專利名稱：：南蛇藤莖總萜提取物及其制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種南蛇藤莖提取物總二、三萜的制備方法，以及該方法制得的提取物在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：南蛇藤為衛(wèi)矛科南蛇藤屬植物南蛇藤CelastrusorbiculatusThunb.的干燥藤$」藥性辛溫，有小毒，具有祛風(fēng)除濕、活血消腫解毒的功效，可治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、跌打損傷、腰腿痛等。近年的藥效學(xué)研究證明南蛇藤莖提取物具有抗腫瘤活性。南蛇藤莖的主要有效成分為H萜和二萜類成分。公開號為CN1823870A的中國專利文獻，其方法是從南蛇藤的根及其藤莖中利用大孔樹脂富集三萜和倍半砲，方法繁瑣，流程時間較長。因樹脂可能產(chǎn)生毒性殘留，《中華人民共和國食品衛(wèi)生法》規(guī)定對申報與審評規(guī)定應(yīng)提供安全性研究資料，建立成品中樹脂殘留物及裂解產(chǎn)物的檢測方法，制訂合理的限量。甚至樹脂純化前后的藥物按新藥藥效學(xué)研究，必須進行對比^F究，以充分保證上柱前與洗脫后藥物的"等效性"。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種南蛇藤莖總萜提取物及其制備方法，該方法對南蛇藤莖的醇提取物采用有機溶劑萃取，有機溶劑的回收簡單易行，確保了有效成分最大程度的保留。且避免了己有技術(shù)使用大孔樹脂后期煩雜的藥效學(xué)研究。本發(fā)明的另一目的在于南蛇藤莖總萜提取物在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本方法采用的技術(shù)方案是一種南蛇藤莖總萜提取物，其總二、三萜含量大于50%。南蛇藤莖總萜提取物的制備方法是，取南蛇藤莖飲片，,用高濃度醇作提取溶劑提取，合并提取液，回收醇；浸膏加水分散后用醚、酯類溶劑依次萃??；收集酯類有機溶劑層用水或低濃度醇作洗滌溶劑洗滌后，減壓濃縮，干燥，得南蛇藤莖總二、三萜。所述提取溶劑高濃度醇是濃度50%~100%的甲醇或乙醇。所述萃取所用的酯類溶劑為乙酸乙酯。所述洗滌所用的溶劑低濃度醇為水或濃度30%以下的甲醇或乙醇。南蛇藤莖總二、三萜提取物在制備用于抗腫瘤,藥物中的應(yīng)用。抗腫瘤藥物組合物制劑形式可以是片劑、膠囊、軟膠囊、滴丸、顆粒劑、注射劑及粉針劑。本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案為取南蛇藤莖飲片，用6倍量95%乙醇提取2次，合并提取液，回收乙醇，浸膏加水分散后用石油醚萃取3次，再用乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯層，用水洗滌3次后，減壓濃縮，干燥，得南蛇藤莖總二、三萜。所用的酯類有機溶劑優(yōu)選為乙酸乙酯。上述發(fā)明中的干燥方法可以為烘干或減壓干燥或噴霧干燥或冷凍干燥等?？傒祁惖暮吭?0%以上，總萜主要由總?cè)坪涂偠苾刹糠纸M成。上述南蛇藤莖提取物具有抗腫瘤作用，能用于制備抗癌藥物，可以制成各種劑型，如片劑、膠囊、軟膠囊、滴丸、顆粒劑、注射劑及粉針劑等。南蛇藤莖提取物總萜類含量測定對照品溶液的制備精密稱取105'C下干燥至恒重的乙酰齊墩果酸對照品2mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得(每lml含乙酰齊墩果酸(0.08mg)。標準曲線的制備精密吸取上述對照品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6ml,分別置具塞試管中，水浴揮去溶劑，冷卻，準確加入0.4ml香草醛-冰醋酸溶液和1.8ml高氯酸，混勻，密塞。置70'C恒溫水浴中加熱20min，取出，放冷，加冰醋酸5ml，搖勻，在540nm處測定吸光度，以試劑為空白。