專利名稱：一種關節(jié)軟骨生物支架材料及制備方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于生物材料制備技術(shù)領域，涉及一種新型共混的關節(jié)軟骨生物支架材料的制備方法及由該方法制備得到的產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
軟骨缺乏再生能力，外傷或疾病引起的軟骨缺損需利用軟骨或其它材料修復。自體軟骨來源有限，且容易造成供區(qū)缺損，應用受到限制。異體軟骨曾廣泛應用，由于可引起免疫排斥反應，導致細胞死亡及功能喪失。骨膜移植曾風行一時，但其存在遠期效果不穩(wěn)定的缺陷，使得人們不斷探索更完善的修復方法。體外軟骨細胞培養(yǎng)成功，引發(fā)人們嘗試直接用軟骨細胞修復軟骨缺損。1968年，Chertman等將軟骨細胞懸液注射到關節(jié)軟骨缺損部位，結(jié)果表明缺損為滑膜成纖維組織修復，鏡下僅見少量新生軟骨細胞結(jié)節(jié)。1977年，Green等人以脫鈣骨作為支架，并接種上軟骨細胞，移植到缺損部位。雖未成功，可喜的是他第一次提出如能找到一種合適的支架材料，將軟骨細胞接種于其上，即有可能形成良好的軟骨組織修復。當前，在組織工程中開發(fā)為細胞培養(yǎng)支架的生物材料主要分為兩類，即人工合成的材料和天然生物材料。天然生物材料具有細胞信號識別，促進細胞的粘附、增殖和分化、良好的生物相容性及良好的生物降解性等優(yōu)點，顯示出人工合成材料無可比擬的優(yōu)勢。
細胞外基質(zhì)是由細胞自身分泌組成的并圍繞在細胞周圍主要含有膠原蛋白、纖維蛋白粘連素、層粘連蛋白，層連素等。細胞外基質(zhì)不僅為細胞提供了一個支持結(jié)構(gòu)和附著位點，而且對細胞的粘附、遷移、增殖、分化以及基因表達的調(diào)控有重要作用和顯著影響。天然脫細胞生物材料主要利用同種或異種器官/組織，經(jīng)脫細胞、去除抗原處理得到脫細胞基質(zhì)材料。脫細胞基質(zhì)材料具有多種天然細胞外成分和大量的活性細胞因子，有利于細胞的吸附，增殖和分化并具有一定的力學強度，可作為組織填充物而長期存在；并且它還具有較好的組織親和性和相容性，可誘導軟骨細胞向其中生長而重建軟骨，在未來組織修復中它們將擁有廣泛的應用前景。我們前期的研究表明脫細胞的天然軟骨基質(zhì)能夠促進軟骨細胞黏附、生長和功能表達，但是這種只脫去細胞和除去抗原成分的天然軟骨基質(zhì)材料，具有一些無法彌補的缺點，如孔隙率低，孔隙小，接種的軟骨細胞無法進入材料深層；降解速度慢等[孔清泉，楊志明，項舟，等《離心力在體外構(gòu)建組織工程軟骨中的作用》中華實驗外科雜志，2005，22(3)281-283]。II型膠原由于含有特別的識別信號，有利于軟骨細胞粘附、增殖、分化，可作為良好的材料包埋添加劑。缺點是缺乏一定的機械強度，難于塑形，支架材料在體內(nèi)降解過快。體內(nèi)細胞生長的基質(zhì)非常復雜，單一材料較難適應細胞培養(yǎng)的要求，通過共混調(diào)整不同材料之間的比例，可以使共混材料具有更適合細胞培養(yǎng)的力學性能、降解性和生物學性質(zhì)等。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述天然生物材料的缺陷，本發(fā)明的第一個目的是提供一種兼具天然軟骨細胞外基質(zhì)材料和II型膠原優(yōu)點，同時改善兩種材料自身所固有缺點的關節(jié)軟骨生物支架材料。發(fā)明的第二個目的是提供一種制備上述材料的方法。
