專利名稱：：仙人掌多糖及其提取純化方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種化學方法，具體涉及仙人掌多糖及其提取純化方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：糖尿病(diabetesmdlitus，DM)是一種慢性、多發(fā)性常見病，多伴有并發(fā)癥。它與腫瘤、心血管疾病同樣被視為世界性三大疾病。隨著我國人民生活水平的提高，糖尿病患者的人數(shù)在逐年增加。據(jù)WHO統(tǒng)計，目前全球糖尿病患者已經(jīng)超過1.5億，預(yù)計到2025年將突破3億，并預(yù)測二十一世紀糖尿病將在發(fā)展中國家流行。糖尿病患者如果血糖控制不理想，日久則可能發(fā)生急、慢性并發(fā)癥。常見的慢性并發(fā)癥有糖尿病合并高血壓、糖尿病性心臟病、糖尿病腦血管病變、糖尿病眼病、糖尿病足、糖尿病感染等。急性并發(fā)癥有糖尿病酮癥酸中毒昏迷，糖尿病非酮癥高滲性昏迷，糖尿病乳酸性酸性酸中毒等。高血糖作為糖尿病主要代謝紊亂之一，在糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。高血糖主要通過以下四條通路引發(fā)病癥(1)蛋白激酶C(PKC)的激活；(2)氧化應(yīng)激(ROS);(3)高級糖化終產(chǎn)物(AGEs)形成；(4)多元醇通路(PP)的增加。國內(nèi)外學者根據(jù)糖尿病發(fā)病機制的四條通路，研制出多種特異性針對四大通路中某一通路的藥物，對糖尿病慢性并發(fā)癥的防治有潛在作用，但大多數(shù)尚處于動物試驗、觀察和試用階段，主要包括以下幾類醛糖還原酶抑制劑(ARI);高級糖化終產(chǎn)物(AGEs)抑制劑；蛋白激酶C(PKC)抑制劑；抗氧化劑。其中，抗氧化劑多為一些非特異性抗氧化劑，如VitC，v旭等。近年來有關(guān)VitB6、硫胺素、硫辛酸等抗氧化劑在動物實驗中報道較多。研究顯示許多植物多糖都具有提高抗氧化酶活性、清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化，從而保護生物膜的作用。因此，研究多糖的抗氧化性時，通常以其清除自由基的能力及抗脂質(zhì)過氧化的活性來作為評價的主要指標。野生的仙人掌生長很快，資源廣泛，即使是人工種植，扦插繁殖時只要切下一段肉質(zhì)莖，種在排水良好的菜園土壤中即可。一半土壤，一半沙子，一些碎瓦礫、葉土和骨粉的混合物將會產(chǎn)生良好的發(fā)芽生根效果，同時它具有具有清熱解毒，散瘀消腫，健胃止痛，鎮(zhèn)咳等作用，已應(yīng)用于治療胃、十二指腸潰瘍，急性痢疾，咳嗽，外用治流行性腮腺炎，乳腺炎，癰癤腫毒，蛇咬傷等，但關(guān)于仙人掌多糖對糖尿病并發(fā)癥中的氧化應(yīng)激的抑制作用的研究以及在糖尿病并發(fā)癥中的治療和保健作用的應(yīng)用還未見報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種仙人掌多糖的提取純化方法。以野生仙人掌為原料，對多糖物質(zhì)進行提取、純化，得到具有抗氧化性的仙人掌多糖半純品。本發(fā)明的另一個目的是提供所述方法制備的仙人掌多糖。本發(fā)明的另一個目的是提供所述方法制備的仙人掌多糖的應(yīng)用。本發(fā)明的一種仙人掌多糖的提取純化方法，包括以下步驟-(1)用水浸提經(jīng)除雜、破碎的仙人掌鮮莖，離心取上清液；(2)過濾后，采用超濾膜對步驟(1)得到的上清液純化和濃縮；(3)將步驟(2)超濾濃縮后的溶液在不同乙醇濃度下分段沉降多糖；(4)經(jīng)Sevag法脫蛋白、活性炭脫色初步純化。