專利名稱：丹參提取物治療敗血癥的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥產(chǎn)品的新用途，特別涉及丹參提取物在治療和/或預(yù)防敗血癥的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
-丹參為中國的傳統(tǒng)中藥，最早見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，并被列為上品.丹參以唇型科鼠尾屬多年化:草本植物乃參(Salviami Itior2rhizaBunge)的干燥根及根莖入藥. 別名赤參，紫丹參,血丹參.丹參主產(chǎn)于山西，四川，安徽,河北，江蘇，山東，浙江等 省.丹參味苦,微寒，入心，心包,肝經(jīng).具有活性化瘀,涼血消癰及養(yǎng)血安神的功效, 主治瘀血所致的各種疼痛，癥瘕積聚,瘡瘍痛腫以及心悸失眠等，為臨床之常用藥 物，尤以治療冠心病及缺血性腦血管病最為常用，且療效頗佳，多用于治療冠心病， 心絞痛，心肌梗塞，心動(dòng)過速，腦血栓等，已被現(xiàn)代臨床實(shí)驗(yàn)和藥理實(shí)驗(yàn)研究所證 實(shí)活血化瘀等多方面的藥理活性,其主要成份是丹參酮(I， IIA, IIB),異丹參酮 (I ， II),隱丹參酮，羥基丹參酮IIA,異隱丹參酮，丹參新酮，左旋二氫丹參酮I ,乃-參酸甲酯，次甲丹參醌,丹參酚，乙，丙，e-谷甾醇，3,4 -二羥基苯甲醛,兒茶精,蕓香甙，原兒茶醛,原兒茶酸，乳酸,維生素E等. 丹參中的水溶性成分主要是二羥基苯基乳酸(DLA，見圖1A) H0\ yCH2CH(0H)C00H又名丹參素-D(+) e-(3，4_二羥基苯基)乳酸(1)是丹參水溶性各種成分的基 本結(jié)構(gòu)成分，已被證明有抗氧化、抗纖維化等作用。 丹酚酸B (SAB，見圖1B)丹酚酸類化合物具有很強(qiáng)的抑制脂質(zhì)過氧化、清除超氧陰離子和羥基自由基的作 用。其中丹酚酸A和B活性最強(qiáng)。丹酚酸B對腦缺血-再灌注損傷所致線粒體損 傷和神經(jīng)細(xì)胞凋亡有明顯抑制作用?？煽笴aspase-3高表達(dá)PCI2細(xì)胞的凋亡， 還可抑制B淀粉樣蛋白(A e 1-40)纖維形成及A e 1-40所致PC12細(xì)胞線粒體損 傷和細(xì)胞凋亡。屬強(qiáng)抗氧化藥，且能消除細(xì)胞內(nèi)鈣超載。敗血癥是致病菌或條件致病菌侵入血循環(huán)中生長繁殖，產(chǎn)生毒素和其他代謝產(chǎn)物 所引起的急性全身性感染，臨床上以寒戰(zhàn)、高熱、皮疹、關(guān)節(jié)痛及肝脾腫大為特 征，部分可有感染性休克和遷徙性病灶。引起敗血癥的原因有 --、人體因素① 當(dāng)皮膚粘膜有破損或發(fā)生化膿性炎癥時(shí)，細(xì)菌則容易侵入體內(nèi)。② 人體的免疫反應(yīng)可分為非特異性免疫反應(yīng)及特異性免疫反應(yīng)兩種，后者又可分 為細(xì)胞免疫與體液免疫兩方面。當(dāng)機(jī)體免疫功能下降時(shí)，不能充分發(fā)揮其吞噬殺 滅細(xì)菌的作用，即使入侵的細(xì)菌量較少，致病力不強(qiáng)也能引起敗血癥。③ 條件致病菌所引起的醫(yī)源性感染也逐漸增多。二、細(xì)菌因素主要與病原菌的毒力和數(shù)量有關(guān)。毒力強(qiáng)或數(shù)量多的致病菌進(jìn)入機(jī)體，引起敗血 癥的可能性較大。敗血癥的主要癥狀是1. 原發(fā)炎癥各種病原菌所引起的原發(fā)炎癥與其在人體的分布部位有關(guān)。 原發(fā)炎癥的特點(diǎn)是局部的紅、腫、熱、痛和功能障礙。2. 毒血癥癥狀起病多急驟。常有寒戰(zhàn)、高熱、發(fā)熱多為弛張熱及或間歇 熱，亦可呈稽留熱、不規(guī)則熱及雙峰熱，后者多系革蘭陰性桿菌敗血癥所致。發(fā) 熱同時(shí)伴有不同程度的毒血癥癥狀，如頭痛、惡心、嘔吐、腹脹、腹痛、周身不 適、肌肉及關(guān)節(jié)疼痛等。3. 皮疹見于部分患者，以瘀點(diǎn)最為多見，多分布于軀干、四肢、眼結(jié)膜、 口腔粘膜等處，為數(shù)不多。4. 關(guān)節(jié)癥狀可出現(xiàn)大關(guān)節(jié)紅、腫、熱、痛和活動(dòng)受限，甚至并發(fā)關(guān)節(jié)腔 積液、積膿，多見于革蘭陽性球菌、腦膜炎球菌、產(chǎn)堿桿菌等敗血癥的病程中。5. 感染性休克約見于l/5 l/3敗血癥患者，表現(xiàn)為煩燥不安，脈搏細(xì)速，四肢厥冷，皮膚花斑，尿量減少及血壓下降等，且可發(fā)生DIC，系嚴(yán)重毒血癥所致。6.肝脾腫大 一般僅輕度腫大。 根據(jù)研究，脂多糖(LPS)是革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞壁的組成成分之一，造成了革蘭氏陽性細(xì)菌導(dǎo)致的人敗血癥和感染性休克的多種表現(xiàn)。