活躍繁殖的細(xì)胞中，大多數(shù)代謝能量消耗在再生上而不是合成上 (Sanchez-Bustamante等，Biotechnol. Bioeng., 93(1): 169-180 (2005》。通 常用受控繁殖技術(shù)來(lái)提高細(xì)胞的蛋白生產(chǎn)率(授予Bailey等的美國(guó)專利 No. 6,274,341; Wurm, Nature Biotechnol, 2(11);1393-1398 (2004))，所 述受控繁殖:!支術(shù)例如使細(xì)^9包缺乏必需營(yíng)養(yǎng)素或添加DNA合成抑制劑 (Suzuki和Ollis, Biotechnol Prog., 6(3):231-6 (1990))，分離特定的細(xì)胞 系例如溫度敏感型CHO細(xì)胞(它在溫度變?yōu)?9。C時(shí)產(chǎn)生更多的蛋白) (Jenkins和Hovey, Biotechnol Bioeng., 42(9): 1029-36 (1993)),以及對(duì) 生長(zhǎng)循環(huán)控制基因進(jìn)行基因操作，例如過(guò)表達(dá)肺瘤抑制物基因 p53(Kastan等，Cancer Research, 51: 6304-11 (1991 ))、 p21 (Watanabe, Biotechnol Bioeng., 77: l畫(huà)7 (2002))和p27 (Coats等，Science, 272:877-80 (1996))。然而，這些繁殖控制策略導(dǎo)致細(xì)胞活性降低(Mercille等， Cytotechnology, 15(1陽(yáng)3);117-28 (1994))并且細(xì)胞凋亡增力口(Ko和Prives, Genes Den， 10(9): 1054-72 (1996))。細(xì)胞循環(huán)控制胂瘤抑制物與抗細(xì)胞 凋亡基因(例如bcl-2)的共表達(dá)已被用于改進(jìn)細(xì)胞活性問(wèn)題(授予 Bailey等的美國(guó)專利No. 6,274,341 )。然而,該系統(tǒng)要求對(duì)載體(vector) 系統(tǒng)進(jìn)行復(fù)雜的設(shè)計(jì)，以及復(fù)雜的基因操作，該操作從內(nèi)部干擾了細(xì) 胞代謝。此外，通過(guò)使用外部抑制劑-四環(huán)素開(kāi)關(guān)系統(tǒng)(Mazur等， Biotechnol. Bioeng., 65: 144-150 (1999)),實(shí)現(xiàn)了對(duì)雙相繁殖和生產(chǎn)循 環(huán)的自調(diào)節(jié)控制，以當(dāng)達(dá)到最適細(xì)胞密度時(shí)，保持可誘導(dǎo)的生長(zhǎng)阻滯 (growth-arresting)生產(chǎn)相，這樣可以達(dá)到長(zhǎng)達(dá)7天的增加生產(chǎn)率的更長(zhǎng) 時(shí)間窗。該系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)包括使用外部藥劑，不會(huì)干擾細(xì)胞的總體代謝， 但問(wèn)題在于消除抗生素的下游純化步驟、由基因操作帶來(lái)的基因不穩(wěn) 定性以及培養(yǎng)物中的四環(huán)素不穩(wěn)定性。近來(lái)，已開(kāi)發(fā)了使用掛滴 (hanging-drop)法的3D多細(xì)胞微組織培養(yǎng)，其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中增加
8了蛋白生產(chǎn)率(Sanchez隱Bustamante等，Biotechnol Bioeng., 93(1): 169-180 (2005))。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供制備細(xì)胞微載體的方法以及所得 的細(xì)胞基質(zhì)微載體，所述方法相對(duì)便宜、有效，并且有利于細(xì)胞存活、 受控繁殖和生物分子的生產(chǎn)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于細(xì)胞療法、組織工程和制造生物 分子的方法。
發(fā)明概述
使用低形態(tài)和機(jī)械穩(wěn)定性的基質(zhì)或生物材料系統(tǒng)，開(kāi)發(fā)了生產(chǎn)穩(wěn) 定的細(xì)胞-基質(zhì)微球的方法，所述微球具有最高100%的膠嚢化效率和 高的細(xì)胞存活率，其應(yīng)用包括通過(guò)微注射或外科植入進(jìn)行的細(xì)胞療 法；用于體外擴(kuò)展的3D培養(yǎng)，不需要用酶促消化或機(jī)械解離重復(fù)地進(jìn) 行細(xì)胞分離(splitting);提高治療性生物分子的產(chǎn)量；用于形態(tài)發(fā)生研 究的體外模塑。改進(jìn)的微滴生成法是筒單的，可擴(kuò)展的(scalable),當(dāng) 所用的基質(zhì)或生物材料系統(tǒng)濃度低、相變慢、形態(tài)和機(jī)械穩(wěn)定性差時(shí) 仍能生產(chǎn)細(xì)胞-基質(zhì)微球。
所述方法使用了包含細(xì)胞、第一細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和其他生物分 子的制劑。在優(yōu)選實(shí)施方案中，能夠?qū)?xì)胞提供支持、與細(xì)胞相互作 用使得細(xì)胞生長(zhǎng)而不產(chǎn)生毒性并且允許細(xì)胞遷移和滲透的第一 ECM 是膠原，或是支持細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移，并且具有足夠溫和以支持細(xì)胞存 活的相變特性的其他材料，例如纖維蛋白和透明質(zhì)酸。組合物可以包 含第二ECM,例如蛋白聚糖或GAG。它們可以以一定方式相互作用， 該相互作用導(dǎo)致生長(zhǎng)和分化中細(xì)胞應(yīng)答以及微球物理特性的改變，所 述微球物理特性例如結(jié)構(gòu)體積、ECM密度、細(xì)胞密度、機(jī)械特性和穩(wěn) 定性等。組合物也可包含生長(zhǎng)刺激信號(hào)，例如人血清、富血小板血漿 或其他血液制品。組合物中也可摻入治療性組分，例如抗炎性藥物和 抗生素。
形成微球的方法包括以正確的次序和正確的時(shí)間，用分配單元將 組合物混合并分配成液滴的步驟。第 一基質(zhì)的pH被調(diào)節(jié)到適于細(xì)胞存 活。細(xì)胞懸液和其他生物分子與基質(zhì)組分盡快地充分混合，以在加速
9(accelerating)相變之前使細(xì)胞均勻地完全分布在形成基質(zhì)的溶液中。用 不帶有機(jī)械擾動(dòng)的干式收集平臺(tái)(platform)收集液滴。所述平臺(tái)具有維 持液滴的球形的表面特性，例如高的表面張力。通過(guò)維持低的溫度， 基質(zhì)相變速率可被控制得盡可能地慢，依賴于基質(zhì)濃度在2分鐘至10 小時(shí)的范圍內(nèi)，優(yōu)選30分鐘。分配的微球的體積優(yōu)選為約2.5nl。分 配的液滴的直徑優(yōu)選為2mm。此外，所述方法包括在分配之后，通過(guò) 提高收集平臺(tái)的溫度，優(yōu)選至37。C,加快基質(zhì)相變的速率。使液滴的 基質(zhì)組分進(jìn)行相變，以在足以使相變達(dá)到平tf的時(shí)間內(nèi)形成細(xì)月包-基質(zhì) 微球。
微球被穩(wěn)定化，方法是用最小的機(jī)械擾動(dòng)從收集平臺(tái)收集細(xì)胞-基 質(zhì)微球；保持微球自由浮動(dòng)在第一介質(zhì)中一段時(shí)間，直到微球的大小 基本上恒定；將微球從第一介質(zhì)中釋放出來(lái)。保持微球自由浮動(dòng)可通 過(guò)在非粘附性培養(yǎng)盤(例如陪替氏培養(yǎng)皿)中保持懸浮狀態(tài)，或者在 攪拌式培養(yǎng)瓶(spinner flask)或旋轉(zhuǎn)式(rotating vessel)生物反應(yīng)器中培 養(yǎng)微球來(lái)實(shí)現(xiàn)。微球的大小和機(jī)械強(qiáng)度可通過(guò)控制下列參數(shù)中的至少 一種來(lái)控制細(xì)胞密度、膠原濃度、血清濃度、ECM的組成、第一和 第二ECM的比例、液滴的體積、微球自由浮動(dòng)狀態(tài)的持續(xù)時(shí)間。提高 細(xì)胞密度、降低基質(zhì)濃度或降低液滴體積可以降低大小，提高細(xì)胞-基 質(zhì)微球的穩(wěn)定性。
產(chǎn)生微球的系統(tǒng)包括上述的組合物、用于將組合物分配成液滴的 分配單元、以及收集平臺(tái)，所述收集平臺(tái)用于收集分配的液滴以及基 質(zhì)的凝膠化以形成細(xì)胞-基質(zhì)微球，所述收集平臺(tái)包括具有維持液滴的 球形的表面特性的表面。該系統(tǒng)可進(jìn)一步包括用于控制分配速度和體 積的控制單元，以及在分配過(guò)程中和基質(zhì)相變過(guò)程中維持組合物的溫 度的溫度控制單元。
包含未分化的活細(xì)胞的細(xì)胞-基質(zhì)微球可被注射或移植，用于例如 組織修復(fù)或再生。方法包括沉淀微球；去除過(guò)量的上清；將微球重懸 于用于注射或移植的液體；將微球懸液加入用于注射或移植的容器中； 將微球注入或植入動(dòng)物或人的缺陷組織，例如皮膚傷口或損傷的軟骨。 在一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括注射或移植包含特異性分化的活細(xì)胞的 細(xì)胞-基質(zhì)微球，其中基質(zhì)將細(xì)胞包埋入動(dòng)物或人的缺陷組織。細(xì)胞-基質(zhì)微球也可用于3D培養(yǎng)。與現(xiàn)有的微載體系統(tǒng)相比，它們具有大量 的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的系統(tǒng)可用于在生理相關(guān)微環(huán)境中培養(yǎng)分泌蛋白的細(xì) 胞，與不受限制繁殖的單層培養(yǎng)相比，通過(guò)基質(zhì)誘導(dǎo)的繁殖控制顯著 地提高了蛋白生產(chǎn)率。
附圖簡(jiǎn)述
圖l是示意圖，顯示了制備細(xì)胞-基質(zhì)微球的生產(chǎn)裝備。
圖2是流程圖，顯示機(jī)械上穩(wěn)定的可控制大小的細(xì)胞-基質(zhì)微球的 制備。
圖3是流程圖，顯示控制細(xì)胞從細(xì)胞-基質(zhì)微球遷移的方法。 圖4A、 4B和4C顯示hMSC-膠原微球的直徑(微米)作為細(xì)胞密 度(圖4A)、膠原濃度(圖4B)和微滴體積(圖4C)的函數(shù)隨時(shí)間 (小時(shí))的變化。
圖5A和5B顯示膠嚢化的hMSC的細(xì)胞數(shù)(圖5A )和存活率， 細(xì)胞數(shù)對(duì)膠嚢化后時(shí)間(小時(shí))。所有數(shù)據(jù)以平均值+Z-SD表示。
圖6A-6D細(xì)胞數(shù)對(duì)微球中的細(xì)胞密度，細(xì)胞/毫升(圖6A),細(xì) 胞數(shù)對(duì)平板密度，微球/cm2(圖6B),纟田胞數(shù)，95。/oCI對(duì)單次鋪平板， 3D第一次鋪平板(plating), 3D第二次鋪平板，3D第三次鋪平板和3D 第四次鋪平板(圖6C),第一、第二、第三、第四次鋪平板的微球數(shù) (圖6D)。中間線是中位數(shù)；最上和最下的條棒(bar)分別是數(shù)據(jù)的2.5th 和97.5th百分位數(shù)(percentile),框線的上限和下限分別是數(shù)據(jù)的25&和 75th百分位數(shù)，顯示作為細(xì)胞密度函數(shù)的外生(outgrowing)細(xì)胞數(shù)(圖 6A)和平板密度(圖6B);誤差棒圖(數(shù)據(jù)以平均值+/-95%置信區(qū)間 表示)比較單層培養(yǎng)和3D微球之間的細(xì)胞數(shù)(圖6C);框線圖顯示 不同次鋪平板的微球數(shù)(圖6D)。
圖7是直方圖，顯示從hMSC-膠原;微球外生的細(xì)胞形成的單細(xì)胞 來(lái)源的克隆數(shù)，兩個(gè)受試者，比較單、第一、第二和第三次鋪平板。
圖8A和8B顯示在糖胺聚糖的存在下成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)的膠原凝膠 收縮的程度(mm),以不同細(xì)胞密度(G:C, 3:1, 1:1， 1:3,無(wú)GAG)對(duì)時(shí) 間(天)表示。
圖9顯示以不同密度包裹細(xì)胞的細(xì)胞-基質(zhì)微球的直徑(mm)的時(shí)間變化50、 500和5000細(xì)胞/微球?qū)r(shí)間(天)。
