專利名稱：：牛樟芝的環(huán)己烯酮萃取物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種新的化合物，尤其涉及一種由牛樟芝(^7^w//acamp/zorato)萃取物中所分離純化的化合物及其在抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：牛樟芝(^^ra&"camp/zorato),又稱樟芝、牛樟菇、紅樟、紅樟芝、樟菰或樟窟內(nèi)菰等，為臺(tái)灣特有種真菌，只生長(zhǎng)于臺(tái)灣山區(qū)海拔4502000公尺間的牛樟樹(shù)(C/朋awowwfewe/z/raz'Hay)的中空腐朽心材內(nèi)壁上，因此是由樹(shù)干內(nèi)面生長(zhǎng)出子實(shí)體。牛樟樹(shù)目前主要分布于桃園、南投等山區(qū)，由于牛樟樹(shù)是臺(tái)灣數(shù)量極為稀少的保育類樹(shù)種，加上人為的盜伐，使得寄生于其中方能生長(zhǎng)的野生牛樟芝數(shù)量更形稀少，且由于其生長(zhǎng)相當(dāng)緩慢，生長(zhǎng)期亦僅在六月至十月之間，因此價(jià)格非常昂貴。牛樟芝的子實(shí)體為多年生，無(wú)柄，呈木栓質(zhì)至木質(zhì)，其外形多變，有板狀、鐘狀、馬蹄狀或塔狀。初時(shí)為扁平型，貼生于木材表面，之后其前緣會(huì)略為巻曲翹起，而呈板塊狀(層紋板狀)或如鐘乳石狀。牛樟芝頂部表面呈褐色至黑褐色，具不明顯的皺紋，有光澤，邊緣平而鈍，其腹面則為橘紅色或局部黃色，并有許多細(xì)孔。此外，牛樟芝具有強(qiáng)烈的黃樟香氣，其曬干后褪色成土黃白色，味極苦，民間將其用作解毒、保肝、抗癌的草藥。牛樟芝如同一般食藥用的蕈菇類，具有許多復(fù)雜的成分，已知的生理活性成分中，包括多醣體(polysaccharides,如P-萄聚醣)、三萜類化合物(triterpenoids)、超氧歧化酶(superoxidedismutase，SOD)、腺苷(adenosine)、蛋白質(zhì)(含免疫球蛋白)、維生素(如維生素B、煙堿酸)、微量元素(如鈣、磷及鍺等)、核酸、凝集素、胺基酸、固醇類、木質(zhì)素以及血壓穩(wěn)定物質(zhì)(如antodiaacid)等，這些生理活性成分被認(rèn)為具有抗腫瘤、增加免疫能力、抗過(guò)敏、抑制血小板凝集、抗病毒、抗細(xì)菌、抗高血壓、降血糖、降膽固醇以及保護(hù)肝臟等功能。牛樟芝眾多成分中以三萜類化合物被研究的最多，三碎類化合物是由三十個(gè)碳元素結(jié)合成六角形或五角形天然化合物的總稱，牛樟芝所具的苦味即主要來(lái)自三辟類此成分。1995年時(shí)，Cherng等人發(fā)現(xiàn)牛樟芝子實(shí)體萃取物中含有三種新的以麥角甾烷(ergostane)為骨架的三辟類化合物antcinA、antcinB與antcinC(Chemg,I.H.，andChiang,H.C.1995.ThreenewtriterpenoidsfromJwfr<%//<3cz.wamowea.J.Nat.Prod.58:365-371)。Chen等人以乙國(guó)孚萃取樟芝子實(shí)體后發(fā)現(xiàn)zhankuicacidA、zhankuicacidB及zhankuicacidC等三種三辟類化合物(Chen，C.H.,andYang,S.W.1995.NewsteroidacidsfromJWrac//""'朋aw函叫—afungusparasiticonCV朋a附o附ww附/c'raw/Zm附.J.Nat.Prod.58:1655-1661)。此外，Chiang等人于1995年也由子實(shí)體萃取物中發(fā)現(xiàn)另外三種分別為倍半辟內(nèi)酯(sesquiterpenelactone)與兩種雙酚類書亍生物的新三辟類化合物，此即antrocin，4,7-二曱氧基-5-曱基-1,3-苯并二氧環(huán)(4，7-dimethoxy-5-methy-l，3-benzodioxole)與2，2'，5,5'-四曱氧基國(guó)3,4,3',4'-雙-亞曱二氧基-6,6'-二甲基聯(lián)苯(2，2',5,5'-teramethoxy-3,4,3',4'-bi-methyknedioxy畫G,"畫dimd;hylbiphenyl)(Chiang,H.C,，Wu,D.P，C!herng，LandUeng，C.H.1995.Asesquiterpenelactone,phenylandbiphenylcompoundsfromJw/^cxi/aa>z"mome".Phytochemistry.39:613-616)。到了1996年，Chemg等人以同樣分析方法再度發(fā)現(xiàn)四種新的三碎類化合物antcinE、antcinF、methylantcinateG、methylantcinateH(Chemg,I.H.，Wu，D.P.，andChiang,H.C.1996.TriteroenoidsfromJ^o<i/ac/wwmowea.Phytochemistry.41:263-267);而Yang等人則發(fā)現(xiàn)了二種以麥角甾烷為骨架的新化合物zhankuicacidD、zhankuicacidE,和三種以羊毛甾烷(lanostane)'為骨架的新化合物15a-乙醯-去氬碌u色多孔菌酸(15a-acetyl-dehydrosulphurenicacid)、去氫齒孔酸(dehydroeburicoicacid)與去7JO克色多孑L菌酸(dehydrasulphurenicacid)(Yang,S.W.,Shen,Y.C.,andChen,C.H.1996.Steroidsandtriterpenoidsof—aftmgusparasiticonCVwwamoww附wZcraw/Zrww.Phytochemistry.41:1389-1392)。雖然由目前諸多的實(shí)驗(yàn)可得知牛樟芝萃取物具有抑癌的功效(如前述Chen(1995)),但究為何種有效成分可達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞效果的研究，目前則仍處于試驗(yàn)階段，并未有具體的有效成分發(fā)表，故若能將該萃取物進(jìn)一步純化分析，找出其真正有效抑癌成分，對(duì)于人類癌癥的治療將產(chǎn)生莫大的助益。