優(yōu)選方案如下步驟(1)所述水浸提條件水料比為6:1，浸提溫度為7080°C，浸提時間為2,23h。步驟(2)所述過濾采用400目尼龍濾布。步驟(2)所述純化和濃縮選用截留分子質(zhì)量為10000ku的超濾膜，超濾壓力為0,20MPa，超濾溫度為25t:，料液體積流量控制在0.040.05L/min。步驟(2)所述濃縮的倍數(shù)控制57倍。步驟(3)所述分段沉降先用濃度為55%65°/。的乙醇，4"下沉降8h，離心后得到粗多糖0P1，上清液再超濾濃縮到粗多糖濃度1.52.0%重量后，加入體積濃度為95%乙醇調(diào)節(jié)體系乙醇濃度到80%，得沉降粗多糖OP2。步驟(4)所述Sevag法脫蛋白重復操作6次；所述活性炭脫色是將多糖分別配成1%的水溶液，調(diào)pH4.06.0后，每100mL多糖水溶液使用活性炭0.150.2g脫色。本發(fā)明所述方法提得到的仙人掌多糖可以用于制備糖尿病抗氧化劑藥物。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下(1)將超濾技術(shù)應(yīng)用于仙人掌多糖浸提液的純化和濃縮，具有條件溫和、多糖類物質(zhì)損失少、超濾速度決、工藝路徑短、節(jié)約能源等優(yōu)點。(2)提供了一種制備有抗氧化作用的仙人掌多糖的方法，用于對糖尿病并發(fā)癥中的氧化應(yīng)激的抑制作用，為開發(fā)和有效利用野生仙人掌植物資源提供新途徑。(3)利于研究防治糖尿病的新的藥物，將袓國的中醫(yī)藥學發(fā)揚光大。具體實施例方式實施例1(1)以500克仙人掌鮮莖為原料，除雜、破碎，水溶液浸提多糖，7jC料比6:l，浸提溫度7(TC，浸提時間2,2h;浸提1次，4000轉(zhuǎn)/分條件下離心20min分離得上清液3050mL。(2)用400目的尼龍濾布過濾作為預(yù)處理，之后，用截留分子質(zhì)量為10000ku的超濾膜過濾，超濾壓力為0.20MPa，超濾溫度為25°C，料液體積流量控制在0.05L/min、控制濃縮5倍，得濃縮浸提液600mL。(3)上述濃縮浸提液在乙醇體積濃度為55%，4'C下沉降8h，離心、干燥后得到粗多糖OPl，2.42克，上清液再超濾濃縮到粗多糖濃度1.5%重量后，加入體積濃度為95%的乙醇調(diào)節(jié)體系乙醇濃度到80%，得沉降粗多糖OP2，2.18克。測定二種粗多糖OPl、OP2中多糖含量分別為64.35%、83.42%。選OP2進入下一步驟。(4)粗多糖OP2經(jīng)Sevag法脫蛋白、重復操作6次；之后，將多糖分別配成1%重量的水溶液，用醋酸調(diào)pH4.0。添加水溶液體積量0.15^g/100mL的活性炭脫色，得到初步純化的仙人掌多糖OPM2，1.93克，測定OPM2中多糖含量為86.78%重量。實施例2(1)以500克仙人掌鮮莖為原料，除雜、破碎，水溶液浸提多糖，水料比6:1，浸提溫度75。C，浸提時間2.5h;浸提1次，同實施例1離心分離得上清液3050mL。(2)用400目的尼龍濾布過濾作為預(yù)處理，之后，用截留分子質(zhì)量為10000ku的超濾膜過濾，超濾壓力為0.20MPa，超濾溫度為25°C，料液體積流量控制在0.04L/min、控制濃縮6倍，得濃縮浸提液500mL。(3)上述濃縮浸提液在乙醇濃度為60%體積，4。C下沉降8h，離心、干燥后得到粗多糖0P1，2.48克，上清液再超濾濃縮到粗多糖濃度2.0%重量后，加入濃度為95%體積的乙醇調(diào)節(jié)體系乙醇濃度到80%，得沉降粗多糖OP2，2J0克。測定二種粗多糖0P1、OP2中多糖含量分別為64.75%、83.62%重量。選OP2進入下一步驟。(4)粗多糖OP2經(jīng)Sevag法脫蛋白、重復操作6次；之后，將多糖分別配成1%重量的水溶液，用醋酸調(diào)pH6.0。