以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線。含量測定(UV法測定)供試品溶液的制備取南蛇藤莖總萜提取物10mg,置25ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得供試品溶液。精密量取供試品溶液0.4ml按標準曲線制備項下的方法，自"分別置具塞試管中，水浴揮去溶劑"起，依法測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液中含乙酰齊墩果酸的量，計算含量。本發(fā)明的有益效果是南蛇藤莖藥材用乙醇提取，成本較低，而且乙醇可反復(fù)循環(huán)使用，節(jié)約了成本。純化方法較簡單，從原料中分離總萜類，收率約2%。避免了大孔樹脂的使用，即避免了后期煩雜的藥效學(xué)研究。對南蛇藤莖的醇提取物采用有機溶劑萃取，有機溶劑的回收簡單易行，確保了有效成分最大程度的保留?？稍谥苽溥^程中富集活性成分，去除大量雜質(zhì)；同時，本方法的重復(fù)性、穩(wěn)定性好，從而保證了療效的穩(wěn)定；原料提取得率高，成本低，操作簡便，適用于工業(yè)化生產(chǎn)，因此具有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景。經(jīng)藥效學(xué)及毒理學(xué)試驗證明，該南蛇藤莖提取物具有較好的抗腫瘤作用，有效成分明確。其主要有效成分為總瞎，且總萜含量較高，雜質(zhì)成分較少，可減少服用量，在一定程度上也可減小副作用，更有利于保證藥物的安全性和有效性。具體實施方式下面結(jié)合實施例及實驗例對本發(fā)明進一步說明。實施例l取南蛇藤莖飲片10kg，加6倍量95%乙醇，浸泡lh，回流提取2次，每次2h，合并提取液，減壓回收乙醇后加水混懸，用石油醚萃取3次，再用乙酸乙酯萃取3次，分離出乙酸乙酯層，加水洗滌3次后將乙酸乙酯層減壓濃縮，干燥，即得南蛇藤莖總萜部位195g，其中總二、三萜含量68.3%。實施例2取南蛇藤莖飲片10kg，加6倍量90%乙醇，浸泡lh，回流提取2次，每次2h,合并提取液，減壓回收乙醇后加水混懸，用石油醚萃取3次，再用乙酸乙酯萃取3次，分離出乙酸乙酯層，加水洗滌3次后將乙酸乙酯層減壓濃縮，干燥，即得南蛇藤莖總萜部位212g，其中總二、三萜含量62.5%。實施例3取南蛇藤莖飲片10kg，加6倍量90%乙醇，浸泡lh，回流提取3次，每次2h，合并提取液，減壓回收乙醇后加水混懸，用石油醚萃取3次，再用乙酸乙酯萃取3次，分離出乙酸乙酯層，加20%乙醇洗滌3次后將乙酸乙酯層減壓濃縮，干燥，即得南蛇藤莖總萜部位220g，其中總二、三萜含量71.2%。實施例4取南蛇藤莖飲片10kg，加6倍量95%乙醇，浸泡lh，回流提取3次，每次2h，合并提取液，減壓回收乙醇后加水混懸，用石油醚萃取3次，再用乙酸乙酯萃取3次，分離出乙酸乙酯層，加20%乙醇洗滌3次后將乙酸乙酯層減壓濃縮，噴霧干燥，即得南蛇藤莖總萜部位204g，其中總二、三砲含量70.7%。實施例5取南蛇藤莖飲片10kg，加6，量甲醇，浸泡lh,回流提取3次，每次2h,合并提取液，減壓回收甲醇后加水混懸，用石油醚萃取3次，再用乙酸乙酯萃取3次，分離出乙酸乙酯層，加水洗滌3次后將乙酸乙酯層減壓濃縮，噴霧干燥，即得南蛇藤莖總萜部位224g，其中總二、三萜含量62.4%。南蛇藤莖總萜提取物抗腫瘤藥效實驗實驗例l:南蛇藤提取物體外對腫瘤細胞抑制作用。材料與方法1、細胞株人肝癌細胞株SMMC-7721;人胃癌細胞株SGC-7901、人宮頸癌細胞株Hda;紅白血病細胞株K562及其耐藥株K562-A由本院中醫(yī)藥研究室傳代保種。2、藥材與試劑藥材南蛇藤飲片，為衛(wèi)矛科南蛇藤屬植物南蛇藤的藤莖。3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑(MTT，噻唑藍)、二甲基亞砜(DMSO):RMPI-1640培養(yǎng)基干粉、胰蛋白酶。新生牛血清(NBCS)。注射用鹽酸阿霉素(ADM)。