專利名稱：包括通過調(diào)節(jié)先天免疫治療和預防感染在內(nèi)的治療和預防免疫相關(guān)疾病的新型肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
0002本發(fā)明涉及用于預防和治療免疫相關(guān)疾病，包括通過調(diào)節(jié)先天 免疫治療和預防感染的肽。 一方面，本發(fā)明涉及組合物及其調(diào)節(jié)先天 免疫的用途。另一方面，本發(fā)明提供了新型肽及其有效減少二肽基肽 酶IV (DPPIV)活性的用途。
背景技術(shù)：
隨著抗菌藥耐藥性的日益嚴重以及新傳染病的出現(xiàn)，存在著對
新型治療性化合物的持續(xù)需求。作用于宿主而非致病菌的治療是理想 的，因為其不促使致病菌產(chǎn)生耐藥性。尤其是經(jīng)先天免疫系統(tǒng)作用于 宿主的藥物提供了一種有前景的治療來源。先天免疫系統(tǒng)提供了一系列的保護機制，包括上皮屏障功能， 以及細胞因子和趨化因子的分泌。到目前為止，根據(jù)保守N端半胱氨 酸基序C、 CC、 CXC和CX3C(其中X是一個非保守的氨基酸殘基) 的數(shù)量，趨化因子被分為四個家族。已知CXC趨化因子對帶有 CXCR3受體的細胞，包括單核細胞，活化T細胞(Thl)和NK細 胞，有趨化效應。原代人類呼吸道上皮細胞和細胞系16-HBE組成型表 達CXCR3受體及其配體，IP-IO、 I-TAC和MIG (Kelsen d a/., The chemokine receptor CXCR3 and its splice variant are expressed in human airway epithelial cells(趨化因子受體CXCR3及其剪切變體在人呼吸道上
皮細胞中表達)，爿肌J P/j>wW.丄柳g CW/ Mo/. P/z>w'o/.， 287:L584, 2004)。此外，CXCR3配體誘導16-HBE細胞內(nèi)的趨化反應和肌動蛋白 重組(Kelsen a/., The chemokine receptor CXCR3 and its splice variant are expressed in human airway epithelial cells(趨葉匕因子受體CXCR3及其 剪切變體在人呼吸道上皮細胞中表達)，J肌J P/7>w'o/.Ce〃 Mo/, /^>w'oZ.,287:L584, 2004)。
0009此外II型跨膜絲氨酸蛋白酶二肽酰肽酶IV (DPPIV)又稱為 CD26或腺苷脫氨酶結(jié)合蛋白，是一個調(diào)節(jié)各種生理過程，包括免疫功 能的重要調(diào)節(jié)子。CD26/DPPIV是一個110 kD的細胞表面糖蛋白，主 要在成熟胸腺細胞、活化的T細胞、B細胞、NK細胞，巨噬細胞和上 皮細胞上表達。它至少有兩種功能，信號傳導功能和蛋白水解功能 (Morimoto C, Schlossman SF. The structure and function of CD26 in the T-cell immune response(T細胞免疫反應中CD26的結(jié)構(gòu)和功能).Immunol. Review, 1998， 161 : 55-70.)。它的一個細胞作用涉及從趨化因子N端裂 解二肽來調(diào)節(jié)趨化因子活性。趨化因子氨基末端的調(diào)節(jié)不僅對與其受 體的結(jié)合以及下列反應，而且對改變經(jīng)處理的趨化因子的受體特異 性，都是非常重要的。DPPIV活性已與許多免疫相關(guān)疾病相關(guān)聯(lián)。
發(fā)明概述
OOIO]本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，具有表1所列和所述肽之一的氨基酸序列的
肽，或其類似物，衍生物，或變體，能增強宿主的先天免疫。 一方 面，本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)肽表現(xiàn)出提高受感染宿主存活能力時，被發(fā)現(xiàn)
