專利名稱：一種含有環(huán)孢素的眼植入凝膠的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種含有環(huán)孢素的眼植入凝膠及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
環(huán)孢素即環(huán)胞霉素(Cyclosporine)為一種特效的免投抑制劑，臨床常用環(huán)孢素A(CyclosporineA，CyA)是目前公認的抗器官移植排斥反應(yīng)最為有效的藥物。它通過選擇性地抑制輔助淋巴細胞，干擾淋巴細胞活性，阻斷參與排斥反應(yīng)的體液和細胞效應(yīng)機制，從而抑制排異反應(yīng)及免疫反應(yīng)?，F(xiàn)在CyA的口服制劑和注射劑被廣泛用于器官移植手術(shù)后的排異治療，眼科使用CyA滴眼劑主要用于角膜移植排異反應(yīng)、自身免疫性眼病以及干眼癥的治療，如CN99102848和CN02117619分別公開了含有CyA的眼外用溶液或凝膠的組方。由于CyA分子量較大，通透性差，局部使用對于眼內(nèi)炎癥的治療，如自身免疫性葡萄膜炎，難以實現(xiàn)治療效果，而全身用藥易產(chǎn)生高血壓和肝、腎毒副作用，多次眼內(nèi)注射可造成眼內(nèi)感染和出血并發(fā)癥，因此開發(fā)局部使用的CyA緩釋制劑成為眼科應(yīng)用CyA的突破口。CN00122863和CN200510066417公開了用于眼內(nèi)緩釋制劑，前者用聚乳酸、殼聚糖及其混合物制成包埋有CyA的眼內(nèi)植入緩釋制劑，后者用乳酸-羥乙酸共聚物、聚乳酸等高分子材料制成可供眼內(nèi)注射用的緩釋微球。有資料報道，CyA用于青光眼濾過手術(shù)有與5-FU相似的促進濾泡形成作用，抑制濾泡成纖維細胞的增殖和過濾通道瘢痕化，提高青光眼手術(shù)的成功率，且術(shù)后低眼壓黃斑病變等后遺癥較少[胡義珍等。環(huán)孢素A與5氟尿嘧啶用于青光眼濾過手術(shù)臨床對比觀察。美中國際眼科雜志，2001，1(4)34～36]。其機理與CyA調(diào)控蛋白質(zhì)合成，抗炎，抑制細胞因子產(chǎn)生和成纖維細胞活化，抑制局部血管形成造成局部缺血，誘導細胞凋亡等作用有關(guān)[王繼兵。環(huán)孢素A抗增殖作用的研究。國外醫(yī)學(眼科分冊)，1999，23(2)93～97]。
透明質(zhì)酸(hyalouronic acid，HA)是構(gòu)成皮膚、玻璃體、關(guān)節(jié)滑液和軟骨組織的一種重要成分，是由(1-β-4)D-葡糖醛酸和(1-β-3)N-乙?；?D-氨基葡糖雙糖單位重復(fù)連接組成的鏈狀聚陰離子黏多糖，具有獨特的理化性質(zhì)和生物學功能。其鈉鹽，即透明質(zhì)酸鈉在臨床已應(yīng)用多年，可作為黏彈劑用于眼科手術(shù)和骨科手術(shù)、關(guān)節(jié)腔注射可治療骨性關(guān)節(jié)炎和類風濕性關(guān)節(jié)炎、預(yù)防術(shù)后粘連，由于其良好的生物相容性和潤滑、保濕作用而又被作為一種藥物媒介應(yīng)用于多種藥物制劑。交聯(lián)HA是HA的衍生物，它克服了天然HA在組織中易被降解和擴散、體內(nèi)存留時間較短等缺點，進一步擴大了HA在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。自Balazs1987年公開第一個HA交聯(lián)產(chǎn)品hylan的制備(US4713448)，至今越來越多的HA交聯(lián)的技術(shù)及其應(yīng)用被陸續(xù)公開，如鐵交聯(lián)HA防粘連膜(EP0507604，EP1593394)、磷交聯(lián)HA凝膠(WO9009401)、酰肼交聯(lián)HA(WO9515168)、醇交聯(lián)HA酯(EP1265116，EP0216453)、環(huán)氧樹脂交聯(lián)HA凝膠(WO8600912，WO0206350)等，多種交聯(lián)HA產(chǎn)品已經(jīng)上市，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療和美容臨床。目前，酰肼交聯(lián)的透明質(zhì)酸主要應(yīng)用于研究制備治療心肌缺血、骨關(guān)節(jié)炎、干眼癥、腫瘤和傷口愈合等疾病的透明質(zhì)酸-鏈系藥物(US2003114406、WO03006068、US2004234497和WO0206373)，也用于制備青光眼濾過手術(shù)植入凝膠，保持房水濾過通道。
