專利名稱：抗犬細(xì)小病毒卵黃抗體生物制劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物制劑的制備方法，具體是一種抗犬細(xì)小病毒卵黃抗體生物制劑的制備方法。用于生物工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus，CPV)性腸炎是犬最常見(jiàn)的傳染病之一，其發(fā)病率與死亡率高達(dá)50％～100％，嚴(yán)重影響犬的健康。近年來(lái)，隨著城鄉(xiāng)肉用犬及寵物犬飼養(yǎng)數(shù)量的增加，該病的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。目前對(duì)患病犬一般采用對(duì)癥和支持治療，治愈率很低，尤其是對(duì)2～3月齡幼犬效果更差。有報(bào)道用犬、馬、兔、豬、驢等動(dòng)物制作抗病毒血清，將提純的犬細(xì)小病毒性腸炎免疫球蛋白注射液用于治療患病犬。自1992年Yokoyama等發(fā)現(xiàn)卵黃抗體能治療仔豬大腸桿菌性腹瀉以來(lái)，卵黃抗體已廣泛應(yīng)用于消化道疾病的防治中。卵黃中的IgY耐消化道屏障，性質(zhì)穩(wěn)定。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，王玉燕等在《中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)》(2003年第25卷第3期)發(fā)表的“抗CAD、CAV卵黃抗體的制備”一文，該研究用CDV、CAV分別免疫產(chǎn)蛋雞，收集雞蛋，用海藻酸鈉-硫酸銨法提取卵黃抗體(IgY)，并對(duì)提取的IgY采用了SDS-PAGE和低壓層析檢測(cè)純度，用間接ELISA測(cè)定提取的IgY的活性。但是該方法需對(duì)卵黃抗體進(jìn)行多步提純后使用，制備工藝繁瑣，成本高且IgY的活性損失較大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足和缺陷，自制疫苗，在強(qiáng)化免疫的基礎(chǔ)上，提供一種抗犬細(xì)小病毒卵黃抗體生物制劑的制備方法，使其建立抗犬細(xì)小病毒抗體效價(jià)評(píng)定依據(jù)，將具有生物活性的卵黃抗體制備成無(wú)副作用的能直接飲用的口服生物制劑或利于保存的粉劑，該制劑也可作為寵物保健品或生物制藥的原料。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明包括以下步驟步驟一，采集診斷為細(xì)小病毒感染的病死犬的腸道及內(nèi)容物按重量比1∶1加生理鹽水研磨，離心去除沉渣，上清液20000rpm離心60分鐘去除微小顆粒；步驟二，按去除微小顆粒后的上清液總體積的10％加入氯仿，劇烈振蕩，離心去除脂溶性物質(zhì)；步驟三，取去除脂溶性物質(zhì)后的上清液，按其總體積的10％加入用體積百分比濃度為2.5％戊二醛醛化、洗滌后的豬紅細(xì)胞，搖勻4℃放置2小時(shí)進(jìn)行病毒吸附，離心沉淀豬紅細(xì)胞，用體積比為4％的鹽水配成體積比10％的紅細(xì)胞懸液，37℃放置2小時(shí)進(jìn)行病毒釋放，離心去除豬紅細(xì)胞，取病毒釋放液，釋放液中的病毒HA效價(jià)達(dá)1∶4096有效；步驟四，取上述病毒釋放液經(jīng)甲醛滅活后加入褐藻多糖，使每毫升液體含4毫克，制備成油乳劑疫苗，即犬細(xì)小病毒疫苗；將制備的犬細(xì)小病毒疫苗免疫20周齡以上經(jīng)產(chǎn)母雞后，用血凝抑制試驗(yàn)(HI)進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，當(dāng)卵黃中HI效價(jià)達(dá)1∶256以上時(shí)收集免疫卵，效價(jià)低于1∶128時(shí)進(jìn)行第三次免疫；步驟五，收獲卵黃用無(wú)菌蒸餾水對(duì)倍稀釋，用乳酸液調(diào)pH4.4進(jìn)行酸處理去除雜蛋白、-40℃凍融處理2次去除脂質(zhì)，抽濾液經(jīng)35％飽和硫酸銨鹽析、除鹽后即可獲得IgY，稀釋封裝在安培瓶中，放65℃水浴箱處理20分鐘，經(jīng)口服安全性檢驗(yàn)、微生物檢驗(yàn)合格后即成安全的口服生物制劑，其IgY的得率達(dá)95％以上，活性不受任何影響，5毫升卵黃混合液中提取后可獲得IgY26毫克以上，一個(gè)免疫蛋一般可得70-100毫克的IgY。本發(fā)明制得的制劑噴霧干燥成粉劑后IgY的活性不變。