圖10A和10B顯示HEK293細(xì)l包以不同的起始細(xì)胞數(shù)(2500、 25,000、 250,000細(xì)胞)在3D微球和單層培養(yǎng)中的存活率(10A)和數(shù) 量(10B)。
圖11A和11B顯示HEK293細(xì)胞在3D微球和單層培養(yǎng)中的存活 率、百分率(3A)和數(shù)量(3B)隨時(shí)間(天)的時(shí)間變化。
圖12A-F顯示HEK293細(xì)胞中GDNF生產(chǎn)率。在3D微球和單層 培養(yǎng)中HEK293細(xì)胞隨時(shí)間(天)的GDNF累積分泌(ng GDNF )(圖 12A)和分泌速率(ng GDNF/百萬(wàn)細(xì)胞/天)(圖12B)。在3D微球 和單層培養(yǎng)中不同起始細(xì)胞數(shù)的HEK293細(xì)胞分泌的總GDNF ( ng ) (圖12C)和分泌速率(ngGDNF/百萬(wàn)細(xì)胞/天)(圖12F)。在不同 的血清濃度(2、 5和10%)下，在3D微球和單層培養(yǎng)中HEK293細(xì) 胞分泌的總GDNF (ng)(圖12E)和分泌速率(ng GDNF/百萬(wàn)細(xì)胞/ 天)(圖12F)。
圖13A和13B顯示在不同的血清濃度(2、 5和10%)下，在3D 微球和單層培養(yǎng)中HEK293細(xì)胞的細(xì)胞存活率、百分率(13A)和數(shù) 量(13B)。
圖14A和14B顯示在不同的膠原濃度(0.5、 1.0、 2.0和3.0 mg/ml) 下，不同細(xì)胞接種密度(0、 0.5、 1和5xl06/ml)的樣品中GAG (圖 14A)和GA/DNA (圖14B )的量。
發(fā)明詳述 I.定義
在本文中，膠嚢化到微球中指的是形成納米纖維(nanofibrous)微 球，由于形成微球的材料的相變而在其中包埋了細(xì)胞。
在本文中，"ECM"指的是細(xì)胞外基質(zhì)材料，其為純的、分離的、 部分分離的、重組的或合成的形式，或是具有與ECM相似的物理和生 物學(xué)特性的合成材料。
在本文中，機(jī)械上穩(wěn)定的微球是這樣一種微球，它在達(dá)到平衡后， 可#皮夕卜力才幾才戒性J也才喿作，可4氐4元快速吹吸(pipetting up and down,例如 20ml/min)或以最大速率渦旋(vortexed)過(guò)程中產(chǎn)生的剪切應(yīng)力和湍流。
12II.制造細(xì)胞-基質(zhì)微球的材料
使用低形態(tài)和機(jī)械穩(wěn)定性的基質(zhì)或生物材料系統(tǒng)，開(kāi)發(fā)了生產(chǎn)穩(wěn) 定的細(xì)胞-基質(zhì)微球的方法，所述微球具有最高100%的膠嚢化效率和
高的細(xì)胞存活率，其應(yīng)用包括通過(guò)微注射或外科植入進(jìn)行的細(xì)胞療
法；體外擴(kuò)展的3D培養(yǎng)，不需要用酶促消化或機(jī)械解離重復(fù)地進(jìn)行細(xì)
胞分離；提高治療性生物分子的產(chǎn)量；用于形態(tài)發(fā)生研究的體外模塑。 改進(jìn)的微滴生成法是簡(jiǎn)單的，可擴(kuò)展的，當(dāng)所用的基質(zhì)或生物材料系 統(tǒng)濃度低、相變慢、形態(tài)和機(jī)械穩(wěn)定性差時(shí)仍能生產(chǎn)細(xì)胞-基質(zhì)微球。 該方法使用的制劑包含細(xì)胞、第一細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)、任選的笫二 ECM,以及其他生物分子。 A. ECM材料
組合物包含至少一種ECM。 ECM必須能夠?qū)?xì)胞提供支持，與 細(xì)胞相互作用以使細(xì)胞生長(zhǎng)而不產(chǎn)生毒性，允許細(xì)胞遷移并滲透，可
以是不同類型的膠原，例如i型、ii型和m型，或者是適于支持細(xì)胞 生長(zhǎng)和遷移，并具有足夠溫和的相變特性以支持細(xì)胞存活的任何材料，
例如纖維蛋白和透明質(zhì)酸。所用的膠原可以是來(lái)源于牛的，例如FDA 批準(zhǔn)的皮膚等同物Integra⑧和Apligraf⑧和軟組織填充物，或已在臨床 上用于減少皺紋的產(chǎn)品(例如DermaLive和 DermaDeep ) (Bergeret-Galley等，Aesthetic Plast Surg., 25(4):-249-55 (2001))或在治 療尿失禁的產(chǎn)品(Corcos等，Urology, 65(5):898-904 (2005))中所用的。 ECM可以是天然來(lái)源的或合成的，并且在足夠溫和以支持細(xì)胞存活和 生長(zhǎng)的特定條件下可被誘導(dǎo)重建(reconstitute)成固體形式。ECM可以 從不同的動(dòng)物來(lái)源分離或提取制備，所述動(dòng)物來(lái)源例如鼠尾、豬皮、 牛跟腱或人胎盤。優(yōu)選地，第一ECM分離自提取過(guò)程中的不同級(jí)分， 例如酸溶性級(jí)分、胃蛋白酶溶性級(jí)分或不溶性級(jí)分。
組合物可進(jìn)一步包含第二ECM,它可以是由鯊魚(yú)軟骨制得的蛋白 聚糖或糖胺聚糖("GAG，，)、纖維蛋白、彈性蛋白或透明質(zhì)酸。第一ECM 可以和活細(xì)胞相互作用，或者與第二ECM相互作用，所述相互作用導(dǎo) 致細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)和分化的應(yīng)答的改變，以及微球物理特性(例如結(jié)構(gòu)體 積、ECM密度、細(xì)胞密度、機(jī)械特性和穩(wěn)定性等)的改變。基質(zhì)組分也包含其他水凝膠，它們的制造條件足夠溫和以在膠嚢 化之后維持高的細(xì)胞存活率，不需要使用有機(jī)溶劑或其他對(duì)細(xì)胞有毒 性的物質(zhì)，而且不需要嚴(yán)苛的條件，例如通過(guò)添加鉀而凝膠化的藻酸 凝膠。
B. 細(xì)胞
細(xì)胞可以是人或臨床易得來(lái)源的成熟細(xì)胞或干細(xì)胞，所述臨床易 得來(lái)源例如自體、同種異體、胎兒(fetal)、胚胎和異種來(lái)源。細(xì)胞可以 是不同來(lái)源的。在優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞是來(lái)源于人骨髓的間質(zhì)干細(xì) 胞(hMSCs)、有治療用途的人胚胎和胎兒干細(xì)胞、成體干細(xì)胞和有治療 用途的成體細(xì)胞，分離所述成體干細(xì)胞的來(lái)源包括但不限于人皮膚、 胃腸道、脂肪組織、胎盤，所述有治療用途的成體細(xì)胞來(lái)自例如推間 盤、軟骨、肌肉、皮膚、腱和韌帶等的健康活檢樣品。細(xì)胞可被基因 操作以過(guò)表達(dá)一種或多種特異性生物分子，例如蛋白，或具有分泌一 種或多中特異性生物分子(例如蛋白)的活性，細(xì)胞的例子是HEK293 細(xì)胞、3T3成纖維細(xì)胞、骨肉瘤細(xì)胞、C2C12細(xì)胞系、來(lái)源于人骨髓 的間質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)等。細(xì)胞也可得自有治療用途的同種異體來(lái)源， 例如兔MSC、小鼠MSC和在動(dòng)物疾病才莫型中有治療用途的其他動(dòng)物 纟田胞。優(yōu)選地，細(xì)胞是來(lái)源于骨髓的間質(zhì)干細(xì)胞(MSCs),對(duì)HLA匹配 供體是自體的或者是同種異體的。優(yōu)選地，成熟細(xì)胞是分離自燒傷患
者健康皮膚活檢樣品的角質(zhì)細(xì)胞；分離自骨關(guān)節(jié)炎患者的健康關(guān)節(jié)軟 骨活檢樣品的軟骨細(xì)胞；分離自嚴(yán)重推間盤退化患者的健康推間盤活 檢樣品的推間盤細(xì)胞；分離自脊髓或其他CNS損傷患者的自體外周神 經(jīng)移植的Schwann細(xì)胞。
用HEK293分泌GDNF作為生產(chǎn)生物分子的例子?？墒褂闷渌?xì) 胞例如3T3成纖維細(xì)胞和CHO細(xì)胞，也可使用其他有用的生物分子例 如糖蛋白和蛋白聚糖。
C. 任選的生長(zhǎng)因子
組合物也可包含生長(zhǎng)刺激信號(hào)，例如人血清、富血小板血漿或其 他血液制品。有效地，組合物包含影響MSC分化的附加因子。例示性 的因子包括用于分化成軟骨的TGF-P.
D. 細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)
14含水介質(zhì)可以是培養(yǎng)介質(zhì)，含有或不含有血清、緩沖鹽，或與細(xì) 胞存活力相容并具有適當(dāng)離子強(qiáng)度的其他液相。典型的介質(zhì)包括
DMEM、 DMEM-LG、 MEM和RPMI。
E.任選的治療性、預(yù)防性或生物活性藥劑
制劑也可包含治療性、預(yù)防性或診斷性藥劑。例如，可將治療性 組分(例如抗炎藥物和抗生素)摻入組合物中。也可摻入診斷藥劑， 例如染料或放射造影劑?？杉尤敕栏瘎┯糜谫A存。
m.制備細(xì)胞-基質(zhì)微球的方法
用于制備微球的系統(tǒng)包括上述組合物；用于將組合物分配成液滴 的單元；以及收集平臺(tái)，所述收集平臺(tái)用于收集分配的液滴以及基質(zhì) 的凝膠化以形成細(xì)胞-基質(zhì)微球，所述平臺(tái)包括具有維持微球?yàn)榍蛐蔚?表面特性的表面。液滴分配于其上的基底(substratum)可被封口膜包裹 或被明膠包被，或是具有類似表面特性的其他材料，具有高表面張力 以盡可能維持液滴的球形的塑料、金屬或玻璃平臺(tái)。該系統(tǒng)可進(jìn)一步 包括用于控制分配速度和體積的控制單元，以及在分配過(guò)程中和在基 質(zhì)相變過(guò)程中維持組合物的溫度的溫度控制單元。
形成擺i球的方法包括以正確的次序和正確的時(shí)間，用分配單元將 組合物混合并分配成液滴中的步驟。ECM的pH被調(diào)節(jié)到適于細(xì)胞存 活。如果需要組分之間特定的相互作用，則將第一和第二基質(zhì)充分混 合。細(xì)胞懸液和其他生物分子與基質(zhì)組分盡快地充分混合，以在加速 (accelerating)相變之前使細(xì)胞均勻地完全分布在形成基質(zhì)的溶液中。分 配單元可以是手動(dòng)的或自動(dòng)的。用不帶有機(jī)械擾動(dòng)的干式收集平臺(tái)收 集液滴。
所述平臺(tái)具有維持液滴的球形的表面特性，例如高的表面張力。 分配環(huán)境維持在-5至20。C、 0至15。C、更優(yōu)選0°C至10°C的溫度下。 通過(guò)維持低的溫度，基質(zhì)相變速率可被控制得盡可能地慢，依賴于基 質(zhì)濃度例如在2分鐘至10小時(shí)的范圍內(nèi)，優(yōu)選30分鐘。分配的微球 的體積纟皮控制在約0.01至100fil、0.05至50|ul、0.1至20|ul、0.1至10|ul、 0.5±l)il,或優(yōu)選為約2.5^1。分配的液滴的直徑范圍為0.5mm至3mm, 優(yōu)選為2mm。通過(guò)在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間控制液體環(huán)境的溫度、pH和離子強(qiáng)度來(lái)引發(fā)液
體基質(zhì)的溶液-凝膠(sol-gel)轉(zhuǎn)變過(guò)程。溫度由4。C提高到10。C、 16°C、 25。C、 37°C和優(yōu)選的37°C。 pH由2才是高到5、 6、 7、 8、大于8和優(yōu) 選的7。通過(guò)將混合物的溫度維持在低至4°C,正在膠凝的(gelling)基 質(zhì)的凝膠化速度可以在引發(fā)凝膠化之后立即減慢。通過(guò)將混合物的溫 度提高到37。C,或者通過(guò)提高溶液的離子強(qiáng)度，正在膠凝的基質(zhì)的凝 膠化速度可以在將該基質(zhì)在收集單元分配成液滴之后立即提高。
使液滴的基質(zhì)組分進(jìn)行相變以形成細(xì)胞-基質(zhì)微球，時(shí)間足夠地長(zhǎng) 以4吏相變達(dá)到平tf,典型地為約10至30》>鐘、15至60分鐘、0.5至 5小時(shí)，優(yōu)選45分鐘。