第一個目的的實現(xiàn)是通過將脫細胞、去抗原、脫I型和X型膠原的天然軟骨基質(zhì)成分與II型膠原共混實現(xiàn)的，將兩種材料以按一定重量比(10～3∶1)共混(最佳比例為4∶1)。第二個目的是通過如下步驟實現(xiàn)的①取新鮮豬關節(jié)軟骨，盡量不要取到軟骨下骨部分，將取下的軟骨用絞碎機絞成大小平均約為3mm×3mm的碎屑，然后通過脫鈣、脫脂、脫細胞、去垢、除去I型和X型膠原等混雜基質(zhì)成分、去抗原、鹽析和干燥等步驟制備提取出→脫鈣、脫細胞、去抗原、脫I型和X型膠原的天然軟骨基質(zhì)成分；②II型膠原制備，可以按照已有的方法自己提取，方法可以參見[李斯明，鄒海燕，葉春婷等《豬軟骨II型膠原的制備及理化性能分析》，生物醫(yī)學工程與臨床，2001年03期]，也可以購買商品化的成品；③將材料1(天然軟骨基質(zhì)成分)和材料2(II型膠原)按一定重量比例(10～3∶1)混合；④應用乙酸溶解上述混合物，鹽析提純后加入致孔劑氯化鈉；然后置于模具，加壓凍干，無離子水中漂洗去除氯化鈉，再一次置于模具中干燥處理，施加較小的壓力(＜1Mpa)，置于-40℃～-10℃下冷凍條件下干燥處理后封裝、環(huán)氧乙烷消毒；其中步驟①中的關鍵步驟詳述如下取豬關節(jié)軟骨部分，盡量不要取到軟骨下骨部分，將取下的軟骨用絞碎機絞成大小平均約為3mm×3mm，然后進行以下流程處理。(1)脫鈣0.5M的HCl溶液浸泡72小時，蒸餾水浸洗干凈；(2)脫細胞和脫脂在35～38℃下，用35％的過氧化氫持續(xù)振蕩清洗36小時，蒸餾水漂洗；應用脫脂劑(氯仿-甲醇溶液)進行脫脂，然后加入無水乙醇去除氯仿，蒸餾水漂洗；(3)去垢和去殘余細胞成分應用1～5％TritonX-100，在4℃下持續(xù)振蕩72小時，蒸餾水浸洗干凈；(4)去I型和X型膠原組織搗碎機搗碎后，應用I型和X型膠原酶37℃下持續(xù)振蕩消化6～12小時，離心去除I型和X型裂解產(chǎn)物；應用Tris-HCl(pH＝7.5)緩沖液浸泡3小時，去離子水漂洗3次，離心沉淀所需要的產(chǎn)物；(5)消化將0.25％胰蛋白酶(蛋白酶總量是需要消化蛋白產(chǎn)物量的4％)加入到上述離心沉淀產(chǎn)物中，37℃下持續(xù)振蕩消化18～36小時；在反應體系中加入Tris-HCl(pH＝7.5)緩沖液，繼續(xù)持續(xù)攪拌1小時；(6)鹽析應用氫氧化鈉溶液和鹽酸溶液將溶液調(diào)成中性，然后加入氯化鈉，直到其濃度為3mol/1；持續(xù)攪拌2小時，靜置鹽析10～36小時；(7)漂洗用去離子水透析12小時，每3小時換一次水，直至檢測不到氯離子為止；(8)干燥離心收集沉淀物，置于-40℃～-10℃下冷凍條件下干燥處理；其中步驟④的關鍵步驟詳述如下(1)用0.2～0.8M乙酸緩沖液溶解混合物，在37℃下持續(xù)振蕩攪拌；(2)通過氫氧化鈉溶液中和上述混合溶液，使溶液成中性(pH＝7.0)后加入氯化鈉，最終濃度到達3mol/l；持續(xù)攪拌2小時，靜置鹽析10～36小時；(3)將鹽析得到的成分在去離子水中透析12小時，每3小時換一次水；(4)離心后，置于無水乙醇脫水，再次離心，離心后的物質(zhì)置于4～10℃下10小時，讓乙醇和其他殘余有機物自然揮發(fā)掉，將氯化鈉與離心后的乳狀物質(zhì)混勻；(5)將混合物置于特制的金屬塑性模具內(nèi)(形狀可根據(jù)需要自行設計)，置于加壓裝置上，置于-40℃～-10℃下冷凍條件下，在5Mpa～10Mpa壓力下進行模塑，凍干后取出材料；將塑形后的材料浸泡于去離子水中，使材料中的氯化鈉晶體溶解析出，3小時換一次水，直至蒸餾水中檢測不到氯離子為止，即形成多孔結(jié)構(gòu)的復合軟骨支架材料；(6)再一次置于模具中施加較小的壓力(＜1Mpa)，置于-40℃～-10℃下冷凍條件下干燥處理后封裝、環(huán)氧乙烷消毒；其中氯化鈉的重量與孔隙率密切相關，可以根據(jù)實驗所需要的孔隙率來調(diào)控需要加入的氯化鈉的重量，一般情況下控制在總重量的50％～90％，在這種情況下孔隙率范圍在45％～95％；氯化鈉的大小與孔隙大小相關，根據(jù)實驗要求選擇氯化鈉的大小，一般情況下控制在20～80目，在這種情況下，孔隙大小在50μm～250μm。