氟尿嘧啶注射液(5-FU)。正己垸、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇，均為分析純。3、儀器與設(shè)備C02培養(yǎng)箱(RCO3000TVBA)，超凈工作臺(SW-CJ-1F),倒置相差顯微鏡(CKX41-32PH),酶標儀(MultiskanMK3)，無菌濾器，無菌培養(yǎng)板，真空干燥箱(ZK-82B)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Senco-R系列)、恒溫水浴鍋(SencoW201B)。4、實驗內(nèi)容及方法4.1藥品配制南蛇藤5kg切斷粉碎成粉，烘干，95%乙醇加熱回流提取3次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑得浸膏，拌入硅藻土，真空低溫抽干，干燥后裝入抽濾漏斗，用乙酸乙酯洗脫至無色，回收溶劑分別得浸膏。取浸膏適量，用生理鹽水配成所需濃度，溶解后抽濾除雜除菌。脂溶物用DMSO助溶，其最終濃度小于0.05%,DMSO在此濃度下對細胞的生長無影響。4.2細胞培養(yǎng)人胃癌SGC-7901、人肝癌SMMC-7721、人子宮頸癌Hela、人紅白血病K562:RPMI1640培養(yǎng)基加12%新生牛血清。K562/ADM(-ADM):RPMI1640培養(yǎng)基加12%新生牛血清中培養(yǎng)2星期以上。K562/ADM(+ADM):RPMI1640培養(yǎng)基加12%新生牛血清、ADM1mg-I/1所有細胞均在溫度37。C、飽和濕度、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)。4.3體外抑瘤實驗取處于指數(shù)生長期的細胞，加入適量Trypsin-EDTA液，吹打后使貼壁細胞脫落(K562細胞及耐藥株直接吹打)，0.1%臺盼藍染色計數(shù)細胞活力在95%以上，細胞計數(shù)后用含5%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔8000個接種于96孔培養(yǎng)板中，[K562及K562/ADM(-ADM)每孔104，K562/ADM(+ADM)每孔接種1.5xl(^個細胞]，調(diào)零孔加等量完全培養(yǎng)基，在37'C，飽和濕度，5MC02條件下繼續(xù)培養(yǎng)24h后，每孔加入5個濃度的4個受試組分10ul，每個濃度設(shè)四個平行樣本。繼續(xù)孵育48h，然后加入10^1MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)。4h后仔細吸去上清液(K562及其耐藥株1000rpm離心5min)，每孔加入二甲基亞楓150nL，輕輕振蕩以使溴代噻唑藍完全溶解,約1h后在570nm波長處用酶標儀測其吸光度(A)值，測定時需減去空白對照的A值。細胞生長抑制率(IRn/。"(l-A樣品組/A對照組)xlOOn/。。4.4統(tǒng)計學(xué)處理所得資料用SPSS13.0forwindows統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)用I土s表示，組間比較用f檢驗。結(jié)果南蛇藤乙酸乙酯提取物對本實驗用腫瘤細胞有顯著抑制作用，呈明顯的量效關(guān)系。在抑制K562/ADM(+ADM)時，COE顯示了較強的作用，提示其中含有拮抗多藥耐藥的成分。各種腫瘤細胞以K562及其耐藥株較為敏感。高倍鏡下可見細胞呈病理性萎縮和不可逆性損壞，隨藥物濃度增高，可見細胞周圍碎片增多，而陰性對照組未見明顯病理改變。實驗例2:南蛇藤提取物體外抑瘤作用材料與方法1動物與細胞株清潔級ICR小鼠,體重(21土2)g,雌雄各半，由揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供,合格證:SCXK(蘇)2002-0009;小鼠移植性腫瘤肉瘤(S,J、肝癌(H印s),均由中國科學(xué)院上海藥物研究所提供，江蘇省腫瘤防治研究所傳代保種。