采用交聯(lián)透明質(zhì)酸包埋環(huán)孢素制備緩釋制劑的研究未見文獻公開。本發(fā)明將環(huán)孢素混于酰肼交聯(lián)的HA凝膠，制成緩釋制劑。本發(fā)明產(chǎn)品可用于青光眼濾過手術(shù)，與單純的交聯(lián)HA凝膠(WO9835640，WO9835639)相比，本發(fā)明產(chǎn)品不僅有凝膠的物理支撐、阻隔作用，而且還有環(huán)孢素抑制濾泡成纖維細胞增殖、促進濾泡形成、阻止濾過通道瘢痕化的作用，將顯著提高青光眼濾過手術(shù)的成功率。本發(fā)明產(chǎn)品也可用于治療和預(yù)防高危眼角膜移植的排斥反應(yīng)以及慢性葡萄膜炎和白塞氏病等自身免疫性眼病，與使用聚乳酸等高分子材料制備的環(huán)孢素緩釋系統(tǒng)(CN00122863)相比，本發(fā)明產(chǎn)品具有更好的生物相容性，在體內(nèi)的降解產(chǎn)物為肌體固有的成分，不會改變肌體局部的生理環(huán)境，具有安全性高的優(yōu)點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種含有環(huán)孢素的眼植入凝膠及其制備方法，以及其在制備眼部植入藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明為一種含有環(huán)孢素的眼植入凝膠，其特征在于環(huán)孢素以非溶解狀態(tài)分散于交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠中，按干燥品計，交聯(lián)透明質(zhì)酸與環(huán)孢素的質(zhì)量比為1∶5～5∶1，優(yōu)選質(zhì)量比為1∶3～3∶1，更優(yōu)選質(zhì)量比為1∶2～2∶1。
所述的凝膠，其特征還在于凝膠中含有的環(huán)孢素是環(huán)孢素A。
所述的凝膠，其特征還在于交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠來源于酰肼化合物交聯(lián)的透明質(zhì)酸鈉，優(yōu)選雙酰肼化合物交聯(lián)的透明質(zhì)酸鈉，更優(yōu)選丁二酸二酰肼、辛二酸二酰肼或己二酸二酰肼交聯(lián)的透明質(zhì)酸鈉。
本發(fā)明還包括上述含有環(huán)孢素的眼植入凝膠的制備方法，該方法特征在于環(huán)孢素先混懸于透明質(zhì)酸鈉水溶液中，再與交聯(lián)劑混合反應(yīng)形成凝膠，凝膠經(jīng)純化后，切割，包裝，滅菌制得成品。
所述的制備方法，其特征還在于反應(yīng)使用的透明質(zhì)酸鈉可以選用提取法生產(chǎn)的產(chǎn)品，也可以選用發(fā)酵法生產(chǎn)或其他方式生產(chǎn)的產(chǎn)品，平均分子量可以為10萬～300萬道爾頓，優(yōu)選平均分子量為20萬～150萬道爾頓，更優(yōu)選平均分子量為20萬～60萬道爾頓。
所述的制備方法，其特征還在于反應(yīng)中使用的交聯(lián)劑是酰肼化合物，可以是單酰肼、雙酰肼或多酰肼化合物，優(yōu)選雙酰肼化合物，更優(yōu)選丁二酸二酰肼、辛二酸二酰肼或己二酸二酰肼。
所述的制備方法，其特征還在于反應(yīng)液中加入羰基活化劑碳二亞胺，可以是單碳二亞胺或雙碳二亞胺，優(yōu)選單碳二亞胺，更優(yōu)選乙基(N，N-二甲基氨基丙基)碳二亞胺。
本發(fā)明凝膠具有以下優(yōu)點(1)同時具有交聯(lián)透明質(zhì)酸的物理支撐、阻隔作用以及CyA抑制濾泡成纖維細胞增殖、促進濾泡形成、阻止濾過通道瘢痕化的作用；(2)具有緩釋作用；(3)具有更好的生物相容性，交聯(lián)透明質(zhì)酸的降解產(chǎn)物為肌體固有的成分，不會改變肌體局部的生理環(huán)境，安全性更高。
本發(fā)明凝膠應(yīng)用于眼部植入藥物的制備，以本發(fā)明凝膠制備的藥物可用于青光眼濾過手術(shù)植入，促進濾泡的形成，防止房水濾過通道瘢痕化，維持術(shù)后眼壓穩(wěn)定，提高青光眼手術(shù)治療的成功率；也可用于治療和預(yù)防高危眼角膜移植的排斥反應(yīng)以及慢性葡萄膜炎和白塞氏病等自身免疫性眼病。
