專利名稱：：伴侶蛋白10-誘導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明大體上涉及伴侶蛋白lO在調(diào)節(jié)Toll樣受體信號(hào)傳導(dǎo)，尤其是TLR2、TLR3、TLR4、TLR7禾口TLR9i言號(hào)傳導(dǎo)中白勺應(yīng)用，以及用于通過伴侶蛋白IO誘導(dǎo)的對這些信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)作用治療疾病的方法和組合物，所述疾病包括但不限于病毒和細(xì)菌感染、炎性疾病和自體免疫疾病。
背景技術(shù)：
：針對入侵的細(xì)菌、真菌、酵母和病毒病原體的宿主防御系統(tǒng)的主要成分，參與了細(xì)胞受體對病原體或其成分的成功識(shí)別，該細(xì)胞受體誘發(fā)信號(hào)傳導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的刺激和多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生。在此防線中具有重要地位的一個(gè)受體家族是Toll-樣受體(TLR)家族。TLR在包括下列的免疫細(xì)胞上表達(dá)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、B細(xì)胞和粒細(xì)胞、以及多種其他類型的細(xì)胞，包括內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞。TLR被病原體或其來源的分子活化，誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)，其主要引起轉(zhuǎn)錄因子NF-kB的活化(Beg，2002,7>e"A/mw,o/，23509-12)和細(xì)胞因子產(chǎn)生的調(diào)節(jié)。但也可激發(fā)一系列其他的通路，包括p38促分裂原活化的激酶、c-Jim-N-末端激酶和細(xì)胞外信號(hào)相關(guān)的激酶通路(Flohe等人，2003，J/mmww/,1702340-2348;Triantafilou禾口Triantafilou，2002，7ewfe/mmwm/，23301-304)。I型干擾素，主要是IFN(x和IFN卩，是對細(xì)菌和病毒感染的免疫應(yīng)答中主要的作用因子。在這些感染后，I型干擾素的主要來源是漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(PDC)，一種外周血單核細(xì)胞的特殊亞群。PDC表達(dá)Toll樣受體TLR7和TLR9,且TLR7/TLR9剌激作用能活化PDC，并產(chǎn)生大量的I型干擾素。大量病原體來源的因子能選擇性地刺激不同的TLR。其中最典型的是脂多糖(LPS)，一種來自革蘭氏陰性細(xì)菌外膜的糖脂，其是TLR4的激動(dòng)劑。TLR2能識(shí)別脂磷壁質(zhì)酸(LTA)、肽聚糖(petidoglycan，PGN)和脂肽；TLR3能識(shí)別雙鏈RNA，一般是病毒來源的；TLR7能識(shí)別病毒單鏈RNA，而TLR9能識(shí)別未甲基化的CpG二核苷酸，一般在細(xì)菌和病毒DNA內(nèi)。TLR也能被多種合成的激動(dòng)劑刺激，例如對TLR3刺激的polyl:C(聚肌苷酸-聚胞苷酸(polysytidilicacid))，對TLR7刺激的咪唑并喹啉，如瑞喹莫德(resiquimod，R848)禾tl咪喹莫特(imiquimod)，和對TLR9刺激的富CpG寡核苷酸。闡明TLR信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)和TLR刺激細(xì)胞因子和趨化因子產(chǎn)生的調(diào)節(jié)機(jī)制，將為開發(fā)多種疾病和病癥(包括病毒和細(xì)菌疾病)的治療的治療方式提供途徑。哺乳動(dòng)物伴侶蛋白10(CpnlO),也稱為熱休克蛋白10(Hsp10)，一般與伴侶蛋白60(Cpn60;Hsp60)—起被典型地表征為參與蛋白質(zhì)折疊的線粒體"分子伴侶"蛋白。CpnlO是細(xì)菌蛋白GroES的同源物。GroES和CpnlO寡聚為7元環(huán)，作為蓋子結(jié)合在筒狀結(jié)構(gòu)上，該筒狀結(jié)構(gòu)包括14個(gè)GroEL或7個(gè)Hsp60分子，可將變性的蛋白束縛在復(fù)合體上。CpnlO也常常發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞表面上(Belles等人，1999,/w/e"/m"w"，67:4191-4200)和細(xì)胞外液中(Shin等人，2003，J5zb/C7zem，278:7607-7616)。但CpnlO也已經(jīng)在試驗(yàn)性自體免疫腦脊髓炎、遲發(fā)型超敏反應(yīng)和同種異體移植排斥模型中顯示具有免疫抑制活性(Zhang等人，2003,J7VeMra/212:37-46;Morton等人，2000,/www"o/Ce〃5/o/78:603-607)。以前，本發(fā)明人已經(jīng)證明在TLR4和TLR2激動(dòng)劑(分別為LPS和PAM3CysSIQ)的存在下，Cpn10能以劑量依賴的方式減少TLR4-禾口TLR2-刺激的NF-kB活化，減少TNF-a和RANTES分泌，同時(shí)增加IL-10分泌(Johnson等人，2005,/所o/C7^m280:4037-4047;國際專利申請第PCT/AU2005/000041號(hào)；WO2005/067959,其公開內(nèi)容引入本文作為參考)。發(fā)明人現(xiàn)在驚奇地發(fā)現(xiàn)Cpn10也能調(diào)節(jié)由TLR3、TLR7和TLR9引起的信號(hào)傳導(dǎo)。本文顯示Cpn10能在TLR3-特異性配體的存在下，劑量反應(yīng)性地增強(qiáng)IFNa和IFNP的產(chǎn)生，并在TLR7-和TLR9-特異性配體的存在下減少NF-kB活化。而且，本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)CpnlO，但不是Cpn60或GroES，與活化簇中的TLR在細(xì)胞表面處發(fā)生結(jié)合，從而使這些活化簇調(diào)節(jié)TLR信號(hào)傳導(dǎo)。