發(fā)明內(nèi)容為明了牛樟芝萃取物中究竟是何成分具有抑癌的效果，本發(fā)明由牛樟芝萃取物中分離純化出具式(1)結(jié)構(gòu)式的新的化合物；(1)其中，X為氧(O)或硫(S)，Y為氧或硫；R!為氫基(H)、曱基(CHs)或(CH2)m-CH3，R2為氫基、曱基或(CH2)m-CH3，113為氬基、曱基或(CH2)m-CH3,m=l~12;n=l~12。如式(l)結(jié)構(gòu)式的化合物中，較佳者為如下所示式(2)的化合物(2)式(2)的化合物，其化學(xué)名為4-羥基-2,3-二曱氧基-6-甲基-5(3,7,11-三曱基-2,6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮(4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methy國(guó)5(3,7,1l國(guó)trimethyl-dodeca-2,6，10-trienyl)-cyclohex-2-enone),分子式為C24H3804,外觀為淡黃色4分末狀，分子量為390。本發(fā)明中式(l)、式(2)的化合物為分離純化自牛樟芝水萃取物或有機(jī)溶劑萃取物，有機(jī)溶劑可包括醇類(例如曱醇、乙醇或丙醇)、酯類(例如乙酸乙酯)、烷類(例如己烷)或囟烷(例如氯甲烷、氯乙烷)，但并不以此為限，其中較佳者為醇類，更佳者為乙醇。藉由前述化合物，本發(fā)明為將其應(yīng)用于抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)上，使能進(jìn)一步應(yīng)用于治療癌癥的醫(yī)藥組成份中，增益癌癥的治療效果。本發(fā)明化合物得應(yīng)用的范圍包括對(duì)于乳癌腫瘤細(xì)胞、肝癌腫瘤細(xì)胞與攝護(hù)腺癌腫瘤細(xì)胞等細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制效果，使該等腫瘤細(xì)胞無(wú)法迅速生長(zhǎng)，進(jìn)而抑制腫瘤的增生，延緩腫瘤的惡化，因此，可進(jìn)一步利用于乳癌、肝癌與:fe護(hù)腺癌等癌癥的治療。癌與攝護(hù)腺癌等醫(yī)藥組成物的成分中，藉以抑制該等腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。前述醫(yī)藥組成物除包括有效劑量的式(l)或/與式(2)的化合物外，尚可包括藥學(xué)上可接受的載體。載體可為賦形劑(如水)、填充劑(如蔗糖或淀粉)、黏合劑(如纖維素衍生物)、稀釋劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑或甜味劑，但并未僅限于此。本發(fā)明醫(yī)藥組成物可依一般習(xí)知藥學(xué)的制備方法生產(chǎn)制造，將式(1)或/與式(2)有效成分劑量與一種以上的載體相混合，制備出所需的劑型，此劑型可包括錠劑、粉劑、粒劑、膠嚢或其它液體制劑，但未以此為限。此外，由于本發(fā)明中的化合物同時(shí)具有抗氧化活性，因此也可將其添加于保健食品、飲食品、醫(yī)藥品、化妝品當(dāng)中，藉由其抗氧化能力達(dá)到預(yù)防心血管疾病或避免細(xì)胞突變等效用，使之助益于施用人體的健康。以下將配合圖式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，下述所列舉的實(shí)施例用以闡明本發(fā)明，并非用以限定本發(fā)明的范圍，任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可做些許更動(dòng)與潤(rùn)飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)視后附的申請(qǐng)專利范圍所界定者為準(zhǔn)。具體實(shí)施例方式首先取牛樟芝(^fro^acflm;/2orato)菌絲體、子實(shí)體或二者的混合物，利用已知萃取方式，以水或有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，藉以取得牛樟芝水萃取物或有機(jī)溶劑萃取物。其中，有機(jī)溶劑可包括醇類(例如曱醇、乙醇或丙醇)、酯類(例如乙酸乙酯)、烷類(例如己烷)或卣烷(例如氯曱烷、氯乙烷)，但并不以此為限。其中較優(yōu)者為醇類，更優(yōu)者為乙醇。經(jīng)萃取過(guò)后的牛樟芝水萃取物或有機(jī)溶劑萃取物，可進(jìn)一步藉由高效液相層析加以分離純化，之后再對(duì)每一分液(fraction)進(jìn)行抑癌效果的測(cè)試。最后，則針對(duì)具抑癌效果的分液進(jìn)行成分分析，將可能產(chǎn)生抑癌效果的成分再分別進(jìn)一步做不同癌癥腫瘤細(xì)胞的抑制效果測(cè)試。最終即發(fā)現(xiàn)本發(fā)明中如式(l)/式(2)的化合物為具有抑制不同癌癥腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的效果，且該化合物經(jīng)與已知文獻(xiàn)比對(duì)，并未曾發(fā)現(xiàn)于牛樟芝中，因此為一新的化合物。為方便說(shuō)明本發(fā)明，以下將以式(2)的4-羥基-2，3-二曱氧基-6-曱基-5(3,7,1l-三曱基-2,6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮化合物進(jìn)行說(shuō)明。此外，為證實(shí)4-羥基-2，3-二曱氧基-6-曱基-5(3，7,11-三曱基-2，6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮化合物對(duì)肺瘤細(xì)胞生的抑制效果，本發(fā)明中以MTT分析法，根據(jù)美國(guó)國(guó)家癌癥研究所(NationalCancerInstitute,NCI)抗腫瘤藥物篩檢模式，對(duì)包括乳癌、肝癌與#_護(hù)腺癌等肺瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞存活率的測(cè)試。