本發(fā)明選用豬來源的關節(jié)軟骨是因為豬與人在遺傳背景上同源性達到了96％以上，比牛羊等動物更接近人類。所以豬關節(jié)軟骨更適于作為軟骨組織工程和軟骨缺損修復的材料。另外豬來源的生物材料取得容易，價錢便宜，適于將來大規(guī)模采集應用。
總之，與現(xiàn)有的材料和技術(shù)相比本發(fā)明具有如下特點1、材料組成結(jié)構(gòu)和成分與人的關節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)更加接近，因為其中的大部分材料是來源于豬的關節(jié)軟骨，只是這種關節(jié)軟骨進行了相應的理化處理。去除了細胞、抗原和有可能混雜有的I型和X型膠原成分?；旧蠠o抗原性，對植入受體的全身及局部免疫基本無影響，組織相容性好。
2、材料中添加了提純的II型膠原成分，這種成分單獨存在降解速度稍快；而提取的天然關節(jié)軟骨基質(zhì)成分，因為其成分仍是以復合結(jié)構(gòu)存在(即各種成分之間相互交聯(lián)纏繞)，因此降解速度稍慢；兩種材料共混后，相互之間互相彌補，我們提供的兩種材料的重量比是10～3∶1(天然關節(jié)軟骨基質(zhì)成分占主要部分)，這種情況下能為我們提供較佳的降解速度，能夠滿足臨床實際應用的需要。
3、可以隨意調(diào)控材料的孔隙率和孔隙的大小，滿足不同實際應用情況下對材料的不同要求。
4、所述材料中具有天然的關節(jié)軟骨基質(zhì)成分，而這些成分是以相互交聯(lián)的復合結(jié)構(gòu)存在的，因此材料也具有了一定的力學強度，可以一定程度上彌補II型膠原結(jié)構(gòu)力學強度不足的缺點。
5、天然的關節(jié)軟骨基質(zhì)成分和II型膠原均有利于軟骨細胞黏附、增殖和表型表達。
6、如上所述，所述材料具有較佳的孔隙率和孔隙大小，具有較好的力學強度，具有較佳的降解速度，這些都會使接種的軟骨細胞更好的發(fā)揮功能，會今后實現(xiàn)修復軟骨缺損提供可能。
7、原料來源豐富，易于獲得；原料無毒性及致瘤性；制備材料所需的條件簡單，可以在材料中添加TGFβ和(或)bFGF等活性因子成分，材料可以方便的加工成其他組織工程材料，在臨床上具有廣泛的用途。
具體實施例方式
下面通過實施例對本發(fā)明作更為詳細的描述。
實施例天然軟骨基質(zhì)成分與II型膠原重量比為4∶1，孔隙率為90％，平均孔徑為100μm的關節(jié)軟骨生物支架材料的具體制備方法。
1.提取關節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)成分，按照以下流程提取處理1)取新鮮豬關節(jié)軟骨，盡量不要取到軟骨下骨部分，重量大約200g，應用車床絞碎成平均大小約3mm×3mm的碎屑。
2)將軟骨碎屑置于盛有0.5M的HCl溶液的大燒杯中浸泡72小時，脫去可能混雜的骨組織成分中的無機物質(zhì)，蒸餾水浸洗干凈3)取出軟骨碎屑，放入盛有35％的過氧化氫溶液的大燒杯中，在35～38℃下持續(xù)振蕩清洗36小時，蒸餾水漂洗干凈；4)取出軟骨碎屑，放入盛有1升氯仿-甲醇溶液(3∶1)的大燒杯中進行脫脂，在37℃下持續(xù)振蕩36小時，然后加入無水乙醇去除氯仿，蒸餾水漂洗；5)取出軟骨碎屑，放入盛有1升1～5％TritonX-100的大燒杯中進行去垢和去殘余細胞成分，在4℃下持續(xù)振蕩72小時，蒸餾水浸洗干凈；6)取出軟骨碎屑，組織搗碎機將其搗碎，然后加入20mg