使凝膠化的液滴從收集平臺(tái)脫離或釋放，方法是用液體(例如培 養(yǎng)介質(zhì)和磷酸緩沖液)輕柔地清洗，或?qū)⑵脚_(tái)浸入浴液(bath)中輕柔地 攪動(dòng)(agitation),或使用足夠溫和以保持柔軟微球的完整性的其他適當(dāng) 方法。微球被穩(wěn)定化，方法是用最小的機(jī)械擾動(dòng)從收集平臺(tái)收集細(xì)胞-基質(zhì)微球；保持微球自由浮動(dòng)在第一介質(zhì)中一段時(shí)間，直到微球的大 小基本上恒定；將微球從第一介質(zhì)中釋放出來(lái)。保持微球自由浮動(dòng)可 通過(guò)在非粘附性培養(yǎng)盤(例如陪替氏培養(yǎng)皿)中保持懸浮狀態(tài)，或者 在攪拌式培養(yǎng)瓶或旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器中培養(yǎng)微球來(lái)實(shí)現(xiàn)。微球可以保 持在自由浮動(dòng)狀態(tài)2小時(shí)至10天、12小時(shí)至8天、或約2至7天， 最優(yōu)選3天。溫度可維持在約25至45。C、 30至40°C或約37°C。
微球的大小和機(jī)械強(qiáng)度可通過(guò)控制下列參數(shù)中的至少 一種來(lái)控 制細(xì)胞密度、膠原濃度、血清濃度、ECM的組成、第一和任選的第 二ECM的比例、液滴的體積、微球自由浮動(dòng)狀態(tài)的持續(xù)時(shí)間?？赏ㄟ^(guò) 控制上述參數(shù)中的至少一種來(lái)控制微球的機(jī)械強(qiáng)度和大小。例如，起 始細(xì)胞密度或每微球的細(xì)胞量可被控制在1至2500、 1至1000、 1至 500或約250細(xì)胞/微球；第一 ECM的濃度可畔皮控制在約0.01至 10.0mg/ml、 0.1至5.0mg/ml、 0.1至3.0mg/ml或約0.5mg/ml;第一 ECM 與第二 ECM的比例為1:10至10:1、 1:5至5:1、 1:2至2:1或約1:1; 血清濃度可以是0.1%至50%、 0.5至30%、 1至25%、 5%至15%或約 10%。提高細(xì)胞密度、降低基質(zhì)濃度或降低液滴體積可以降低大小， 提高細(xì)胞-基質(zhì)微球的穩(wěn)定性。微球的大小可被多個(gè)參數(shù)精確地控制，所述多個(gè)參數(shù)包括但不限
于起始細(xì)胞密度或每微球的細(xì)胞數(shù)，范圍是每微球1至2500，優(yōu)選250 個(gè)細(xì)胞；膠原濃度，范圍是0.1至8.0,優(yōu)選0.5mg/ml;血清濃度，范 圍是2至20,優(yōu)選10%;不同基質(zhì)組分之間的比例，例如膠原對(duì)GAG, 范圍是10:1至1:10,優(yōu)選1:1。
細(xì)胞-基質(zhì)微球的配制參數(shù)可被優(yōu)化，以使膠嚢化的干細(xì)胞更好地 分化。例如，可用不同的參數(shù)(例如細(xì)胞密度和膠原濃度)制備膠原-間質(zhì)干細(xì)胞微球?？筛淖儏?shù)以得到優(yōu)化的分化結(jié)果例如GAG產(chǎn)量。 可使用每毫升lxl(^至lxlO 個(gè)細(xì)胞，優(yōu)選每毫升5xl()S個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞 密度。提高細(xì)胞密度有利于人MSC在微球中分化成軟骨細(xì)胞 (chondrocyte)樣細(xì)胞?？墒褂?.1至10mg/ml，優(yōu)選2mg/ml的膠原濃 度。提高膠原濃度有利于人MSC在微球中分化成軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞。因 此，可以優(yōu)化這些參數(shù)以在組織再生中得到最佳的分化結(jié)果。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)控制以下參數(shù)來(lái)控制微球的機(jī)械強(qiáng)度 起始細(xì)胞密度或每微球的細(xì)胞數(shù)，范圍是每微球1至2500,優(yōu)選250 個(gè)細(xì)胞；膠原基質(zhì)的起始濃度，范圍是0.1至8.0,優(yōu)選0.5mg/ml;血 清濃度，范圍是2至20,優(yōu)選10%;不同基質(zhì)組分之間的比例，例如 膠原對(duì)GAG,范圍是10:1至1:10,優(yōu)選l:l;自由浮動(dòng)孵育的持續(xù)時(shí) 間，范圍是2小時(shí)至14天，優(yōu)選48小時(shí)。提高細(xì)胞密度、降低基質(zhì) 濃度并降低分配的液滴的體積、降低GAG組成(composition)、提高血 清濃度以及提高自由浮動(dòng)孵育時(shí)間導(dǎo)致所得的微球的機(jī)械強(qiáng)度提高。
圖1顯示了用于生產(chǎn)細(xì)胞-基質(zhì)微球的系統(tǒng)101的示意圖。系統(tǒng)101 包括分配單元100,其由手動(dòng)或自動(dòng)分配器102組成；控制單元104， 其控制分配液的體積、分配的速度和分配器的X-Y位置；冷卻單元106 (或水室)在4。C下容納分配單元100。系統(tǒng)還包括收集單元108,其 由以下部分組成具有非粘附性表面的可擴(kuò)展收集平臺(tái)110; X-Y-Z 移動(dòng)臺(tái)架(stage)112,收集平臺(tái)安裝在上面；平板控制單元114,其控 制移動(dòng)臺(tái)運(yùn)動(dòng)的速度、頻率和方向。系統(tǒng)可以是手動(dòng)的或自動(dòng)的、定 制的或由市售儀器(例如移液器(liqmd handlers))改制的。
通過(guò)系統(tǒng)101形成樣O求的方法包才舌分配混合物的小液滴(例如 Q.5)al),所述混合物包含以正確的次序和時(shí)間混合的細(xì)胞、水性介質(zhì)和液體基質(zhì)?？赏ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)分配室側(cè)部的溫度來(lái)控制基質(zhì)相變的速率，
通過(guò)保持分配側(cè)部低溫而維持慢的速率。液滴的直徑范圍是0.5mm至 3mm,優(yōu)選2mm。使在收集平臺(tái)上收集的液滴在37°C下膠凝足夠長(zhǎng) 的時(shí)間，以形成固體細(xì)胞-基質(zhì)微球。從收集平臺(tái)上釋放微球，在培養(yǎng) 條件下保持自由浮動(dòng)，直至形成穩(wěn)定的微球。
圖2顯示了制備具有可控制的大小和機(jī)械強(qiáng)度的細(xì)胞-基質(zhì)微球的 方法。微球的大小和機(jī)械強(qiáng)度受到多種參數(shù)的控制，所述參數(shù)包括但 不限于細(xì)胞-基質(zhì)混合物的體積、細(xì)胞密度或每微球的細(xì)胞數(shù)量、基質(zhì) 密度、不同基質(zhì)組分的比例、血清濃度、分配的液滴的體積和細(xì)胞-基 質(zhì)微球自由浮動(dòng)孵育的持續(xù)時(shí)間。
方法包括步驟200:在將凝膠化的細(xì)胞-基質(zhì)微球從非粘附性收集 平臺(tái)110釋放或脫離后，保持凝膠化的細(xì)胞-基質(zhì)微球自由浮動(dòng)或懸浮 在靜置的非粘附性培養(yǎng)容器(例如用于細(xì)菌培養(yǎng)的容器)中或者在自 轉(zhuǎn)(spinning)或旋轉(zhuǎn)(rotating)培養(yǎng)容器中足夠長(zhǎng)的時(shí)間，時(shí)間范圍是2 小時(shí)至14天，優(yōu)選72小時(shí)。步驟202:通過(guò)在收集平臺(tái)110上用介 質(zhì)沖洗微球來(lái)收集微球。步驟203包括使微球維持一段時(shí)間。步驟204 包括檢查微球的大小，直到達(dá)到平衡，即微球的大小達(dá)到恒定。步 驟206:收集機(jī)械上穩(wěn)定的微球，用于注射、移植或3D培養(yǎng)。
自由浮動(dòng)的持續(xù)時(shí)間依賴于達(dá)到平衡(微球的大小達(dá)到恒定)之 前細(xì)胞-基質(zhì)相互作用的速率。相互作用的速率依賴于細(xì)胞類型和基質(zhì) 類型。達(dá)到平衡的細(xì)胞-基質(zhì)微球的直徑應(yīng)當(dāng)適于體內(nèi)治療性注射，范 圍是50至800擺i米，優(yōu)選300孩i:米。
IV.在形成細(xì)胞-基質(zhì)樣i球之后改變細(xì)胞行為的方法 可操作細(xì)胞從微球遷移，方法是通過(guò)將微球鋪在培養(yǎng)皿的固體 基底上，或?qū)⑽⑶蛑糜谡谀z凝的基質(zhì)中或已膠凝的基質(zhì)上，對(duì)微球 提供機(jī)械支撐；將微球鋪在培養(yǎng)皿或正在膠凝的基質(zhì)中或已膠凝的基 質(zhì)上，其中各微球彼此分開(kāi)一段距離；向培養(yǎng)系統(tǒng)中加入第二介質(zhì)， 以保持(hold)微球；使細(xì)胞從微球遷移出來(lái)一段時(shí)間；使微球從粘連的 基底和第二介質(zhì)中釋放。在加入第二介質(zhì)之前，微球典型地保持在培 養(yǎng)系統(tǒng)中一段時(shí)間，例如30、 60、 90或120分鐘，優(yōu)選60分鐘。這細(xì)胞全部遷移。例如，這些步驟可重復(fù)3、 5、
7次，優(yōu)選10次。細(xì)胞遷移的時(shí)間范圍是2、 4、 12、 48小時(shí)至12天， 優(yōu)選約3天。使遷移出微球的細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間，可將其收獲用于進(jìn) 一步的應(yīng)用或重新膠嚢化。培養(yǎng)系統(tǒng)可以是2D或3D環(huán)境。介質(zhì)優(yōu)選 是DMEM、 DMEM-LG、 MEM或RPMI。
V.細(xì)胞-基質(zhì)微球
所生產(chǎn)的細(xì)胞-基質(zhì)微球是機(jī)械上穩(wěn)定的，能夠抵抗流速高達(dá) 20ml/mm的快速注射產(chǎn)生的剪切應(yīng)力，能夠經(jīng)受機(jī)械操作例如鑷子的 夾取和放下，能夠經(jīng)受最高速度的渦旋產(chǎn)生的湍流。
膠原和其他基質(zhì)提供了刺激細(xì)胞生長(zhǎng)的天然微環(huán)境，保護(hù)細(xì)胞在 注射或移植產(chǎn)生的局部有害環(huán)境中免受酶的消化，固定化可溶性試劑， 刺激生長(zhǎng)和分化(如果需要的話)，而且粘附性的細(xì)胞-基質(zhì)微球容易 與宿主組織融合在一起，用宿主組織填充任意的不規(guī)則間隙，因此可 以彌補(bǔ)組織缺陷。細(xì)胞-基質(zhì)微球是可滲透性的，可以自由交換營(yíng)養(yǎng)和 代謝物。根據(jù)3D組織樣結(jié)構(gòu)中的質(zhì)量轉(zhuǎn)移規(guī)則，組織樣結(jié)構(gòu)的容積 (dimension)是有限的(Muschler等，J. Bone Joint Surg. Am., 86扁A(7); 1541-58 (2004))。在3D細(xì)胞-微球系統(tǒng)中，通?？蓪⑽⑶虻拇笮】刂圃?小至100-300微米，這是進(jìn)行充分營(yíng)養(yǎng)交換的3D結(jié)構(gòu)的適當(dāng)容積。影 響微球大小的另 一 因素是基質(zhì)濃度。較高的濃度會(huì)產(chǎn)生較硬的基質(zhì)， 因此細(xì)胞與低濃度的正在膠凝的基質(zhì)的相互作用產(chǎn)生的收縮力不足以 產(chǎn)生大程度的體積減小。此外，當(dāng)微球與粘連的環(huán)境(例如宿主組織) 緊密接觸時(shí)，膠嚢化的細(xì)胞能夠遷移出微球，與宿主組織整合，或者 快速生長(zhǎng)，因此可以促進(jìn)移植物-宿主整合，提高移植率。
細(xì)胞-基質(zhì)微球也可用于固定化其他治療分子，例如誘導(dǎo)特異性分 化的因子，例如用于分化成軟骨的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)(3,以及抗炎藥 物。
方法包括以可預(yù)測(cè)的方式控制獲得的細(xì)胞的量以及獲得該數(shù)量的 細(xì)胞的速度的步驟，控制因素包括但不限于微球的鋪平板密度，范 圍是每平方厘米0.5至500個(gè)，優(yōu)選5個(gè)微球；細(xì)胞密度，范圍是每 微球1至2500個(gè)，優(yōu)選250個(gè)細(xì)胞；基質(zhì)(例如膠原)濃度，范圍是
19;膠原對(duì)GAG比例，范圍是1:10至 10:1,優(yōu)選l:l;血清濃度，范圍是2至20%,優(yōu)選10%。提高鋪平板 密度、提高細(xì)胞密度、降低基質(zhì)濃度、降低膠原對(duì)GAG比例、提高血 清濃度，導(dǎo)致所得的細(xì)胞數(shù)量提高，以及獲得該細(xì)胞數(shù)量的速度提高。
