專利名稱：：扎考比利作為制備治療心律失常藥物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，主要涉及治療心律失常的藥物，具體為扎考比利作為制備治療心律失常藥物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：心律失常是指心跳頻率和節(jié)律的異常，心律失常是臨床上常見的心血管疾病，嚴重心律失常往往是患者的主要死因之一。心肌缺血、缺氧、酸中毒/堿中毒、電解質(zhì)紊亂、藥物中毒、心肌損傷等均可誘發(fā)心律失.常。心律失常發(fā)生的基本機制有折返、自律性異常和觸發(fā)性活動。亦即所有心律失常均是由于沖動傳導(dǎo)障礙及沖動形成障礙或二者兼有所引起的。形成嚴重心律失常的機制很復(fù)雜，往往不是單一的機制，但是究其根本，都有離子通道功能活動的改變，由此引起離子流的變化會影響動作電位的發(fā)生和形態(tài)，從而具有致心律失?；蛑涡穆墒С５淖饔?。目前所用抗心律失常藥的作用機制1.降低自律性>增加最大舒張電位(4相)，促進4相K+外流。>減慢4相除極速度，抑制Na+、Ca^內(nèi)流。2.消除后除極，觸發(fā)活動>早后除極鈣拮抗藥。>遲后除極鈣拮抗藥，阻斷Na+、(^2+交換電流。3.改變膜反應(yīng)性，改變傳導(dǎo)，消除折返>增強膜反應(yīng)性，增加膜電位，膜電位絕對值越大，反應(yīng)性越高，則可改變傳導(dǎo)，消除單向阻滯(苯妥英鈉)。>降低膜反應(yīng)性，減慢傳導(dǎo)，導(dǎo)致單向阻滯區(qū)變?yōu)殡p向的完全阻滯，消除折返環(huán)路。4.改變動作電位時程和有效不應(yīng)期，消除折返>絕對延長有效不應(yīng)期延長動作電位時程，延長有效不應(yīng)期，消除折返。>相對延長有效不應(yīng)期動作電位時程的縮短大于有效不應(yīng)期的縮短，消除折返。>使相鄰細胞不均一的有效不應(yīng)期趨向均一化。長期以來，人們一直致力于抗心律失常藥物的研究。目前臨床應(yīng)用的抗心律失常藥物主要的作用靶點是電壓門控鈉通道(INa)、延遲整流鉀通道(IK)和L型鈣通道(ICai)，根據(jù)藥物對離子通道和受體的作用，將治療快速型心律失常藥物分成四類I類鈉通道阻滯藥>Ia:中等強度(適度阻滯鈉通道)，如奎尼丁、普魯卡因胺>Ib:輕度阻滯鈉通道，如利多卡因、苯妥英鈉、美西律、妥卡尼>Ie:重度阻滯鈉通道，如普羅帕酮、氟卡尼此類藥物可使阻斷鈉通道，改變單向組織區(qū)的傳導(dǎo)，消除折返。II類p受體阻斷藥，如普萘洛爾，此類藥物可使4相去極化電流減小，自律性降低。III類延長動作電位時程藥(鉀通道阻滯藥)，如胺碘酮，抑制Ik，使復(fù)極化3相鉀離子外流減少，延長動作電位時程和有效不應(yīng)期延長，消除折返。W類鈣通道阻滯藥，如維拉帕米，阻斷鈣通道，使動作電位4相鈣離子內(nèi)流減少，慢反應(yīng)細胞自律性降低，可用來治療室上性心律失常?！陨纤念愔饕委熆焖傩托穆墒С！獙徛托穆墒С?，可用阿托品、異丙腎上腺素來治療——其他藥物如去氧腎上腺素、新斯的明可治療室上性心動過速目前無論哪種抗心律失常藥物均有一定的致心律失常作用。I類藥物可因阻斷鈉通道減慢傳導(dǎo)而誘發(fā)折返；III類藥物因延長動作電位時程而誘發(fā)長QT綜合癥。這引起了人們的重視，尋找新的更安全的治療方法迫在眉睫。九十年代中期以后，心導(dǎo)管介入技術(shù)治療各類心律失常取得了很大進展，開辟了心律失常治療的新方向。但介入治療有一定的適應(yīng)癥范圍，故對于多數(shù)心律失?；颊叨?，藥物治療仍是治療的主要方法或必需的組成部分，其中利多卡因是公認的治療室性心律失常的藥物。以往研究心律失常藥物時，內(nèi)向整流鉀通道(lKi通道)是一個不被重視的耙點。因為迄今所有抗心律失常藥物都是通道阻斷劑，而lK,是心肌最主要的背景外向電流，阻斷I^通道雖可延長動作電位時程，但同時由于背景外向電流的減小而導(dǎo)致靜息電位減小或自律細胞的最人舒張期電位減小，從而降低了心肌傳導(dǎo)性，提高了自律性，產(chǎn)生致心律失常的效應(yīng)。因此至今還沒有一種特異性阻斷IK1的抗心律失常藥物問世。1993年Kubo克隆成功IK1通道以來，對IK1的結(jié)構(gòu)、功能和電生理特性得到了較深入的研究。