發(fā)明內(nèi)容根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了一種調(diào)節(jié)受試者或其至少一種細(xì)胞、組織或器官中Toll樣受體信號(hào)傳導(dǎo)的方法，其中所述的方法包括給予有效量的伴侶蛋白10，其中Toll樣受體信號(hào)傳導(dǎo)涉及伴侶蛋白10與活化簇中的Toll-樣受體之間的結(jié)合(association)。根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供了一種調(diào)節(jié)受試者或其至少一種細(xì)胞、組織或器官中Toll樣受體信號(hào)傳導(dǎo)的方法，其中所述的方法包括給予有效量的至少一種伴侶蛋白10的拮抗劑，其中Toll樣受體信號(hào)傳導(dǎo)涉及伴侶蛋白10與活化簇中的Toll-樣受體之間的結(jié)合，且其中所述拮抗劑阻止伴侶蛋白10與活化簇中的Toll樣受體發(fā)生結(jié)合，和/或阻止活化簇引起信號(hào)傳導(dǎo)?；罨乜晌挥诩?xì)胞表面上。活化簇可包括伴侶蛋白10、Toll樣受體和任選地至少一種其他分子。該至少一種其他分子可包括Toll-樣受體激動(dòng)劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，該活化簇包括伴侶蛋白10、TLR2和脂磷壁質(zhì)酸(LTA)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，該活化簇包括伴侶蛋白10、TLR3和雙鏈RNA。在另一個(gè)實(shí)施方式中，該活化簇包括伴侶蛋白10、TLR4和LPS。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，該活化簇包括伴侶蛋白10、TLR7和單鏈RNA。還在另一個(gè)實(shí)施方式中，該活化簇包括伴侶蛋白10、TLR9和包括CpG基序的DNA。伴侶蛋白10可以是天然來源的、重組產(chǎn)生的或合成產(chǎn)生的伴侶蛋白10。伴侶蛋白10可以是真核細(xì)胞來源的。伴侶蛋白10可以是人伴侶蛋白10。伴侶蛋白10可包括SEQIDNO:l、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3中所示的多肽序列。伴侶蛋白可以是乙?；幕蚍且阴；?。伴侶蛋白10可以以編碼伴侶蛋白10的多核苷酸形式給藥。編碼伴侶蛋白io的多核苷酸可位于基因構(gòu)建物中，可操作地與啟動(dòng)子連接。多核苷酸可包括SEQIDN0:4所示的序列。該方法可進(jìn)一步包括給予至少一種其他的藥劑。該藥劑可以是免疫調(diào)節(jié)劑。該免疫調(diào)節(jié)劑可以是I型干擾素，如IFNa或IFNI3。根據(jù)本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供了一種治療或預(yù)防受試者疾病或病癥的方法，其中所述方法包括給予受試者有效量的伴侶蛋白10，其中所述伴侶蛋白10與活化簇中的Toll-樣受體發(fā)生結(jié)合，且其中活化簇的形成與對該疾病或病癥的免疫應(yīng)答的啟動(dòng)、增強(qiáng)和/或維持有關(guān)。根據(jù)本發(fā)明的第四個(gè)方面，提供了一種治療或預(yù)防受試者病癥的方法，其中所述方法包括給予受試者有效量的至少一種伴侶蛋白10拮抗劑，其中所述拮抗劑阻止伴侶蛋白10與活化簇中的Toll樣受體發(fā)生結(jié)合，和/或阻止活化簇引起信號(hào)傳導(dǎo)，且其中活化簇的形成與該疾病或病癥的發(fā)生和/或進(jìn)展有關(guān)。疾病或病癥可選自病毒、真菌、酵母或細(xì)菌感染、急性或慢性炎性疾病，包括敗血性休克、炎性腸病、關(guān)節(jié)炎、銀屑病、心臟病、動(dòng)脈粥樣硬化、慢性肺病、惡病質(zhì)、多發(fā)性硬化癥、GVHD、和癌癥。在一個(gè)實(shí)施方式中，伴侶蛋白10調(diào)節(jié)LTA-誘導(dǎo)的TLR2信號(hào)傳導(dǎo)。伴侶蛋白10可調(diào)節(jié)TLR2-誘導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)劑的產(chǎn)生和/或分泌。在另一個(gè)實(shí)施方式中，伴侶蛋白10調(diào)節(jié)雙鏈RNA-誘導(dǎo)的TLR3信號(hào)傳導(dǎo)。伴侶蛋白10可調(diào)節(jié)TLR3-誘導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)劑的產(chǎn)生和/或分泌。在另一個(gè)實(shí)施方式中，伴侶蛋白10調(diào)節(jié)LPS-誘導(dǎo)的TLR4信號(hào)傳導(dǎo)。伴侶蛋白10可調(diào)節(jié)TLR4-誘導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)劑的產(chǎn)生和/或分泌。還在另一個(gè)實(shí)施方式中，伴侶蛋白10調(diào)節(jié)病毒單鏈RNA-誘導(dǎo)的TLR7信號(hào)傳導(dǎo)。伴侶蛋白10可調(diào)節(jié)TLR7-誘導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)劑的產(chǎn)生和/或分泌。還是在另一個(gè)實(shí)施方式中，伴侶蛋白10調(diào)節(jié)CpG基序誘導(dǎo)的TLR9信號(hào)傳導(dǎo)。伴侶蛋白10可調(diào)節(jié)TLR9-誘導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)劑的產(chǎn)生和/或分泌。伴侶蛋白io可以是天然來源的、重組產(chǎn)生的或合成產(chǎn)生的伴侶蛋白10。伴侶蛋白IO可以是真核細(xì)胞來源的。伴侶蛋白IO可以是人伴侶蛋白10。伴侶蛋白IO可包括SEQIDNO:I、SEQIDN0:2或SEQIDN0:3中所示的多肽序列。伴侶蛋白IO可以是乙?；幕蚍且阴；?。