2試劑環(huán)磷酰胺(CTX)，S0D、MDA試劑盒，切片石蠟，無水乙醇，其它常規(guī)化學(xué)試劑均為分析純。3儀器與設(shè)備電熱恒溫水浴箱，電熱恒溫水浴鍋，低速自動平衡離心機(LDZ5-2)，可見光分光光度計(UV-754),LEICA-RM2145切片機。4實驗內(nèi)容及方法4.1藥物用量及配制實驗用藥物在成年人(按體重60kg計算)的用量為9-15g'cT1[4]，小鼠口服用藥量按公式WdB二dAX(RB/RA)X(WA/WB)1/3計算。dB為小鼠口飼用量(mg'kg—1)，dA為人體口服用量(mg/kg);RA:人體型系數(shù)，為100;RB:小鼠體型系數(shù)，為59;WA:成年人體重，按60kg計算；WB:小鼠體重，按21g計算。取體外抑瘤實驗效果較好的南蛇藤乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物浸膏適量，每克浸膏含50克生藥，以0.9%NaCl配成所需濃度。4.2體外抑瘤實驗選擇腫瘤生長良好的荷瘤小鼠，無菌條件下取出腫瘤，用0.9。/。NaCl按比例(S,8。l:3、Heps1:4)制成腫瘤細胞懸液，每只小鼠右前肢腋窩皮下接種0,2ml。接種后使用均衡隨機法分組(每組雌雄各半，組間平均體重相差不超過lg)，實驗組每組10只，對照組每組14只。設(shè)陰性對照組(溶媒)、陽性對照組(CTX),COE、COB給藥組各設(shè)10、20、40mgkg"3個劑量。接種24h后開始灌胃給藥，每天固定時間段給藥一次并記錄小鼠的活動情況，連續(xù)10d，末次給藥后24h稱體重，摘眼球取血后處死，完整剝離腫瘤、肝臟、脾臟、胸腺等組織。4.3療效總體評價分別稱取各組小鼠瘤質(zhì)量及肝臟、脾臟、胸腺等器官的質(zhì)量，并計算其抑瘤率和肝臟、脾臟、胸腺指數(shù)。4.4抗氧化指標摘眼球取血，分離得到血清。采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD，硫代巴比妥酸法測定MDA。4.4血清SOD測定測定原理黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生((￥)，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑作用下呈紫紅色，而SOD則抑制其反應(yīng)，根據(jù)抑制率的高低計算出SOD的含量。4.5病理觀察取各組瘤塊組織，脫水透明后石蠟包埋，常規(guī)病理切片制備，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。結(jié)果1、小鼠活動情況觀察CTX組小鼠進食量較陰性對照組明顯減少，毛發(fā)干枯、蓬松、無光澤，且有中度腹瀉，體質(zhì)消瘦，活動遲緩。而C0E、COB組小鼠較陰性對照組活動敏捷，進食量增加。2、療效總體評價COE、COB3個劑量組對小鼠Sw。腫瘤均有較強的抑制作用，其高(40mg.kg—1)、中(20mg'kg")劑量組對小鼠Heps腫瘤也有較強的抑制作用，和陰性對照組相比，均有顯著性差異。兩種腫瘤的抑制作用均以中劑量組(20mg'kg勺效果為好，結(jié)果見表2.1、2.2。與陰性對照組比較，C0E、C0B各處理組小鼠肝、脾、胸腺指數(shù)無明顯改變，而CTX組脾、胸腺指數(shù)明顯降低，與陰性對照組比較差異有顯著性。3、對荷瘤鼠血清抗氧化功能的影響COE、COB中劑量組(20mg/kg)作用的的S則、Heps荷瘤小鼠血清SOD活力均有升高，MDA水平均有下降，與陰性對照組對比均差異有顯著性。結(jié)果見表4.1，4.2。表4.1COE、COB對荷S,抑小鼠SOD和MDA的影響(n=8)組別劑量SODMDA(mg'kg"Xd)(Uml-1)(nmolml")陰性對照090.89±33.1824.23±4.12CTX10116.75±20.8717.50±4.48COE(H)10106.52±11.0215.29±4.02COE(M)20x10163.10士47.13')13.27土4.03')COE(L)10x10114.23±29.0315.