敗血癥時(shí)發(fā)生的微循環(huán)障是由LPS的過度釋放造成的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，由許多激活的因子所介導(dǎo)，這些 因子如粘附分子，活性氧成份(R0S)，以及炎癥前體介質(zhì)如腫瘤壞死因子一 a(TNF-a)、白介素一6 (IL-6)以及干擾素一 Y (INF-Y ) 。 LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的微循 環(huán)障礙對敗血癥時(shí)發(fā)生的器官功能障礙起著關(guān)鍵作用，在這個(gè)過程中白細(xì)胞沿著 內(nèi)皮旋轉(zhuǎn)并粘附于血管內(nèi)皮，血管壁產(chǎn)生過氧化氫和肥大細(xì)胞脫顆粒都是文獻(xiàn)報(bào) 道的關(guān)鍵步驟。當(dāng)前敗血癥的主要臨床治療方法包括容量復(fù)蘇，兒茶酚胺的運(yùn)用和抗生素補(bǔ) 償治療。這些方法可以增加敗血癥病人的存活率，但是在臨床上會(huì)導(dǎo)致血糖升高 以及血壓和血鈣的下降，并發(fā)生出血。臨床研究建議采用抗TNF-a治療對敗血 癥的治療有所幫助。然而，最近的研究表明這種方法不能治愈敗血癥且會(huì)增加嚴(yán) 重?cái)⊙Y病人的死亡率。因而，在LPS導(dǎo)致的敗血癥中尋找防止出現(xiàn)嚴(yán)重微循 環(huán)障的方法仍然是個(gè)挑戰(zhàn)。本發(fā)明人在對丹參中的兩個(gè)重要提取物二羥基苯基乳酸和丹酚酸B進(jìn)行的 研究過程中，發(fā)現(xiàn)二羥基苯基乳酸和丹酚酸B顯著改善脂多糖誘導(dǎo)的大鼠腸系 膜微循環(huán)障礙，并抑制脂多糖引起的CDllb和CD18表達(dá)和嗜中性粒細(xì)胞產(chǎn)生 '02 —和11202，對敗血癥有明顯的治療作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種丹參提取物的新的治療用途。所述新的治療用途，是用丹參提取 物治療因微循環(huán)障礙引發(fā)的敗血癥。為此，本發(fā)明提供一種藥物新用途，即用丹參提取物制備一種治療和/或預(yù)防敗 血癥的藥物。本發(fā)明所述丹參提取物選自兩個(gè)重要提取物二羥基苯基乳酸和丹酚酸B。 本發(fā)明所述的二羥基苯基乳酸和丹酚酸B是現(xiàn)有技術(shù)，可以從市場上買到，也 可以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)制備，符合藥用標(biāo)準(zhǔn)即可。優(yōu)選純度〉50%，更優(yōu)選純度〉90%，。本發(fā)明所述制備的藥物，是用上述丹參提取物作為藥物活性成分制備成的藥物制 劑組合物。本發(fā)明的藥物制劑組合物，根據(jù)需要可以含有藥物可接受的載體，其中丹參 提取物作為藥物活性成分，其在制劑中所占重量百分比可以是0.1-99.9%,其余 為藥物可接受的載體。本發(fā)明的藥物制劑組合物，以單位劑量形式存在，所述單 位劑量形式是指制劑的單位，如片劑的每片，膠囊的每粒膠囊，口服液的每瓶， 顆粒劑每袋，注射劑的每支等。本發(fā)明的藥物制劑組合物可以是任何可藥用的劑型，這些劑型包括片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口服液、 口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注 射劑、栓劑、軟膏劑、硬膏劑、霜?jiǎng)?、噴霧劑、滴劑、貼劑。本發(fā)明的中藥制劑，其口服給藥的制劑可含有常用的賦形劑，諸如粘合劑、 填充劑、稀釋劑、壓片劑、潤滑劑、崩解劑、著色劑、調(diào)味劑和濕潤劑，必要時(shí) 可對片劑進(jìn)行包衣。適用的填充劑包括纖維素、甘露糖醇、乳糖和其它類似的填充劑。適宜的崩 解劑包括淀粉、聚乙烯吡咯垸酮和淀粉衍生物，例如羥基乙酸淀粉鈉。適宜的潤 滑劑包括，例如硬脂酸鎂。適宜的藥物可接受的濕潤劑包括十二垸基硫酸鈉。可通過混合，填充，壓片等常用的方法制備固體口服組合物。進(jìn)行反復(fù)混合 可使活性物質(zhì)分布在整個(gè)使用大量填充劑的那些組合物中?？诜后w制劑的形式例如可以是水性或油性懸浮液、溶液、乳劑、糖漿劑或 酏劑，或者可以是一種在使用前可用水或其它適宜的載體復(fù)配的干燥產(chǎn)品。這種 液體制劑可含有常規(guī)的添加劑，諸如懸浮劑，例如山梨醇、糖漿、甲基纖維素、 明膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠或氫化食用脂肪，乳化劑，例如卵磷脂、脫水山梨醇一油酸酯或阿拉伯膠；非水性載體(它們可以包括食用 油)，例如杏仁油、分餾椰子油、諸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐 劑，例如對羥基苯甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常 規(guī)的香味劑或著色劑。