伴侶蛋白io可以以編碼伴侶蛋白IO的多核苷酸形式給藥。編碼伴侶蛋白io的多核苷酸可位于基因構(gòu)建物中，可操作地與啟動(dòng)子連接。多核苷酸可包括SEQIDNO:4所示的序列。該方法可進(jìn)一步包括給予至少一種其他的藥劑。該藥劑可以是免疫調(diào)節(jié)劑。該免疫調(diào)節(jié)劑可以是I型干擾素，如IFNa或IFNp。根據(jù)本發(fā)明的第五個(gè)方面，提供了一種用于治療或預(yù)防疾病或病癥的組合物，該組合物包括伴侶蛋白10以及至少一種藥學(xué)可接受的載體、稀釋劑或輔料，其中所述伴侶蛋白10與活化簇中的Toll樣受體發(fā)生結(jié)合，且其中活化簇的形成與對該疾病或病癥的免疫應(yīng)答的啟動(dòng)、增強(qiáng)和/或維持有關(guān)。該組合物可進(jìn)一步包括至少一種Toll樣受體激動(dòng)劑。該組合物可進(jìn)一步包括至少一種免疫調(diào)節(jié)劑，如I型干擾素。根據(jù)本發(fā)明的第六個(gè)方面，提供了一種用于治療或預(yù)防疾病或病癥的組合物，該組合物包括至少一種伴侶蛋白10拮抗劑，其中所述拮抗劑阻止伴侶蛋白10與活化簇中的Toll樣受體發(fā)生結(jié)合，和/或阻止活化簇引起信號(hào)傳導(dǎo)，且其中活化簇的形成與該疾病或病癥的發(fā)生和/或進(jìn)展有關(guān)。根據(jù)本發(fā)明的第七個(gè)方面，提供了伴侶蛋白io在制造用于治療或預(yù)防疾病或病癥的藥物中的應(yīng)用，其中所述伴侶蛋白10與活化簇中的Toll樣受體發(fā)生結(jié)合，且其中活化簇的形成與對該疾病或病癥的免疫應(yīng)答的啟動(dòng)、增強(qiáng)和/或維持有關(guān)。根據(jù)本發(fā)明的第八個(gè)方面，提供了伴侶蛋白io拮抗劑在制造用于治療或預(yù)防疾病或病癥的藥物中的應(yīng)用，其中所述拮抗劑阻止伴侶蛋白10與活化簇中的Toll樣受體發(fā)生結(jié)合，和/或阻止活化簇引起信號(hào)傳導(dǎo)，且其中活化簇的形成與該疾病或病癥的發(fā)生和/或進(jìn)展有關(guān)。根據(jù)本發(fā)明的第九個(gè)方面，提供了一種調(diào)節(jié)受試者或其至少一種細(xì)胞、組織或器官中一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑的產(chǎn)生和/或分泌的方法，其中所述方法包括給予有效量的伴侶蛋白10，其中所述伴侶蛋白10與活化簇中的Toll樣受體發(fā)生結(jié)合，且其中活化簇的形成與一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑的產(chǎn)生和/或分泌的調(diào)節(jié)有關(guān)。根據(jù)本發(fā)明的第十個(gè)方面，提供了一種調(diào)節(jié)受試者或其至少一種細(xì)胞、組織或器官中一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑的產(chǎn)生和/或分泌的方法，其中所述方法包括給予有效量的伴侶蛋白io拮抗劑，其中所述拮抗劑阻止伴侶蛋白10與活化簇中的Toll-樣受體發(fā)生結(jié)合，和/或阻止活化簇引起信號(hào)傳導(dǎo)，且其中活化簇的形成與一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑的產(chǎn)生和/或分泌的調(diào)節(jié)有關(guān)。上述免疫調(diào)節(jié)劑可以是，例如TNF-a、IL-1(3、IL-6、IL-IO、IL-12或I型干擾素。I型干擾素可以是IFNa或IFN(3。上述的方面和實(shí)施方式考慮了伴侶蛋白10的野生型和修飾形式以及全長伴侶蛋白IO多肽和其保留了免疫調(diào)節(jié)活性的片段或衍生物的應(yīng)用。定義在本說明書的上下文中，術(shù)語"包括"的含義是"主要包括，但不一定是唯一的"。而且術(shù)語"包括"的變化形式(例如單數(shù)形式(comprises)和復(fù)數(shù)形式(comprise))都具有相應(yīng)變化的含義。如本文所使用的術(shù)語"治療(treatment、treating)"及其變化形式是指無論以任何方式治療疾病狀態(tài)或癥狀，防止疾病形成，或另外防止、阻止、延緩、減輕或逆轉(zhuǎn)疾病或其他不良癥狀的進(jìn)展的任何和所有應(yīng)用。如本文中所使用的術(shù)語"有效量"的含義包括藥劑或化合物的用量無毒性但足以提供所需的治療或預(yù)防效應(yīng)。所需的確切用量在受試者之間將根據(jù)下列因素而發(fā)生變化例如要治療的物種、受試者的年齡和一般狀況、要治療的病癥的嚴(yán)重性、要被給藥的具體藥劑和給藥方式等等。因此，不可能規(guī)定確切的"有效量"。然而，對于任何指定的情況，一名本領(lǐng)域普通技術(shù)人員僅通過常規(guī)的試驗(yàn)就可確定合適的"有效量"。術(shù)語"多肽"是指由通過肽鍵連接在一起的氨基酸組成的聚合物。術(shù)語"多肽"和"蛋白"在本文中可互換使用，盡管對于本發(fā)明的目的，"多肽"可構(gòu)成全長蛋白的一部分。多肽也可包括但不限于其片段、類似物、變異體和衍生物。這些其片段、類似物、變異體和衍生物可與多肽都具有特定的結(jié)構(gòu)和域官能團(tuán)相似性。如本文中所使用的術(shù)語"多核苷酸"是指脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸堿基或已知的類似物或天然核苷酸的單鏈或雙鏈聚合物、或其混合物。多核苷酸的反向互補(bǔ)、和多核苷酸的片段、類似物、變異體和衍生物、以及與多核苷酸在高嚴(yán)格性條件下雜交的任何其他多核苷酸，都包括在術(shù)語"多核苷酸"的范圍內(nèi)。如本文中所使用的術(shù)語"調(diào)節(jié)(modulating、modulates)"及其變化體是指在本發(fā)明的特定調(diào)節(jié)分子或藥劑的存在下，與在缺少調(diào)節(jié)分子或藥劑的情況下分子的活性、產(chǎn)生、分泌或其其他功能水平相比，能增加或降低其活性、產(chǎn)生、分泌或功能水平。這些術(shù)語并沒有提示增加或減少的數(shù)量。