研究表明，Andersen-Tawil綜合癥的主要病因是KCNJ基因(心室肌Ik,通道的主要基因)突變，導(dǎo)致Kir2.1通道功能減弱或喪失；計算機模擬的研究顯示，降低Kir2.1通道的電導(dǎo)，可致動作電位復(fù)極終末延遲，靜息電位減小(去極化)，出現(xiàn)自發(fā)的室性心律失常；動物實驗證實，心肌缺血時膜電位的減小和心律失常的發(fā)生，內(nèi)皮素、血管緊張素II的致心律失常作用，心衰時胞內(nèi)C^+濃度升高所致的心律失常等均與Tja電流的抑制有關(guān)。因此可以設(shè)想，激動I^通道將具有抗心律失常的效應(yīng)。但是至今國內(nèi)外還未見有選擇性lKi通道激動劑的報道，更未見通過特異性激動Iiu通道在人或動物發(fā)揮抗心律失常效應(yīng)的報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明為了解決現(xiàn)有抗心律失常藥物均有一定的致心律失常作用，以及目前為止國內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)lK,選擇性激動劑的問題，提供扎考比利(Zacopride)的新用途，即在制藥中的新應(yīng)用——扎考比利作為制備治療心律失常藥物的應(yīng)用。實際上，本發(fā)明涉及扎考比利作為制備治療心律失常藥物的應(yīng)用。所述的扎考比利制劑為膠囊、微囊、脂質(zhì)體、顆粒體、注射液、片劑和口服液。扎考比利(Zacopride)，胃動力促進劑，為呱啶苯酰胺衍生物，屬5-HT3受體阻斷藥和5-HT4受體激動劑，目前用于促進胃動力和腸運轉(zhuǎn)，也作為促進腦代謝循環(huán)藥治療老年癡呆癥。扎考比利的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為在一項促腸道動力藥致心律失常作用的篩查試驗中，我們發(fā)現(xiàn)扎考比利(Zacopride)無致心律失常副作用，且可增強I]U通道電流，但對Ica-L、INa、Ito、IK、iNa/Ca等主要的心肌離子電流均無顯著影響。這項結(jié)果提示扎考比利(Zacopride)可作為IK1選擇性激動劑，成為一種新的抗心律失常藥物。本發(fā)明采用SD大鼠和豚鼠(只用于觀測lK通道)進行實驗，通過測定扎考比利(Zacopride)對心室肌細胞離子通道電流的影響及測定扎考比利(Zacopride)對大鼠缺血性以及再灌注性心律失常作用的影響，證實了上述的啟示。具體證實內(nèi)容如下A.l~30pmol/L范圍內(nèi)，扎考比利(Zacopride)呈濃度依賴性增強IK1，10nmol/L扎考比利(Zacopride)使IK1電流密度增加29.45%(P<0.01)。130nmol/L范圍內(nèi)扎考比利(Zacopride)對ICa-L、INa、It。、IK、iNa/ca無明顯影響，顯示扎考比利(Zacopride)對通道激動作用的特異性。扎考比利(Zacopride)對靜息膜電位、動作電位幅度(ActionpotentialAmplitude,APA)、動作電位復(fù)極50%時程(Actionpotentialdurationat50%repolarization,APD5o)以及動作電位復(fù)極900/o時程(Actionpotentialdurationat卯％repolarization,APD9o)的影響。在3~40|nmol/L范圍內(nèi)，扎考比利(Zacopride)可濃度依賴性增大靜息電位，增加動作電位幅度，縮短動作電位復(fù)極50°/。時程(APD5o)以及動作電位復(fù)極90°/。時程(APD90)。B.扎考比利(Zacopride)對缺血及再灌注引起的期前收縮數(shù)目、室速持續(xù)時間、室顫持續(xù)時間、室顫發(fā)生率均具有顯著抑制作用，呈劑量依賴性，50mnol/kg為扎考比利(Zacopride)最適給藥濃度；抑制心律失常的效應(yīng)與公認的抗心律失常藥利多卡因(lidocaine)相似。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和效果1.扎考比利(Zacopride)是目前首次發(fā)現(xiàn)的選擇性心肌Ija通道激動劑，并用于抗心律失常的藥物的研究。2.扎考比利(Zacopride)作為治療缺血再灌注性心律失常的藥物，其效果與利多卡因相似，作用穩(wěn)定，對心律無明顯影響，安全范圍大。在缺血再灌注誘發(fā)心律失常的實驗中，利多卡因可使心律減慢，扎考比利(Zacopride)則無明顯影響；利多卡因在劑量增加1/3時其抗心律失常作用明顯減弱，扎考比利(Zacopride)則在100倍有效濃度時才出現(xiàn)此現(xiàn)象。圖1.扎考比利(Zacopride)對大鼠心室肌細胞Iiu電流的影響.