對于注射劑，制備的液體單位劑型含有本發(fā)明的活性物質(zhì)和無菌載體。根據(jù)載體和濃度，可以將此化合物懸浮或者溶解。溶液的制備通常是通過將活性物質(zhì) 溶解在一種載體中，在將其裝入一種適宜的小瓶或安瓿前過濾消毒，然后密封。 輔料例如一種局部麻醉劑、防腐劑和緩沖劑也可以溶解在這種載體中。為了提高 其穩(wěn)定性，可在裝入小瓶以后將這種組合物冰凍，并在真空下將水除去。本發(fā)明的中藥制劑，在制備成藥劑時(shí)可選擇性的加入適合的藥物可接受的載 體，所述藥物可接受的載體選自甘露醇、山梨醇、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、鹽酸半胱氨酸、巰基乙酸、蛋氨酸、維生素C、 EDTA二鈉、EDTA 鈣鈉， 一價(jià)堿金屬的碳酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽或其水溶液、鹽酸、醋酸、硫酸、 磷酸、氨基酸、氯化鈉、氯化鉀、乳酸鈉、木糖醇、麥芽糖、葡萄糖、果糖、右 旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纖維素及其衍生物、 藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土溫80、瓊脂、碳酸鈣、碳酸氫鈣、表面活性劑、聚乙二醇、環(huán)糊精、e _環(huán)糊精、磷脂類材料、高嶺土、滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂等。本發(fā)明的制劑在使用時(shí)根據(jù)病人的情況確定用法用量，可每日服三次，每次 1-20劑，如l-20袋或?；蚱縿﹍mg-1000mg。 本發(fā)明所述的治療用途是通過以下實(shí)驗(yàn)證明的 材料和方法 試藥二羥基苯基乳酸和丹酚酸B均購自中國藥品生物制品檢定所(北京，中國)。 脂多糖取自大腸桿菌血清型055: B5，甲苯胺藍(lán)，2， ， 7， -二氯熒光素乙酰乙 酸鹽(DCFH-DA)和氫化乙啡啶均購自Sigma (圣路易斯，密蘇里州)。FITC-結(jié)合小鼠抗-大鼠CDllb單克隆抗體，F(xiàn)ITC-結(jié)合小鼠抗-大鼠CD18單克隆抗體， FITC-結(jié)合小鼠IgA， k和FITC-結(jié)合小鼠IgGn k均購自BD生物科學(xué)系統(tǒng)(圣 地亞哥，加州)。溶血素購自BD生物科學(xué)Immunocytometer系統(tǒng)(美國加州硅 谷)。Mono-Pol分離液購自大日本製薬株式會(huì)社(大阪，日本)。RPMI 1640和 胎牛血清購自Hyclone (樓根，猶他州)。試驗(yàn)中使用的所有其它化學(xué)試劑為最 優(yōu)商品級(jí)試劑。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性SD大鼠，體重200 250g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有研究經(jīng)過批準(zhǔn)，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遵循北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究委員會(huì)指南進(jìn)行處 理。腸系膜微循環(huán)觀察試驗(yàn)前SD大鼠禁食12小時(shí)，可以自由飲水。用烏拉坦將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉 (1.25mg/kg體重，肌肉注射)。將導(dǎo)管插入左頸靜脈和右股靜脈，供注射各種 實(shí)驗(yàn)藥物使用。經(jīng)腹正中線切開20-30mm，輕柔地將20cm腸系膜尾部的回盲腸 由腹部取出，置于透明塑料大鼠實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。用恒溫裝置將腸系膜保持在37°C， 在表面連續(xù)滴加生理鹽水，保持水分。取倒置顯微鏡(DM-IRB, Leica， Wetzlar， 德國)，用透照法觀察腸系膜微循環(huán)血液動(dòng)力學(xué)。 一臺(tái)攝像機(jī)(Jk-TU53H，日本 東芝公司，東京，日本)安裝在顯微鏡上，將圖像反射到彩色監(jiān)視器(J2118A， TCL，徽州，中國)，使用DVD (DVR-R25， Malata， Xiamen，中國)記錄圖像。 研究中供測量參數(shù)使用的微靜脈應(yīng)為單根，非分枝，無明顯彎曲，直徑范圍為 30(im-50fxm，長度為200nm。 脂多糖誘導(dǎo)的微循環(huán)障礙和藥物輸注將大鼠隨機(jī)分成4組，每組6只。