I型膠原酶和20mgX型膠原酶，同時加入磷酸鹽緩沖液(PBS液)1升，37℃下持續(xù)振蕩消化6～12小時，離心去除I型和X型裂解產(chǎn)物；應用Tris-HCl(pH＝7.5)緩沖液浸泡3小時，去離子水漂洗3次，離心沉淀所需要的產(chǎn)物7)將0.25％胰蛋白酶(蛋白酶總量是需要消化蛋白產(chǎn)物量的5％)加入到上述離心沉淀產(chǎn)物中，37℃下持續(xù)振蕩消化18～36小時；在反應體系中加入Tris-HCl(pH＝7.5)緩沖液，繼續(xù)持續(xù)攪拌1小時；6)應用氫氧化鈉溶液和鹽酸溶液將溶液調(diào)成中性，然后加入氯化鈉，直到其濃度為3mol/l；4℃～10℃持續(xù)攪拌2小時，靜置鹽析10～36小時；用去離子水透析提取的軟骨基質(zhì)成分12小時，每3小時換一次水，直至檢測不到氯離子為止；離心收集沉淀物，置于-40℃～-10℃下冷凍條件下干燥處理；2.稱量出4g上述提取物備用；3.購買II型膠原(Sigma)，稱出1g備用；4.將兩種材料混合后，按照以下的流程處理；1)用0.2～0.8M乙酸緩沖液溶解混合物，在37℃下持續(xù)振蕩攪拌；2)通過氫氧化鈉溶液中和上述混合溶液，使溶液成中性(pH＝7.0)后加入氯化鈉，最終濃度到達3mol/l；持續(xù)攪拌2小時，靜置鹽析10～36小時；3)將鹽析得到的成分在去離子水中透析12小時，每3小時換一次水；離心后，置于無水乙醇脫水，再次離心，離心后的物質(zhì)置于4～10℃下6小時，讓乙醇和其他殘余有機物自然揮發(fā)掉，將30g氯化鈉(大小為20～60目)與離心后的乳狀物質(zhì)混勻；4)將混合物置于特制的金屬塑性模具內(nèi)(形狀可根據(jù)需要自行設計)，置于加壓裝置上，-40℃～-70℃條件下，在5Mpa～10Mpa壓力下進行模塑，凍干后取出材料；將塑形后的材料浸泡于去離子水中，使材料中的氯化鈉晶體溶解析出，3小時換一次水，直至蒸餾水中檢測不到氯離子為止，即形成多孔結(jié)構(gòu)的復合軟骨支架材料；5)再一次置于模具中，施加較小的壓力(＜1Mpa)，置于-40℃～-10℃下冷凍條件下干燥處理后封裝、環(huán)氧乙烷消毒，4℃保存?zhèn)溆?，產(chǎn)品為一種乳白色的海綿樣結(jié)構(gòu)。
從上述制備方法的實施例中，即揭示了制備提取方法，揭示了又產(chǎn)品特征。因此，關于“關節(jié)軟骨生物支架材料”的發(fā)明就不再累述了。
除了豬關節(jié)軟骨外，其他動物來源的關節(jié)軟骨，同樣可以依照本發(fā)明所述的方法提取出相應的天然關節(jié)軟骨基質(zhì)成分，并制備出相應的共混支架材料。另外，除了II型膠原外，我們同樣可以應用其他的天然材料和人工合成材料與關節(jié)軟骨提取物進行混合，用來制備關節(jié)軟骨的支架材料。
權(quán)利要求
1.一種關節(jié)軟骨生物支架材料，其特征在于含有天然豬關節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)成分提取物和II型膠原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的關節(jié)軟骨生物支架材料，其特征在于天然豬關節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)成分提取物是由以下方法制得取豬關節(jié)軟骨部分，盡量不要取到軟骨下骨部分，將取下的軟骨用絞碎機絞成大小平均約為3mm×3mm，然后通過以下流程進行處理(1)脫鈣0.5M的HCl溶液浸泡72小時，蒸餾水浸洗干凈；(2)脫細胞和脫脂在35～38℃下，用35％的過氧化氫持續(xù)振蕩清洗36小時，蒸餾水漂洗；應用脫脂劑進行脫脂，然后加入無水乙醇除去氯仿，蒸餾水漂洗；(3)去垢和去殘余細胞成分應用TritonX-100，在4℃下持續(xù)振蕩72小時，蒸餾水浸洗干凈；(4)去I型和X型膠原組織搗碎機搗碎后，應用I型和X型膠原酶37℃下持續(xù)振蕩消化6～12小時，離心去除I型和X型裂解產(chǎn)物；應用Tris-HCl緩沖液浸泡3小時，去離子水漂洗3次，離心沉淀所需要的產(chǎn)物；(5)消化將0.25％胰蛋白酶加入到上述離心沉淀產(chǎn)物中，37℃下持續(xù)振蕩消化18～36小時；在反應體系中加入Tris-HCl緩沖液，繼續(xù)持續(xù)攪拌1小時；(6)鹽析應用氫氧化鈉溶液和鹽酸溶液將溶液調(diào)成中性，然后加入氯化鈉，直到其濃度為3mol/l；持續(xù)攪拌2小時，靜置鹽析10～36小時；(7)漂洗用去離子水透析12小時，每3小時換一次水，直至檢測不到氯離子為止；(8)干燥離心收集沉淀物，置于-40℃～-10℃下冷凍條件下干燥處理。