卯±3.68COB(H)10111.00±26.8516.54±3.13<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表4.2COE、COB對荷Heps小鼠SOD和MDA的影響(7±&n=8)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>4、病理光學(xué)顯微鏡下，CE、CN組瘤結(jié)節(jié)中壞死較多，腫瘤細胞較小，核分裂數(shù)稍少，癌巢內(nèi)可見大量淋巴細胞浸潤。陰性對照組瘤結(jié)節(jié)中央可見癌性壞死，核分裂多見，壞死灶中有淋巴細胞、漿細胞反應(yīng)。討論本實驗選用與臨床結(jié)合緊密的人胃癌SGC-7901、人肝癌S國C-7721、人子宮頸癌Hela、人紅白血病K562及其耐藥株進行細胞毒試驗，提高本次體外篩選的可信度。從實驗結(jié)果可見，南蛇藤乙酸乙酯提取物對上述細胞均有明顯的細胞毒性，在100mg.L"時，細胞的抑制率均大于50%,其ICs?！?00mg'L'1。在體外篩選的基礎(chǔ)上我們運用腫瘤動物模型觀察了南蛇藤乙酸乙酯提取物、的抑瘤作用。實驗結(jié)果提示南蛇藤提取物對小鼠移植性腫瘤S,8。、Heps均具有顯著的抑制作用，與對照組比，有顯著性差異，以中劑量組(20mg'mr1'd")效果較好，在發(fā)揮抗腫瘤作用的同時，肝、脾、胸腺指數(shù)無明顯改變，無明顯毒副作用。SOD和MDA是反映機體抗氧化能力的指標，測定方法簡單，結(jié)果真實可靠?？寡趸匦允窃S多腫瘤化學(xué)防治藥物發(fā)揮作用的重要機制之一。本實驗中南蛇藤乙酸乙酯提取物對于提高荷瘤小鼠血清SOD活力及降低MDA水平有一定作用。結(jié)果提示南蛇藤提取物可能通過提高體內(nèi)抗氧化酶活性和自由基清除劑水平，保護機體免受氧自由基的攻擊，起到腫瘤防治作用，但其抑瘤作用與抗氧化活性之間無明顯相關(guān)性，提示可能存在其他抑瘤機制。從病理學(xué)觀察結(jié)果分析，CE、CN組腫瘤細胞增殖比率明顯減低，腫瘤細胞較小，瘤組織壞死明顯，提示南蛇藤提取物具有抑制腫瘤生長和瘤組織分裂繁殖的能力以及對該腫瘤細胞的細胞毒作用。-結(jié)論1、南蛇藤提取物4個組分對體外腫瘤細胞均有一定程度的抑制作用，以乙酸乙酯提取物作用顯著，呈明顯的量效關(guān)系。2、南蛇藤乙酸乙酯提取物整體實驗對小鼠移植性腫瘤有明顯的抑制作用。在發(fā)揮抗腫瘤作用的同時，肝、脾、胸腺指數(shù)無明顯改變，無明顯毒副作用。實驗例3:南蛇藤提取物體外對幽門螺桿菌抑制作用材料與方法1H.pylori菌株1.1標準菌株NCTC11637購于中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，NCTC11638、26695來自上海第二醫(yī)科大學(xué)。1.2臨床菌株將江蘇石油勘探局職工總醫(yī)院胃鏡室提供的慢性淺表性胃炎病人、胃潰瘍病人、胃癌病人胃粘膜活檢標本，直接接種在腦心浸液血液瓊脂平板上，經(jīng)過微氧環(huán)境培養(yǎng)，分離出H.pylori菌落，經(jīng)觀察菌落、細菌形態(tài)及尿素酶、觸酶、氧化酶試驗，鑒定為幽門螺桿菌。依次編號為l、2、3,保存?zhèn)溆谩?.3、質(zhì)控菌株用NCTC11637(甲硝唑MIC為lmg.L")作為標準的H.pylori質(zhì)控菌株。2、試劑腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基美國BectonDickinson公司配套試劑杭州微生物試劑有限公司無菌脫纖維綿羊血杭州微生物試劑有限公司C02、N2，小牛血清杭州四季青生物材料工程公司產(chǎn)品布氏肉湯北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司快速尿素酶診斷試紙，過氧化酶、氧化酶試劑。