圖1中a:正常對照b:扎考比利3pmol/Lc:扎考比利lOpmol/Ld:扎考比利30pmol/L圖2.大鼠心室肌細胞IK1電流的I-V曲線及扎考比利(Zacopride)對大鼠心室肌細胞膜IK1電流的作用圖3.扎考比利(Zacopride)對大鼠心室肌細胞ICa-L電流的影響圖3中a:對照；b:扎考比利3pmol/Lc:扎考比利lOpmolb:扎考比利30pmol/L;圖4.大鼠心室肌細胞L型鈣通道的I_V曲線及扎考比利(Zacopride)對大鼠心室肌細胞ICa-L電流的影響圖5.扎考比利(Zacopride)對大鼠心室肌細胞INa電流的影響。圖5中a:正常對照b:扎考比利30nmol/L圖6.大鼠心室肌細胞lNa電流的I-V曲線及扎考比利(Zacopride)對大鼠心室肌細胞鈉電流的影響圖7.扎考比利(Zacopride)對大鼠心室肌細胞It。電流的影響.圖7中a:正常對照b:扎考比利3(Hunol/L圖8.大鼠心室肌細胞It。電流的I-V曲線及扎考比利(Zacopride)對大鼠心室肌細胞膜It。電流的影響圖9.扎考比利(Zacopride)對大鼠心室肌細胞INa/Ca電流的影響圖9中a:正常對照b:扎考比利30nmol/Lc:5mmoI/LNiCl2圖10.扎考比利(Zacopride)對豚鼠心室肌細胞IK電流的影響圖IO中a:正常對照b:扎考比利lOpmol/L圖11.豚鼠心室肌細胞IK電流的I-V曲線及扎考比利(Zacopride)対豚鼠心室肌細胞膜Ik電流的影響圖12.扎考比利(Zacopride)對大鼠心室肌細胞動作電位的影響.圖12中a:正常對照b:扎考比利3pmol/Lc:扎考比利10pmol/Ld:扎考比利30pmol/Le:扎考比利40nmol/L圖13.不同濃度扎考比利(Zacopride)在15分鐘缺血期內(nèi)的期前收縮數(shù)圖14.不同濃度扎考比利(Zacopride)組在15分鐘缺血期內(nèi)室速、室顫持續(xù)時間的比較.圖15.大鼠正常及缺血性心律失常時的心電圖.圖15中A缺血性心律失常心電圖(未給藥)B缺血前2分鐘股靜脈注射扎考比利50nmol/kg，可有效預(yù)防缺血性心律失常C缺血前5分鐘股靜脈注射利多卡因7.5mg/kg，可有效預(yù)防缺血性心律失常D缺血前5分鐘股靜脈注射利多卡因10mg/kg，可促進心律失常的發(fā)生。a:缺血前心電圖b:冠狀動脈左前降支結(jié)扎后l分鐘C:室性期前收縮d:室速e:室顫f:缺血前股靜脈注射利多卡因10mg/kg可明顯減慢心率g:利多卡因10mg/kg抗心律失常作用明顯減弱，出現(xiàn)室顫及期前收縮。圖16.不同濃度扎考比利(Zacopride)在15分鐘再灌注期內(nèi)室速、室顫持續(xù)時間的比較具體實施例方式下面用扎考比利(Zacopride)進行關(guān)于對IK1通道的激動作用的實驗研究及對抗心律失常作用的探討，說明其在制藥領(lǐng)域的新用途。實施例l:扎考比利(Zacopride對心室肌細胞離子通道電流的影響1材料與方法1.1實驗動物健康SD大鼠，雄性，體重220—260g，購自河南鄭州大學(xué)實驗動物中心。1.2藥品與試劑Zac叩ridehydrochloride購自TOCRIS。膠原酶P購自德國BochringerMannhein公司，?；撬?taurine)、四乙胺(tetraethylammoniumchloride,TEA)、4-氨基吡啶(4-aminopyridine,4-AP)、尼卡地平(nicardipine)、三磷酸腺苷二鈉鹽(adenosine5'-triphosphatedisodiumsalt)、三磷酸腺苷二鉀鹽(adenosine5'-triphosphatedipotassiumsalt)、三磷酸腺苷鎂鹽(adenosine5'-triphosphatemagnesiumsalt)、DL-天門冬氨酸鉀鹽(DL-asparticacidpotassium)、L-谷氮酸(L-glutamicacid)、EthyleneGlycol-bis(beta-aminoethyl-ether)-N,N,N，,N，-TetraAcetate(EGTA)、肌酸磷酸鈉鹽(creatininephosphatesodiumsalt)購自美國Sigma公司；HEPES(N-2-hudroxyethylpiperazine-N'-2-ethane-sulfonicacide)購自美國sigma公司，其余均為國內(nèi)生產(chǎn)分析純產(chǎn)品。