缺乏抗菌活性。另一方面，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)DPPIV活性的肽。 一方 面本發(fā)明提供了降低DPPIV活性的肽。但另一方面，本發(fā)明提供了可 用于診斷，治療或預防如與DPPIV活性和/或先天免疫相關(guān)的免疫系統(tǒng) 疾病的肽。另一方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包括一種具有或 包含表1氨基酸序列的分離肽，或其類似物、衍生物、或變體(包括 藥學上可接受的鹽，加成鹽，或上述任何物質(zhì)的酯，或多晶型)，以 及藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。另一方面，本發(fā)明提供了一種通過將具有或包含表1氨基酸序 列的肽，或其類似物、衍生物、或變體或明顯化學等同物施用于受試 者，來治療和/或預防受試者感染(例如微生物感染)的方法。舉例來 說，受試者可能受到感染，或有感染的風險。在一個實施方案中，所 述肽調(diào)節(jié)受試者的先天免疫，從而治療和/或預防受試者感染。本發(fā)明 還提供了 一種方法，其用于鑒別可用本發(fā)明的肽治療的微生物感染。
另一方面，本發(fā)明提供了一種治療或預防DDPIV相關(guān)疾病的方法。
本發(fā)明的方法可治療和/或預防的代表性感染，包括
細菌感染(例如革蘭氏陽性或革蘭氏陰性菌)，真菌感染，寄生蟲感 染和病毒感染。在本發(fā)明的一個實施方案中，這種感染是細菌感染 (如大腸桿菌(￡. co//)、肺炎克雷伯氏菌(幻eZwW/a ; "e"wom'ae)、綠膿 桿菌(尸化M(iomo"as aewg〖wwa)、 沙門氏桿菌(Sa/wo"e/Za s; p.)、金黃色 葡萄球菌(5to; /^/ococaw awews)、鏈球菌(5^e/ fococci^ s/7/ .)、或抗萬 古霉素腸球菌感染)。在另一實施方案中，所述感染是真菌感染(例 如霉、酵母、或更高級的真菌感染)。在另一實施方案中，所述感染 是寄生性感染(例如單細胞或多細胞寄生蟲感染，包括賈第鞭毛蟲 (G/ara^3f <^(%/6""http://力、小3求隱孑包子蟲(Ojptoy/7oW(i/ww /wrvww)、 圓孑包子 ^求蟲(Cyc/(w/ on3 cqyetowe"J7'力禾口弓形蟲(Tbxop/oswa go"c ") ) 。 4旦在另 一實施方案中，所述感染是病毒性感染(例如愛滋病、禽流感、水 痘、感冒瘡、傷風感冒、腸胃炎、腺發(fā)燒、流感、麻疹、腮腺炎、咽
炎、肺炎、風疹、非典型性肺炎、下或上呼吸道感染相關(guān)病毒(例如 呼吸道合胞病毒))。
0018按照本發(fā)明的方法，具有或包含表1氨基酸序列的肽，或其類 似物、衍生物、或變體可以直接(即把肽本身施用于受試者)或間接 (例如以允許該肽在受試者內(nèi)表達的方式把編碼該肽的核酸序列施用于 受試者)施用于受試者。本發(fā)明的肽(或編碼該肽的核酸)可以口 服，胃腸外(例如皮內(nèi)，肌注，腹腔注射，靜脈注射或皮下注射)， 透皮，滴鼻，肺部(例如氣管內(nèi)給藥)和/或由滲透泵施用于受試者。
根據(jù)本發(fā)明方法，可檢測受試者診斷樣品的標記物表達，用所 知領(lǐng)域容易確定的技術(shù)(如免疫技術(shù)，雜交分析，熒光成像技術(shù)，和/ 或放射性檢測)，以及本文公開的任何檢測方法(如免疫沉定反應， 蛋白質(zhì)印跡分析等)，可以檢測診斷樣本中標記物表達。例如可以用 與炎癥標記物起反應的物質(zhì)檢驗受試者診斷樣本的標記物表達。本文 所用的"起反應的，，是指該物質(zhì)對標記物有親和力，能鍵合于標記物， 或直接作用于標記物。本文進一步使用的"物質(zhì)"包括蛋白質(zhì)，多肽， 肽，核酸(包括DNA或RNA),抗體，F(xiàn)ab片段，片段，分子，化合 物，抗生素，藥物及其任意組合。優(yōu)選得，依據(jù)本文所述的技術(shù)，本 發(fā)明的物質(zhì)用可^r測的標記物或標簽標記。在本發(fā)明的 一 實施方案 中，與該標記物反應的物質(zhì)是一種抗體。或者，通過對提取自受試者診斷樣品的核酸進行雜交分析，以 檢驗受試者診斷樣品的標記物表達。