4、實驗內(nèi)容及方法4.1H.pylori培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件采用腦心浸液瓊脂(含8%-10%的脫纖維羊血+萬古霉素、兩性霉素、TMP、多粘菌素B)，PH=7.2。抽氣換氣法形成微氧環(huán)境(N285%，C0210%,025%)，于恒溫培養(yǎng)箱37。C條件下培養(yǎng)。腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基為美國BectonDickinson產(chǎn)叩o4.2藥物配制取COH、COE、COB、COA適量，用生理鹽水配成所需濃度，脂溶物以二甲基亞楓(DMSO)助溶，DMSO最終濃度小于0.05X。過濾除菌，4'C保存?zhèn)溆?。a)中藥培養(yǎng)基制備用H.pylori培養(yǎng)基將各提取物試驗液進行倍比稀釋成終濃度為10.24g丄—1、5.12g.1/1、2.56g.1/1、1.28g.L層1、0.64g'I/1、0.32g.1/1、0.16g.1/1、0.08g.1/1(編號為18)制備成含不同濃度中藥的血瓊脂平板。同時做空白不含中藥的培養(yǎng)基作為對照。b)甲硝唑培養(yǎng)基制備按0.2511^.1/1、0.5mg.U1、1mg.L"、2mg.1/1、4mg.U1、8mg'L"的甲硝唑終濃度制備H.pylori血瓊脂平板。4.5藥物抑菌試驗將受試菌在H.pylori培養(yǎng)基血平板上傳種三次以保證其純度及活力，得到的72小時菌齡的菌株，將各菌株用生理鹽水洗下，稀釋成1()SCFu-mr1(1麥氏濃度)濃度菌液，取l^il菌液涂布藥物平皿，每一菌株重復(fù)3塊平板。其中，含甲硝唑瓊脂平板只涂布NCTC11637菌株。于37"C微需氧環(huán)境下培養(yǎng)3天。觀察細菌生長情況，以不出現(xiàn)菌落的平板上的最低藥物濃度為最低抑菌濃度(MICfW。結(jié)果NCTC11637菌株對甲硝唑的MIC為1mg七"，空白對照組6種菌株均生長良好。COH的MIO10.24g-L'1、COE的MIC為0.64g-L"、COB的MIC為5.12g丄—1、C0A的MIO10.24g丄"。結(jié)果見表5。Tab5南蛇藤提取物體外抑制H.Pylori的實驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>COB-3+—_+一—COB-4—一一———COB-5—一_———COB-6—一一———COB-7—一一——一COB-8—一———一COA-l——_———COA-2——一———COA-3———一——COA-4—一————COA-5——一————COA-6—一————COA-7—一—一—一COA-8—一一——一注1~8代表藥物濃度從高到低；"+"表示菌株被抑制，"-"表示菌株生長討論1、本實驗中選用與臨床結(jié)合緊密的人胃癌SGC-7901、人肝癌SMMC-7721、人子宮頸癌Hela、人紅白血病K562及其耐藥株進行細胞毒試驗，提高本次體外篩選的可信度。從本次實驗結(jié)果可見，南蛇藤乙酸乙酯提取物對上述細胞均有明顯的細胞毒性，在100mg丄"時，細胞的抑制率均大于50%，其1(:5()<10011^1/1,正丁醇提取物對上述細胞也有較強的抑制作用。2、在體外篩選的基礎(chǔ)上我們運用腫瘤動物模型觀察了南蛇藤乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物的抑瘤作用。實驗結(jié)果提示南蛇藤提取物對小鼠移植性腫瘤S18o、Heps均具有顯著的抑制作用，與對照組比，有顯著性差異，以中劑量組(20mg-mrLd")效果較好，在發(fā)揮抗腫瘤作用的同時，肝、脾、胸腺指數(shù)無明顯改變,無明顯毒副作用。SOD和MDA是反映機體抗氧化能力的指標，測定方法簡單，結(jié)果真實可靠。