由該些測(cè)試證實(shí)，4-羥基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5(3，7,11-三曱基-2,6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮對(duì)于乳癌胂瘤細(xì)胞(包括MCF-7與MDA-MB-231)、肝癌腫瘤細(xì)胞(包括Hep3B與HepG2)與攝護(hù)腺癌腫瘤細(xì)胞(包括LNCaP與DU-145)等皆可降低其存活率，相對(duì)之下并可同時(shí)降低生長(zhǎng)半抑制率所需濃度(即IC50值)，因此得藉由4-羥基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5(3,7,11-三曱基-2,6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮，應(yīng)用于包括乳癌、肝癌與攝護(hù)腺癌等腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制上，而進(jìn)一步可應(yīng)用于乳癌、肝癌與攝護(hù)腺癌等癌癥的治療。茲對(duì)前述實(shí)施方式詳盡說(shuō)明如下實(shí)施例1:4-羥基-2，3-二曱氧基-6-曱基-5(3,7,1l-三曱基-2，6，10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮的分離將IOO克左右的牛樟芝菌絲體、子實(shí)體或二者的混合物，置入三角錐形瓶j中，加入適當(dāng)比例的水與醇類(70%~100%醇類水溶液)，于2025。C下攪拌萃取至少1小時(shí)以上，之后以濾紙及0.45)um濾膜過(guò)濾，收集萃取液。將前述收集的牛樟芝萃取液，利用高效能液相層析儀(HighPerformanceLiquidchromatography),以RP18的層析管(column)進(jìn)行分析，并以曱醇(A)及0.10/。0.5。/。醋酸水溶液(B)做為移動(dòng)相(mobilephase)(其溶液比例為0~10分鐘，8比例為95%~20%;10~20分鐘，B比例為20%~10%;20~35分鐘，B比例為10%~10%;3540分鐘，B比例為10%~95%)，在每分鐘1ml的速度下沖提，同時(shí)以紫外-可見(jiàn)光全波長(zhǎng)偵測(cè)器分析。將25分鐘至30分鐘的沖提液收集濃縮即可得淡黃色粉末狀的固體產(chǎn)物，此即4-羥基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5(3,7,1l-三甲基-2,6，10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮。經(jīng)分析，其分子式為C24H3804,分子量390,熔點(diǎn)(m.p.)為48°C~52°C。核磁共振(NMR)分析值則如下所示^-NMR(CDCl3)5(ppm):1.51、1.67、1,71、1.75、1.94、2.03、2.07、2.22、2.25、3.68、4.05、5.07與5.14。13C-NMR(CDC13)5(ppm):12.31、16.1、16.12、17.67、25.67、26.44、26.74、27.00、39.71、39.81、4.027、43.34、59.22、60.59、120.97、123.84、124.30、131.32、135.35、135.92、138.05、160.45與197.12。經(jīng)將4-羥基-2,3-二甲氧基-6-曱基-5(3，7，11-三曱基-2,6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮與化學(xué)式數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后，并未發(fā)現(xiàn)與前述相同的化合物結(jié)構(gòu)，因此，此化合物為一新的且前所未見(jiàn)的化合物。實(shí)施例2:體外抗乳癌腫瘤細(xì)胞的活性測(cè)試為進(jìn)一步測(cè)試實(shí)施例1中所發(fā)現(xiàn)化合物對(duì)肺瘤細(xì)胞的抑制效果，本實(shí)施例將根據(jù)美國(guó)國(guó)家癌癥研究所(NationalCancerInstitute,NCI)抗腫瘤藥物篩檢模式，首先取實(shí)施例1中所分離的4-羥基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5(3,7,11-三曱基-2,6，10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮化合物，加入MCF-7與MDA-MB-231人類肺瘤細(xì)胞培養(yǎng)液中，進(jìn)行腫瘤細(xì)胞存活性的測(cè)試。細(xì)胞存活性的測(cè)試可采已知的MTT分析法進(jìn)行分析，而MCF-7與MDA-MB-231皆為人類乳癌肺瘤細(xì)胞系。MTT分析法是一種常見(jiàn)用于分析細(xì)胞增生(cellproliferation)、存活率(percentofviablecells)以及細(xì)胞毒性(cytotoxicity)的分析方法。其中，MTT(3畫[4，5一dimethylthiazol畫2-yl]2,5隱diphenyltetrazoliumbromide)為一黃色染齊寸,它可被活細(xì)胞吸收并被粒腺體中的琥珀酸四哇還原酶(succinatetetrazoliumreductase)還原成不溶水性且呈藍(lán)紫色的formazan，因此藉由formazan形成與否，即可判斷并計(jì)算細(xì)胞的存活率。首先將人類乳癌細(xì)胞MCF-7與MDA-MB-231分別于含有胎牛血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時(shí)。將增生后的細(xì)胞以PBS清洗一次，并以1倍的胰蛋白酶-EDTA處理細(xì)胞，隨后于1,200rpm下離心5分鐘，將細(xì)胞沉淀并丟棄上清液。之后加入10ml的新培養(yǎng)液，輕微搖晃使細(xì)胞再次懸浮，再將細(xì)胞分置于96孔微量盤內(nèi)。測(cè)試時(shí)，分別于每一孔內(nèi)加入30、10、3、1、0.3、0.1與0.03嗎/ml牛樟芝乙醇萃取物(對(duì)照組，未經(jīng)純化分離的總萃取物)以及4-羥基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5(3,7,1l-三曱基-2，6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮(試驗(yàn)組)，于37°C、5%C02下培養(yǎng)48小時(shí)。