本發(fā)明的基本原理是利用家禽作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)各類(lèi)生物活性物質(zhì)。當(dāng)供試雞免疫后即產(chǎn)生特異性抗體，血液中的抗體逐漸進(jìn)入卵黃并蓄積。該抗體穩(wěn)定，經(jīng)口服后能抵抗胃酸的破壞，活性物質(zhì)封閉胃腸中的特異性病原入侵受體或直接中和特異性病原體或毒素，從而達(dá)到預(yù)防和治療的目的。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效益是感染細(xì)小病毒的病犬，可直接口服生物制劑替代其他生物制劑的注射治療，幼犬臨床治愈率高達(dá)95％以上，也可添加于寵物保健品中口服，可預(yù)防幼犬感染細(xì)小病毒。該方法成本低，見(jiàn)效快，一個(gè)免疫蛋一般可得70-100毫克的IgY。
具體實(shí)施例方式
下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
實(shí)施例1犬細(xì)小病毒野毒采集取診斷為細(xì)小病毒感染的病死犬的腸道及內(nèi)容物按重量比1∶1加生理鹽水研磨，離心去除沉渣，上清液20000rpm高速離心60分鐘去除微小顆粒。
病毒初提按上清液總量的10％加入氯仿，劇烈振蕩，離心去除脂溶性物質(zhì)。
病毒吸附取上清液按總量的10％加入用體積百分比濃度為2.5％的戊二醛醛化的洗滌后的豬紅細(xì)胞，搖勻4℃放置2小時(shí)，離心沉淀豬紅細(xì)胞。
病毒釋放用4％濃度的高滲鹽水將沉淀的豬紅細(xì)胞配成體積比10％的懸液，37℃2小時(shí)，離心去除豬紅細(xì)胞。
HA效價(jià)測(cè)定釋放液中的病毒效價(jià)用HA試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，達(dá)1∶4096有效。
疫苗水相制備取上述病毒釋放液經(jīng)甲醛滅活后加入褐藻多糖，使每毫升釋放病毒液體含4毫克褐藻多糖，并加入無(wú)菌的吐溫80。
疫苗油相制備在10號(hào)白油中加入硬脂酸鋁和司本80，滅菌后備用。
疫苗制備按水相與油相之比1∶1在高速搗碎機(jī)中進(jìn)行乳化，制備成油乳劑疫苗。
免疫選擇20周齡以上經(jīng)產(chǎn)母雞，用上述制備的油乳劑疫苗(即犬細(xì)小病毒油乳劑苗)進(jìn)行免疫，第一次肌注0.5ml，10天后第二次免疫，肌注1ml，14天后用血凝抑制試驗(yàn)(HI)進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，當(dāng)卵黃中HI效價(jià)達(dá)1∶256以上時(shí)收集免疫卵。
IgY提取收獲卵黃用無(wú)菌蒸餾水對(duì)倍稀釋，用乳酸液調(diào)pH4.4進(jìn)行酸處理去除雜蛋白、-40℃凍融處理2次去除脂質(zhì)，抽濾液備用。
IgY純化經(jīng)35％飽和硫酸銨鹽析、除鹽后即可獲得較純的IgY。
口服制劑制備用無(wú)菌水將提純的抗細(xì)小病毒IgY稀釋成每毫升加入褐藻多糖后的釋放病毒液體含2毫克IgY，封裝在安培瓶中，放65℃水浴箱處理20分鐘，經(jīng)口服安全性檢驗(yàn)、微生物檢驗(yàn)合格后即成安全的口服生物制劑。
實(shí)施例2犬細(xì)小病毒野毒采集、病毒初提、病毒吸附釋放試驗(yàn)提純、HA價(jià)檢測(cè)、疫苗制備同實(shí)施例1。第一次免疫，免疫劑量每頭份0.5ml。間隔10天進(jìn)行第二次免疫，免疫劑量為1ml。免疫14天后，用血凝抑制試驗(yàn)對(duì)卵黃進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，當(dāng)效價(jià)低于1∶128時(shí)，進(jìn)行第三次免疫，免疫劑量為1ml，14天后收集免疫卵，其后抗細(xì)小病毒卵黃抗體生物制劑的制備方法同實(shí)施例1。
用上述方法制備疫苗、免疫、IgY提取與純化，IgY的得率達(dá)95％以上，活性不受任何影響，5毫升卵黃混合液中提取后可獲得IgY26毫克以上，一個(gè)免疫蛋一般可得70-100毫克的IgY。該制劑噴霧干燥成粉劑后IgY的活性不變。
細(xì)小病毒感染犬，每次按每公斤體重0.5ml，口服生物制劑不少于1ml，連用3天，能有效治愈病犬，細(xì)小病毒病幼犬的治愈率達(dá)95％以上，或制備成寵物保健品，或用于治療犬細(xì)小病毒病的藥物中。
權(quán)利要求
1.一種抗犬細(xì)小病毒卵黃抗體生物制劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟步驟一，采集診斷為細(xì)小病毒感染的病死犬的腸道及內(nèi)容物按重量比1∶1加生理鹽水研磨，離心去除沉渣，上清液離心去除微小顆粒；步驟二，在去除微小顆粒后的上清液中加入氯仿，劇烈振蕩，離心去除脂溶性物質(zhì)；步驟三，取去除脂溶性物質(zhì)后的上清液，加入醛化、洗滌后的豬紅細(xì)胞，搖勻放置進(jìn)行病毒吸附，離心沉淀豬紅細(xì)胞，加入高滲鹽水后放置進(jìn)行病毒釋放，離心去除豬紅細(xì)胞，取病毒釋放液，測(cè)HA效價(jià)，達(dá)1∶4096有效；步驟四，取上述病毒釋放液經(jīng)