依據(jù)本發(fā)明的這種方法，可用 mRNA的Northern印跡分析進行雜交分析，也可用與編碼標記物的核 酸雜交的一個或多個核酸進行DNA的Southern印跡分析。核酸4笨針可 以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種技術(shù)來制備，包括但不限于下述技 術(shù)標記物核酸的限制性內(nèi)切酶消化；4吏用如Applied Biosystems Model 392 DNA/RNA合成儀的商業(yè)上可購買的寡聚核苷酸合成儀自動 合成寡核苦酸，該寡核苷酸具有與標記物核酸的核苷酸序列的選定部 分對應的序列。在本發(fā)明的方法中，檢測標記物表達后，可以進行測量或量化 受試者診斷樣品中標記物表達程度的檢測。這樣的檢測方法為本領(lǐng)域 技術(shù)人員所熟知，可以包括免疫組織化學/免疫細胞化學，流式細胞術(shù)
分析，質(zhì)譜分析，蛋白質(zhì)印跡分析，或ELISA法以計量標記物蛋白數(shù) 量。例如用免疫組織化學方法，可以把組織切片(石蠟包埋)置于載 玻片上，然后與標記物抗體一起孵育。載玻片可隨后與二抗(針對一 抗而言)一起孵育，該二抗用染料或其它量熱體系(比如熒光染料， 放射活化劑，或具有高電子掃描能力的物質(zhì))標記，以使切片中的標 記物顯像。
0121本發(fā)明在下列實施例中描述，其闡述有助于理解本發(fā)明，并且 實施例
實施例1-肽的合成
001221表l中的肽用固相肽合成4支術(shù)合成
00123相對于lmmole所需的肽，所有所需Fmoc-保護的氨基酸以3 倍摩爾過量稱量。然后將氨基酸溶于二甲基甲酰胺(DMF, 7.5ml)中 制成3mMo1的溶液。根據(jù)樹脂的取代度，稱取適量Rink amide MBHA 樹脂。然后將該樹脂轉(zhuǎn)移到自動合成儀的反應容器里，用二氯甲烷 (DCM)預泡15分鐘。由于這些肽的親水性，無法使用乙醚分離。因此需要用氯仿提 取。蒸除TFA，將肽殘余物溶于10%乙酸(15ml)。溶液用氯仿 (30ml)洗滌兩次，以便將乙酸肽溶液的中的雜質(zhì)和清除劑除去。然后 將肽的水溶液在-8()GC冷凍并凍干，得到可用HPLC純化的肽凍干粉。
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權(quán)利要求
1.一種分離的肽，其包括表1的氨基酸序列，或其類似物、衍生物或變體。
2. 權(quán)利要求1所述的分離的肽，其具有修飾的C-端和/或修飾的N-端。
3. 權(quán)利要求2所述的分離的肽，其具有修飾的C-端。
4. 權(quán)利要求3所述的分離的肽，其具有酰胺化的C-端。
5. 權(quán)利要求1所述的分離的肽，其包括至少一 D型氨基酸取 代修飾的表l氨基酸序列。
6. —種物質(zhì)，其與權(quán)利要求1所述的肽起反應。
7. 權(quán)利要求6所述的物質(zhì)，其為抗體。
8. 權(quán)利要求7所述的物質(zhì)，其為單克隆抗體。
9. 一種分離的核酸分子，其編碼權(quán)利要求1所述的肽。
10. —種重組核酸構(gòu)建體，其包括可操作地連接到一種表達載 體上的權(quán)利要求9所述的核酸分子。
11. 至少一種宿主細胞，其包括權(quán)利要求10所述的重組核酸構(gòu)建體。
12. —種制備包括表1所列氨基酸序列的肽，或其類似物、衍生 物、或變體的方法，所述方法包括步驟(a) 在允許該肽表達的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求11所述的至少一種 宿主細"包；和(b) 從該至少 一種宿主細胞或其培養(yǎng)基回收該肽。
13. —種藥物組合物，其包括權(quán)利要求1所述的肽和藥學上可 接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
14. 一種治療和/或預防受試者感染的方法，其包括將一種包括 表1所列氨基酸序列的肽，或其類似物、衍生物、或變體施用于受試 者。
15. 權(quán)利要求14所述的方法，其中所述肽具有SEQIDNO: 1、 3-16、 18-60的氨基酸序列。