觀察大鼠腸系膜微血管系統(tǒng)的基本血液動(dòng) 力學(xué)10分鐘后，給予溶媒(生理鹽水溶液)或試驗(yàn)藥品。自試驗(yàn)開始(第O分 鐘)至試驗(yàn)結(jié)束(第60分鐘)，自對照組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物左頸靜脈插管灌注鹽水溶液 (8ml/kg體重/hr);自試驗(yàn)開始(第O分鐘)至試驗(yàn)結(jié)束(第60分鐘)，自脂 多糖組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物左股靜脈連續(xù)灌注脂多糖(2mg/kg體重/hrin鹽水溶液)。自脂 多糖+二羥基苯基乳酸組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物左股靜脈輸注脂多糖(2mg/kg體重/hr)后， 自試驗(yàn)前20分鐘至觀察結(jié)束期間由左頸靜脈輸注二羥基苯基乳酸(5mg/kg體重 /hrin鹽水溶液)。脂多糖+丹酚酸B組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理方法與脂多糖+ 二羥基苯 基乳酸組相同，只需用丹酚酸B (5mg/kg體重/hrin鹽水溶液)代替二羥基苯基 乳酸。四個(gè)實(shí)驗(yàn)組的總輸注量相同。 微靜脈直徑測量使用圖像-Pro Plus 5.0軟件評(píng)價(jià)系統(tǒng)記錄的微靜脈動(dòng)態(tài)圖像，在第O， 10， 30和50分鐘測量微靜脈直徑。 微靜脈紅細(xì)胞流速測量記錄微靜脈紅細(xì)胞流速，通過CCD將監(jiān)控器調(diào)節(jié)至高速度攝像機(jī)系統(tǒng)(FAST C層-ultima APX， photron，圣地亞哥，加州)，調(diào)節(jié)速度至2000幀每 秒(幀/秒)，以25幀/秒重新播放高速保存圖像。用圖像-Pro Plus 5.0軟件測量 第0， 10， 30和50分鐘的微靜脈紅細(xì)胞流速。 切變率測量遵循下述公式計(jì)算微靜脈切變率(Y ): Y=8 (微靜脈/微靜脈直徑RBCs平 均速度)。粒性白細(xì)胞粘附測量觀察系統(tǒng)記錄的粒性白細(xì)胞動(dòng)態(tài)圖像，鑒定粘附在微靜脈壁上的粒性白細(xì) 胞。粘附的粒性白細(xì)胞是指重新播放DVD圖像時(shí)粒性白細(xì)胞在同一位點(diǎn)粘附10 秒鐘以上。在觀察第O， 10， 30和50分鐘圖像隨機(jī)選擇200pm微靜脈，然后沿 微靜脈統(tǒng)計(jì)粘附的粒性白細(xì)胞數(shù)量。 趨化游走粒性白細(xì)胞測量檢查記錄的圖像，測量趨化游走粒性白細(xì)胞數(shù)。白細(xì)胞趨化游走即每200pm 微靜脈粒性白細(xì)胞的數(shù)量，在第O， 10， 30和50分鐘隨機(jī)選擇圖像。 肥大細(xì)胞脫顆粒測量輸注脂多糖或鹽水溶液60分鐘后，用0.1%甲苯胺藍(lán)將組織局部染色1分鐘， 然后用生理鹽水清洗。視野中沒有脫顆粒的肥大細(xì)胞和脫顆粒的肥大細(xì)胞的數(shù)量 放大20X，每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物共評(píng)價(jià)5個(gè)視野。脫顆粒的肥大細(xì)胞數(shù)量與肥大細(xì)胞 總數(shù)量的比值即為脫顆粒的肥大細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。 嗜中性粒細(xì)胞表面CDllb和CD18表達(dá)測量經(jīng)腹主動(dòng)脈采集其它組大鼠血樣(n=6)，加肝臟素抗凝，檢測嗜中性粒細(xì)胞 表面CDllb和CD18表達(dá)。樣品分成四組對照組，脂多糖組(脂多糖2pg/ml)， 脂多糖+ 二羥基苯基乳酸組(脂多糖2pg/ml加二羥基苯基乳酸0.2mg/ml， 0.5mg/ml或1.0mg/ml)和脂多糖+丹酚酸B組(脂多糖2pg/ml加丹酚酸B 0.2mg/ml， 0.5mg/ml或1.0mg/ml)。樣品在37。C水浴中培育2小時(shí)，然后使用 lpg/ml FITC-結(jié)合小鼠抗-大鼠CDllb抗體，lpig/mlFITC-結(jié)合小鼠抗-大鼠 CD18抗體或FITC-結(jié)合相應(yīng)同種型(小鼠IgA，Kfor CD1 lb，小鼠IgG!， /cforCD18) 在室溫條件下標(biāo)記20分鐘。然后，按照生產(chǎn)廠家(BD生物科學(xué)系統(tǒng)，美國加 州硅谷)說明，用溶血素將紅細(xì)胞溶解，磷殘留細(xì)胞用酸鹽緩沖溶液洗滌兩次。9根據(jù)前向角-/側(cè)向角-散射表達(dá)特性，使用FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BD生物 科學(xué)系統(tǒng)，美國加州硅谷)將嗜中性粒細(xì)胞分類，評(píng)價(jià)每個(gè)樣本中的5000個(gè)嗜 中性粒細(xì)胞，測量平均熒光強(qiáng)度。 