調(diào)節(jié)作用可以是足以產(chǎn)生所需結(jié)果的任何程度，且可以是直接的或間接的。如本文中所使用的術(shù)語"免疫調(diào)節(jié)劑"包括但不限于由一種或多種細(xì)胞類型分泌的分子介質(zhì)，其在免疫應(yīng)答的啟動(dòng)、活化、維持、增強(qiáng)、成熟、抑制、遏制或增加中具有重要地位。如本文所使用的術(shù)語"活化簇"是指具有產(chǎn)生生物學(xué)信號(hào)功能的分子的群落。一般地，生物學(xué)信號(hào)可包括免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)，特別是可包括調(diào)節(jié)Toll樣受體信號(hào)傳導(dǎo)作為這種調(diào)節(jié)過程的一部分?；罨乜稍诶?，細(xì)胞的表面上或內(nèi)體(endosome)內(nèi)結(jié)合，且可包括，例如伴侶蛋白10以及Toll樣受體激動(dòng)劑和Toll樣受體。其他分子也可作為活化簇的一部分結(jié)合，包括但不限于CD14。本發(fā)明現(xiàn)在通過非限制性實(shí)施例參考附圖進(jìn)行描述。圖1.在用100嗎/mlpolyl:C刺激23小時(shí)后并加入10-200嗎/ml重組人Cpnl0預(yù)刺激2小時(shí)，IFN(3(pg/ml)分泌進(jìn)入RAW264.7細(xì)胞的上清液中。顯示的結(jié)果來自兩次試驗(yàn)。圖2.在用100ng/ml再純化的LPS或100昭/mlpolyl:C刺激后，并加入10-100昭/ml重組人CpnlO預(yù)刺激2小時(shí)，I型干擾素(lU/ml)分泌進(jìn)入RAW264.7細(xì)胞的上清液中。圖3.在存在(空心正方形)或不存在(實(shí)心正方形)50jig/ml重組人CpnlO(與激動(dòng)劑同時(shí)加入)的情況下，用TLR7/TLR4表達(dá)構(gòu)建物和NF-kb-螢光素酶報(bào)告子構(gòu)建物轉(zhuǎn)染后，HEK293細(xì)胞中的NF-kB活化(x-倍)。細(xì)胞用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA;蛋白激酶C活化劑)、R848(R848;TLR7激動(dòng)劑)、CpG寡核苷酸(CpG;TLR9激動(dòng)劑)或再純化的脂多糖(LPS;TLR4激動(dòng)劑)刺激。圖4.在存在(空心正方形)或不存在(實(shí)心正方形)50pg/ml重組人CpnlO(與激動(dòng)劑同時(shí)加入)時(shí)，用TLR9表達(dá)構(gòu)建物和NF-kB-螢光素酶報(bào)告子構(gòu)建物轉(zhuǎn)染后，HEK293細(xì)胞中的NF-kB活化(x-倍)。細(xì)胞用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA;蛋白激酶C活化劑)、R848(R848;TLR7激動(dòng)劑)、CpG寡核苷酸(CpG;TLR9激動(dòng)劑)或再純化的脂多糖(LPS;TLR4激動(dòng)劑)刺激。顯示了兩個(gè)單獨(dú)克隆的結(jié)果(A和B)。圖5.在CpGDNA(CpnlO與激動(dòng)劑同時(shí)加入)的存在下，重組人CpnlO濃度(12.5|ig/ml、25|ig/ml、50嗎/ml和100(ig/ml)對用TLR9表達(dá)構(gòu)建物和NF-kb-螢光素酶報(bào)告子構(gòu)建物轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中NF-kB活化的作用(顯示為A，熒光素酶單位和B，相對熒光素酶單位)。圖6.A.用再純化的脂多糖(LPS)刺激，并在不同濃度(1叱/ml、10嗎/ml或50嗎/ml)的重組人CpnlO(與激動(dòng)劑同時(shí)加入)的存在下或不存在CpnlO時(shí)，從人外周血單核細(xì)胞(PBMC)中的TNF-a釋放(ng/ml)。B.如A—樣，不同之處是首先將PBMC消耗掉漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(PDC)。圖7.A.用再純化的脂多糖(LPS)刺激，并在不同濃度(1嗎/ml、10昭/ml或50嗎/ml)的重組人CpnlO存在下或不存在CpnlO時(shí)，從人外周血單核細(xì)胞(PBMC)中的IL-10釋放(ng/ml)。B.如A—樣，不同之處是首先將PBMC消耗掉漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(PDC)。圖8.在RAW264-pNifty2-LUC細(xì)胞系中，CpnlO不通過Poly(I:C)降低NF-KB活化。圖9.CpnlO劑量反應(yīng)性地促進(jìn)被LPS(主要是IFN-卩)或Poly(I:C)(主要是IFN-a)刺激24小時(shí)的RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生I型IFN。圖10.CpnlO以轉(zhuǎn)錄水平劑量反應(yīng)性地促進(jìn)被Poly(I:C)刺激的RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生IFN|3。在用LPS剌激的RAW264.7細(xì)胞中也見到在CpnlO存在下IFN卩的增效作用。圖11.來自兩個(gè)用50昭/mlPoly(I:C)刺激的不同供體的人PBMC，在CpnlO的存在下產(chǎn)生增加水平的IFN-a。圖12.CpnlO但不是GroES，在Poly(I:C)-誘導(dǎo)的IFN-(3中誘導(dǎo)劑量反應(yīng)性的增加。圖13.CpnlO預(yù)孵育然后洗滌，減少在Poly(I:C)-誘導(dǎo)的IFN-卩的產(chǎn)生中的CpnlO劑量反應(yīng)性的增加。圖14.CpnlO不增強(qiáng)來自IFNARW-小鼠的BMM中的IFN卩反應(yīng)。圖15.巨噬細(xì)胞通過I型干擾素通路的啟動(dòng)需要CpnlO對TLR4反應(yīng)的調(diào)節(jié)(n=2)。圖16.用LPS誘導(dǎo)全身炎癥的小鼠中血清TNFa和IFN卩水平。圖17.用SFV感染的6-9天齡新生C57BL/6小鼠的存活率。