添加水溶液體積量0.2%g/100mL的活性炭脫色，得到初步純化的仙人掌多糖OPM2，1.97克，OPM2中多糖含量為86.90%重量。實施例3(1)以500克仙人掌鮮莖為原料，除雜、破碎，水溶液浸提多糖，水料比6:1，浸提溫度8(TC，浸提時間3h;浸提1次，離心分離得上清液3050mL。(2)用400目的尼龍濾布過濾作為預(yù)處理，之后，用截留分子質(zhì)量為10000ku的超濾膜過濾，超濾壓力為0.20MPa，超濾溫度為25°C，料液體積流量控制在0.045L/min、控制濃縮7倍，得濃縮浸提液450mL。(3)上述濃縮浸提液在乙醇濃度為65%體積，4。C下沉降8h，離心分離、干燥后得到粗多糖OPl，2.69克，上清液再超濾濃縮到粗多糖濃度2.0%重量后，加入95%體積乙醇調(diào)節(jié)體系乙醇濃度到80%，得沉降粗多糖OP2，1.95克。二種粗多糖0P1、OP2中多糖含量分別為64.15%、83.72%重量。選OP2進入下一步驟。(4)粗多糖OP2經(jīng)Sevag法脫蛋白、重復操作6次；之后，將多糖分別配成1%重量的水溶液，調(diào)pH5.0。添加水溶液體積量0.18^g/100mL的活性炭脫色，得到初步純化的仙人掌多糖OPM2，1.87克，OPM2中多糖含量為88.75。/。重量。實施例4測定仙人掌多糖體外抗氧化性，測定方法如下1)清除0—2，實驗采用核黃素-蛋氨酸體系向干燥比色皿內(nèi)依次加入，0.05mol/L磷酸鹽緩沖液pH7.8、0.13mol/L蛋氨酸、2xl(r5mol/L核黃素、7xl()4mol/L氯化硝基四氮唑藍NBT各0,4mL，依據(jù)試驗的不同樣品濃度，加不同體積的本發(fā)明多糖溶液或抗壞血酸溶液、以雙蒸水稀釋至4.0mL，混勻。空白樣管不加蛋氨酸和清除劑，對照樣管不加清除劑?；旌弦涸?5"C恒溫，40001x下光照20min進行還原，以黑暗中止反應(yīng)。用分光光度計在560nm處測量各管溶液的光吸收值。OY清除率為=[(A禮照-A作品)/A對照]xlOOX2)清除OH實驗采用鄰二氮菲-金屬鐵離子-^02體系取5xlO'3mol/L鄰二氮菲溶液1.5mL，力Q0.05mol/L的磷酸緩沖液pH7.42.0mL充分混勻后，加7.5xl0-3mol/LFeSO4溶液1.0mL，每加一管立即混勻，加0.1%H2O21.0mL，最后以雙蒸水補充至總體積為10mL。反應(yīng)液37。C保溫lh，在波長536nm處測吸光度A損傷。多糖溶液及抗壞血酸溶液清除'OH作用，依上法試驗，在加入7.5xl(^mol/L的FeSCV溶液混勻后，分別加入不同濃度本發(fā)明多糖溶液、抗壞血酸溶液后再加H202，37。C保溫lh，測A,禱。未損傷管不加H202及多糖溶液或抗壞血酸溶液。.OH清除率為=[(A加ff-A碰)/(A末纖-A攝)]xl00%3)對丙二醛(MDA)含量的影響與本發(fā)明多糖和Vc的作用本發(fā)明多糖液或Vc液各30ul與Fenton試劑作用后的大鼠腦組織勻漿120ul加入到EP管中，充分混勻，放入37"C震蕩溫育箱(110W分)中溫育lh，控制多糖或Vc液的終濃度均為lmg/mL。加樣按照試劑盒說明加樣，將樣品用漩渦混勻器混勻，試管口用保險膜扎緊，95'C水浴80分鐘，取出后用流動水冷卻，然后，在3500-4000轉(zhuǎn)/分下，離心10分鐘，取上清液lmL，用lcm光徑比色皿，蒸餾水調(diào)零，532nm處，測定各管吸光度值。MDA含量(nmol/mgProt)由下式進行計算測定管吸光度值-測定空白管吸光度值MDA含量X標準品濃度+蛋白濃度標準管吸光度值-標準空白管吸光度值注標準品濃度單位10nM/mL，蛋白含量的測定單位mgProt/mL通過0'2請除率，OH清除率MDA含量的測定，對仙人掌多糖的抗氧化性能進行測定，并與天然抗氧化劑維生素C(Vc)進行比較。