嗜中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)11202和'02 —測量血樣分別取自不同組大鼠，加肝臟素抗凝。遵循Ting所述方法，使用Mono-多分離液分離嗜中性粒細(xì)胞，然后將其懸浮在0.1M磷酸鹽緩沖溶液中。使用 FACSCalibur流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)(BD生物科學(xué)系統(tǒng)，美國加州硅谷)分析細(xì)胞內(nèi)產(chǎn) 生的'02 —和11202。簡而言之，將采集的嗜中性粒細(xì)胞在20mM2' -7， -二氯熒光 素雙醋酸鹽溶液中培育5分鐘，溫度為37。C，然后在10mM氫化乙啡P定中培育15 分鐘。2' -7' -二氯熒光素雙醋酸鹽的硝酸鹽部分被細(xì)胞內(nèi)酯酶斷開，釋放不能 通過細(xì)胞膜的2' ，7' -二氯熒光素，被11202氧化成2' ，7' -二氯熒光素(DCF) 后發(fā)出熒光；另一方面Hydroethidium可以直接被'02 —氧化成菲啶溴紅(EB)， 嵌入核酸后發(fā)熒光。然后使用二羥基苯基乳酸(0.5mg/ml)或丹酚酸B (0.5mg/ml) 處理細(xì)胞，用脂多糖(2ug/ml)刺激細(xì)胞。在冰中培育20分鐘后，用流式細(xì)胞 計(jì)量術(shù)測量產(chǎn)生的11202和'02 —，測量發(fā)射波長為525nm (FL1， forDCF)和590nm(FL2， forEB)。 統(tǒng)計(jì)分析使用ANOVA和Fisher' s post hoc test計(jì)算統(tǒng)計(jì)顯著性。統(tǒng)計(jì)顯著水平為 p<0.05。數(shù)據(jù)以平均土S.E.M表示。 結(jié)果二羥基苯基乳酸和丹酚酸B對脂多糖誘導(dǎo)的微靜脈紅細(xì)胞流速變化的干預(yù) 作用在不同時(shí)間點(diǎn)測量四個(gè)實(shí)驗(yàn)組中微靜脈紅細(xì)胞流速(見表l)。脂多糖輸 注30分鐘后，微靜脈紅細(xì)胞流速降低至74%基礎(chǔ)值水平，并且這種干預(yù)作用一 直維持觀察結(jié)束。二羥基苯基乳酸或丹酚酸B處理后，脂多糖誘導(dǎo)的微靜脈紅 細(xì)胞流速降低明顯降低。二羥基苯基乳酸和丹酚酸B對脂多糖誘導(dǎo)的腸系膜微靜脈切變率變化的干 預(yù)作用表2顯示四個(gè)實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)觀察的腸系膜微靜脈切變率。對照組， 脂多糖組，脂多糖+ 二羥基苯基乳酸組和脂多糖+丹酚酸B組的基礎(chǔ)值微靜脈 切變率未出現(xiàn)顯著性差異。給予脂多糖后腸系膜微靜脈切變率明顯降低，30分鐘后變得更加顯著，并且這種降低一值維持到脂多糖輸注結(jié)束50分鐘。二羥基 苯基乳酸或丹酚酸B處理減弱脂多糖誘導(dǎo)的腸系膜微靜脈切變率降低，降低數(shù) 值較小，因此并不顯著，脂多糖輸注50分鐘后可以檢測到脂多糖+ 二羥基苯基 乳酸或脂多糖+丹酚酸B組切變率降低。二羥基苯基乳酸和丹酚酸B對脂多糖誘導(dǎo)的粘附在微靜脈壁上的粒性白細(xì)胞數(shù)量變化的干擾作用評(píng)價(jià)不同條件下粘附在微靜脈壁上的粒性白細(xì)胞數(shù)量隨 時(shí)間的變化(見圖2)。在觀察期內(nèi)，對照組粘附的粒性白細(xì)胞數(shù)隨著時(shí)間的推 移只有少量增加。但是，脂多糖刺激后粘附的粒性白細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)顯著性遞增， 自脂多糖輸注第IO分鐘開始增加，且這種增加趨勢維持了 50分鐘。二羥基苯基 乳酸或丹酚酸B處理顯著抑制脂多糖誘導(dǎo)的白細(xì)胞粘附。二羥基苯基乳酸和丹酚酸B對脂多糖誘導(dǎo)的沿微靜脈壁趨化游走的粒性白 細(xì)胞數(shù)量變化的干擾作用沿微靜脈壁趨化游走的粒性白細(xì)胞數(shù)量的變化時(shí)間過 程見圖3。在所有時(shí)間點(diǎn)，對照組出現(xiàn)很少或沒有出現(xiàn)趨化游走的粒性白細(xì)胞。 給予脂多糖引起趨化游走粒性白細(xì)胞數(shù)量在50分鐘顯著增加，二羥基苯基乳酸 或丹酚酸B處理后幾乎完全沒有出現(xiàn)這種增加。二羥基苯基乳酸和丹酚酸B對脂多糖誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫顆粒的干預(yù)作用 圖4顯示四個(gè)實(shí)驗(yàn)組中微靜脈中脫顆粒肥大細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。對照組中甚至可以檢測 到少量脫顆粒肥大細(xì)胞。