6-9天齡新生C57BL/6小鼠的使用如下A組SFV(n=13);B組SFV+CpnlO20嗎(n=13);C組SFV+CpnlO50嗎(n=13)。B組和C組腹腔注射20和50嗎Cpn10，然后(3小時(shí)后)對所有三組注射50piSFV(30xTCID50)。根據(jù)所示的圖例對存活率進(jìn)行作圖。圖18.通過熱休克(HS)刺激和TLR刺激誘導(dǎo)CpnlO啟動(dòng)子。代表性化驗(yàn)證明熱休克復(fù)原6小時(shí)能顯著地誘導(dǎo)CpnlO啟動(dòng)子活性，然后HS后18小時(shí)恢復(fù)至基線水平(n=2次重復(fù)化驗(yàn))(A)。相反，用LTA(TLR2激動(dòng)劑)刺激，通過24小時(shí)的刺激產(chǎn)生2.7-倍的啟動(dòng)子誘導(dǎo)，并在30小時(shí)時(shí)保持恒定(A)。用TLR2(B、C)、TLR7(D、E)或TLR9(F、G)配體滴定刺激細(xì)胞，以劑量依賴性方式誘導(dǎo)CpnlO啟動(dòng)子(n=2-6次重復(fù))。C、E禾卩G中所示的數(shù)據(jù)所示的數(shù)據(jù)反映與B、D和F中相同的數(shù)據(jù)，但表現(xiàn)為基線上的倍數(shù)變化。誤差棒表示為均數(shù)的一個(gè)SD。TLR激動(dòng)劑和細(xì)胞因子誘導(dǎo)CpnlO啟動(dòng)子的最高水平不同(H)。對于每種激動(dòng)劑，CpnlO啟動(dòng)子活性表示為以基線水平標(biāo)準(zhǔn)化的螢光素酶cps。最佳的激動(dòng)劑濃度和化驗(yàn)重復(fù)次數(shù)TLR2:枯草芽孢桿菌LTA100(ig/ml，n=12;TLR3:100昭/mlpoly(I:C)，n=6;TLR4:超純大腸桿菌LPS10ng/ml，n=12;TLR7:咪喹莫特R83710嗎/ml，n=2;TLR9，CpGODN1mM，n=2;IFN丫1ng/ml，n=3，IL-1卩(1ng/ml)，n=2，TNF-a(100ng/ml)，n=2(H)。用ANOVA來評價(jià)(A)的顯著性(p<0.02)禾卩(F)的顯著性(p<0.05)，并表示為氣cps二每秒計(jì)數(shù)。在用LTA刺激的未轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞中，通過實(shí)時(shí)PCR(I)測量CpnlOmRNA水平暫時(shí)的濃度依賴性的增加。用對照看家基因(18S和Pbgd)對基因表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。圖19.TLR激動(dòng)劑和熱休克誘導(dǎo)CpnlO產(chǎn)生，但僅使用TLR激動(dòng)劑引起CpnlO的細(xì)胞外釋放。通過ELISA對LTA-刺激的RAW264.7全細(xì)胞溶胞產(chǎn)物進(jìn)行定量分析，顯示處理細(xì)胞與對照細(xì)胞之間CpnlO水平變化很小(A)，但培養(yǎng)上清液的分析證明在100叱/mlLTA刺激30小時(shí)后細(xì)胞外CpnlO增加3-倍(B)。上清液CpnlO用每孔的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。時(shí)程分析證明持續(xù)的CpnlO啟動(dòng)子活化超過30小時(shí)，作為對TLR2結(jié)合的反應(yīng)。根據(jù)樣品蛋白濃度對結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(C)。RAW264.7細(xì)胞的輕度、中度或重度熱休克不能誘導(dǎo)CpnlO的細(xì)胞外釋放(D)。在RA患者的循環(huán)血液中的CpnlO水平顯著高于MS或銀屑病患者或健康對照受試者。通過單側(cè)ANOVA采用Tukey事后檢驗(yàn)分析顯著性，并表示為^pO.01)或"(P〈0.001)(E)。圖20.CpnlO限制激動(dòng)劑經(jīng)多個(gè)TLR誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)。用HIV-LTR-LUC啟動(dòng)子構(gòu)建物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的RAW264.7細(xì)胞，在用多種TLR配體刺激之前與CpnlO預(yù)孵育，導(dǎo)致抑制了這些細(xì)胞中的螢光素醇活性(NF-kB活化的指標(biāo))(A)。激動(dòng)劑濃度和孵育時(shí)間為CpGODN16.25(ig/ml，4h;咪喹莫特10}ig/ml，2h;poly(I:C)100昭/ml,4h;酵母多糖10pg/ml,2h;PGN10|ig/ml,2h;PGN10叱/ml，2h;超純LPS10ng/ml，2h;LPS5ng/ml，2h。RAW264.7細(xì)胞(B、C)或人PBMC(D)與CpnlO預(yù)孵育，然后進(jìn)行LPS刺激(RAW264.7細(xì)胞中為10ng/ml，PBMC中為100ng/ml)引起磷酸化MAPK信號(hào)水平的劑量反應(yīng)性降低。人PBMC用TLRs2、2/6、4、7、9的配體在CpnlO的存在下刺激，引起TNF-a、IL-ip、IL-6和IL-10水平的降低，并增加咪喹莫特-和CpGODN-誘導(dǎo)的IFNa產(chǎn)生(E)。使用的配體濃度為10嗎/mlPGN、10}ig/mlLTA、10|ig/ml酵母多糖、0.12ng/mlLPS、6.5|ig/mlCpGODN、10昭/ml咪喹莫特。圖21.在懸液中生長的RAW264細(xì)胞在100ng/mlCpnlO或等體積的稀釋緩沖液的存在下孵育4小時(shí)，然后染色以證明TLR4的存在。圖22.在懸液中生長的RAW264細(xì)胞在100|ig/mlCpnlO或等體積的稀釋緩沖液的存在下，與或不與2ng/mlLPS(在CpnlO處理的后2小時(shí)加入)孵育4小時(shí)，然后染色以證明TLR4的存在。圖23.在懸液中生長的RAW264細(xì)胞在100嗎/mlCpnlO或等體積的稀釋緩沖液的存在下，與或不與20ng/mlLPS(在CpnlO處理的后2小時(shí)加入)孵育4小時(shí)，之后進(jìn)行TLR4染色。