其后，于避光的環(huán)境下于每一孔內(nèi)加入2.5mg/ml的MTT,反應(yīng)4小時(shí)后再于每一孔內(nèi)加入100jal的lysisbuffer終止反應(yīng)。最后以酵素免疫分析儀在570nm吸光波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值，藉以計(jì)算細(xì)胞的存活率，并推算出其生長(zhǎng)半抑制率所需濃度(即IC50值)，其結(jié)果如表一所示。表一體外對(duì)乳癌胂瘤細(xì)胞存活率的測(cè)試結(jié)果測(cè)試樣品IC5o(pg/ml)對(duì)照組(加入牛樟芝萃取物)MCF-711.132MDA-MB-23125.812試一瞼組(加入式2)MCF-70.852MDA-MB-2311.031由表一中可知，藉由4-羥基-2，3-二曱氧基-6-曱基-5(3,7，ll-三曱基-2，6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮的作用，其對(duì)于MCF-7人類乳癌腫瘤細(xì)胞的ICso值為0.852pg/ml，對(duì)于MDA-MB-231人類乳癌腫瘤細(xì)胞的IC5o值則為1.031pg/ml，相較于牛樟芝萃取混合物所測(cè)得的ICso值低的多，因此可證實(shí)牛樟芝萃取物中的4-羥基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5(3,7,1l-三曱基-2,6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮確實(shí)能夠應(yīng)用于乳癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制。實(shí)施例3:體外對(duì)乳癌腫瘤細(xì)胞輔助治療的活性測(cè)試本測(cè)試同樣根據(jù)美國(guó)國(guó)家癌癥研究所的體外篩檢模式進(jìn)行測(cè)試。首先，取人類乳癌細(xì)胞MCF-7與MDA-MB-231,分別于含有胎牛血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時(shí)后，將增生后的細(xì)胞以PBS清洗一次，并以1倍的胰蛋白酶-EDTA處理細(xì)胞，隨后于1，200rpm下離心5分鐘，將細(xì)胞沉淀并丟棄上清液。之后加入10ml的新培養(yǎng)液，輕微搖晃使細(xì)胞再次懸浮。測(cè)試前，先加入0.0017pg/ml紫杉醇(Taxol)處理細(xì)胞72小時(shí)，再將細(xì)胞分置于96孔微量盤內(nèi)，之后分別于每孔內(nèi)加入0jag/ml(對(duì)照組)，30、10、3、1、0.3、0.1與0.03嗎/ml實(shí)施例1中所分離的4-羥基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5(3，7,ll-三曱基-2,6,10-十二碳三烯)畫2-環(huán)己烯酮(試驗(yàn)組)，于37°C、5%C02下培養(yǎng)48小時(shí)。其后，于避光的環(huán)境下在每一孔內(nèi)加入2.5mg/ml的MTT，反應(yīng)4小時(shí)后在每一孔內(nèi)加入100pi的lysisbuffer終止反應(yīng)。最后以酵素免疫分析儀在570nm吸光波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值，藉以計(jì)算細(xì)胞的存活率，并推算出其生長(zhǎng)半抑制所需濃度(即ICso值)，其結(jié)果如表二所示。表二體外對(duì)乳癌胂瘤細(xì)胞經(jīng)紫杉醇輔助治療后抑制的測(cè)試結(jié)果<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage12</formula>由表二中可知，透過(guò)紫杉醇的協(xié)同作用，4-羥基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5(3,7,1l-三曱基-2,6，10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮對(duì)于MCF-7人類乳癌胂瘤細(xì)胞的ICso值降為0.009pg/ml，對(duì)于MDA-MB-231人類乳癌腫瘤細(xì)胞的IQo值亦降為約0.011pg/ml，因此可證實(shí)牛樟芝萃取物中的4-羥基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5(3,7,1l-三曱基-2,6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮確實(shí)能夠應(yīng)用于乳癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制，且在紫杉醇的協(xié)同作用下，有更優(yōu)的抑制效果。實(shí)施例4:體外抗肝癌腫瘤細(xì)胞的活性測(cè)試本測(cè)試根據(jù)美國(guó)國(guó)家癌癥研究所抗腫瘤藥物篩檢模式進(jìn)行，將實(shí)施例1中所分離的4-羥基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5(3,7,1l-三曱基-2，6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮化合物，加入Hep3B與HepG2人類肝癌腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，藉以進(jìn)行腫瘤細(xì)胞存活性的測(cè)試。首先將人類肝癌細(xì)胞Hep3B與HepG2分別于含有胎牛血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時(shí)。將增生后的細(xì)胞以PBS清洗一次，并以1倍的胰蛋白酶-EDTA處理細(xì)胞，隨后于1,200rpm下離心5分鐘，將細(xì)胞沉淀并丟棄上清液。之后加入IOml的新培養(yǎng)液，輕微搖晃使細(xì)胞再次懸浮，再將細(xì)胞分置于96孔微量盤內(nèi)。