脂多糖輸注60分鐘后脫顆粒肥大細(xì)胞數(shù)量開始增加， 二羥基苯基乳酸或丹酚酸B處理組顯著抑制脂多糖誘導(dǎo)的脫顆粒反應(yīng)肥大細(xì)胞。二羥基苯基乳酸和丹酚酸B對嗜中性粒細(xì)胞體外CDllb和CD18表達(dá)的干預(yù) 作用本研究使用流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析接受不同處理的嗜中性粒細(xì)胞表面粘附分 子CDllb和CD18表達(dá)。圖5A顯示，與對照組比較經(jīng)脂多糖處理后嗜中性粒細(xì)胞 表面CDllb的熒光強(qiáng)度顯著增加，加入丹酚酸B或二羥基苯基乳酸后這種由脂多 糖誘導(dǎo)的CDllb熒光強(qiáng)度增強(qiáng)消失，加入的丹酚酸B的有效濃度可以低至 0.2mg/ml， 二羥基苯基乳酸的有效濃度可以低至0.5mg/ml。圖5B表明，粘附分 子CD18出現(xiàn)類似的趨勢經(jīng)脂多糖處理后嗜中性粒細(xì)胞表面CD18熒光強(qiáng)度顯著 增加，使用的濃度達(dá)到0.2mg/tnl時(shí)，二羥基苯基乳酸或丹酚酸B處理后這種作 用受到抑制。二羥基苯基乳酸和丹酚酸B對嗜中性粒細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生'(V和&02的體外千預(yù)作用使用流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)檢測二羥基苯基乳酸和丹酚酸B的抗氧化作用。細(xì)胞 經(jīng)脂多糖刺激后，嗜中性粒細(xì)胞產(chǎn)生大量'(V ，加入0.5mg/ml二羥基苯基乳酸或 丹酚酸B后，顯著抑制細(xì)胞產(chǎn)生'(V (見圖6A)。與對照組比較，脂多糖刺激后嗜 中性粒細(xì)胞HA熒光強(qiáng)度幾乎增加兩倍，使用O. 5mg/ml二羥基苯基乳酸或丹酚酸B 處理后這種作用顯著降低(見圖6B)。試驗(yàn)結(jié)果表明，二羥基苯基乳酸和丹酚酸B均可以改善脂多糖誘導(dǎo)的大鼠腸 系膜微循環(huán)障礙。包括抑制白細(xì)胞粘附和趨化游走，減弱紅細(xì)胞流速和微靜脈切 變率降低，抑制肥大細(xì)胞脫顆粒?？梢砸种浦嗵谴碳さ氖戎行粤＜?xì)胞粘附分子 CDllb和CD18表達(dá)和'02 —和11202產(chǎn)生。這些結(jié)果為LPS誘導(dǎo)的敗血癥的臨床 治療提供了一個(gè)新的可供選擇的方法。 表l輸注鹽水溶液或脂多糖后不同時(shí)間點(diǎn)微靜脈紅細(xì)胞流速。 按照材料和方法所述方法，輸注鹽水溶液或脂多糖后，給予或不給予二羥基苯 基乳酸或丹酚酸B預(yù)處理，在第O， 10， 30和50分鐘測量微靜脈紅細(xì)胞流速。 數(shù)據(jù)以6只大鼠的平均土S. E. M表示。微靜脈RBCsi速度(mm/秒)對照(n=6) 脂多糖(n=6) 脂多糖+二羥基 苯基乳酸(n=6) 脂多糖+丹酚酸 B (n=6)0分鐘 1,91 ±0.351.90±0.141.79±0.261.90±0.3310分鐘 1.89±0.291.52±0.171.79±0.331.93 ±0.3230分鐘 50分鐘 2.18±0.25 1.99±0.17 1.41±0.09* 1.35±0.11*1.78 ±0.271.94±0.351.50 ±0.201.78±0.33對照組大鼠灌注溶媒(鹽水溶液)(8ml/kg體重/hr);脂多糖組大鼠灌注脂多 糖(2mg/kg體重/hr);脂多糖+ 二羥基苯基乳酸組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在輸注脂多糖(2mg/kg體重/hr) 20分鐘前灌注二羥基苯基乳酸(5mg/kg體重/hr);脂多 糖+丹酚酸B，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在輸注脂多糖(2mg/kg體重/hr) 20分鐘前灌注丹酚 酸B (5mg/kg體重/hr).0.05。 表2輸注鹽水溶液或脂多糖后不同時(shí)間點(diǎn)的微靜脈切變率。按照材料和方法所述方法，給予或不給予二羥基苯基乳酸或丹酚酸B預(yù)處理， 輸注鹽水溶液或脂多糖后，在第0， 10， 30和50分鐘測量微靜脈切變率。數(shù)據(jù) 以6只大鼠的平均士S.E.M。表示。微靜脈切變率(s—')O分鐘對照(n=6) 421.18±95.19脂多糖394.95±31.90(n=6) 脂多糖+ 二羥基苯基乳 417.35土64.11402.50±69.90410.05±59.77 338.48±48.86酸(n=6) 脂多糖+丹酚酸B 375.85±58,82375.15±51.61380.36±64.61 340.35±61.02(n=6)對照組大鼠灌注溶媒(鹽水溶液)(8ml/kg體重/hr);脂多糖組大鼠灌注脂多 糖(2mg/kg體重/hr);脂多糖+二羥基苯基乳酸組大鼠灌注脂多糖(2mg/kg 體重/hr) 20分鐘前，灌注二羥基苯基乳酸(5mg/kg體重/hr);脂多糖+丹酚 酸B組大鼠灌注脂多糖(2mg/kg體重/hr) 20分鐘前，灌注丹酚酸B (5mg/kg 體重/hr)。承與對照組比較p〈0. 05。