(平均熒光強(qiáng)度橙色:4.39，黑色6.14，藍(lán)色25)圖24.在懸液中生長的RAW264細(xì)胞在100|ig/mlCpnlO或等體積的稀釋緩沖液的存在下，與或不與2ng/mlLPS(在CpnlO處理的后2小時(shí)加入)孵育過夜，然后進(jìn)行TLR4染色。平均熒光強(qiáng)度藍(lán)色-25，紅色-33，橙色-11.7，黑色-20。圖25.在懸液中生長的RAW264細(xì)胞在100pg/mlCpnlO或等體積的稀釋緩沖液的存在下，與或不與20ng/mlLPS(在CpnlO處理的后2小時(shí)加入)孵育過夜，然后進(jìn)行TLR4染色。(平均熒光強(qiáng)度橙色3.9，黑色7.9)圖26.代表性的TLR配體、和CpnlO對螢光素酶活性的抑制。A、C、E、G、I中的數(shù)據(jù)描繪了CPS中的螢光素酶單位，而B、D、F、H、J是用LPS刺激的RAW264-HIV-LTR-LUC細(xì)胞中螢光素酶活性的抑制百分比表示這些數(shù)據(jù)。圖27.由大量TLR配體刺激的HIV-LTR活化的最大CpnlO誘導(dǎo)的抑制，作為NF-KB活化的間接指標(biāo)。圖28.在用LPS刺激30分鐘的細(xì)胞中，CpnlO劑量反應(yīng)性地降低磷酸化的p38(A)、ERK1/2和JNK1/2(B)的水平。如對鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7所示，在新鮮分離的人PBMC中，CpnlO劑量反應(yīng)性地降低LPS-誘導(dǎo)的p38、ERK1/2禾BJNK1/2磷酸化的水平(C)。由于MAP激酶通路的活化與誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生的炎性級聯(lián)反應(yīng)密切相關(guān)，因此這些數(shù)據(jù)顯示CpnlO-介導(dǎo)的配體誘導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生的變化來自TLR信號(hào)級聯(lián)反應(yīng)中的變化。圖29.用TLR2(PGN，LTA)、TLR2,6(酵母多糖)、TLR4(LPS)、TLR7(咪喹莫特)或TLR9(CpGODN2216)的配體在CpnlO的存在下刺激人PBMC，導(dǎo)致細(xì)胞因子的產(chǎn)生減少。圖30.CpnlO預(yù)孵育然后洗滌，然后加入LPS仍然以劑量反應(yīng)性方式限制NF-kB的活化。圖31.CpnlO預(yù)孵育，然后用IFN-y刺激6小時(shí)，導(dǎo)致RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-a增加。圖32.CpnlO結(jié)合分子的SDS-PAGE分析。與CpnlO親和柱結(jié)合并從中洗脫的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物蛋白的SDS-PAGE凝膠。圖33.CpnlO結(jié)合分子的2D凝膠電泳。與CpnlO親和柱結(jié)合并從中洗脫的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物蛋白的2D凝膠。圖34.RAW264(A)和HeLa細(xì)胞(B)中三天內(nèi)PolyI:C的毒性曲線。圖35.在RAW264(A)禾卩HeLa細(xì)胞(B)中三天內(nèi)CpnlO對PolyI:C的影響。圖36.CpnlO在細(xì)胞表面與人抗原遞呈細(xì)胞相互作用，并內(nèi)吞至內(nèi)吞溶酶體小室內(nèi)。純化的PBMC與熒光基團(tuán)交聯(lián)的CpnlO在4°C下孵育10分鐘，通過流式細(xì)胞儀測量表面熒光(A)。CpnlO與mDC和pDC的聯(lián)合最為密切，且單核細(xì)胞顯示在LTA剌激4小時(shí)后熒光CpnlO的結(jié)合增加(B)。RAW264.7細(xì)胞和純化的人pDC與熒光CpnlO在37°C下孵育30分鐘，然后進(jìn)行共聚焦成像。與線粒體和酸性小室的熒光標(biāo)志物共孵育顯示CpnlO內(nèi)吞入內(nèi)吞溶酶體小室內(nèi)(C)。野生型人CpnlO(GenBank登記號(hào)X75821)的氨基酸序列提供在SEQIDNO:l中。CpnlO的兩種修飾形式的氨基酸序列，其在N-末端處具有額外的氨基酸殘基，提供在SEQIDNO:2和3中。其編碼核苷酸序列提供在SEQIDNO:4中。在本文中公開的實(shí)施例中使用的寡核苷酸引物提供在SEQIDNO:5-10中。以前己經(jīng)顯示CpnlO能降低細(xì)胞培養(yǎng)物和體內(nèi)致炎細(xì)胞因子如TNF-a和RANTES的產(chǎn)生(參見，例如Johnson等人，2005,JS/o/C&m280:4037-4047和國際專利申請PCT/AU2005/000041，WO2005/067959,這些公開內(nèi)容引入本文作為參考)。這些發(fā)現(xiàn)支持使用CpnlO作為治療藥劑以治療各種炎性疾病，包括，例如，多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和移植物抗宿主疾病。調(diào)節(jié)Toll樣受體信號(hào)傳導(dǎo)和免疫調(diào)節(jié)劑產(chǎn)生的方法如本文所公開，本發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)證明人Cpn10當(dāng)與TLR3激動(dòng)劑poIyl:C—起給藥時(shí)，會(huì)顯著地協(xié)同性地增加IFN卩和IFNa的產(chǎn)生。另外，通過測量到NF-kB活化的減少，還證明Cpn10能經(jīng)TLR7和TLR9調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)。而且，本發(fā)明人已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)在用LPS刺激后，Cpn10，但不是Cpn60或GroES，與TLR4在細(xì)胞表面上以"活化簇"的形式發(fā)生聯(lián)合。