測(cè)試時(shí)，分別于每一孔內(nèi)加入30、10、3、1、0.3、0.1與0.03嗎/ml的牛樟芝乙醇萃取物(對(duì)照組，未經(jīng)純化分離的總萃取物)以及30、10、3、1、0.3、0.1與0.03pg/ml的4-羥基-2,3-二曱氧基-6-甲基-5(3,7，ll-三曱基-2,6,10誦十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮(試驗(yàn)組)，于37°C、5%C02下培養(yǎng)48小時(shí)。其后，于避光的環(huán)境下在每一孔內(nèi)加入2.5mg/ml的MTT,反應(yīng)4小時(shí)后再在每一孔內(nèi)加入100)il的lysisbuffer終止反應(yīng)。最后以酵素免疫分析儀在570nm吸光波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值，藉以計(jì)算細(xì)胞的存活率，并推算出其IC5。值，其結(jié)果如表三所示。表三體外對(duì)肝癌腫瘤細(xì)胞抑制的測(cè)試結(jié)果<table>complextableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>由表三中可知，藉由4-羥基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮的作用，其對(duì)于Hep3B人類肝癌腫瘤細(xì)胞的IQo值降為0.005ing/ml，對(duì)于HepG2人類肝癌腫瘤細(xì)胞的ICso值則降為1.679pg/ml，相較于牛樟芝萃取混合物所測(cè)得的ICso值低的多，因此可證實(shí)牛樟芝萃取物中的4-羥基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5(3,7,1l-三曱基-2,6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮確實(shí)能夠應(yīng)用于肝癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制。實(shí)施例5:體外對(duì)肝癌腫瘤細(xì)胞輔助治療的活性測(cè)試本測(cè)試同樣根據(jù)美國(guó)國(guó)家癌癥研究所的體外篩4企^^莫式進(jìn)行測(cè)試。首先，取人類肝癌細(xì)胞Hep3B與HepG2,分別于含有胎牛血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時(shí)后，將增生后的細(xì)胞以PBS清洗一次，并以1倍的胰蛋白酶-EDTA處理細(xì)胞，隨后于1,200rpm下離心5分鐘，將細(xì)胞沉淀并丟棄上清液。之后加入10ml的新培養(yǎng)液，輕微搖晃使細(xì)胞再次懸浮。測(cè)試前，先于Hep3B細(xì)胞抹試驗(yàn)加入0.0043pg/mlLovastatin,而于HepG2細(xì)胞林試驗(yàn)加入0.0017fig/ml紫杉醇(Taxol),處理細(xì)胞72小時(shí)，再將細(xì)胞分置于96孔微量盤內(nèi)，之后分別于每孔內(nèi)加入0(ig/ml(對(duì)照組)，30、10、3、1、0.3、0.1與0.03嗎/ml實(shí)施例1中所分離的4-羥基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5(3,7,1l-三曱基-2,6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮(試驗(yàn)組)，于37°C、5%C02下培養(yǎng)48小時(shí)。其后，于避光的環(huán)境下在每一孔內(nèi)加入2.5mg/ml的MTT，反應(yīng)4小時(shí)后在每一孔內(nèi)加入100pl的lysisbuffer終止反應(yīng)。最后以酵素免疫分析儀在570nm吸光波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值，藉以計(jì)算細(xì)胞的存活率，并推算出其ICs。值，其結(jié)果如表四所示。表四體外對(duì)肝癌腫瘤細(xì)胞經(jīng)紫杉醇輔助治療后抑制的測(cè)試結(jié)果<table>complextableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>由表四中可知，透過(guò)Lovastatin及紫杉醇的協(xié)同作用，4-羥基-2，3-二曱氧基-6-甲基-5(3，7，11-三曱基-2,6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮對(duì)于Hep3B人類肝癌腫瘤細(xì)胞的ICso值降為0.002ng/ml,對(duì)于HepG2人類肝癌腫瘤細(xì)胞的IC50值亦降為約0.008jug/ml,因此可證實(shí)牛樟芝萃取物中的4-羥基-2,3-二甲氧基-6-曱基-5(3,7,ll-三曱基-2，6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮確實(shí)能夠應(yīng)用于肝癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制，且在紫杉醇的協(xié)同作用下，有更優(yōu)的抑制效果。實(shí)施例6:體外抗ii護(hù)&泉癌腫瘤細(xì)胞的活性測(cè)試本測(cè)試同樣才艮據(jù)美國(guó)國(guó)家癌癥研究所抗胂瘤藥物篩4全模式進(jìn)行，將實(shí)施例1中所分離的4-羥基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5(3,7,1l-三曱基-2，6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮化合物，加入LNCaP與DU-145人類攝護(hù)腺癌腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，藉以進(jìn)行肺瘤細(xì)胞存活性的測(cè)試。首先將人類攝護(hù)腺癌細(xì)胞LNCaP與DU-145分別于含有胎牛血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時(shí)。將增生后的細(xì)胞以PBS清洗一次，并以1倍的胰蛋白酶-EDTA處理細(xì)胞，隨后于1，200rpm下離心5分鐘，將細(xì)胞沉淀并丟棄上清液。