結(jié)果見表13，其中，表1是實施例l得到的仙人掌多糖清除OY的活性；表2是實施例2得到的仙人掌多糖清除OH的活性；表3是實施例3得到的仙人掌多糖對大鼠腦組織勻漿中MDA含量的影響，多糖或Vc濃度lmg/mL。結(jié)果顯示多糖0PM2清除OY的能力不及Vc，是Vc的1/21/3;多糖0PM2清除OH的能力是Vc的12倍；多糖0PM2有明顯抑制大鼠腦組織勻漿中MDA形成的作用，與模型對照組比較，具有極顯著性差異，與Vc比，有顯著性差異。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>權(quán)利要求1、一種仙人掌多糖的提取純化方法，其特征是包括以下步驟(1)用水浸提經(jīng)除雜、破碎的仙人掌鮮莖，離心取上清液；(2)過濾后，采用超濾膜對步驟(1)得到的上清液純化和濃縮；(3)將步驟(2)超濾濃縮后的溶液在不同乙醇濃度下分段沉降多糖；(4)經(jīng)Sevag法脫蛋白、活性炭脫色初步純化。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征是步驟(1)所述水浸提條件如下水料比為6:1，浸提溫度為708(TC，浸提時間為2.23h。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是步驟(2)^f述過濾采用400目尼龍濾布c4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征是步驟(2)所述純化和濃縮選用截留分子質(zhì)量為10000ku的超濾膜，超濾壓力為0.20MPa，超濾溫度為25"C，料液體積流量控制在0.040.05L/min。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征是步驟(2)所述濃縮倍數(shù)控制在57倍。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征是步驟(3)所述分段沉降先用濃度為55%65%的乙醇，4'C下沉降8h，離心后得到粗多糖OPl，上清液再超濾濃縮到粗多糖濃度1.52.0%重量后，加入體積濃度為95%乙醇調(diào)節(jié)體系乙醇濃度到80%，得沉降粗多糖0P2。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征是步驟(4)所述Sevag法脫蛋白重復操作6次；所述活性炭脫色是將多糖分別配成1%的水溶液，調(diào)pH4.06.0后，每100mL多糖水溶液使用活性炭0.150.2g脫色。8、一種權(quán)利要求1~7之一所述方法提得到的仙人掌多糖。9、權(quán)利要求9所述仙人掌多糖在制備糖尿病抗氧化劑藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種仙人掌多糖的提取純化方法，包括用水浸提經(jīng)除雜、破碎的仙人掌鮮莖，離心取上清液；過濾后，采用超濾膜對上清液純化和濃縮；將超濾濃縮后的溶液在不同乙醇濃度下分段沉降多糖；經(jīng)Sevag法脫蛋白、活性炭脫色初步純化；該方法條件溫和、多糖類物質(zhì)損失少、超濾速度快、工藝路徑短、節(jié)約能源。得到的仙人掌多糖對糖尿病并發(fā)癥中的氧化應(yīng)激的抑制作用，可用于制備糖尿病抗氧化劑藥物，為開發(fā)和有效利用野生仙人掌植物資源提供了新的途徑。文檔編號A61K36/33GK101095480SQ20071002912公開日2008年1月2日申請日期2007年7月11日優(yōu)先權(quán)日2007年7月11日發(fā)明者春崔,張桂和,寧楊,趙謀明申請人:華南理工大學