1.3主要儀器Axopatch200B膜片鉗放大器(AxonInstrument,USA)、Digidate1322A模數(shù)轉(zhuǎn)換器(AxonInstrument,USA)及Pclamp8.0(AxonInstrumen，USA)、微電極拉制儀(Narishige，PP—83，CO.Japan)1.4試劑配制1.4.1溶液配制1.臺氏液(mmol/L):NaCl140，KC15.4,NaH2P040.33，HEPES5.0，glucose10，MgCl21.0，CaCl21.8，用NaOH調(diào)節(jié)PH至7.38。2.酶液(mmol/L):NaCl125,KC15.4,CaCl275,MgCl21.0,NaH2P040.33,4-(2-hydroxyethyl)-l-piperazine-ethanesulfonicacid(HEPES)10,glucose10，taurine20，CollagenaseP(BoehringeMannheim,Germary)膠原酶P0.1-0.3mg/ml(3.5—5mg)。3.KB液(mmol/L):KOH85，L隱谷氨酸50，KC130，taurine20，KH2PO430，MgCl21.0，HEPES10，葡萄糖10，EGTA0.5，用KOH調(diào)節(jié)PH至7.4。4.扎考比利(Zacopride)原液用去離子水溶解zacopride濃度為lmmol/L。使用時按需要稀釋。1.4.2電極內(nèi)液的配制1.L-型鈣電流(Ica-0的電極內(nèi)液成份(mmol/L):KC1150，HEPES5，EGTA5.0,ATP-K23.0，MgCl21.0，4-AP5.0,ATP-Mgl.O，用KOH調(diào)節(jié)PH至7.3。細胞外灌流液為臺氏液。2.瞬時外向鉀電流(Ito)的電極內(nèi)液成份(mmol/L):KC1150，HEPES5.0，EGTA5.0,ATP-K23.0，MgCl21.0，用KOH調(diào)節(jié)PH至7.3。細胞外灌流液為臺氏液中加入CdCl20.1mmol/L，BaCl20.2mml/L，分別阻斷Ic"及內(nèi)向整流鉀通道。3.內(nèi)向整流鉀電流(IK1)電極內(nèi)液成分與Ica-L相同。細胞外液在臺氏液中加入CdCl20.5mmol/L阻斷Ica—L電流。4.鈉電流(lNa)的電極內(nèi)液(mmol/L):NaCl5.0,CsCl20,KC1110,MgCl21.0,HEPES5.0，EGTA5.0，Mg—ATP5.0,用CsOH調(diào)節(jié)PH至7.2。細胞外灌流液成份(mmol/L):NaCl50,CsCl90,MgCl21,glucose10,CaCl20.5,CoCl20.5,HEPES5.0,用CsOH調(diào)節(jié)PH至7.45.鈉鈣交換電流(lNa/ca)的電極內(nèi)液成份(mmol/L):天門冬氨酸鉀42，MgCl213，EGTA42,CaCl229，ATP-K210，磷酸肌酸鈉鹽5.0，HEPES5.0，4-AP20，用CsOH調(diào)節(jié)PH至7.3。細胞外液成份(mmol/L):NaCl140，CaCl21.8，MgCl22.0，HEPES5.0，葡萄糖10，用CsOH調(diào)節(jié)PH至7.4，加入尼卡地平lpmol/L，哇巴因20pmol/L，BaCl21.0mmol/L，CsCl2mmol/L,分別阻斷L型鈣通道、鈉鉀泵和鉀通道。2實驗方法2.1單個心室肌細胞的分離方法-選用健康成年SD大鼠220-260g，雄性，術(shù)前15分鐘腹腔靜脈注射肝素(1000U/kg)，戊巴比妥鈉(65mg/kg,ip)麻醉后頸動脈放血，迅速開胸取出心臟，置于4。C用100%氧氣飽和的無鈣臺氏液中修剪，然后將心臟懸掛在Langendorff灌流裝置上經(jīng)主動脈逆行灌流。先用無鈣臺氏液灌流8~10分鐘，再用酶液循環(huán)灌流1520分鐘。灌流過程中保持37°C恒溫，灌流壓70cmH2O，，并持續(xù)通以100%氧氣。待心室肌組織變大、變軟后將其剪碎，置于KB液中輕輕吹打得到分散的心室肌細胞，經(jīng)150jim孔徑的濾網(wǎng)過濾后保存于KB液中，室溫放置56小時進行實驗。2.2全細胞膜片鉗記錄方法實驗前先將存放于高鉀KB液中的細胞逐步復(fù)鈣。然后取幾滴細胞懸液加入細胞池(約lml)，平放在連有微操縱儀的倒置顯微鏡上靜置10min，待細胞充分貼壁后，用臺氏液灌流，速度約12ml/min。電極用玻璃毛細管經(jīng)微電極拉制儀(Narishige，PP—83，CO.Japan)分兩步拉制而成，充灌電極內(nèi)液后，電阻約25MQ。選取橫紋清晰的心肌細胞進行實驗。形成高阻抗封接后，用負壓破膜，進行全細胞記錄。