本發(fā)明人進(jìn)一步顯示在用脂磷壁質(zhì)酸(LTA)刺激后Cpn10與TLR2發(fā)生聯(lián)合，在用病毒單鏈RNA和/或咪喹莫特刺激后與TLR7發(fā)生聯(lián)合，以及用CpGDNA刺激后與TLR9發(fā)生聯(lián)合。在每種情況下，這種聯(lián)合的形式都是Cpn10與"活化簇"發(fā)生相互作用，該"活化簇"包括特定的TLR及其激動(dòng)劑。因此，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)受試者或其至少一種細(xì)胞、組織或器官中Toll樣受體信號(hào)傳導(dǎo)的方法，其中所述方法包括給予有效量的伴侶蛋白10，其中Toll樣受體信號(hào)傳導(dǎo)涉及伴侶蛋白lO與活化簇中的Toll-樣受體之間的聯(lián)合。Toll樣受體信號(hào)傳導(dǎo)也可通過下列的方式來調(diào)節(jié)給予有效量的至少一種伴侶蛋白10的拮抗劑，其中Toll樣受體信號(hào)傳導(dǎo)涉及伴侶蛋白10與活化簇中的Toll-樣受體之間的聯(lián)合，且其中所述拮抗劑阻止伴侶蛋白10與活化簇中的Toll樣受體發(fā)生聯(lián)合，和/或阻止活化簇引起信號(hào)傳導(dǎo)?；罨乜晌挥诩?xì)胞表面上或例如內(nèi)含體的細(xì)胞囊泡的表面上?；罨乜砂ò閭H蛋白10、Toll樣受體和任選至少一種其他的分子。該至少一種其他分子可包括Toll樣受體激動(dòng)劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，該活化簇包括伴侶蛋白10、TLR2和脂磷壁質(zhì)酸(LTA)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，該活化簇包括伴侶蛋白10、TLR3和雙鏈RNA。在另一個(gè)實(shí)施方式中，該活化簇包括伴侶蛋白10、TLR4和LPS。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，該活化簇包括伴侶蛋白10、TLR7和單鏈RNA。還在另一個(gè)實(shí)施方式中，該活化簇包括伴侶蛋白10、TLR9和包括CpG基序的DNA。伴侶蛋白IO可以是天然來源的、重組產(chǎn)生的或合成產(chǎn)生的伴侶蛋白10。伴侶蛋白IO可以是真核細(xì)胞來源的。伴侶蛋白IO可以是人伴侶蛋白10。伴侶蛋白10可包括SEQIDNO:l、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3中所示的多肽序列。伴侶蛋白10可以是乙酰化的或非乙?；?，且可以包括或不包括單個(gè)或多個(gè)N-末端延伸。伴侶蛋白10可以以編碼伴侶蛋白10的多核苷酸形式給藥。編碼伴侶蛋白10的多核苷酸可位于基因構(gòu)建物中，可操作地與啟動(dòng)子連接。多核苷酸可包括SEQIDNO:4所示的序列。該方法進(jìn)一步包括給予至少一種其他的藥劑。該藥劑可以是免疫調(diào)節(jié)劑。該免疫調(diào)節(jié)劑可以是，例如，TNF-a、IL-1(3、IL-6、IL-10、IL-12或I型干擾素。I型干擾素可以是IFNa或IFN(3。一般地，CpnlO的調(diào)節(jié)活性是通過下列方式發(fā)揮的首先是TLR與Cpnl0接觸，然后加入一種或多種TLR激動(dòng)劑，如本發(fā)明人和本文公開內(nèi)容(例如，涉及RAW264.7細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)試驗(yàn)的相關(guān)內(nèi)容)所證明的那樣。激動(dòng)劑可以是細(xì)菌、真菌、酵母或病毒病原體、從其衍生的或由此產(chǎn)生的分子或成分或成分或合成的化合物。該TLR激動(dòng)劑也可以是來自與自體免疫性疾病有關(guān)的人類損傷細(xì)胞的產(chǎn)物，如對于TLR9，其實(shí)例是人DNA作為激動(dòng)劑。TLR3激動(dòng)劑的非限制性實(shí)例包括雙鏈RNA和polyl:C。TLR7激動(dòng)劑的非限制性實(shí)例包括單鏈RNA、例如瑞喹莫德和咪喹莫特的咪唑并喹啉、以及例如艾沙托立賓(isatoribine)的小分子激動(dòng)劑。TLR9激動(dòng)劑的非限制性實(shí)例包括含有未甲基化的富CpG基序的DNA和合成的包括CpG的寡核苷酸。但本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易地理解本發(fā)明不限于這些完全相同的TLR激動(dòng)。本發(fā)明也提供了調(diào)節(jié)受試者或其至少一種細(xì)胞、組織或器官中一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑的產(chǎn)生和/或分泌的方法，其中所述方法包括給予有效量的伴侶蛋白IO，其中所述伴侶蛋白lO與活化簇中的Toll樣受體發(fā)生聯(lián)合，且其中活化簇的形成與調(diào)節(jié)一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑的產(chǎn)生和/或分泌有關(guān)。一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑的產(chǎn)生和/或分泌的調(diào)節(jié)也可通過下列的方法來達(dá)到給予有效量的伴侶蛋白IO拮抗劑，其中所述拮抗劑阻止伴侶蛋白10與活化簇中的Tdl-樣受體發(fā)生聯(lián)合，和/或阻止活化簇引起信號(hào)傳導(dǎo)，且其中活化簇的形成與調(diào)節(jié)一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑的產(chǎn)生和/或分泌有關(guān)。免疫調(diào)節(jié)劑可以是，例如，TNF-a、IL-ip、IL-6、IL-IO、IL-12或I型干擾素。I型干擾素可以是IFNa或IFN(3。治療或預(yù)防疾病的方法在本文中所提供的本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)支持CpnlO在臨床處理各種疾病和病癥中的應(yīng)用，這些疾病和病癥包括急性和慢性病毒和細(xì)菌性疾病。