之后加入10ml的新培養(yǎng)液，輕微搖晃使細(xì)胞再次懸浮，再將細(xì)胞分置于96孔微量盤內(nèi)。測(cè)試時(shí)，分別在每一孔內(nèi)加入30、10、3、1與0.3jug/ml牛樟芝乙醇萃取物(對(duì)照組，未經(jīng)純化分離的總萃取物)以及30、10、3、1與0.3pg/ml由實(shí)施例1所分離的4-羥基-2,3-二曱氧基-6-甲基-5(3，7，ll-三曱基-2，6，10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮(試驗(yàn)組)，于37。C、5%C02下培養(yǎng)48小時(shí)。其后，于避光的環(huán)境下在每一孔內(nèi)加入2.5mg/ml的MTT,反應(yīng)4小時(shí)后再于每一孔內(nèi)加入100pl的lysisbuffer終止反應(yīng)。最后以酵素免疫分析儀在570nm吸光波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值，藉以計(jì)算細(xì)胞的存活率，并推算出其IC50值，其結(jié)果如表五所示。表五體外對(duì)攝護(hù)腺癌肺瘤細(xì)胞抑制的測(cè)試結(jié)果<table>complextableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>由表五中可知，藉由4-羥基-2,3-二曱氧基-6-甲基-5(3，7,ll-三曱基-2，6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮的作用，其對(duì)于LNCaP人類攝護(hù)腺癌腫瘤細(xì)胞的IC50值降為2.378ng/ml，對(duì)于DU-145人類攝護(hù)腺癌腫瘤細(xì)胞的IC5o值則降為1.812嗎/ml,相較于牛樟芝萃取混合物所測(cè)得的IC5o值低的多，因此可證實(shí)牛樟芝萃取物中的4-羥基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5(3,7,1l-三曱基-2，6，10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮確實(shí)能夠利用于攝護(hù)腺癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制。實(shí)施例7:體外對(duì)攝護(hù)腺癌腫瘤細(xì)胞輔助治療的活性測(cè)試本測(cè)試同樣根據(jù)美國(guó)國(guó)家癌癥研究所的體外篩檢模式進(jìn)行測(cè)試。首先，取人類攝護(hù)腺癌細(xì)胞LNCaP與DU-145，分別于含有胎牛血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時(shí)后，將增生后的細(xì)胞以PBS清洗一次，并以1倍的胰蛋白酶-EDTA處理細(xì)胞，隨后于1,200rpm下離心5分鐘，將細(xì)胞沉淀并丟棄上清液。的后加入IOml的新培養(yǎng)液，輕微搖晃使細(xì)胞再次懸浮。測(cè)試前，先于LNCaP細(xì)胞林試驗(yàn)加入0.0017|ng/ml紫杉醇，而于DU-145胞抹試驗(yàn)加入0.0043pg/ml紫杉醇分別處理細(xì)胞72小時(shí)，再將細(xì)胞分置于96孔微量盤內(nèi)，之后分別于每孔內(nèi)加入Opg/ml(對(duì)照組)，30、10、3、1、0.3、0.1與0.03pg/ml于實(shí)施例1中所分離的4-羥基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5(3,7,11-三曱基-2,6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮(試驗(yàn)組)，于37。C、5%C02下培養(yǎng)48小時(shí)。其后，于避光的環(huán)境下在每一孔內(nèi)加入2.5mg/ml的MTT,反應(yīng)4小時(shí)后在每一孔內(nèi)加入100pl的lysisbuffer終止反應(yīng)。最后以酵素免疫分析儀在570nm吸光波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值，藉以計(jì)算細(xì)胞的存活率，并推算出其ICs。值，其結(jié)果如表六所示。:體外對(duì)攝護(hù)腺癌腫瘤細(xì)胞經(jīng)紫杉醇輔助治療后抑制的測(cè)試結(jié)果測(cè)試才羊品結(jié)果細(xì)胞存活率(％)LNCaP(0.0017(ig/mlTaxol)56±3DU-145(0.0043嗎/mlTaxol)70±2試驗(yàn)組IC50(嗎/ml)LNCaP(0.0017|ig/mlTaxol+式2)0.961DU-145(0.0043pg/mlTaxol+式2)0.515由表六中可知，透過(guò)紫杉醇的協(xié)同作用，4-羥基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5(3，7,11-三曱基-2,6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮對(duì)于LNCaP人類攝護(hù)腺癌腫瘤細(xì)胞的ICso值降為0.961pg/ml，對(duì)于DU-145人類攝護(hù)腺癌腫瘤細(xì)胞的IC50值亦降為約0.515pg/ml，相較于牛樟芝萃取混合物所測(cè)得的IC5o值為低的多，因此可證實(shí)牛樟芝萃取物中的4-羥基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5(3,7,11-三曱基-2,6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮確實(shí)能夠利用于攝護(hù)腺癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制，且在紫杉醇的協(xié)同作用下，有更優(yōu)的抑制效果。實(shí)施例8:體外抗氧化活性的試驗(yàn)一般抗氧化活性的測(cè)試，為利用人類低密度脂蛋白(humanlowdensitylipoprotein,LDL),加入銅離子(Cu2+)與待測(cè)樣本進(jìn)行氧化反應(yīng)，檢測(cè)LDL上二烯的反應(yīng)結(jié)果后，以維生素E的水溶性類似物Trolox作為對(duì)照(Trolox濃度為2pM時(shí)，其效力值訂為標(biāo)準(zhǔn)值1.0),計(jì)算出待測(cè)樣本的抗氧化活性。