圖3顯示控制膠嚢化的細(xì)胞遷移和生長(zhǎng)的方法。步驟300包括根 據(jù)圖1和圖2描述的步驟制備機(jī)械上穩(wěn)定的微球。步驟301包括通過(guò) 步驟302-304,在不補(bǔ)充介質(zhì)的情況下，提供用于微球粘連的機(jī)械支撐， 時(shí)間足夠進(jìn)行粘連，例如5分鐘至60分鐘、半小時(shí)至6小時(shí)，優(yōu)選 45分鐘。步驟302和303包括將微球(302a)分別鋪在培養(yǎng)JDi的固體基 底和膠原凝膠層(303a)上。步驟304包括將微球懸于一定體積的正在膠 凝的膠原基質(zhì)(304a)中，將混合物注入培養(yǎng)皿，通過(guò)將溫度提高至 37。C,使其凝膠化。步驟305包括將完全(full)介質(zhì)加入培養(yǎng)皿，而不 擾動(dòng)粘連的微球。步驟306包括使細(xì)胞從微球的周圍遷移(306b)—l殳時(shí) 間，從12小時(shí)至3天，2天至8天，4天至14天，優(yōu)選3天。步驟 307包括使細(xì)胞-基質(zhì)微球從粘連的基底回收或釋放，方法例如輕柔地 用完全介質(zhì)沖洗基底。步驟308包括立刻向培養(yǎng)皿補(bǔ)充完全介質(zhì)，使 遷移的細(xì)胞(308a)在有規(guī)律的介質(zhì)變化下繼續(xù)生長(zhǎng)。步驟309包括使脫 離的細(xì)胞重復(fù)進(jìn)行步驟301-307中的鋪平板以及細(xì)胞外生(未顯示)。 可在步驟310中收獲遷移的細(xì)胞備用。
該方法包括使浮動(dòng)的微球發(fā)生粘連，方法是在不存在介質(zhì)的情況 下，將收縮的細(xì)胞-基質(zhì)微球鋪在粘附性的基底(例如培養(yǎng)基)上一段 時(shí)間，范圍是30分鐘至12小時(shí)，優(yōu)選45分鐘，直到粘連完成。該方 法也包括向微球補(bǔ)充足量的介質(zhì)，而不擾動(dòng)粘連的微球。
該方法包括使細(xì)胞外生(outgrowth)出粘連的細(xì)胞-基質(zhì)微球。膠原 基質(zhì)允許細(xì)胞遷移。和完全收縮的細(xì)胞-基質(zhì)微球中產(chǎn)生的種群壓力一 起，使細(xì)胞從粘連的微球外周外生到基底上或周圍的環(huán)境中，并且遷 移的細(xì)胞繁殖。誘導(dǎo)細(xì)胞外生一段時(shí)間，范圍是12小時(shí)至14天，優(yōu) 選3天。
該方法包括當(dāng)足夠數(shù)量的細(xì)胞遷移出微球使得微球被外生的細(xì)胞 包圍時(shí)，去除細(xì)胞-基質(zhì)微球的粘附。這發(fā)生在12小時(shí)至14天，優(yōu)選 3天。該步驟不需要酶促消化，例如胰蛋白酶消化，也不需要機(jī)械性
20破壞微球，所述酶促消化可能會(huì)改變表面標(biāo)記物和細(xì)胞活性；只需要
簡(jiǎn)單地用介質(zhì)或PBS輕柔地沖洗微球，或用鑷子夾取。
細(xì)胞-基質(zhì)孩i球是完整的，通過(guò)沉淀或800至2000rpm優(yōu)選1000rpm 的溫和離心來(lái)收集。
細(xì)胞-基質(zhì)微球可以多次重鋪于新的空培養(yǎng)容器中，依賴于微球大 小、每微球的細(xì)胞密度可以鋪多達(dá)10次，使得可以在相同代次(passage) 中提供大量細(xì)胞，而不改變細(xì)胞生長(zhǎng)和分化潛能，以及表面標(biāo)記物。
該方法可被用于根據(jù)要求提供細(xì)胞，方法是，如果不需要細(xì)胞的 話，將細(xì)胞-基質(zhì)微球維持在懸液中至少一周。自由浮動(dòng)的微球以粘連 形式提供，以便當(dāng)需要細(xì)胞時(shí)，使細(xì)胞遷移并外生，直至匯集 (confluence)備用。該方法能夠恒定地提供來(lái)自細(xì)胞-基質(zhì)微球中相同代 次的細(xì)胞，方法是將微球多次鋪平板直至細(xì)胞遷移終止。遷移的細(xì)胞 在一段時(shí)間內(nèi)可以以有規(guī)律的間隔(優(yōu)選每天)獲得，所述時(shí)間為2 至30天，優(yōu)選10天，該時(shí)間對(duì)構(gòu)建多層異源組織樣結(jié)構(gòu)是必需的， 所述結(jié)構(gòu)包括但不限于IVD、胃腸道和血管。
細(xì)胞-基質(zhì)微球可簡(jiǎn)單地通過(guò)酶促消化來(lái)解離(dissembled),所述酶 促消化特異性針對(duì)微球的基質(zhì)組分，例如針對(duì)膠原的膠原酶，針對(duì)硫 酸軟骨素GAG的軟骨素酶。單個(gè)細(xì)胞懸液可纟皮進(jìn)一步應(yīng)用。
通過(guò)形成細(xì)胞-基質(zhì)微球，用于包裹細(xì)胞的天然細(xì)胞外基質(zhì)材料 (例如膠原)以3D方式提供了生理上相關(guān)的微環(huán)境。膠嚢化細(xì)胞所處 的組織樣基質(zhì)微環(huán)境約束(constrains)細(xì)胞繁殖。結(jié)果，細(xì)胞的繁殖暫 時(shí)受到控制，3D微球中的細(xì)胞數(shù)量在第4天僅提高2倍多一點(diǎn)，而傳 統(tǒng)的單層培養(yǎng)在相同時(shí)間內(nèi)提高超過(guò)20倍。在不同的時(shí)間點(diǎn)，在不同 的細(xì)胞密度下，3D微球中的細(xì)胞繁殖指數(shù)一致地比傳統(tǒng)單層培養(yǎng)中的 低。該方法提供了天然存在的、外部應(yīng)用的對(duì)繁殖的控制，不需要對(duì) 細(xì)胞代謝進(jìn)行基因操作。
IV.應(yīng)用
A.組織^修復(fù)或再生
本發(fā)明的方法和細(xì)胞-基質(zhì)微球可用于治療心血管病，例如心肌梗 塞的修復(fù)；用于神經(jīng)疾病，例如脊髓損傷；用于肌肉骨骼疾病，例如軟骨損傷、推間盤退化和肌營(yíng)養(yǎng)不良。與干細(xì)胞治療有關(guān)的服務(wù)和產(chǎn) 品也可使用本發(fā)明的方法和細(xì)胞-基質(zhì)微球，以用3D或與單層培養(yǎng)結(jié) 合的方式來(lái)培養(yǎng)干細(xì)胞，以根據(jù)需要大量地生產(chǎn)干細(xì)胞，不需改變它
們的特性(identity)、自我更新和分化能力。
含有未分化的活細(xì)胞的細(xì)胞-基質(zhì)微球可被注射或移植，例如用于 組織修復(fù)或再生。該方法包括以下步驟沉淀微球一段時(shí)間，優(yōu)選10 分鐘，或在800-2000rpm (優(yōu)選800rpm )的速度下溫和地離心擺i球懸 液一段時(shí)間，優(yōu)選5分鐘；除去過(guò)量的上清；將微球重懸于用于注射 或移植的液體，例如已知體積的鹽水、介質(zhì)、磷酸緩沖液、低濃度水 凝膠例如膠原凝膠；將微球懸液加入用于注射或移植的容器，例如帶 有G18-G30 (優(yōu)選G27)針頭的注射器；將微球注射或移植到動(dòng)物或 人的缺陷組織中，例如皮膚傷口或損傷的軟骨。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括注射或移植含有特異性分 化的活細(xì)胞的細(xì)胞-基質(zhì)微球，其中基質(zhì)將這些細(xì)胞包埋到動(dòng)物或人的 缺陷組織中。該方法包括添加分化介質(zhì)，其中化學(xué)信號(hào)(例如TGF-b) 包含在微球懸液中 一段時(shí)間，該時(shí)間足以將微球中存在的干細(xì)胞成軟 骨性(chondrogenic)分化成為成軟骨細(xì)胞；沉淀帶有分化細(xì)胞的微球一 段時(shí)間，優(yōu)選10分鐘，或在800-2000rpm (優(yōu)選800rpm)的速度下溫 和地離心微球懸液一段時(shí)間，優(yōu)選5分鐘；除去過(guò)量的上清；將微球 重懸于用于注射或移植的液體，例如已知體積的鹽水、介質(zhì)、磷酸緩 沖液、低濃度水凝膠例如膠原凝膠；將微球懸液加入用于注射或移植 的容器，例如帶有G18-G30 (優(yōu)選G27)針頭的注射器；將微球注射 或移植到動(dòng)物或人的缺陷組織中，例如皮膚傷口或損傷的軟骨。微球 可用于通過(guò)注射或移植進(jìn)行的細(xì)胞治療，所治療的疾病包括但不限于 肌肉骨格病、心血管病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
細(xì)胞-基質(zhì)微球可用作相同代次的細(xì)胞的長(zhǎng)時(shí)程來(lái)源，不需要使用 通常在單層培養(yǎng)和在3D支架上接種細(xì)胞中所用的細(xì)胞分離(splitting) 法，例如重復(fù)進(jìn)行酶促消化以及機(jī)械破裂。
B.作為生物反應(yīng)器的細(xì)胞-基質(zhì)微球
提供與細(xì)胞(遺傳修飾或未修飾的)培養(yǎng)物中的3D微載體有關(guān)的 服務(wù)或產(chǎn)品(用于生產(chǎn)治療性生物分子例如但不限于生長(zhǎng)因子)的公
22司可使用本發(fā)明的方法和組合物來(lái)生產(chǎn)能進(jìn)一 步提高治療性分子產(chǎn)率 的自組裝微載體。細(xì)胞-基質(zhì)微球可像生物技術(shù)和制藥工業(yè)所用的傳統(tǒng) 微載體培養(yǎng)那樣用于3D培養(yǎng)。它們可作為懸液培養(yǎng)，以便容易地提高
床體積(bedvolume),并放大培養(yǎng)系統(tǒng)。與傳統(tǒng)的微載體培養(yǎng)相比，本 發(fā)明的方法在提高效率和降低費(fèi)用方面提供了幾個(gè)重要的優(yōu)點(diǎn)。細(xì)胞 以幾乎100%的膠嚢化效率固定化在正在膠凝的基質(zhì)中，幾乎所有的細(xì) 胞都被膠嚢化。在靜態(tài)培養(yǎng)條件下，膠嚢化過(guò)程僅需要30-60分鐘。 另 一方面，傳統(tǒng)的微載體培養(yǎng)系統(tǒng)需要耗時(shí)而且低效率的細(xì)胞結(jié)合過(guò) 程，以使細(xì)胞與懸液中預(yù)先制造的微載體表面結(jié)合。為了提高細(xì)胞與 預(yù)先制造的微載體結(jié)合的效率，需要復(fù)雜的培養(yǎng)容器設(shè)計(jì)，例如旋轉(zhuǎn) 式生物反應(yīng)器、灌注式生物反應(yīng)器、攪拌式培養(yǎng)瓶以及其他方法，例 如恒定攪動(dòng)。細(xì)胞結(jié)合步驟有時(shí)需要超過(guò)一周。由于本發(fā)明的方法消 除了這些復(fù)雜而耗時(shí)的步驟的必要性，它成為更有效、低費(fèi)用的3D 培養(yǎng)方法。其次，微膠嚢化系統(tǒng)將微球的形成和基質(zhì)系統(tǒng)中細(xì)胞固定 化結(jié)合成一個(gè)步驟。這顯著地降低了費(fèi)用，節(jié)約了時(shí)間。此外，它消 除了單獨(dú)制造微載體的必要性，顯著降低了系統(tǒng)的費(fèi)用，因?yàn)榭梢员?免制造微載體在技術(shù)上需要的步驟，例如相分離、溶劑蒸發(fā)、化學(xué)交 聯(lián)。第三，微膠嚢化系統(tǒng)是在確保高細(xì)胞存活率的生理相關(guān)溫度和條 件下處理的。另一方面，制造微載體過(guò)程中使用的有機(jī)溶劑和有毒的 化學(xué)交聯(lián)劑(例如戊二醛)的殘留可能降低細(xì)胞存活率。
細(xì)胞-基質(zhì)箱t球也可用于3D培養(yǎng)。與現(xiàn)有的微載體系統(tǒng)相比，它 們具有大量的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的系統(tǒng)可用于在生理相關(guān)微環(huán)境中培養(yǎng)分 泌蛋白的細(xì)胞，與未受限制繁殖的單層培養(yǎng)相比，本發(fā)明的系統(tǒng)通過(guò)
基質(zhì)誘導(dǎo)的繁殖控制顯著地提高了蛋白生產(chǎn)率。
當(dāng)在低血清濃度(例如2%)下培養(yǎng)微球時(shí)，3D微球的生產(chǎn)率提 高。這表明培養(yǎng)系統(tǒng)可以維持在低血清濃度下，這樣可以簡(jiǎn)化下游的 蛋白純化過(guò)程。細(xì)胞培養(yǎng)在帶有或不帶有恒定攪動(dòng)、自轉(zhuǎn)、旋轉(zhuǎn)或灌 注的培養(yǎng)容器或生物反應(yīng)器中。
在微球內(nèi)部達(dá)到最大細(xì)胞密度之前，以有規(guī)律的周期(1天至10 天，優(yōu)選2天)在微球懸浮培養(yǎng)后用替代法收獲培養(yǎng)介質(zhì)中分泌的蛋 白一段時(shí)間(7天至3個(gè)月，優(yōu)選14天)。通過(guò)在液體基質(zhì)的亞最適(sub-optimal)濃度下(1乂104至lx107細(xì)胞/毫升，優(yōu)選lx105細(xì)胞/毫升) 膠嚢化細(xì)胞，可以實(shí)現(xiàn)更寬的蛋白生產(chǎn)窗口(windows)。當(dāng)基質(zhì)微球中 的細(xì)胞繁殖受到控制時(shí)，細(xì)胞的生產(chǎn)率顯著提高。該窗口可以維持至 少2周，比其他受控繁殖策略中的生產(chǎn)率提高的窗口長(zhǎng)得多。與其他 繁殖控制技術(shù)不同，本發(fā)明的方法通過(guò)在合適的濃度和時(shí)間，在天然 細(xì)胞外基質(zhì)材料中膠嚢化細(xì)胞，對(duì)繁殖進(jìn)行了暫時(shí)的、可逆的控制。