16. 權(quán)利要求14所述的方法，其中所述肽調(diào)節(jié)受試者的先天免 疫，從而治療和/或預防受試者感染。
17. 權(quán)利要求14所述的方法，其中所述感染是微生物感染。
18. 權(quán)利要求17所述的方法，其中所述感染選自細菌感染、真菌 感染、寄生蟲感染和病毒感染。
19. 權(quán)利要求18所述的方法，其中所述細菌是革蘭氏陽性或革蘭 氏陰性菌。
20. 權(quán)利要求19所述的方法，其中所述細菌選自大腸桿菌、肺炎 克雷伯氏菌、綠膿桿菌、沙門氏桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌和萬 古霉素耐藥的腸球菌。
21. 權(quán)利要求18所述的方法，其中所述真菌選自霉菌、酵母菌、 和更高級的真菌。
22. 權(quán)利要求18所述的方法，其中所述寄生蟲是單細胞或多細胞的。
23. 權(quán)利要求22所述的方法，其中所述寄生蟲選自十二指腸賈第 鞭毛蟲、小球隱孢子蟲、圓孢子球蟲和弓形蟲。
24. 權(quán)利要求18所述的方法，其中所述病毒與選自以下的疾病相 關(guān)愛滋病、禽流感、水痘、感冒瘡、傷風感冒、腸胃炎、腺發(fā)燒、 流感、下呼吸道感染、麻疹、腮腺炎、咽炎、肺炎、風疹、非典型性 肺炎和上呼吸道感染。
25. 權(quán)利要求24所述的方法，其中所述病毒是呼吸道合胞病毒 (RSV)。
26. 權(quán)利要求14所述的方法，其中所迷受試者受到感染、或有感 染的風險。
27. 權(quán)利要求26所述的方法，其中所述肽是以口服給藥、非腸道 給藥、透皮給藥、鼻內(nèi)給藥、呼吸道給藥、或滲透泵方式給藥。
28. —種預測受試者是否對微生物感染或免疫相關(guān)疾病的治療有應答的方法，其中所述治療包括將一種包括表1氨基酸序列的肽， 或其類似物、衍生物、或變體施用于受試者，該方法包括有DPPIV 底物存在，在允許DPPIV與底物反應的條件下，通過將本發(fā)明的肽施 用于樣本，檢測受試者診斷樣本的DPPIV活性，其中較之沒有肽的對 照組，所述DPPIV活性的減少表明受試者對治療有應答。
29. —種分離的肽，其包含 一種選自SEQ. ID. NO. 1-60的氨基 酸序列。
30. 權(quán)利要求29所述的一種分離的肽，其中所述氨基i^列選自 SEQ.ID.NO. 1、 3-16、 18-60。
31. 權(quán)利要求30所述的一種分離的肽，其中所述氨基^f列選自 SEQ. ID.NO.l、 3-16、 18-54。
32. 權(quán)利要求29或30的任何一項所述的一種分離的肽，其包括 免疫活性。
33. 權(quán)利要求32所述的一種分離的肽，其由最多達10個的氨基 酸組成。
34. 權(quán)利要求32或33的任何一項所述的一種分離的肽在治療 DPPIV相關(guān)疾病中的用途。
35. 權(quán)利要求32或33的任何一項所述的一種肽在治療感染或先 天性免疫相關(guān)疾病中的用途。
全文摘要
一方面，本發(fā)明提供了分離的新型肽，其可用于調(diào)節(jié)受試者的先天免疫和/或用于治療免疫相關(guān)疾病，包括通過調(diào)節(jié)先天免疫來預防和治療感染。本發(fā)明還提供了一種與該肽反應的物質(zhì)，一種包括該肽的藥物組合物，一種編碼該肽的分離的核酸分子，一種包括該核酸分子的核酸構(gòu)建體，至少一種包括該重組核酸構(gòu)建體的宿主細胞，以及一種利用該宿主細胞生產(chǎn)該肽的方法。本發(fā)明進一步提供了一種通過將本發(fā)明的肽施用于受試者以治療和/或預防受試者感染的方法，從而調(diào)節(jié)受試者的先天免疫。此外，本發(fā)明提供了一種預測受試者是否對用本發(fā)明的肽治療有應答的方法。
文檔編號A61P31/00GK101351554SQ200680045440
公開日2009年1月21日 申請日期2006年10月4日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月4日
發(fā)明者A·羅策, O·多尼尼, S·W·倫茨 申請人:伊尼梅克斯制藥公司