甲醛滅活后加入褐藻多糖，制備成油乳劑犬細(xì)小病毒疫苗，將制備的犬細(xì)小病毒疫苗免疫20周齡以上經(jīng)產(chǎn)母雞，用血凝抑制試驗(yàn)進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，當(dāng)卵黃中HI效價(jià)達(dá)1∶256以上時(shí)收集免疫卵，效價(jià)低于1∶128時(shí)進(jìn)行第三次免疫；步驟五，收獲卵黃用無(wú)菌蒸餾水對(duì)倍稀釋，用乳酸液進(jìn)行酸處理去除雜蛋白、凍融去脂，抽濾液經(jīng)硫酸銨鹽析提取IgY，除鹽后稀釋封裝安培瓶中，放水浴箱處理，經(jīng)口服安全性檢驗(yàn)及微生物檢驗(yàn)合格后即成口服生物制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗犬細(xì)小病毒卵黃抗體生物制劑的制備方法，其特征是，步驟一中，所述上清液離心去除微小顆粒，是指上清液在20000rpm離心60分鐘去除微小顆粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗犬細(xì)小病毒卵黃抗體生物制劑的制備方法，其特征是，步驟二中，所述加入氯仿，是指按去除微小顆粒后的上清液總體積的10％加入氯仿。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗犬細(xì)小病毒卵黃抗體生物制劑的制備方法，其特征是，步驟三中，所述醛化，是指用體積百分比為2.5％的戊二醛對(duì)豬紅細(xì)胞進(jìn)行醛化；所述搖勻放置進(jìn)行病毒吸附，是指搖勻4℃放置2小時(shí)進(jìn)行病毒吸附。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的抗犬細(xì)小病毒卵黃抗體生物制劑的制備方法，其特征是，步驟三中，所述加入高滲鹽水后放置，是指加入體積比為4％的鹽水配成體積比10％的紅細(xì)胞懸液，在37℃放置2小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗犬細(xì)小病毒卵黃抗體生物制劑的制備方法，其特征是，步驟四中，所述褐藻多糖，其使用量為每毫升釋放病毒液體含4毫克褐藻多糖。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗犬細(xì)小病毒卵黃抗體生物制劑的制備方法，其特征是，步驟五中，所述用乳酸液進(jìn)行酸處理去除雜蛋白，是指用乳酸液調(diào)pH4.4進(jìn)行酸處理去除雜蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或7所述的抗犬細(xì)小病毒卵黃抗體生物制劑的制備方法，其特征是，步驟五中，所述凍融去脂，是指-40℃凍融處理2次去除脂質(zhì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或7所述的抗犬細(xì)小病毒卵黃抗體生物制劑的制備方法，其特征是，步驟五中，所述經(jīng)硫酸銨鹽析提取IgY，采用的硫酸銨飽和度為35％；所述稀釋，是指用無(wú)菌水稀釋成每毫升加入褐藻多糖后的釋放病毒液體含2毫克IgY。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或7所述的抗犬細(xì)小病毒卵黃抗體生物制劑的制備方法，其特征是，步驟五中，所述放水浴箱處理，是指放65℃水浴箱處理20分鐘。
全文摘要
一種抗犬細(xì)小病毒卵黃抗體生物制劑的制備方法，采集診斷為細(xì)小病毒感染的病死犬病料，離心去除沉渣，上清液離心，取上清液加入氯仿，劇烈振蕩，離心取上清液加入醛化洗滌后的豬紅細(xì)胞，搖勻放置，離心取沉淀，加入鹽水后放置，離心取病毒釋放液測(cè)HA效價(jià)，達(dá)14096有效；取上述病毒釋放液經(jīng)甲醛滅活后加入褐藻多糖制備成油乳劑犬細(xì)小病毒疫苗，將該疫苗免疫經(jīng)產(chǎn)母雞后用血凝抑制試驗(yàn)測(cè)定免疫卵HI效價(jià)，達(dá)標(biāo)后收獲卵黃用無(wú)菌蒸餾水對(duì)倍稀釋，用乳酸液進(jìn)行酸處理去除雜蛋白、凍融去脂，抽濾液進(jìn)行鹽析，除鹽后調(diào)整IgY的濃度分裝，放水浴箱處理，即成口服生物制劑，其IgY的得率達(dá)95％以上，活性不受任何影響，一個(gè)免疫卵一般可得IgY 70－100mg。
文檔編號(hào)A61P31/00GK101062413SQ20071004047
公開(kāi)日2007年10月31日 申請(qǐng)日期2007年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月10日
發(fā)明者劉永德, 唐峰, 葉陳梁, 汪毅 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)