首先準(zhǔn)備二次純水(控制組)，并配制5mM磷酸鈉緩沖溶液(sodiumphosphatebuffer,SPB)、1fiM與2|iM的Trolox(對(duì)照組)及40fig/ml由實(shí)施例1中所分離的4-羥基-2,3-二甲氧基-6-曱基-5(3,7，ll-三曱基-2，6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮(試驗(yàn)組)。利用酵素法測(cè)得低密度膽固醇濃度(LDL-C)后，利用5mMSPB將LDL稀釋至0.10-0.25mg/ml間。取96孔的石英微量盤，在其中先加入100|Lil的LDL，再分別加入前述預(yù)定濃度的Trolox及由實(shí)施例1中所分離的化合物，的后再分別加入CuSO4溶液以激活氧化反應(yīng)(每一250ji1孔中的銅(II)濃度為5.0piM),最后將該;微量盤置于ELISAreader中進(jìn)行才企測(cè)。酵素免疫微量盤分析儀(ELISAreader)檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)為232nm,溫度設(shè)為37°C，檢測(cè)時(shí)間為12小時(shí)，釆樣間隔時(shí)間為15分鐘，其結(jié)果如表七所示。表七體外試驗(yàn)對(duì)抗氧化的測(cè)試結(jié)果測(cè)試才羊品Tlag(分)ATlag(分)效力值H20(控制組，Tlago)1851(iMTrolox(對(duì)照組)266810.482|LiMTrolox3441591.0040jig/mL式24392081.30注1:Tlag(分)指在吸收光波長(zhǎng)為234nm下，延滯期(lagphase)與連鎖期(propagationphase)的交差點(diǎn)；ATlag(分)指各測(cè)試樣品Tlag時(shí)間與Tlago時(shí)間的差值。注2:效力值>0.5時(shí)，表示其具抗氧化作用。由表七中可知，4-羥基-2,3-二曱氧基-6-甲基-5(3，7，11-三曱基-2，6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮具有1.30的效力值，其比具抗氧化能力的標(biāo)準(zhǔn)值0.5高出甚多，也就是，其具有相當(dāng)?shù)目寡趸芰?，因此可用作保健食品、飲食品、醫(yī)藥品、化妝品當(dāng)中的成分，藉由其抗氧化能力達(dá)到預(yù)防心血管疾病或避免細(xì)胞突變等效用，使對(duì)于施用的人體健康產(chǎn)生莫大的助益。權(quán)利要求1.一種化合物，包括下列結(jié)構(gòu)式其中，X為氧(O)或硫(S)，Y為氧或硫；R1為氫基(H)、甲基(CH3)或(CH2)m-CH3，R2為氫基、甲基或(CH2)m-CH3，R3為氫基、甲基或或(CH2)m-CH3，m＝1～12；n＝1～12。2.根據(jù)權(quán)利要求第1所述的化合物，其分離自牛樟芝。3.根據(jù)權(quán)利要求第2項(xiàng)所述的化合物，其為由牛樟芝的有機(jī)溶劑萃取物中所分離。4.根據(jù)權(quán)利要求第3項(xiàng)所述的化合物，其中該有機(jī)溶劑為選自酯類、醇類、烷類或卣烷所組成的族群。5.根據(jù)權(quán)利要求第4項(xiàng)所述的化合物，其中該醇類為乙醇。6.根據(jù)權(quán)利要求第第2項(xiàng)所述的化合物，其由牛樟芝的水萃取物中所分離。7.根據(jù)權(quán)利要求第1項(xiàng)所述的化合物，該化合物為4-羥基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5(3，7,11-三曱基-2,6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮(4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methy-5(3,7,ll-trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl)-cyclohex-2-enone)。8.—種將具有如權(quán)利要求第1或7項(xiàng)所述化合物在抑制乳癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中的應(yīng)用。9.根據(jù)權(quán)利要求第8項(xiàng)所述化合物在抑制乳癌肺瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中的應(yīng)用，其中該化合物分離自牛樟芝。10.根據(jù)權(quán)利要求第9項(xiàng)所述化合物在抑制乳癌肺瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中的應(yīng)用，其中該化合物為由牛樟芝的有機(jī)溶劑萃取物中所分離。11.根據(jù)權(quán)利要求第1O項(xiàng)所述化合物在抑制乳癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中的應(yīng)用，其中該有機(jī)溶劑為選自酯類、醇類、烷類或卣烷所組成的族群。12.根據(jù)權(quán)利要求第11項(xiàng)所述化合物在抑制乳癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中的應(yīng)用，其中該有機(jī)溶劑為乙醇。13.根據(jù)權(quán)利要求第9項(xiàng)所述化合物在抑制乳癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中的應(yīng)用，其中該化合物為由牛樟芝的水萃取物中所分離。14.根據(jù)權(quán)利要求第8項(xiàng)所述化合物在抑制乳癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中的應(yīng)用，其中該乳癌胂瘤細(xì)胞為MCF-7或MDA-MB-231細(xì)胞系。15.