圖1. 二羥基苯基乳酸和丹酚酸B的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖2. 二羥基苯基乳酸和丹酚酸B對大鼠輸注脂多糖后粘附在微靜脈壁上的粒 性白細(xì)胞數(shù)量變化的時(shí)間過程干預(yù)作用。對照組大鼠灌注鹽水溶液60分鐘 (8ml/kg體重/hr)，脂多糖組大鼠灌注脂多糖(2mg/kg體重/hr) 60分鐘。遵10分鐘 30分鐘 50分鐘397.88±74.85459.61 ±68.58 426.06±50.02330.87±44.96295.52±24.36* 282.94±25.99*13循材料和方法所述方法，大鼠輸注脂多糖(2mg/kg體重/hr) 20分鐘前靜脈注 射二羥基苯基乳酸(5mg/kg體重/hr)或丹酚酸B (5mg/kg體重/hr)，連續(xù)輸 注直至觀察結(jié)束。四個(gè)實(shí)驗(yàn)組的總輸注量相同。統(tǒng)計(jì)粒性白細(xì)胞趨化游走數(shù)量， 結(jié)果以每200 u m微靜脈的細(xì)胞數(shù)量表示。數(shù)據(jù)為6只大鼠的平均士S. E. M表示。 *與對照組比較P〈0. 05。， t與脂多糖比較p<0, 05。圖3. 二羥基苯基乳酸和丹酚酸B對大鼠輸注脂多糖后微靜脈趨化游走粒性白細(xì) 胞數(shù)量變化的時(shí)間過程干預(yù)作用。對照組大鼠灌注鹽水溶液60分鐘(8ml/kg 體重/hr),脂多糖組大鼠灌注脂多糖(2mg/kg體重/hr) 60分鐘。按照材料和 方法所述方法，大鼠輸注脂多糖(2mg/kg體重/hr) 20分鐘前靜脈注射二羥基 苯基乳酸(5mg/kg體重/hr)或丹酚酸B (5mg/kg體重/hr)，連續(xù)輸注直至觀 察結(jié)束。四個(gè)實(shí)驗(yàn)組的總輸注量相同。統(tǒng)計(jì)粒性白細(xì)胞趨化游走數(shù)量，結(jié)果以 每200um微靜脈的細(xì)胞數(shù)量表示。數(shù)據(jù)6只大鼠的平均土S.E.M表示。*與對 照組比較p<0. 05。 ， t與脂多糖比較p〈0. 05。圖4. 二羥基苯基乳酸和丹酚酸B對大鼠輸注脂多糖后沿微靜脈肥大細(xì)胞脫顆粒 的干預(yù)作用。對照組大鼠灌注鹽水溶液60分鐘(8ml/kg體重/hr)，脂多糖組 大鼠灌注脂多糖(2mg/kg體重/hr) 60分鐘。按照材料和方法所述方法，大鼠 輸注脂多糖(2mg/kg體重/hr) 20分鐘前靜脈注射二羥基苯基乳酸(5mg/kg體 重/hr)或丹酚酸B (5mg/kg體重/hr，連續(xù)輸注直至觀察結(jié)束。四個(gè)實(shí)驗(yàn)組的 總輸注量相同。脂多糖輸注60分鐘后測量肥大細(xì)胞脫顆粒。數(shù)據(jù)6只大鼠的平 均士S.E.M表示。Hc與對照組比較p〈0.05。， t與脂多糖比較p〈0.05。 圖5. 二羥基苯基乳酸和丹酚酸B對體外脂多糖刺激嗜中性粒細(xì)胞粘附分子 CDllb (A)和CD18 (B)表達(dá)的干預(yù)作用。使用流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析CDUb和 CD18表達(dá)。血樣用脂多糖(2Pg/ml)培育，加入或不加各種濃度的二羥基苯基 乳酸或丹酚酸B，然后使用相應(yīng)抗體培育。將紅細(xì)胞溶解，將嗜中性粒細(xì)胞分 類，使用流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)評(píng)價(jià)，測量平均熒光強(qiáng)度。數(shù)據(jù)6只大鼠的平均士S. E. M 表示。本與對照組比較p〈0.05。， t與脂多糖比較p〈0.05。 圖6. 二羥基苯基乳酸和丹酚酸B對體外脂多糖刺激嗜中性粒細(xì)胞產(chǎn)生'(V (A) 和H202 (B)的干預(yù)作用。嗜中性粒細(xì)胞用2化Anl脂多糖培育，加入或不加二 羥基苯基乳酸(0.5mg/ml)或丹酚酸B (0.5mg/ml)。用流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)測量產(chǎn)生的.(V和HA。數(shù)據(jù)6只大鼠的平均土S.E.M表示。氺與對照組比較p〈0.05。十 與脂多糖比較p<0.05。
具體實(shí)施例方式
以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不作為對本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1
片劑
處方二羥基苯基乳酸或丹酚酸B100g 微晶纖維素50g 微粉
硅膠3g 硬脂酸鎂1. 5g