與不使用基質(zhì)微球的2D培養(yǎng)相類似，細(xì)胞數(shù)在對(duì)數(shù)時(shí)程(phase) 內(nèi)線性提高。在該時(shí)程內(nèi)，總蛋白產(chǎn)量隨細(xì)胞數(shù)線性地提高，而特定 蛋白的產(chǎn)率降低。這可能是由于更多的能量被引向再生而不是蛋白生 產(chǎn)。在該時(shí)程中生產(chǎn)的特定蛋白也可被收獲。由于空間限制和營(yíng)養(yǎng)竟 爭(zhēng)，細(xì)胞將達(dá)到最大或最適密度，而細(xì)胞的繁殖率將會(huì)下降。這通常 伴隨著蛋白產(chǎn)量的提高。然而，在該時(shí)程內(nèi)，可能i秀發(fā)細(xì)胞凋亡和死 亡，細(xì)胞內(nèi)成分的釋放可能降解分泌產(chǎn)物。因此，在最適化過(guò)程中的 適當(dāng)時(shí)間點(diǎn)收獲分泌的蛋白是有利的。與其他系統(tǒng)不同，該方法使得 高蛋白產(chǎn)率和快速繁殖相分離。該蛋白生產(chǎn)時(shí)程在對(duì)數(shù)繁殖時(shí)程之前， 并伴隨著對(duì)數(shù)繁殖時(shí)程。因此，該系統(tǒng)是可持續(xù)的，并且典型地以顯 著提高細(xì)胞數(shù)而結(jié)束。
培養(yǎng)系統(tǒng)的有效性和費(fèi)用降低可通過(guò)在2周至3個(gè)月，優(yōu)選1個(gè) 月的時(shí)間達(dá)到最適細(xì)胞密度之后，用重膠嚢化技術(shù)(re-encapsulation)使 膠嚢化的細(xì)胞循環(huán)而實(shí)現(xiàn)。這在經(jīng)濟(jì)上是有效率的，因?yàn)榈鞍资斋@可 以正好在活躍繁殖時(shí)程之前開(kāi)始，而系統(tǒng)的產(chǎn)出不僅包括所生產(chǎn)的特 定蛋白，而且包括提高高存活率的細(xì)胞數(shù)量。此外，可通過(guò)酶促釋放 細(xì)胞并重新膠嚢化成新的基質(zhì)微球來(lái)重新啟動(dòng)循環(huán)，這樣啟動(dòng)以下循 環(huán)具有高蛋白生產(chǎn)率的基質(zhì)誘導(dǎo)的繁殖控制和隨后在3D微球中的活 3夭細(xì)胞繁殖。
這一 系統(tǒng)的另 一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞的繁殖可被直接控制，提高蛋白生 產(chǎn)率，這不同于傳統(tǒng)的繁殖控制技術(shù)，例如營(yíng)養(yǎng)耗竭(deprivation)和腫 瘤抑制子基因過(guò)表達(dá)，以控制細(xì)胞代謝并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或死亡，其在 不同的時(shí)間點(diǎn)總是維持高的細(xì)胞存活率(幾乎100%),具有不同的細(xì) 胞密度和血清濃度。在使用分泌GDNF的HEK293細(xì)胞的實(shí)施例中， 在不同的細(xì)胞密度和不同的血清濃度下，3D微球中的細(xì)胞生產(chǎn)率在不同的時(shí)間點(diǎn)通常高于(3至67倍)單層培養(yǎng)的。
實(shí)施例
通過(guò)參考以下非限制性實(shí)施例，可以進(jìn)一步理解本發(fā)明。 實(shí)施例1: hMSC-膠原微球的制備
用NaOH中和溶于乙酸的I型鼠尾膠原溶液(主要由三螺旋單體 組成)，稀釋至終濃度為0.5mg/ml。所有步驟在水浴中進(jìn)行以防止膠 原凝膠形成。以最快的速度將處于完全介質(zhì)(10。/。FBS和1%P/S的 DMEM-LG)中的來(lái)源于人骨髓的間質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)充分地懸于中和的 膠原溶液中。將水冷的細(xì)胞混合物加入分配器中，每次分配2.5微升 的小體積到覆蓋了 UV照射的封口膜(parafilm)的細(xì)菌培養(yǎng)皿上。為了 防止液滴中氣泡的形成，在分配液滴后將分配器上移或?qū)⑹占脚_(tái)下 移。對(duì)液滴進(jìn)4亍熱誘導(dǎo)以重建成組織化膠原纖維的凝膠網(wǎng)絡(luò)，與月交嚢 化細(xì)胞相互作用，通過(guò)在37。C的孵育器中下孵育1小時(shí)形成固體微球。 通過(guò)用介質(zhì)輕柔地沖洗封口膜，將形成的細(xì)胞-基質(zhì)微球收集到含完全 介質(zhì)的具有非粘附性基底的浴液中。
實(shí)施例2:制備機(jī)械上穩(wěn)定的細(xì)胞-基質(zhì)微球并控制微球大小參數(shù) 才才泮十和方法
按圖2所示的步驟，在存在不同濃度(2xl04、 lxl()S和5xl()S細(xì)胞 /毫升)的處于實(shí)施例1中所述具有10%FBS的DMEM介質(zhì)中的來(lái)源 于人骨髓的MSC的條件下，中和I型鼠尾膠原溶液并稀釋成不同濃度 (0.5、 1.0、 2.0和3.0mg/ml)。將細(xì)胞-基質(zhì)微球收集到含DMEM介 質(zhì)的細(xì)菌培養(yǎng)皿中。在培養(yǎng)容器中在37。C下將收集的微球維持在自由 浮動(dòng)狀態(tài)2至7天，直至達(dá)到平衡，其特征在于微球大小恒定。
結(jié)果
記錄不同細(xì)胞密度和膠原基質(zhì)密度的細(xì)胞-基質(zhì)微球的時(shí)間形態(tài) 變化。第0天的微球顯現(xiàn)包埋在膠原基質(zhì)中的單個(gè)細(xì)胞，微球仍然透 明。隨時(shí)間流逝，較高細(xì)胞密度(例如lxl(^和5乂105細(xì)胞/毫升)和 0.5、 1.0和2.0mg/ml的較低膠原基質(zhì)密度的微球收縮，變得更不透明 和密實(shí)。這表明hMSC將基質(zhì)重組形成微球中的更緊密的基質(zhì)。低細(xì)胞密度(2xl04細(xì)胞/毫升)的微球需要長(zhǎng)得多的時(shí)間以收縮到恒定大
小，而較高膠原基質(zhì)密度(3.Omg/ml)的微球顯示出很少的收縮以至于基 質(zhì)看起來(lái)是透明的。HMSC誘導(dǎo)的膠原微球收縮程度與細(xì)胞密度、膠 原濃度和液滴體積(分別為圖4A、 4B和4C)成正比，證實(shí)這些參數(shù) 可用于控制微球的最終大小。在達(dá)到平衡后，可用鑷子對(duì)hMSC-膠原 微球進(jìn)行機(jī)械操作，并且hMSC-膠原微球可抵抗快速吹吸(例如 20ml/mm)或甚至最高速度的渦旋產(chǎn)生的剪切應(yīng)力和湍流。結(jié)果，這 些微球在機(jī)械上足夠穩(wěn)定，可以抵抗微注射器注射時(shí)產(chǎn)生的剪切應(yīng)力， 易于進(jìn)行細(xì)胞治療和組織工程目的的注射和移才直。
實(shí)施例3:控制膠原微球中膠嚢化的hMSC的生長(zhǎng)速率 hMSC分離自從捐獻(xiàn)者抽取的骨髓，所述捐獻(xiàn)者根據(jù)人類倫理委 員會(huì)的規(guī)定簽署了知情同意書(shū)。如Li等(2004)的描述培養(yǎng)hMSC。冷 凍保藏通過(guò)傳統(tǒng)的單層培養(yǎng)從第2和3次傳代收獲的細(xì)胞，用于生產(chǎn) 不同膠原密度(0.5和2mg/ml)的細(xì)胞-基質(zhì)微球。如實(shí)施例1和2所述 獲得完全收縮的機(jī)械上穩(wěn)定的hMSC膠原微球。用2juM CalceinAM和 4juM乙錠均二聚物-1孵育這些樣i球45分鐘，用于同時(shí)染色活的和死 的細(xì)胞。染色的微球在4%多聚曱醛(paraformaldehyde)中固定1小時(shí)， 用激光共焦掃描顯微鏡檢查堆疊的(stacked)影像。在單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，微 球(每平板100個(gè)微球， 一式三份)在完全介質(zhì)中培養(yǎng)10小時(shí)、3天、 6天和9天。在孵育的末期，用100U/ml細(xì)菌膠原酶在37。C下消化微 球45-80分鐘，然后0.05%胰蛋白酶/EDTA消化5分鐘。對(duì)獲得的單 個(gè)細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)和存活率進(jìn)行計(jì)數(shù)。 結(jié)果
在微膠嚢化后的起始階段同時(shí)發(fā)現(xiàn)了活的和死的細(xì)胞。在3天后， 較低膠原濃度的微球中的大多數(shù)細(xì)胞存活，而在較高膠原濃度的微球 中能發(fā)現(xiàn)死細(xì)胞。所有的活細(xì)胞顯示了伸長(zhǎng)的形態(tài)。在第6天，細(xì)胞 更加伸長(zhǎng)，達(dá)到了細(xì)胞與細(xì)胞接觸。在較低膠原濃度的微球中，細(xì)胞 遍布基質(zhì)，而在3毫克膠原/毫升的微球中，較多的細(xì)胞排列在周圍。 如圖5A所示，微膠嚢化細(xì)胞的生長(zhǎng)依賴于膠原濃度。在膠嚢化后第8 個(gè)小時(shí)，兩個(gè)濃度下的細(xì)胞數(shù)量降到起始微膠嚢化細(xì)胞的大約40%。0.5mg/ml組在第6天后細(xì)胞數(shù)量只有輕微的增加，但在2mg/ml組中觀 察到細(xì)胞數(shù)量快速增加。兩因素方差分析(two-way ANOVA)顯示時(shí)間 和膠原濃度都顯著地影響細(xì)胞數(shù)量(pO.OOl)。 Bonferroni，s post-hoc檢 測(cè)顯示第6或第9天與較早的時(shí)間點(diǎn)之間有顯著的差異(pO.OOl)。如 圖5B所示，在第8小時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率顯著降低^<=0.033),但之后 不是這樣(p《.959)。
實(shí)施例4:控制膠嚢化hMSC從膠原微嚢中遷移和生長(zhǎng) 才才津+和方法
在膠嚢化3天后將細(xì)胞密度為2xl04、 lxl()S或5xl()S細(xì)胞/毫升的 自由浮動(dòng)hMSC-膠原微球轉(zhuǎn)移到100mm直徑的組織培養(yǎng)平板，平板密 度為每平板63、 125或250個(gè)微球，相應(yīng)于0.64、 1.59和3.18個(gè)微球 /平方厘米。在抽取過(guò)量的介質(zhì)后使微球與培養(yǎng)平板粘連1小時(shí)，補(bǔ)充 完全介質(zhì)。在第72小時(shí)，通過(guò)輕柔地用完全介質(zhì)沖洗使微球脫離培養(yǎng) 平板，沉淀下來(lái)，并重鋪于新的培養(yǎng)平板若千次，直至細(xì)胞外生停止。 在單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，微球以0.5mg/ml接種到膠原凝膠上，以評(píng)估細(xì)胞是 否會(huì)遷移到軟性基底。將不同次鋪平板后生長(zhǎng)出微球的細(xì)胞培養(yǎng)12 天，有規(guī)律地更換介質(zhì)，在第3、 38和154小時(shí)記錄它們的形態(tài)。用 胰蛋白酶處理從250個(gè)微球外生的細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以便與用相 同起始細(xì)胞數(shù)接種的常規(guī)單層培養(yǎng)進(jìn)行比較。
結(jié)果
在微球鋪平板之后沒(méi)有立即發(fā)生細(xì)胞遷移。在第38小時(shí)，細(xì)胞外 遷，形成集群(cluster)。在第72小時(shí)脫離微球之后，外生的細(xì)胞長(zhǎng)成 大的集落。這些細(xì)胞均勻地小而伸長(zhǎng)，可被冷凍保藏以進(jìn)一步用于例 如基于細(xì)胞的檢測(cè)、冷凍保藏、重新膠嚢化和制造組織樣結(jié)構(gòu)。外生 的hMSC的形態(tài)即使在10次鋪平板之后也維持不變，性態(tài)類似于單層 培養(yǎng)早期傳代的形態(tài)。相反，在低細(xì)胞密度的微球中只有很少的外生 細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞密度(圖6A)和微球鋪平板密度(圖6B)提高時(shí)，外 生細(xì)胞數(shù)量線性地提高。Kruskal Wallis檢測(cè)顯示各組之間存在顯著的 差異(p二0.044)。脫離的微球可以重鋪幾次，不需要酶促消化。包裹250 個(gè)細(xì)胞的微球可以鋪至少三次，而包裹500個(gè)細(xì)胞的微球可以鋪至少
276次。此外，從早期鋪平板的微球獲得的細(xì)胞數(shù)量與單層培養(yǎng)(圖6C)