離子電流信號經(jīng)Axopatch200B膜片鉗放大器(AxonInstrument,USA)、Digidate1322A模數(shù)轉(zhuǎn)換器(AxonInstrument,USA)及Pclamp8.0(AxonInstrumen，USA)采集、忙存及分析，并保存在電腦硬盤中，所有實驗均在室溫25°C下進行。應(yīng)用電流密度(即單位膜電容的膜電流)表示膜電流的大小。電壓鉗方式下進行全細胞離子流記錄，電流鉗方式下記錄單細胞動作電位。2.3觀測指標觀察扎考比利(Zacopride)對大鼠心室肌細胞L-型Ca^電流(Ica丄)、INa、瞬時外向鉀電流(It。)以及內(nèi)向整流鉀電流(IK1)和心室肌細胞lNa/ca的影響；觀察扎考比利(Zacopride)對豚鼠心室肌細胞lK電流的影響；觀察扎考比利(Zacopride)對大鼠心室肌細胞跨膜電位、動作電位幅度(ActionpotentialAmplitude,APA)動作電位復(fù)極50%時程(Actionpotentialdurationat50%repolarization,APD50)以及動作電位復(fù)極90%時程(Actionpotentialdurationat90%repolarization，APD90)的影響。2.4數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)以均數(shù)士標準差(Mean士SD)表示，采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，P<0.05為具有顯著性差異。3實驗結(jié)果3.1扎考比利(Zacopride)對大鼠心室肌細胞內(nèi)向整流鉀電流(IK1)的影響維持電位-40mv，給予超極化至-100mv，持續(xù)470ms的階躍式脈沖激活I(lǐng)kl，在細胞外液中加入CdCl20.5mmol/L以阻斷1^—^電流。扎考比利(Zacopride)呈濃度依賴性增強IK1，10pmol/L扎考比利(Zacopride)可使IK1電流密度增加29.45%(P<0.01)。30pmol/L扎考比利(Zac叩ride)可使IK1電流密度增加38.53%(P<0.01)。見表1、圖1(圖1中a:正常對照b:扎考比利3nmol/Lc:扎考比利10pmol/Ld:扎考比利30pmol/L)，圖2。表l.扎考比利(Zacopride)對大鼠心室肌細胞IK1電流的影晌.<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>與對照組相比*<0.05**P<0.013.2扎考比利(Zacopride)對大鼠心室肌細胞各離子通道的影響3.2.1扎考比利(Zacopride)對大鼠心室肌細胞L-型Ca^電流(Ica.O的影響測定L-型鈣離子通道電流(L-typecalciumcurrent,Ica-O時，維持電位-40mv，去極化到+10mv，持續(xù)500ms的階躍脈沖激活I(lǐng)ca-L口為確認記錄到的電流為Ica丄,在細胞外液中加入5|amol/L尼卡地平，可完全阻斷該電流，從而支持所記錄的電流為Ic^口破膜后平衡5分鐘，待Ic"穩(wěn)定后加入藥物進行實驗.。1-30pmol/L范圍內(nèi)扎考比利(Zacopride)對Ica丄無明顯作用，用藥前后電流密度相比無統(tǒng)計學(xué)差異，PX).05。見表2，圖3(a:正常對照b:扎考比利3nmol/Lc:扎考比利10nmol/Ld:扎考比利30nmol/L)，圖4。表2.扎考比利(Zacopride)對大鼠心室肌細胞ICa-L電流的影響.pmol/L細胞例數(shù)電流密度(PA/PF)變化率(％)0511.13±1.131.0511.16±1.24+0.263.0510.91±1.55-1.9810,0511.87±1.36+1.0730.0512.06±1.41+8.353.2.2扎考比利(Zacopride)對大鼠心室肌細胞INa的影響測鈉電流時，維持電壓-80mV，去極化至0mV，持續(xù)50ms的階躍脈沖激活I(lǐng)Na。1-30nmol/L扎考比利(Zacopride)對I他無顯著影響。用藥前后電流密度相比無統(tǒng)計學(xué)差異，P〉0.05。見表3、圖5(圖5中a:正常對照b:扎考比利30nmol/L)，圖6。表3.扎考比利(Zacopride)對大鼠心室肌細胞INa電流的影響Hmol/L細胞例數(shù)電流密度(PA/PF)變化率(％)0.0638.16±1.461.0636.78±1.33-3.623.0639.21±1.18+2.7510.0637.64士1.39-1.3630.0637.92±1.34-0.633.2.3扎考比利(Zacopride)對大鼠心室肌細胞瞬時外向鉀電流(It。)