制法取原、輔料分別過100目篩；取三七皂苷、微晶纖維素，混勻， 用60%乙醇適量作為粘合劑制軟材，過20目篩制顆粒，6(TC干燥，取出， 過30目篩整粒，加入微粉硅膠及硬脂酸鎂，混勻，壓片，制成1000片，
即得。 實(shí)施例處方二羥基苯基乳酸或丹酚酸B75g 微晶纖維素37g 微粉硅膠 2. 3g 硬脂酸鎂l.lg
制法取原、輔料分別過IOO目篩；取三七皂苷、硫酸鈣、微晶纖維素， 混勻，用60%乙醇適量作為粘合劑制軟材，過20目篩制顆粒，6(TC干燥， 取出，過30目篩整粒，加入適量微粉硅膠及硬脂酸鎂，混勻，壓片，制 成1000片，即得。 實(shí)施例處方二羥基苯基乳酸或丹酚酸B133g 微晶纖維素66g 微粉硅膠 4g
硬脂酸鎂2g
制法取原、輔料分別過100目篩；取三七皂苷、硫酸鈣、微晶纖維素， 混勻，用60%乙醇適量作為粘合劑制軟材，過20目篩制顆粒，6(TC干燥， 取出，過30目篩整粒，加入適量微粉硅膠及硬脂酸鎂，混勻，壓片，制 成1000片，即得。 實(shí)施例4
膠囊，取二羥基苯基乳酸或丹酚酸B100mg，加入適量淀粉，硬脂酸鎂等輔料，制粒，整粒，裝入1號(hào)膠囊，即得。 實(shí)施例5
口服液，取二羥基苯基乳酸或丹酚酸B100mg，加入適量蔗糖，防腐劑，加水到 1000ml，分裝成10ml—支，即得口服液。 實(shí)施例6
顆粒劑，取二羥基苯基乳酸或丹酚酸B100mg，加入適量糊精、甜菊素，干式制 粒，整粒，分裝，即得。 實(shí)施例7
注射劑，二羥基苯基乳酸或丹酚酸B150g加水溶解，另氯化鈉、對羥基苯甲酸 乙酯加熱水溶解，混勻，調(diào)
pH值。注射用水稀釋至1000ml,用中空纖維膜濾過，灌裝，滅菌，即得。 實(shí)施例8
應(yīng)用實(shí)例，敗血癥的治療 典型病例(一)
患者孫XX，男性，30歲，印刷工人，有頭痛、惡心、嘔吐、腹脹、腹痛、 周身不適、肌肉及關(guān)節(jié)疼痛等，經(jīng)診斷為敗血癥
開始注射二羥基苯基乳酸注射液，規(guī)格0.1g/支，每日三次每次2支。半月 后自覺癥狀有明顯好轉(zhuǎn)。用藥期間無任何不良反應(yīng)。
權(quán)利要求
1、丹參提取物在制備一種治療敗血癥的藥物中的應(yīng)用。
2、 權(quán)利要求l的應(yīng)用，其特征在于，所述丹參提取物是二羥基苯基乳酸。
3、 權(quán)利要求l的應(yīng)用，其特征在于，所述丹參提取物丹酚酸B。
4、 權(quán)利要求l的應(yīng)用，其特征在于，所述敗血癥是致病菌或條件致病菌侵入血 循環(huán)中生長繁殖，產(chǎn)生毒素和其他代謝產(chǎn)物所引起的急性全身性感染。
5、 權(quán)利要求l的應(yīng)用，其特征在于，所述敗血癥引發(fā)微循環(huán)障礙，該微循環(huán)障 礙是由脂多糖的過度釋放造成的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)。
6、 權(quán)利要求l的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是用二羥基苯基乳酸或丹酚酸B 處理后，脂多糖誘導(dǎo)的微靜脈紅細(xì)胞流速降低。
7、 權(quán)利要求l的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是二羥基苯基乳酸或丹酚酸B抑 制脂多糖誘導(dǎo)的白細(xì)胞粘附。
8、 權(quán)利要求l的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是二羥基苯基乳酸或丹酚酸B抑 制脂多糖誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫顆粒反應(yīng)。
9、 權(quán)利要求l的應(yīng)用，其特征在于，所述丹參提取物是含有丹參提取物的藥物 制劑組合物。
10、 權(quán)利要求9的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物制劑組合物，以丹參提取物二羥 基苯基乳酸和乃酚酸B作為藥物活性成分，同時(shí)含有藥物可接受的載體，其中丹 參提取物在制劑中所占重量百分比是0. 1-99. 9%，其余為藥物可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及丹參提取物治療敗血癥的應(yīng)用，特別涉及丹參提取物二羥基苯基乳酸或丹酚酸B在治療和/或預(yù)防敗血癥的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P31/04GK101327249SQ200710111279
公開日2008年12月24日 申請日期2007年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月21日
發(fā)明者劉育英, 凱 孫, 王傳社, 俊 郭, 韓晶巖 申請人:天津天士力制藥股份有限公司