具體實施例方式
以下實施例是為了更好地說明本發(fā)明，不是限制本發(fā)明。
實施例1將0.125克透明質(zhì)酸鈉(平均分子量141.5萬道爾頓)溶解于5毫升Tris-HCl(pH4.5)緩沖溶液中，加入己二酸二酰肼(ADH)12.5毫克，加入環(huán)孢素A細粉0.25克，研勻；另取乙基(N，N-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDCI)30毫克溶解于1毫升Tris-HCl(pH4.5)緩沖溶液中，然后倒入上述透明質(zhì)酸鈉、ADH和環(huán)孢素A的混合溶液中，研勻，倒于潔凈玻璃板，展平，或灌入事先固定好的兩個潔凈玻璃板之間的縫隙中，將玻璃板水平放置，反應(yīng)2～24小時，至反應(yīng)液完全膠化。調(diào)節(jié)玻璃板的大小或兩個玻璃板之間的距離可以得到不同厚度的凝膠片，用于青光眼小梁手術(shù)植入的凝膠片厚度為0.45～0.5毫米比較適宜，用于眼內(nèi)植入治療和預(yù)防高危眼角膜移植的排斥反應(yīng)以及慢性葡萄膜炎和白塞氏病等自身免疫性眼病的凝膠片厚度為1～2毫米比較適宜。
反應(yīng)液成膠后，用去離子水將凝膠沖離玻璃板，置潔凈容器中用大量去離子水浸泡純化2～4小時，再用pH7.2的等滲磷酸鹽緩沖溶液浸泡0.5～1小時，在潔凈環(huán)境中，將凝膠塊平鋪在潔凈玻璃板上，在解剖鏡下，用薄刀片切成要求的形狀。用于青光眼小梁手術(shù)植入的產(chǎn)品可切成邊長為3.5毫米的等腰三角形凝膠片，或切成高4.5毫米、底邊分別為0.5毫米和3毫米的等腰梯形凝膠片；用于眼內(nèi)植入治療和預(yù)防高危眼角膜移植的排斥反應(yīng)以及慢性葡萄膜炎和白塞氏病等自身免疫性眼病的產(chǎn)品可切成2毫米×3毫米的長方形凝膠片，或用沖模沖成直徑2.5毫米的圓形凝膠片。
將切好的凝膠片分裝于5毫升西林瓶中，加蓋，于121℃高壓滅菌15分鐘，即得成品。
實施例2將0.125克透明質(zhì)酸鈉(平均分子量37萬道爾頓)溶解于4毫升Tris-HCl(pH4.0)緩沖溶液中，加入己二酸二酰肼(ADH)21.7毫克，加入環(huán)孢素A細粉0.25克，研勻，；混勻；另取乙基(N，N-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDCI)30毫克溶解于1毫升Tris-HCl(pH4.0)緩沖溶液中，然后倒入上述透明質(zhì)酸鈉、ADH和環(huán)孢素A的混合溶液中，研勻，之后按實施例一中描述的步驟操作，直至得到成品。
實驗數(shù)據(jù)發(fā)明體外藥物釋放試驗，以證明本發(fā)明環(huán)孢素凝膠片的緩釋作用和體外降解特性實驗方法(1)載藥量的測定采用高效液相色譜法測定環(huán)孢素A的含量，色譜條件如下用C18硅膠柱(4.6毫米×250毫米)，以0.1％磷酸-甲醇(7∶93)為流動相，檢測波長210nm，柱溫為50℃。樣品前處理方法取0.5克凝膠，加甲醇至5毫升，振搖提取15分鐘，靜置10分鐘，取上清液稀釋后進樣。采用高純度(99.3％)環(huán)孢素A原料藥作對照品，用流動相稀釋后進樣。按外標法以峰面積計算凝膠中環(huán)孢素A的含量。
(2)體外藥物釋放曲線繪制取凝膠片0.5克，置1×1.5厘米尼龍網(wǎng)(200目)制小袋，置于具塞試管底部。采用等距浸出法[王世亮等。一種新的長效制劑體外釋放方法--等距浸出法。中國新藥雜志，2003，12(8)627～630]，每個試管加入釋放介質(zhì)(等滲磷酸鹽緩沖溶液，pH7.2)3毫升，置35±2℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速80rpm。固定時間點更換釋放液。
采用高效液相色譜法測定釋放液中環(huán)孢素A的含量，計算累計釋放量，以時間為橫坐標，繪制釋放曲線。釋放液的前處理方法取釋放液1毫升，加甲醇至5毫升，振搖1分鐘，10000rpm離心15分鐘，取上清液稀釋后進樣。
試驗結(jié)果按本發(fā)明實施例2制備厚度為0.5毫米的等腰梯形凝膠片，載藥量經(jīng)測定為2.96％(每克凝膠含有29.6毫克環(huán)孢素A)。該凝膠在pH7.2的等滲磷酸鹽緩沖溶液中的釋放曲線見圖1，在釋放介質(zhì)中加入透明質(zhì)酸酶(30Iu/ml)的釋放曲線見圖2。