相近，而從較晚鋪平板的微球獲得的細(xì)胞數(shù)明顯下降(p〈K).018)。這與 聚集和解離造成的微球數(shù)量顯著下降(p-0.009)有關(guān)(圖6D)。微膠嚢 化的hMSC也可遷移到軟膠原凝膠中。來(lái)自不同次鋪平板的細(xì)l包的存 活率沒(méi)有顯示出差別。在粘連后72小時(shí)觀察到微球聚集和解離。粘連 后24小時(shí)外生的細(xì)胞滲入膠原凝膠中。
實(shí)施例5:多次鋪平板后維持由微球外生的hMSC的表面標(biāo)記物 用溶于EDTA的0.05%胰蛋白酶消化IO次鋪平板后遷移出樣O求的 hMSC6至9分鐘，然后固定，并用抗表面標(biāo)記物的抗體(包括CD34、 CD14、 CD29、 CD105、 CD4和HLA)。按先前描述的(Li等，2004) 用適當(dāng)?shù)耐蛯?duì)照進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)數(shù)。 結(jié)果
hMSC顯示與單層培養(yǎng)的Pl相同的表面標(biāo)記物組(panels), CD14、 CD34和CD45陰性，CD105、 CD29和HLA-A、 B、 C陽(yáng)性。這表明 在hMSC-膠原微球鋪平板和重鋪平板的10次循環(huán)之后，hMSC的特 征(identity)沒(méi)有改變。由于這些細(xì)胞來(lái)自相同代次的單層培養(yǎng)的單一 等分試樣(aliquot),通過(guò)將3D培養(yǎng)系統(tǒng)和傳統(tǒng)的單層培養(yǎng)結(jié)合，可以 用來(lái)自單層培養(yǎng)的另 一次傳代的另 一個(gè)或多個(gè)等分試樣重復(fù)這些鋪平 板循環(huán)，可以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期存儲(chǔ)和豐富的細(xì)胞來(lái)源，其對(duì)于基于細(xì)胞的測(cè) 試和組織工程中制造組織樣結(jié)構(gòu)是必需的。
實(shí)施例6:在多次鋪平板后維持從微球外生的hMSC的自我更新
能力
才才泮+和方法
用集落形成測(cè)試來(lái)表征得自3D和單層培養(yǎng)的hMSC的自我更新 潛力。以非常低的密度(每100毫米直徑的培養(yǎng)平板250個(gè)細(xì)胞)一 式三份地接種得自傳統(tǒng)單層培養(yǎng)的第3次至第5次傳代的hMSC和3D 培養(yǎng)的第1次至第5次鋪平板的hMSC,培養(yǎng)14天并有規(guī)律地補(bǔ)充介 質(zhì)。用溶于曱醇的5%結(jié)晶紫(Sigma公司)對(duì)形成的集落染色和固定 IO分鐘，用蒸餾水清洗兩次。對(duì)直徑大于2毫米的集落進(jìn)行計(jì)數(shù)，以
28所有接種的細(xì)胞形成集落的百分?jǐn)?shù)來(lái)計(jì)算來(lái)自單個(gè)細(xì)胞的集落形成效率。
結(jié)果
多次鋪平板后從微球外生的細(xì)胞的自我更新能力與傳統(tǒng)單層培養(yǎng)
得到的相近，如圖7所示。單因素方差分析顯示在所有組中來(lái)自單個(gè) 細(xì)胞的集落的數(shù)量沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上明顯的差異。
實(shí)施例7:在多次鋪平板后維持從微球外生的hMSC的多次分化
潛能
材泮+和方法
細(xì)胞外生的多次分化潛能
根據(jù)先前報(bào)道的標(biāo)準(zhǔn)方案(Pittenger等，284(5411): 143-7 (1999); Okamoto等，i^'oc/化附，^e義Com淤im.， 295(2):354-61 (2002); Romanov等，Sw〃. ￡孕.Sw/. A/^/., 140(1): 138-43 (2005))進(jìn)行 軟骨形成、骨形成和脂肪形成的分化測(cè)試，以考察從3D微球獲得的 hMSC是否仍保留多次分化潛力。使用得自單層培養(yǎng)第2次傳代和3D 培養(yǎng)第3次和第10次鋪平板的細(xì)胞。
軟骨形成
在室溫下將2乂105個(gè)細(xì)胞的等分試樣在15毫升離心管(Falcon公 司)中以800rpm離心5分鐘。將沉淀(pellet)重懸于成軟骨性分化誘導(dǎo) 介質(zhì)中，所述介質(zhì)被定義為高葡萄糖DMEM,補(bǔ)充了 10ng/ml重組人 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子P3(hrTGF-p3), 100nM地塞米松，6mg/ml胰島素，100mM 2-磷酸抗壞血酸，lmM丙酮酸鈉，6mg/ml轉(zhuǎn)4夾蛋白，0.35mM果仁 糖(pralme)和1.25mg/ml牛血清白蛋白。將細(xì)胞再次離心成沉淀，維持 3周，每2天有規(guī)律地用誘導(dǎo)介質(zhì)替換。在孵育的末期，固定沉淀， 并加工成5微米厚的石蠟切片，用于阿利辛(Alcian)藍(lán)染色。
骨形成
用100nM地塞米松、50nM2-磷酸抗壞血酸和10mM P甘油磷酸鹽 進(jìn)一步補(bǔ)充完全介質(zhì)，作為骨形成分化誘導(dǎo)介質(zhì)。以3乂103細(xì)胞/平方 厘米將hMSC —式兩份或一式三份接種到4或6孔平板上，維持在分 化誘導(dǎo)介質(zhì)中三周，每3天有規(guī)律地更換介質(zhì)。在孵育的末期，用PBS
29清洗細(xì)胞，用10%緩沖福爾馬林在室溫下固定10分鐘，用5%硝酸銀
(Nakarai Tesque, Kyoto, Japan)染色,用于馮科薩(von Kossa)染色。 脂肪形成
通過(guò)向完全介質(zhì)補(bǔ)充1|liM地塞米松、0.2mM吲味美辛 (mdomethacin)、 10貼/ml胰島素和0.5mM 3-異丁基-l-曱基黃嘌呤制備 脂肪形成分化誘導(dǎo)介質(zhì)；通過(guò)向完全介質(zhì)僅補(bǔ)充10|iig/ml胰島素制備 維持介質(zhì)(maintenance medium)。以2xl04細(xì)月包/平方厘米將hMSC —式 兩份或一式三份接種到完全介質(zhì)中的4或6孔平板上，直至匯集。加 入脂肪形成分化誘導(dǎo)介質(zhì)3天，然后在維持介質(zhì)中2天，進(jìn)行三次誘 導(dǎo)/維持循環(huán)。清洗、固定細(xì)胞，然后用0.3% Oil-Red-O(Nakarai)染色， 用于油滴(oil droplets)染色。
結(jié)果
在多次鋪平板循環(huán)之后維持了 hMSC的多次分化潛能。第3次和 第11次鋪平板后從微球獲得的細(xì)胞外生仍能夠分化成成骨細(xì)胞、脂肪 細(xì)胞和軟骨細(xì)胞。這通過(guò)馮科薩、OilRedO和阿利辛藍(lán)染色中分別對(duì) 釣沉積、油滴和蛋白聚糖的陽(yáng)性染色而證實(shí)。
實(shí)施例8:膠原微球中hMSC的成軟骨性分化 才才泮牛和方法
hMSC以5乂106個(gè)細(xì)胞/毫升的終濃度懸于100微升中和的膠原溶 液(2mg/ml)。如實(shí)施例7所述將如此制備的微球孵育于成軟骨性分化 介質(zhì)中3周。如實(shí)施例7所述對(duì)分化的微球的軟骨特異性基質(zhì)標(biāo)記物 進(jìn)行染色。
結(jié)果
由于微膠嚢化的hMSC能夠軟骨形成性地分化成具有典型圓形形 狀的軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞，可能會(huì)形成軟骨微組織。如葡糖氨基聚糖、軟 骨可聚蛋白多糖(aggrecan)和II型膠原的陽(yáng)性染色所示，分化的細(xì)胞失 去了遷移能力，并產(chǎn)生了軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)。
實(shí)施例9:膠原-hMSC微球在NOD/SCID小鼠中的體內(nèi)皮下植入 才才3+和方法
30根據(jù)機(jī)構(gòu)規(guī)定在適當(dāng)?shù)膫惱碚J(rèn)可下進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。具有0.5和
2mg/ml膠原以及每個(gè)樣i球250個(gè)細(xì)胞的膠原-hMSC微球在2|uM Calcein AM中孵育45分鐘，進(jìn)行活細(xì)胞標(biāo)記。十二只NOD/SCID小 鼠(25-30g)被麻醉。在背部做一個(gè)切口，產(chǎn)生大約lxlcm的皮下袋 (pocket)。植入一千個(gè)膠原-hMSC微球，用不可吸收的絲質(zhì)縫線縫合傷 口。在植入2、 7和14天后，用過(guò)量的麻醉劑殺死動(dòng)物。收集才直入部 位的皮瓣，在熒光顯微鏡下觀察，追蹤活細(xì)胞。 結(jié)果
微球保持完整并定位在植入部位，而膠嚢化的細(xì)胞在NOD/SCID 小鼠中存活至少14天。在植入后第2、 7和14天鑒別出被活體(vital) 熒光染料染色的包裹了活hMSC的微球集群?；頷MSC顯示出典型的 伸長(zhǎng)的形態(tài)。通過(guò)人抗原P2微球蛋白的免疫陽(yáng)性染色，證實(shí)了它們來(lái) 源于人。在參與血管形成的細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了人抗原免疫陽(yáng)性染色。
實(shí)施例10:在糖胺聚糖(GAG)的存在下接種了成纖維細(xì)胞的膠原 凝膠的收縮程度 材料和方法
用NaOH中和酸性鼠尾膠原溶液，并稀釋到終濃度為0.5mg/ml。 將糖胺聚糖(Chondroitin-6-sulfate)力。入正在膠凝的混合物，質(zhì)量比為 (1:3、 1:1和3:1)。所有的步驟在水浴中進(jìn)行，以防止形成膠原凝膠。 然后在完全介質(zhì)(具有10%FBS和1%P/S的DMEM-LG)的存在下， 將來(lái)源于人骨髓的間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)盡快地充分懸于中和的具有GAG 的膠原溶液，終密度為1或5xl0"田胞/毫升。將混合物倒入4孔培養(yǎng) 板中，在37。C的孵育器中孵育1小時(shí)，進(jìn)行凝膠化。用注射針頭使凝 膠脫離培養(yǎng)板的孔，補(bǔ)充足夠的介質(zhì)。在解剖顯微鏡下測(cè)量不同時(shí)間 點(diǎn)的凝膠大小，記錄收縮程度。
結(jié)果
如圖8A和8B所示，在所有細(xì)胞密度下，由于細(xì)胞遷移和繁殖， 接種了成纖維細(xì)胞的凝膠隨時(shí)間顯著收縮。第二介質(zhì)(例如GAG)的 存在確實(shí)影響了膠原凝膠中的細(xì)胞反應(yīng)。具體地說(shuō)，GAG的存在以劑 量依賴方式降低了成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)的凝膠收縮程度，即較高的GAG:
31膠原質(zhì)量比導(dǎo)致較低程度的收縮，比較圖8A中1乂105細(xì)胞/毫升的結(jié) 果和圖8B中5xl()S細(xì)胞/毫升的結(jié)果可以看出這一點(diǎn)。
實(shí)施例11: HEK293細(xì)胞培養(yǎng)和膠嚢化 材料和方法
HEK293細(xì)胞(第4傳代)；故轉(zhuǎn)染以過(guò)表達(dá)GDNF。用具有10毫 升完全杜氏改性Eagle介質(zhì)-高葡萄糖(DMEM-HG, 2%、5%或10%FBS: P/oPS)和500|ag/ml G418硫酸鹽的T75燒瓶在5%C02, 37°C下培養(yǎng)細(xì) 胞。每?jī)商旄鼡Q新鮮的介質(zhì)和G418石危酸鹽。這些細(xì)胞#皮用于隨后的膠嚢化。
用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化HEK293細(xì)胞。在置于DMEM中的 HEK293細(xì)胞的存在下，用NaOH中和I型鼠尾膠原溶液，稀釋為終濃 度4mg/ml。在使用之前在冰浴中將細(xì)胞混合物保持在4。C。將細(xì)胞混 合物加入分配器，以每次5微升的小體積分配到收集平臺(tái)或覆蓋了 U V 照射過(guò)的封口膜的細(xì)菌培養(yǎng)皿上。通過(guò)在5%。02, 37。C的孵育器中孵 育1小時(shí)而使微滴重建成固體微球。通過(guò)用介質(zhì)輕柔地沖洗封口膜， 將形成的細(xì)胞-基質(zhì)微球收集到含DMDM介質(zhì)，具有非粘附性基底的 bath中。用完全介質(zhì)將包裹了細(xì)胞的膠嚢懸浮在35mm陪替氏培養(yǎng)皿 中。將3D微球中HEK293細(xì)胞的細(xì)胞繁殖、細(xì)胞存活率、GDNF產(chǎn)率 與傳統(tǒng)單層培養(yǎng)的進(jìn)行比較。
結(jié)果
微球的形態(tài)學(xué)分析