的影響測定It。時，維持電壓-40mV，去極化至+50mV，持續(xù)60ms的階躍脈沖激活I(lǐng)t。，在細胞外液中加入CdCl20.5mmol/L，BaCl20.5mmol/L，分別阻斷Ica-L及內(nèi)向整流鉀通道電流(Ikl)。扎考比利(Zacopride)1-30pmol/L對It。無明顯影響。用藥前后電流密度相比無統(tǒng)計學(xué)差異，P>0.05。見表4、圖7(圖7中a:正常對照b:扎考比利30nmol/L)，圖8。表4.扎考比利(Zacopride)對大鼠心室肌細胞It。電流的影晌.pmol/L細胞例數(shù)電流密度(PA/PF)變化率(％)0.0624.39±1.231.0623.72±1.34-1.333.0624.41±1.25+0.3110.0623.64±1.12-3.0830.0623.21±1.16-4.843.2.4扎考比利(Zacopride)對大鼠心室肌細胞INa/Ca的影響iNa/ca測定，運用鋸齒電壓程序記錄電流一電壓關(guān)系，維持電壓為-40mV，斜坡電壓由+60mV降為-120mV，下降速度90mV/s，記錄到電流一電壓關(guān)系，5mmol/L的NiCl2使正向和反向INa/Ca均減小。利用NiCb阻斷前后的電流差，得到Ni2+敏感電流即lNa/Ca。扎考比利(Zacopride)對iNa/ca無明顯影響，用藥前后相比無統(tǒng)計學(xué)差異，P>0.05。見表5、圖9(圖9中a:正常對照b:扎考比利30|imol/Lc:5mmol/LNiCl2)。表5.扎考比利(Zacopride)對大鼠心室肌細胞INa/Ca電流的影響.電流密度(PA/PF)Hmol/L細胞例數(shù)-+70mv-70mv0,060息0.060.48±0.051.060.88±0.070.47±0.063.060.91±0.110.49±0.0310.060.88±0.090.48±0.0430.060.91±0.030.47±0.033.3扎考比利(Zacopride)對豚鼠心室肌細胞IK的影響由于大鼠心室肌細胞k通道分布密度低，所以另外采用豚鼠觀察扎考比利(Zacopride)對心室肌細胞k的影響，豚鼠心室肌細胞分離方法、電流記錄方法與大鼠實驗相似。結(jié)果顯示，扎考比利(Zacopride)對ik無明顯影響。用藥前后Ik密度相比P〉0.05。見表6，圖10(圖10中a:正常對照b:扎考比利10^imol/L)，圖11。表6.扎考比利(Zacopride)對豚鼠心室肌細胞IK電流的影響.__Hmol/L細胞例數(shù)電流密度(PA/PF)變化率(％)0.0613.20±1.891.0612.78±2.32-3.193.0612.84±2.16-3.7210.0612.67±1.99-4.0230.0613.01±2.05-1.443.4扎考比利(Zacopride)對大鼠心室肌細胞跨膜電位的影響采用全細胞膜片鉗記錄，以電流鉗制模式記錄靜息電位(Restingpotential,RP)和動作電位(Actionpotential,AP)，AP由3ms，0.5Hz，700pA-1000pA的內(nèi)向電流激發(fā)口分別觀察扎考比利(Zacopride)對跨膜電位口動作電位幅度(ActionpotentialAmplitude,APA)動作電位復(fù)極50%時程(Actionpotentialdurationat50%repolarization,APDso)以及動作電位復(fù)極90%時程(Actionpotentialdurationat90%repolarization,APD9。)的影響□扎考比利(Zacopride)對靜息電位、動作電位幅度和動作電位時程的影響見表7，圖12(圖12中a:正常對照b:扎考比利3pmol/Lc:扎考比利lO^mol/Ld:扎考比利3(Himol/Le:扎考比利40pmol/L)。在34(Himol/L范圍內(nèi)扎考比利(Zacopride)可濃度依賴性增強靜息電位,增大動作電位幅度，并縮短動作電位復(fù)極50n/。時程(APD5(3)以及動作電位復(fù)極90n/。時程(APD90)。表7扎考比利(Zacopride)對大鼠心室肌細胞靜息電位、動作電位幅度和動作電位時程的影響<table>complextableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>實施例2:扎考比利(Zacopride)抗大鼠缺血性、再灌注性心律失常作用的研究1材料與方法1.1實驗動物健康SD大鼠，雄性，體重220—260g,購自河南鄭州大學(xué)實驗動物中心。