抗氧化特性是許多腫瘤化學(xué)防治藥物發(fā)揮作用的重要機制之一。本實驗中南蛇藤提取物對于提高荷瘤小鼠血清SOD活力及降低MDA水平有一定作用。結(jié)果提示南蛇藤提取物可能通過提高體內(nèi)抗氧化酶活性和自由基清除劑水平，保護機體免受氧自由基的攻擊，起到腫瘤防治作用，但其抑瘤作用與抗氧化活性之間無明顯相關(guān)性，提示可能存在其他抑瘤機制。從病理學(xué)觀察結(jié)果分析，COE、COB處理組腫瘤細胞增殖比率明顯減低，腫瘤細胞較小，瘤組織壞死明顯，提示南蛇藤提取物具有抑制腫瘤生長和瘤組織分裂繁殖的能力以及對該腫瘤細胞的細胞毒作用。3H.pylori是定植于胃粘膜表面與粘膜層之間的微需氧革蘭氏陰性螺旋狀細菌，自1983年澳大利亞學(xué)者Warrent和Marshall首次報道從人胃粘膜標本中分離出該菌以來P"，其致病性日趨明確。它是慢性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關(guān)淋巴組織(MALT)淋巴瘤和胃癌發(fā)生發(fā)展中的一個重要致病因子。1994年世界衛(wèi)生組織正式將H.pylori列為第I類致癌因子[22。本實驗中選用H.pylori作為生物致癌因子，觀察南蛇藤提取物對其作用，結(jié)果顯示COE、COB處理組可有效抑制H.pylori的生長，以COE處理組效果為好。提示南蛇藤可通過抑制某些生物致癌因子而達到腫瘤預(yù)防作用。結(jié)論1南蛇藤提取物4個組分對體外腫瘤細胞均有一定程度的抑制作用，以乙酸乙酯提取物作用顯著，其次為正丁醇提取物，均呈明顯的量效關(guān)系。2南蛇藤乙酸乙酯、正丁醇提取物整體實驗對小鼠移植性腫瘤有明顯的抑制作用，在發(fā)揮抗腫瘤作用的同時，肝、脾、胸腺指數(shù)無明顯改變，無明顯毒副作用。并可通過提高體內(nèi)抗氧化酶活性和自由基清除劑水平，保護機體免受氧自由基的攻擊，起到腫瘤防治作用。3南蛇藤乙酸乙酯、正丁醇提取物可有效抑制H.pylori而達到腫瘤預(yù)防作用。權(quán)利要求1、一種南蛇藤莖總萜提取物，其特征在于，總二、三萜含量大于50%。2、一種權(quán)利要求1所述南蛇藤莖總萜提取物的制備方法，其特征在于，取南蛇藤莖飲片，用醇回流提取，合并提取液，回收醇，浸膏加水分散后依次用醚類、酯類溶劑萃取，收集酯類有機溶劑層，用水洗滌后減壓濃縮，得南蛇藤莖總萜。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的南蛇藤莖總萜提取物的制備方法，其特征在于所用拷取溶劑為濃度50%100%的甲醇或乙醇。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的南蛇藤莖總萜提取物的制備方法，其特征在于萃取所用的酯類溶劑為乙酸乙酯。5、根據(jù)權(quán)利要求2所述的南蛇藤莖總萜提取物的制備方法，其特征在于洗滌所用的溶劑為水或濃度30%以下的甲醇或乙醇。6、權(quán)利要求1所述的南蛇藤莖總萜提取物在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物組合物制劑形式可以是片劑、膠囊、軟膠囊、滴丸、顆粒劑、注射劑及粉針劑。全文摘要本發(fā)明公開了一種南蛇藤莖提取物，它是從南蛇藤屬植物南蛇藤莖中提取分離而得到的含有南蛇藤莖總二、三萜的提取物。經(jīng)藥效學(xué)及毒理學(xué)實驗證明，該提取物對多種腫瘤具有較好的治療作用，它的有效成分比較明確，有利于保證藥物的安全性和有效性。原料提取得率高，成本低，操作簡便，適用于工業(yè)化生產(chǎn)，因此具有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景。文檔編號A61P35/00GK101120960SQ20071002534公開日2008年2月13日申請日期2007年7月25日優(yōu)先權(quán)日2007年7月25日發(fā)明者劉延慶申請人:徐州工程學(xué)院