在倒置顯微鏡下觀察包裹了細(xì)胞的膠嚢。在40x放大率下測(cè)量膠 嚢的直徑。在每個(gè)設(shè)置(setup)中，測(cè)量50個(gè)包裹了細(xì)胞的膠嚢中5個(gè) 膠嚢的直徑，確定平均值。如圖9所示，包裹了細(xì)胞的膠嚢的收縮率 依賴于細(xì)胞接種密度。在較高的細(xì)胞接種密度下，包裹了細(xì)胞的膠嚢 在較早的時(shí)間點(diǎn)，以較高的速率(rate)收縮。用5000細(xì)胞/膠嚢的高細(xì) 胞接種密度，收縮在笫4天開(kāi)始。平均直徑在第O天和第12天分別是 2.42mm±0.05和1.77mm±0.07。如果細(xì)胞接種密度為500細(xì)胞/樣i球， 第0天的平均直徑是2.4mm±0.01。在第8天之前沒(méi)有收縮，第12天 的平均直徑是2.24mm±0.15。如果是50細(xì)胞/微球的低細(xì)胞接種密度，第0天和笫12天的平均膠嚢直徑都是2.4mm±0.04。這表示微球沒(méi)有 可觀察到的收縮。細(xì)胞接種密度為5000、 500和50細(xì)胞/微球的平均 直徑變化百分比分別是(-)26.9%、 (-)6.67%和0%。第6天開(kāi)始形成細(xì) 胞集落或聚集，第8天至第14天聚集的大小一直增加。
實(shí)施例12:膠嚢化細(xì)胞的命運(yùn)(fate)、細(xì)胞的存活率和數(shù)量 材料和方法
對(duì)于傳統(tǒng)的單層培養(yǎng)，用0.25。/o胰蛋白酶-EDTA消化HEK293細(xì) 胞。用臺(tái)盼藍(lán)染色來(lái)檢測(cè)存活率。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器來(lái)計(jì)算細(xì)胞數(shù)量。 對(duì)于3D微球，用膠原酶(30單位/毫升)來(lái)消化包裹了細(xì)胞的膠嚢。 然后向集落懸液中加入胰蛋白酶/EDTA,用5%(3〇2在37°C下孵育3 分鐘，已制備單細(xì)胞懸液。用臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)存活率，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
結(jié)果
在早期時(shí)間點(diǎn)，在膠嚢內(nèi)發(fā)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞大小增加，在第6 天形成小的細(xì)胞聚集。細(xì)胞連續(xù)聚集形成網(wǎng)絡(luò)，細(xì)胞形態(tài)類似于單層 培養(yǎng)的細(xì)胞。圖IO顯示了細(xì)胞存活率。不同細(xì)胞接種密度下的細(xì)胞存 活率幾乎相同。這顯示細(xì)胞接種密度不影響細(xì)胞存活率。此外，單層 培養(yǎng)的細(xì)胞的存活率和膠嚢化細(xì)胞的存活率實(shí)際上沒(méi)有差別。圖10B 顯示了細(xì)胞數(shù)量。在單層組和微球組之間存在顯著的差別。單層組的 繁殖指數(shù)總是比微球組的高，大約為4至140倍。在不同細(xì)胞接種密 度之間也存在顯著的差別。細(xì)胞密度和組之間的相互作用也是顯著的。 單層組的繁殖指數(shù)隨細(xì)胞接種密度下降，而在微球組中這種作用并不 明顯。
實(shí)施例13: GDNF定量分析 才才4+和方法
按照制造商(Promega)提供的說(shuō)明用GDNF Emax 免疫測(cè)試系統(tǒng)測(cè) 量GDNF。用結(jié)合可溶性GDNF的抗GDNF單克隆抗體(mAb)包被96 孔板，4。C下靜置過(guò)夜。用抗人GDNF多克隆抗體(pAb, lpig/ml)結(jié)合 俘獲的GDNF4。C下靜置孵育過(guò)夜。在清洗后，檢測(cè)特異性結(jié)合的pAb 的量，方法是用抗雞IgY孵育，與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)在室溫下在有規(guī)律的攪動(dòng)下綴合(conjugate)2小時(shí)。通過(guò)清洗除去未結(jié)合的綴合物， 然后用TMBOne溶液(一種生色底物)在室溫下靜置孵育15分鐘。 加入IN HC1終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀(microplate reader)在終止反應(yīng)后30 分鐘內(nèi)測(cè)量450nm吸收。待測(cè)溶液中GDNF的量與氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生 的顏色成比例。該ELISA系統(tǒng)可檢測(cè)最少31.2pg/ml的GDNF,線性 范圍是31pg/ml至1000pg/ml GDNF。
用0.25。/。胰蛋白酶-EDTA消化HEK293細(xì)胞。對(duì)于單層培養(yǎng)，用 2ml完全介質(zhì)(DMEM, 10%FBS, P/。PS)和500昭/ml G418硫酸鹽將 2.5xl04HEK293細(xì)胞接種到6孔板上。對(duì)于3D培養(yǎng)，如上所述形成 微球。細(xì)胞接種密度為500個(gè)細(xì)胞/微球，微球數(shù)量為每35mm陪替氏 培養(yǎng)皿50個(gè)。用2ml完全介質(zhì)(DMEM, 10%FBS, 1。/。PS)和500|ig/ml G418硫酸鹽將微球懸于陪替氏培養(yǎng)皿。不同的時(shí)間點(diǎn)包括第2、 4、 8、 10、 14天。對(duì)單層培養(yǎng)和微球培養(yǎng)二者而言，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)有四份樣品 (n=4)。在所有設(shè)置中每?jī)商焓占⑻鎿Q介質(zhì)，用于GDNF定量。
用0.25。/。胰蛋白酶-EDTA消化HEK293細(xì)胞。對(duì)于單層培養(yǎng)，用 2ml完全介質(zhì)(DMEM, 10%FBS, P/。PS)和500貼/ml G418硫酸鹽將 2.5x103、 2.5xl()4或2.5xl05HEK293細(xì)胞接種到6孔板上。對(duì)于3D培 養(yǎng)，如實(shí)施例2所述形成樣i球。細(xì)胞接種密度為50、 500或5000個(gè)細(xì) 胞/微球。每個(gè)35mm陪替氏培養(yǎng)皿用2ml完全介質(zhì)(DMEM, 10%FBS, 1。/。PS)和500昭/ml G418硫酸鹽懸浮50個(gè)微球。3D培養(yǎng)的起始細(xì)胞數(shù) 量與單層培養(yǎng)的相同。對(duì)單層培養(yǎng)和3D培養(yǎng)二者而言，每個(gè)起始細(xì)胞 數(shù)量組有四份樣品(11=4)。在所有組中每?jī)商焓占⑻鎿Q介質(zhì)，用于收 集GDNF并隨后定量。在第12天進(jìn)行細(xì)胞存活率檢測(cè)和細(xì)胞計(jì)數(shù)。
用0.25。/。胰蛋白酶-EDTA消化HEK293細(xì)胞。對(duì)于單層培養(yǎng)，用 2ml具有不同血清百分比(2%、 5%、 10%)和500pg/ml G418硫酸鹽的 介質(zhì)將2.5xl04HEK293細(xì)胞接種到6孔板上。對(duì)于3D培養(yǎng)，如實(shí)施 例2所述形成微球。細(xì)胞接種密度為500個(gè)細(xì)胞/樣￡球，每個(gè)35mm陪 替氏培養(yǎng)皿50個(gè)微球，等同于起始細(xì)胞數(shù)量為2.&104細(xì)胞。微球懸 浮于2ml具有不同血清百分比(2%、 5%、 10%)和500貼/mlG418硫酸 鹽的介質(zhì)中。對(duì)單層培養(yǎng)和微球培養(yǎng)二者而言，每個(gè)血清百分比有四 份樣品(!1=4)。在所有設(shè)置中每?jī)商焓占⑻鎿Q介質(zhì)，用于GDNF定量。
34在第12天進(jìn)行細(xì)胞存活率檢測(cè)和細(xì)胞計(jì)數(shù)。 結(jié)果
圖IIA和11B分別顯示了單層和3D微球中HEK293細(xì)胞在各時(shí) 間點(diǎn)(第2、 4、 8、 10、 14、 18、 22、 26和30天)的存活率和數(shù)量。 單層組的細(xì)胞數(shù)量總是比微球組的高，它們之間有顯著的差異。在3D 微球組中，除了起始細(xì)胞存活率較低，大約為80%之外，在隨后的全 部時(shí)間點(diǎn)所有組的細(xì)胞存活率都接近100%。在單層組和孩￡球組中， GDNF的累積分泌都與時(shí)間成線性比例(圖12)。單層組和凝:球組的 GDNF累積分泌之間存在顯著差別。在此之后的檢測(cè)顯示第2天和第4 天與所有其他時(shí)間點(diǎn)之間存在顯著差別。圖12B顯示了不同組在不同 時(shí)間點(diǎn)的GDNF分泌速率。對(duì)單層組和微球組二者而言，GDNF的分 泌速率持續(xù)上升，直至第8天。單層組和微球組的分泌速率之間存在 顯著的差別。在第2、 4、 8、 10和14天，3D微球中HEK293細(xì)胞的 GDNF分泌速率分別是單層培養(yǎng)中的笫67、 12、 10、 10和3.5倍。這 表明3D微球中的生產(chǎn)率明顯較高。
單層組和微球組的總GDNF分泌都與細(xì)胞接種密度成線性比例 (圖12C)?？侴DNF分泌在單層組和微球組的之間，以及不同細(xì)胞 密度之間存在顯著差別。由于細(xì)胞數(shù)量的差別很大，單層組的總GDNF 分泌比微球組的高。在各細(xì)胞接種密度下，單層組的細(xì)胞數(shù)量在第12 天比微球組的細(xì)胞數(shù)量高約7-20倍。然而，發(fā)現(xiàn)在所有組中HEK293 細(xì)胞的GDNF分泌速率比單層培養(yǎng)的高(圖12D),而且單層培養(yǎng)和 微球培養(yǎng)之間，以及不同起始細(xì)胞數(shù)量的組之間的差別是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯 著的。
在單層和微球組中，第o天和第12天分泌的總GDNF都與介質(zhì)中 的血清百分比成線性比例(圖12E)。單層組和微球組之間，以及介 質(zhì)中不同的血清百分比之間的總GDNF分泌存在顯著的差別。單層組 的總GDNF分泌總是比微球組的高，在所有血清百分比下差別低于2 倍。在組和介質(zhì)中血清百分比之間沒(méi)有相互作用。然而，在所有血清 百分比下，每天每百萬(wàn)HEK293細(xì)胞的GDNF分泌速率(圖12F)明 顯高于單層培養(yǎng)的。在所有血清濃度下，3D微球中的GDNF分泌速率 的差別超過(guò)4倍，表明3D微球中HEK293細(xì)胞生產(chǎn)率的提高依賴于血清百分比。也表明當(dāng)將膠嚢化的細(xì)胞維持在含2%血清的介質(zhì)中時(shí)，
它們以最高速率分泌GDNF。圖13A和13B分別顯示了在不同血清濃 度下培養(yǎng)的微球中的細(xì)胞存活率和HEK293細(xì)胞數(shù)量。在所有血清濃 度下存活率幾乎都是100% (圖13A),表明降低血清濃度并沒(méi)有顯著 地影響細(xì)胞存活率。因此，可通過(guò)降低血清濃度來(lái)簡(jiǎn)化所分泌蛋白的 下游純化步驟。
實(shí)施例14: HEK293細(xì)胞條件介質(zhì)中的GDNF生物活性測(cè)試 測(cè)量和方法
將PC 12細(xì)胞生長(zhǎng)在24孔板上的81.5Q/。F12K介質(zhì)中，所述介質(zhì) 補(bǔ)充了 15。/。House血清、2.5%胎牛血清和1%PS。含有分泌的GDNF 的條件介質(zhì)(conditioned medium)以1:1的體積比與用于PC12培養(yǎng)的完 全介質(zhì)混合，用于培養(yǎng)PC12細(xì)胞。以每孔大約3000個(gè)細(xì)胞(800微 升)的密度將細(xì)胞鋪平板。2天后，固定細(xì)胞以便在相差顯微鏡下觀 察。具有比一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞體長(zhǎng)度更長(zhǎng)的軸突外生(neurite outgrowth) 的細(xì)胞被認(rèn)為是陽(yáng)性結(jié)果。已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)GDNF也被用作陽(yáng)性對(duì)照。 不含條件介質(zhì)的完全介質(zhì)被用作陰性對(duì)照。
結(jié)果
GDNF標(biāo)準(zhǔn)(10和50ng/ml )和所有的條件介質(zhì)樣品都顯示了 PC12 細(xì)胞中的軸突生長(zhǎng)，而陰性對(duì)照沒(méi)有顯示軸突生長(zhǎng)。這表明HEK293 細(xì)胞釋放到條件介質(zhì)中的GDNF沒(méi)有保留其生物活性。