圖1為環(huán)孢素A凝膠在pH7.2的等滲磷酸鹽緩沖溶液中的體外釋放曲線，從圖1可以看出，環(huán)孢素凝膠在等滲磷酸鹽緩沖液中4周僅釋放藥物7.02％，說明本發(fā)明具有良好的緩釋作用。
圖2為環(huán)孢素A凝膠在30Iu/ml透明質(zhì)酸酶磷酸鹽緩沖溶液中的體外釋放曲線，從圖2可以看出，當釋放介質(zhì)中加入了透明質(zhì)酸酶時，釋放速度加快，6小時釋放藥物59.1％，12小時釋放藥物86.2％，同時伴隨凝膠重量有相應(yīng)趨勢的變化，說明藥物載體(交聯(lián)透明質(zhì)酸)能在體內(nèi)降解，不用取出，適合用于制備眼部植入緩釋制劑。
權(quán)利要求
1.一種含有環(huán)孢素的眼植入凝膠，其特征在于環(huán)孢素以非溶解狀態(tài)分散于交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠中，按干燥品計，交聯(lián)透明質(zhì)酸與環(huán)孢素的質(zhì)量比為1∶5～5∶1，優(yōu)選質(zhì)量比為1∶3～3∶1，更優(yōu)選質(zhì)量比為1∶2～2∶1。
2.權(quán)利要求1所述的凝膠，其特征還在所述環(huán)孢素是環(huán)孢素A。
3.權(quán)利要求1所述的凝膠，其特征還在于交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠來源于酰肼化合物交聯(lián)的透明質(zhì)酸鈉，優(yōu)選雙酰肼化合物交聯(lián)的透明質(zhì)酸鈉，更優(yōu)選丁二酸二酰肼、辛二酸二酰肼或己二酸二酰肼交聯(lián)的透明質(zhì)酸鈉。
4.權(quán)利要求1所述凝膠的制備方法，其特征在于環(huán)孢素先混懸于透明質(zhì)酸水溶液中，再與交聯(lián)劑混合反應(yīng)形成凝膠，凝膠經(jīng)純化后，切割，包裝，滅菌制得成品。
5.權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于反應(yīng)使用的透明質(zhì)酸鈉為提取法或發(fā)酵法或其他方式生產(chǎn)的產(chǎn)品，平均分子量為10萬～300萬道爾頓，優(yōu)選平均分子量為20萬～150萬道爾頓，更優(yōu)選平均分子量為20萬～60萬道爾頓。
6.權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于反應(yīng)中使用的交聯(lián)劑是單酰肼、雙酰肼或多酰肼化合物，優(yōu)選雙酰肼化合物，更優(yōu)選丁二酸二酰肼、辛二酸二酰肼或己二酸二酰肼。
7.權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于反應(yīng)液中加入羰基活化劑單碳二亞胺或雙碳二亞胺，優(yōu)選單碳二亞胺，更優(yōu)選乙基(N，N-二甲基氨基丙基)碳二亞胺。
8.權(quán)利要求1所述的的凝膠在制備眼部植入藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含有環(huán)孢素的眼植入凝膠及其制備方法和應(yīng)用。所述凝膠特征在于環(huán)孢素以非溶解狀態(tài)分散于交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠中，按干燥品計，交聯(lián)透明質(zhì)酸與環(huán)孢素的質(zhì)量比為1∶5～5∶1。所述凝膠的制備方法為環(huán)孢素先混懸于透明質(zhì)酸鈉水溶液中，再與交聯(lián)劑混合反應(yīng)形成凝膠，凝膠經(jīng)純化后，切割，包裝，滅菌制得成品。所述凝膠應(yīng)用于制備眼部植入藥物，可用于青光眼非穿透性小梁手術(shù)預(yù)防房水濾過通道粘連，提高濾過和維持濾過通道，使術(shù)后眼壓得到良好控制；也可用于預(yù)防眼角膜移植后的排異反應(yīng)和某些眼科自身免疫性疾病。
文檔編號A61P37/00GK101085341SQ200710130668
公開日2007年12月12日 申請日期2007年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月13日
發(fā)明者凌沛學, 賀艷麗, 陳建英, 劉杰, 汪敏, 榮曉花 申請人:凌沛學