—種將具有如權(quán)利要求第l或7項(xiàng)所述化合物在抑制肝癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中的應(yīng)用。16.根據(jù)權(quán)利要求第15項(xiàng)所述化合物在抑制肝癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中的應(yīng)用，其中該化合物為分離自牛樟芝。17.根據(jù)權(quán)利要求第16項(xiàng)所述化合物在抑制肝癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中的應(yīng)用，其中該化合物為由牛樟芝的有才幾溶劑萃取物中所分離。18.根據(jù)權(quán)利要求第17項(xiàng)所述化合物在抑制肝癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中的應(yīng)用，其中該有機(jī)溶劑為選自酯類、醇類、烷類或卣烷所組成的族群。19.根據(jù)權(quán)利要求第18項(xiàng)所述化合物在抑制肝癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中的應(yīng)用，其中該有機(jī)溶劑為乙醇。20.根據(jù)權(quán)利要求第16項(xiàng)所述化合物在于抑制肝癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中的應(yīng)用，其中該化合物為由牛樟芝的水萃取物中所分離。21.根據(jù)權(quán)利要求第15項(xiàng)所述化合物在抑制肝癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中的應(yīng)用，其中該肝癌腫瘤細(xì)胞為Hep3B或HepG2細(xì)胞系。22.—種將具有如權(quán)利要求第1或7項(xiàng)所述化合物在抑制攝護(hù)腺癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中的應(yīng)用。23.根據(jù)權(quán)利要求第22項(xiàng)所述化合物在抑制攝護(hù)腺癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中的應(yīng)用，其中該化合物為分離自牛樟芝。24.根據(jù)權(quán)利要求圍第23項(xiàng)所述化合物在抑制攝護(hù)腺癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中的應(yīng)用，其中該化合物為由牛樟芝的有機(jī)溶劑萃取物中所分離。25.根據(jù)權(quán)利要求第24項(xiàng)所述化合物在抑制攝護(hù)腺癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中的應(yīng)用，其中該有機(jī)溶劑為選自酯類、醇類、烷類或卣烷所組成的族群。26.根據(jù)權(quán)利要求第25項(xiàng)所述化合物在抑制^i戶腺癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中的應(yīng)用，其中該有機(jī)溶劑為乙醇。27.根據(jù)權(quán)利要求第23項(xiàng)所述化合物在抑制:f聶護(hù)腺癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中的應(yīng)用，其中該化合物為由牛樟芝的水萃取物中所分離。28.根據(jù)權(quán)利要求第22項(xiàng)所述化合物在抑制攝護(hù)腺癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中的應(yīng)用，其中該攝護(hù)&泉癌腫瘤細(xì)胞為L(zhǎng)NCaP或DU145細(xì)胞系。29.根據(jù)權(quán)利要求第l或7項(xiàng)所述的化合物，其為具抗氧化活性。30.—種利用于抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的醫(yī)藥組成物，包括一有效劑量如權(quán)利要求第1項(xiàng)所述的化合物以及一藥學(xué)上可接受的載體，其中該腫瘤細(xì)胞為選自乳癌、肝癌或攝護(hù)腺癌的腫瘤細(xì)胞。31.—種利用于抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的醫(yī)藥組成物，包括一有效劑量如權(quán)利要求第7項(xiàng)所述的化合物以及一藥學(xué)上可接受的載體，其中該腫瘤細(xì)胞為選自乳癌、肝癌或攝護(hù)腺癌的腫瘤細(xì)胞。全文摘要本發(fā)明涉及一種新穎化合物及其用途，尤其涉及一種由牛樟芝萃取物中所分離出的4-羥基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5(3，7，11-三甲基-2，6，10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮(4-hydroxy-2，3-dimethoxy-6-methy-5(3，7，11-trimethyl-dodeca-2，6，10-trienyl)-cyclohex-2-enone)及其在抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中的應(yīng)用。本發(fā)明中，前述化合物首見(jiàn)于牛樟芝中，其可應(yīng)用于抑制乳癌、肝癌與攝護(hù)腺癌腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，同時(shí)可作為抑制前述腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的醫(yī)藥組成物的成分，或進(jìn)一步藉由其抗氧化活性應(yīng)用于心血管疾病的預(yù)防或添加于健康飲食品當(dāng)中。文檔編號(hào)A61K36/06GK101343247SQ20071013626公開(kāi)日2009年1月14日申請(qǐng)日期2007年7月12日優(yōu)先權(quán)日2007年7月12日發(fā)明者劉勝勇,張君綬,李雅嫈,溫武哲,鄒宛玲,郭茂田,霍嘉恒,黃俊鴻申請(qǐng)人:國(guó)鼎生物科技股份有限公司