實(shí)施例15: HEK293細(xì)月包條件介質(zhì)中的GDNF生物活性測(cè)試 將分泌GDNF的HEK293細(xì)胞包裹在3D膠原微球中，培養(yǎng)14天。 在制備10pm厚的冷凍切片之前，在4y。的多聚曱醛中固定微球3小時(shí)， 然后在30%蔗糖溶液中過(guò)夜。用1:100-1:50稀釋的第一抗體(雞抗人 GDNF多克隆抗體(Promega公司))和l:lOO-l:50稀釋的第二抗體(兔 抗雞IgY(Promega公司))進(jìn)行GDNF的免疫組織化學(xué)分析，以證實(shí)其 分泌。用HRP-DAB底物系統(tǒng)來(lái)觀察微球中免疫陽(yáng)性染色的GDNF。 通過(guò)免疫組織化學(xué)分析來(lái)證實(shí)GDNF的合成。GDNF的免疫陽(yáng)性染色 局限于3D微球中的細(xì)胞集落。實(shí)施例16:細(xì)胞-基質(zhì)微球的配制參數(shù)的優(yōu)化
依次加入并混合培養(yǎng)介質(zhì)、NaOH、膠原溶液、硫酸軟骨素溶液和 細(xì)胞懸液，如實(shí)施例1所述制備混合物的100樣i升微球。在標(biāo)準(zhǔn)介質(zhì) 中培養(yǎng)微球1天，然后改為成軟骨性分化介質(zhì)(高葡萄糖DMEM, 10ng/ml重組人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子卩3(Merck公司)，100nM地塞米松(Sigma 公司)，6|tig/ml胰島素(Merck公司)，100mM 2-磷酸-L-抗壞血酸(Fluka 公司)，lmM丙酮酸鈉(Gibco公司)，6嗎/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白(Sigma公司)， 0.35mM L-脯氨酸(Merck公司)和1.25mg/ml牛血清白蛋白(Sigma公 司))。
培養(yǎng)微球21天，每2天更換介質(zhì)。在培養(yǎng)21天后，或者對(duì)樣品 進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析和組織學(xué)分析，以進(jìn)行定性分析；或者在60。C 下在木瓜蛋白酶溶液(溶于50mMPB中的300itig/ml木瓜蛋白酶，含 有5mML-半胱氨酸和5mMEDTA)中消化過(guò)夜，以進(jìn)行軟骨形成的 定量分析。用1,9-二曱基亞甲藍(lán)(DMMB)測(cè)試來(lái)進(jìn)行GAG定量。簡(jiǎn)要 地說(shuō)，向試管中的樣品消化物(sample digest)加入lml的DMMB染料 溶液，在搖動(dòng)器(shaker)上混合容納物30分鐘。將試管在13.2k rpm下 離心10分鐘，形成GAG-染料復(fù)合物沉淀。將沉淀重懸于200微升的 解離劑中，旋渦混合器(vortex)混合，測(cè)量656nm處的吸收。通過(guò)熒光 測(cè)定法由消化混合物定量分析DNA含量。簡(jiǎn)要地說(shuō)，將100微升 Hoechst 33258染料溶液加入樣品消化物，分別用365nm的激發(fā)波長(zhǎng)和 458nm的發(fā)射波長(zhǎng)進(jìn)行熒光測(cè)量。然后用DNA含量使GAG含量歸一 化(normalized)。
結(jié)果
如圖14A所示，隨著細(xì)胞接種密度和膠原濃度的提高，沉積在膠 原微球中的GAG的量提高。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示四個(gè)細(xì)胞接種密度組之間 以及膠原密度組之間的差別是顯著的(p0.05)。當(dāng)用DNA含量歸一化 時(shí)，GAG/DNA的量也隨細(xì)胞接種密度和膠原濃度的提高而提高，如 圖14B所示。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析也顯示不同組之間也存在顯著差異(p0.05)。
權(quán)利要求
1. 細(xì)胞-基質(zhì)微球，其包含細(xì)胞、第一細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，所述基質(zhì)形成納米纖維微球，由于細(xì)胞外基質(zhì)的相變，所述微球包埋所述細(xì)胞。
2. 權(quán)利要求l的微球，其中第一細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)細(xì)胞提供支持，與 細(xì)胞相互作用，使得細(xì)胞在無(wú)毒性的條件下生長(zhǎng)，并使細(xì)胞從微球中 遷移以進(jìn)行生長(zhǎng)。
3. 權(quán)利要求l的微球，其中第一細(xì)胞外基質(zhì)是膠原。
4. 權(quán)利要求1的微球，其中在特定條件下第一細(xì)胞外基質(zhì)可被誘 導(dǎo)重建為固體形式，所述條件足夠溫和以支持細(xì)胞存活和生長(zhǎng)。
5. 權(quán)利要求l的微球，其進(jìn)一步包含第二細(xì)胞外基質(zhì)，所述第二 細(xì)胞外基質(zhì)選自蛋白聚糖和糖胺聚糖(GAGs)。
6. 權(quán)利要求5的微球，其中第二細(xì)胞外基質(zhì)由選自軟骨、纖維蛋 白、彈性蛋白和透明質(zhì)酸的物質(zhì)制成。
7. 權(quán)利要求5的微球，其中第一細(xì)胞外基質(zhì)可以與活細(xì)胞或與第 二細(xì)胞外基質(zhì)相互作用，所述相互作用的方式使得體積或容積、細(xì)胞 外基質(zhì)密度、細(xì)胞密度、機(jī)械特性或穩(wěn)定性發(fā)生改變。
8. 權(quán)利要求1的微球，其中細(xì)胞包括分離自骨髓、皮膚、胃腸道、 脂肪組織、胎盤、推間盤、軟骨、肌肉、皮膚、腱、韌帶和神經(jīng)的成 熟細(xì)月包、間質(zhì)細(xì)l包或干細(xì)月包。
9. 權(quán)利要求1的微球，其中細(xì)胞是來(lái)源于骨髓的間質(zhì)干細(xì)胞 (MSC)，它是自體的或是來(lái)自HLA匹配供體的同種異體的。
10. 權(quán)利要求1的微球，其中細(xì)胞被基因工程化或經(jīng)過(guò)基因篩選， 以生產(chǎn)生物分子。
11. 權(quán)利要求1的微球，其進(jìn)一步包含生長(zhǎng)刺激因子，所述因子 可選自人血清、富血小板血漿和其他血液制品。
12. 權(quán)利要求l的微球，其進(jìn)一步包含分化因子。
13. 權(quán)利要求1的微球，其進(jìn)一步包含治療、預(yù)防或診斷藥劑。
14. 制備微球的方法，其包括在促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)相變的溫度下將細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞混合并分 配，形成細(xì)胞-基質(zhì)微球，在維持液滴為球形的表面上分配細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)混合物形成液滴；加快細(xì)胞外基質(zhì)的相變或凝膠化，形成細(xì)胞-基質(zhì)微球。
15. 權(quán)利要求14的方法，其包括在平臺(tái)上收集細(xì)胞-基質(zhì)微球。
16. 權(quán)利要求15的方法，其包括在分配側(cè)部將組合物維持在 0°C-10°C的溫度下。
17. 權(quán)利要求14的方法，其包括將收集平臺(tái)的溫度提高至 25-37。C,以加快相變一段時(shí)間，所述時(shí)間足以使細(xì)胞外基質(zhì)凝膠化， 但不足以使細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變。
18. 權(quán)利要求14的方法，其中通過(guò)將混合物的溫度維持在低至 4。C使基質(zhì)的凝膠化速度在凝膠化起始之后立即減慢。
19. 權(quán)利要求14的方法，其中通過(guò)將混合物的溫度提高到37°C 而在將正在膠凝的基質(zhì)在收集單元上分配成液滴之后立即加快基質(zhì)的 凝膠化。
20. 權(quán)利要求14的方法，其包括用最小的機(jī)械擾動(dòng)從收集平臺(tái)上收集微球；維持微球在第一介質(zhì)中自由浮動(dòng)一段延長(zhǎng)的時(shí)間，直至微球的大小基本上恒定；并且從第 一介質(zhì)中釋放出微球。
21. 權(quán)利要求20的方法，其中微球在約37。C的溫度下維持自由 浮動(dòng)狀態(tài)約2至7天。
22. 操作細(xì)胞從微球中遷移的方法，所述微球是如權(quán)利要求1-13 定義的由細(xì)胞外基質(zhì)膠嚢化的細(xì)胞形成的微球，所述方法包括以下步 驟通過(guò)將微球鋪在培養(yǎng)皿的固體基底上或?qū)⑽⑶蜾佋谡谀z凝的基 質(zhì)中或鋪在已凝膠化的基質(zhì)上而對(duì)微球提供機(jī)械支持； 微球被鋪成各微球彼此保持一段距離； 向培養(yǎng)系統(tǒng)中加入第二介質(zhì)，用于保持微球； 使細(xì)胞從微球中遷移；并且 在一段延長(zhǎng)的時(shí)間后從第二介質(zhì)中釋放出微球。
23. 權(quán)利要求22的方法，其中遷移出微球的細(xì)胞被冷凍保藏或重新膠嚢化。
24. 向動(dòng)物或人的組織中注入或植入權(quán)利要求l-13任一項(xiàng)的細(xì)胞 -基質(zhì)微球的方法，其包括提供細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)微球，所述微球處于 用于注入或植入組織的藥用介質(zhì)中。
25. 權(quán)利要求24的方法，其進(jìn)一步包括將樣i球注入或植入組織。
26. 權(quán)利要求25的方法，其中細(xì)胞是間質(zhì)干細(xì)胞、軟骨形成細(xì)胞 或分離自組織的細(xì)胞。
27. 權(quán)利要求26的方法，其進(jìn)一步包括在注入或植入之前誘導(dǎo)細(xì) 胞分化。
28. 制備生物分子的方法，其包括培養(yǎng)權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的細(xì) 胞-細(xì)胞外基質(zhì)微球中的細(xì)胞。
29. 用于由細(xì)胞外基質(zhì)和膠嚢化細(xì)胞制備微球的系統(tǒng)，其包括 用于將細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞的混合物分配成液滴的分配單元； 用于收集分配的液滴的收集平臺(tái)，所述平臺(tái)具有一個(gè)表面，該表面的表面特性使得液滴維持為球形，并且使基質(zhì)凝膠化形成固體的細(xì) 胞-基質(zhì)微球。
30. 權(quán)利要求29的系統(tǒng)，其進(jìn)一步包括用于控制分配器的分配速 度、體積和位置的控制單元。
31. 權(quán)利要求29的系統(tǒng)，其進(jìn)一步包括溫度控制單元。
32. 權(quán)利要求29的系統(tǒng)，其中可通過(guò)在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間控制液體環(huán)境 的溫度、pH和離子強(qiáng)度來(lái)起始相變過(guò)程。
33. 權(quán)利要求29的方法，其進(jìn)一步包括使靜態(tài)培養(yǎng)容器或生物反 應(yīng)器有規(guī)律地?cái)噭?dòng)、自轉(zhuǎn)或旋轉(zhuǎn)。
全文摘要
使用低形態(tài)和機(jī)械穩(wěn)定性的基質(zhì)或生物材料系統(tǒng)，開(kāi)發(fā)了生產(chǎn)穩(wěn)定的細(xì)胞-基質(zhì)微球的方法，所述微球具有最高100％的膠囊化效率和高的細(xì)胞存活率，其應(yīng)用包括通過(guò)微注射或外科植入進(jìn)行的細(xì)胞療法；用于體外擴(kuò)展的3D培養(yǎng)，不需要用酶促消化或機(jī)械解離重復(fù)地進(jìn)行細(xì)胞分離；提高治療性生物分子的產(chǎn)量；用于形態(tài)發(fā)生研究的體外模塑。改進(jìn)的微滴生成法是簡(jiǎn)單的，可擴(kuò)展的，當(dāng)所用的基質(zhì)或生物材料系統(tǒng)濃度低、相變慢、形態(tài)和機(jī)械穩(wěn)定性差時(shí)仍能生產(chǎn)細(xì)胞-基質(zhì)微球。
文檔編號(hào)A61K48/00GK101448527SQ200780018296
公開(kāi)日2009年6月3日 申請(qǐng)日期2007年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月19日
發(fā)明者B·P·陳, D·陳, G·C·-F·陳, H·L·黃, K·S·-E·戚, P·T·張 申請(qǐng)人:香港大學(xué)