1.2藥品與試劑Zacopridehydrochloride購自TOCRIS。鹽酸Lidocaine注射液購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司。1.3主要儀器Rm6240多道生理信號采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠)；HX-200動物呼吸機(成都泰盟科技有限公司)1.4試劑配制1.4.1溶液配制1.扎考比利(Zacopride)原液用去離子水溶解zacopride濃度為lmmol/L。使用時按需要稀釋。.2.利多卡因原液(0.1g/5ml):使用時按7.5mg/kg取用2實驗方法2.1缺血性心律失常模型制備方法2丄1實驗分組健康SD大鼠48只，隨機分為6組，即生理鹽水對照組、扎考比利(Zac叩ride)5nmol/kg組、15nmol/kg組、50nmol/kg組和利多卡因(7.5mg/kg)陽性對照組。2丄2實驗方法將大鼠用戊巴比妥鈉(65mg/kg，ip)麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)臺上，然后頸部正中切口，氣管插管，接人工呼吸機(DH—1型)；頸總動脈插管后，Rm6240多道生理信號采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠)連續(xù)記錄n導(dǎo)聯(lián)心電圖和血壓。于胸骨左側(cè)鎖中線第4、5肋間切口開胸，在冠狀動脈左前降支(LAD)發(fā)出后的2mm處，用6-0醫(yī)用無損傷縫合針于左心耳下緣進針，肺動脈圓錐處出針，將線穿入一短PE50管。穩(wěn)定5min后，股靜脈給藥。2min后拉緊絲線，以塑料管末端壓迫冠狀動脈造成心肌缺血，持續(xù)15min，在此期間連續(xù)記錄心電圖(ECG)動脈血壓(BP)。由于利多卡因有減慢心率的作用，所以在缺血前5分鐘給藥，其余方法同上。2丄3實驗觀察指標缺血后心律失常最早出現(xiàn)的時間(潛伏期)；心律失常類型；PVB:連續(xù)出現(xiàn)5個以下的室性異位搏動；VT:連續(xù)出現(xiàn)5個以上的室性早搏；VF:室顫，為QRS波及T波消失，代之一系列大小、形狀不同的不規(guī)則波動。記錄缺血15min內(nèi)的PVB數(shù)目，VT、VF持續(xù)時間(為每次出現(xiàn)VT、VF持續(xù)時間的累加)。2.2再灌注性心律失常模型制備方法2丄1實驗分組健康SD大鼠48只，隨機分為6組，即生理鹽水對照組、扎考比利(Zac叩ride)1.5nmol/kg組、5nmol/kg組、15nmol/kg組和利多卡因(7.5mg/kg)陽性對照組。2.2.2實驗方法將大鼠用戊巴比妥鈉(65mg/kg，ip)麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)臺上，然后頸部正中切口，氣管插管，接人工呼吸機(DH—1型)；頸總動脈插管后，Rm6240多道生理信號采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠)連續(xù)記錄II導(dǎo)聯(lián)心電圖和血壓。于胸骨左側(cè)鎖中線第4、5肋間切口開胸，在冠狀動脈左前降支，(LAD)發(fā)出后的2mm處，用6-0醫(yī)用無損傷縫合針于左心耳下緣進針，肺動脈圓錐處出針，將線穿入一短PE50管。穩(wěn)定5min后，股靜脈給藥。2min后拉緊絲線，以塑料管末端壓迫冠狀動脈造成心肌缺血，持續(xù)15分鐘后松開絲線，再灌注15分鐘，在此期間連續(xù)記錄心電圖(ECG)和動脈血壓(BP)。于再灌注前2分鐘由股靜脈分別給予生理鹽水，扎考比利(Zacopride)各劑量。由于利多卡因有減慢心率的作用，所以在再灌注前5分鐘給藥，其余方法同上。2.2.3觀測指標再灌注后心律失常類型PVB:連續(xù)出現(xiàn)5個以下的室性異位搏動；VT:連續(xù)出現(xiàn)5個以上的室性早搏；VF:室顫，為QRS波及T波消失，代之一系列大小、形狀不同的不規(guī)則波動。記錄再灌注15min內(nèi)的PVB數(shù)目，VT、VF持續(xù)時間(為每次出現(xiàn)VT、VF持續(xù)時間的累加)。2.4數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)以均數(shù)士標準差(Mean士SD)表示，采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，PO.05為具有顯著性差異。