3.根據(jù)權(quán)利要求1～2任一項所述的關節(jié)軟骨生物支架材料，其特征在于II型膠原為提純的天然組織成分，可以是來源于同種異體生物體，也可以是來源于豬的提取物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項所述的關節(jié)軟骨生物支架材料，其特征在于所述的支架材料上可以再添加TGFβ和/或bFGF活性因子成分，或者接種上軟骨細胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～4任一項所述的關節(jié)軟骨生物支架材料，其特征在所述的支架材料可以用于體內(nèi)構(gòu)建組織工程軟骨和體外構(gòu)建組織工程軟骨、修復關節(jié)軟骨缺損、修復其他結(jié)構(gòu)的軟骨組織缺損。
6.一種制備關節(jié)軟骨生物支架材料的方法，其特征在將提取的天然軟骨基質(zhì)成分和II型膠原按重量比10～3∶1混合，然后經(jīng)以下流程處理(1)用0.2～0.8M乙酸緩沖液溶解混合物，在37℃下持續(xù)振蕩攪拌；(2)通過氫氧化鈉溶液中和上述混合溶液，使溶液成中性后加入氯化鈉，最終濃度到達3mol/l；持續(xù)攪拌2小時，靜置鹽析10～36小時；(3)將鹽析得到的成分在去離子水中透析12小時，每3小時換一次水；(4)離心后，置于無水乙醇脫水，再次離心，離心后的物質(zhì)置于4～10℃下6小時，讓乙醇和其他殘余有機物自然揮發(fā)掉，將氯化鈉與離心后的乳狀物質(zhì)混勻；(5)將混合物置于特制的金屬塑性模具內(nèi)，置于加壓裝置上，置于-40℃～-10℃下冷凍條件下，在5Mpa～10Mpa壓力下進行模塑，凍干后取出材料；將塑形后的材料浸泡于去離子水中，使材料中的氯化鈉晶體溶解析出，3小時換一次水，直至蒸餾水中檢測不到氯離子為止，即形成多孔結(jié)構(gòu)的復合軟骨支架材料；(6)再一次置于模具中施加較小的壓力，置于-40℃～-10℃下冷凍條件下干燥處理后封裝、環(huán)氧乙烷消毒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的關節(jié)軟骨生物支架材料制備方法，其特征在于致孔劑氯化鈉的大小為20～80目；氯化鈉的重量應占總重量的50％～90％。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種關節(jié)軟骨生物支架材料及制備方法將脫細胞、去抗原、去I型和X型膠原的天然軟骨基質(zhì)成分與II型膠原共混，以氯化鈉晶體顆粒作為致孔劑，通過一系列理化處理，制成一種多孔的關節(jié)軟骨支架材料。該支架材料不但具有天然軟骨的組成成分、較好的生物力學強度、較佳的孔隙率和較適宜的降解速度，而且具有應用方便，植入后對受體的全身和局部免疫無影響。相容性好，來源豐富，制作簡便，價廉?？梢詰糜谂R床關節(jié)軟骨缺損的修復和組織工程軟骨的體內(nèi)、外構(gòu)建。
文檔編號A61L27/38GK101020080SQ20071009096
公開日2007年8月22日 申請日期2007年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月29日
發(fā)明者孔清泉, 項舟, 李鋒 申請人:孔清泉