3實驗結(jié)果3.1缺血性心律失常生理鹽水對照組8只動物，缺血后均出現(xiàn)期前收縮、室速，有6只發(fā)生室顫。扎考比利(Zacopride)對缺血及再灌注引起的期前收縮數(shù)目、室速持續(xù)時間、室顫持續(xù)時間、室顫發(fā)生率均具有顯著抑制作用，呈劑量依賴性。本研究顯示利多卡因7.5mg/kg為最適給藥濃度，當劑量加大(10tng/kg)時，發(fā)現(xiàn)其可明顯減慢心律，抗心律失常作用明顯減弱。結(jié)果表明，50nmol/kg扎考比利與7.5mg/kg利多卡因相比，其抗心律失常作用無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果見表8，圖13、圖14、圖15(圖15中A缺血性心律失常心電圖(未給藥)B缺血前2分鐘股靜脈注射扎考比利50nmol/kg,可有效預(yù)防缺血性心律失常C缺血前5分鐘股靜脈注射利多卡因7.5mg/kg，可有效預(yù)防缺血性心律失常D缺血前5分鐘股靜脈注射利多卡因10mg/kg，可促進心律失常的發(fā)生。a:缺血前心電圖b:冠狀動脈左前降支結(jié)扎后l分鐘C:室性期前收縮d:室速e:室顫f:缺血前股靜脈注射利多卡因10mg^g可明顯減慢心率)g:利多卡因10mg/kg抗心律失常作用明顯減弱，出現(xiàn)室顫及期前收縮。)表8.扎考比利(zac叩ride)對麻醉大鼠缺血性心律失常的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>*與對照組相比P<0.01，A與利多卡因組相比PX).053.2再灌注性心律失常生理鹽水對照組8只動物，缺血再灌注后均出現(xiàn)期前收縮、室速，有7只發(fā)生室顫。扎考比利對缺血再灌注后出現(xiàn)的期前收縮數(shù)目、室速持續(xù)時間、室顫持續(xù)時間及室顫發(fā)生率都有劑量依賴性抑制作用。5nmol/kg組為扎考比利最適給藥劑量，5nmol/kg扎考比利與7.5mg/kg利多卡因相比，其抑制再灌注性心律失常作用無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果見表9、圖16。表9.扎考比利(zacopride)對麻醉大鼠再灌注性心律失常的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>*與對照組相比P<0.05，A與利多卡因組相比PX).05本實驗中陽性對照組利多卡因給藥量為7.5mg/kg，當劑量加大(10mg/kg)時，發(fā)現(xiàn)其可明顯減慢心律，抗心律失常作用明顯減弱，用藥安全范圍小。結(jié)果見圖15(D:f、g)。權(quán)利要求1、扎考比利作為制備治療心律失常藥物的應(yīng)用。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的扎考比利作為制備治療心律失常藥物的應(yīng)用，其特征是所述的扎考比利制劑為膠囊、微囊、脂質(zhì)體、顆粒體、注射液、片劑和口服液。全文摘要本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及治療心律失常的藥物，具體為扎考比利作為制備治療心律失常藥物的應(yīng)用。解決現(xiàn)有抗心律失常藥物均有一定的致心律失常作用，以及目前為止國內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)I_K1選擇性激動劑的問題。扎考比利(Zacopride)是目前首次發(fā)現(xiàn)的選擇性的I_K1激動劑，并用于抗心律失常的藥物。扎考比利(Zacopride)作為治療缺血再灌注性心律失常的藥物，其效果與利多卡因相似，作用穩(wěn)定，對心律無明顯影響，安全范圍大。在缺血再灌注誘發(fā)心律失常的實驗中，利多卡因可使心律減慢，扎考比利(Zacopride)則無明顯影響；利多卡因在劑量增加1/3時其抗心律失常作用明顯減弱，扎考比利(Zacopride)則在100倍有效濃度時才出現(xiàn)此現(xiàn)象。文檔編號A61K31/439GK101199521SQ20071018532公開日2008年6月18日申請日期2007年11月28日優(yōu)先權(quán)日2007年11月28日發(fā)明者劉清華,吳博威,封啟龍,媛李,李曉麗,楊彩紅,白曉潔申請人:山西醫(yī)科大學(xué)