因此，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防由病毒或細(xì)菌感染引起的或與病毒或細(xì)菌感染相關(guān)的病毒和細(xì)菌性疾病和功能障礙的方法，該方法包括給予CpnlO。另外，TLR3、TLR7禾n/或TLR9的刺激與對多種其他疾病的自然反應(yīng)和/或治療性處理有關(guān)，這些疾病包括哮喘、過敏癥、炎性腸病和全身性炎癥。因此本發(fā)明也涉及治療或預(yù)防這些疾病和功能障礙的方法，該方法包括給予CpnlO。因此，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防受試者的疾病或病癥的方法，其中所述的方法包括給予受試者有效量的伴侶蛋白10，其中該伴侶蛋白10與活化簇中的Toll樣受體發(fā)生聯(lián)合，且其中活化簇的形成與對該疾病或病癥的免疫應(yīng)答的啟動(dòng)、增強(qiáng)和/或維持有關(guān)。所述方法也可包括給予受試者有效量的至少一種伴侶蛋白10拮抗劑，其中所述拮抗劑阻止伴侶蛋白10與活化簇中的Toll樣受體發(fā)生聯(lián)合，和/或阻止活化簇引起信號(hào)傳導(dǎo)，且其中活化簇的形成與該疾病或病癥的發(fā)生和/或進(jìn)展有關(guān)。上述疾病或病癥可包括但不限于，病毒、真菌、酵母或細(xì)菌感染、急性或慢性炎性疾病包括敗血性休克、炎性腸病、關(guān)節(jié)炎、銀屑病、心臟病、動(dòng)脈粥樣硬化、慢性肺病、惡病質(zhì)、多發(fā)性硬化癥、GVHD、和癌癥。任何疾病或病癥，其發(fā)生和/或進(jìn)展、或針對其的免疫應(yīng)答的啟動(dòng)、增強(qiáng)和/或維持涉及伴侶蛋白lO與活化簇中Toll樣受體的聯(lián)合，都被考慮在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方式中，伴侶蛋白10調(diào)節(jié)LTA-誘導(dǎo)的TLR2信號(hào)傳導(dǎo)。伴侶蛋白10可調(diào)節(jié)TLR2-誘導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)劑的產(chǎn)生和/或分泌。在另外一個(gè)實(shí)施方式中，伴侶蛋白10調(diào)節(jié)雙鏈RNA-誘導(dǎo)的TLR3信號(hào)傳導(dǎo)。伴侶蛋白10可調(diào)節(jié)TLR3-誘導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)劑的產(chǎn)生和/或分泌。在另一個(gè)實(shí)施方式中，伴侶蛋白10調(diào)節(jié)LPS-誘導(dǎo)的TLR4信號(hào)傳導(dǎo)。伴侶蛋白10可調(diào)節(jié)TLR4-誘導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)劑的產(chǎn)生和/或分泌。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，伴侶蛋白10調(diào)節(jié)病毒單鏈RNA誘導(dǎo)的TLR7信號(hào)傳導(dǎo)。伴侶蛋白10可調(diào)節(jié)TLR7-誘導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)劑的產(chǎn)生和/或分泌。還是在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，伴侶蛋白10調(diào)節(jié)CpG基序誘導(dǎo)的TLR9信號(hào)傳導(dǎo)。伴侶蛋白10可調(diào)節(jié)TLR9-誘導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)劑的產(chǎn)生和/或分泌。組合物及其應(yīng)用本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防疾病或病癥的組合物，該組合物包括伴侶蛋白IO以及至少一種藥學(xué)可接受的載體、稀釋劑或輔料，其中所述伴侶蛋白lO與活化簇中的Toll樣受體發(fā)生聯(lián)合，且其中活化簇的形成與對該疾病或病癥的免疫應(yīng)答的啟動(dòng)、增強(qiáng)和/或維持有關(guān)。該組合物可進(jìn)一步包括至少一種Toll樣受體激動(dòng)劑。該組合物可進(jìn)一步包括至少一種免疫調(diào)節(jié)劑，如I型干擾素。用于治療或預(yù)防疾病或病癥的其他組合物，該組合物包括至少一種伴侶蛋白IO拮抗劑，其中所述拮抗劑阻止伴侶蛋白IO與活化簇中的Toll樣受體發(fā)生聯(lián)合，和/或阻止活化簇引起信號(hào)傳導(dǎo)，且其中活化簇的形成與該疾病或病癥的發(fā)生和/或進(jìn)展有關(guān)。本發(fā)明也考慮了伴侶蛋白IO在制造用于治療或預(yù)防疾病或病癥的藥物中的應(yīng)用，其中所述伴侶蛋白lO與活化簇中的Toll樣受體發(fā)生聯(lián)合，且其中活化簇的形成與對該疾病或病癥的免疫應(yīng)答的啟動(dòng)、增強(qiáng)和/或維持有關(guān)。本發(fā)明也考慮了伴侶蛋白io拮抗劑在制造用于治療或預(yù)防疾病或病癥的藥物中的應(yīng)用，其中所述拮抗劑阻止伴侶蛋白IO與活化簇中的Toll樣受體發(fā)生聯(lián)合，和/或阻止活化蔟引起信號(hào)傳導(dǎo)，且其中活化簇的形成與該疾病或病癥的發(fā)生和/或進(jìn)展有關(guān)。通常，在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的合適組合物可根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知曉的方法和步驟來進(jìn)行制備，因此可包括藥學(xué)可接受的載體、稀釋劑和/或輔料。聯(lián)合治療本領(lǐng)域中的技術(shù)人員會(huì)理解，根據(jù)本發(fā)明的方法，CpnlO可單獨(dú)或與一種或多種其他的藥劑結(jié)合給藥。例如，CpnlO可與一種或多種能剌激TLR2、TLR3、TLR4、TLR7和TLR9中的一個(gè)或多個(gè)的TLR激動(dòng)劑一起給藥。另外，本發(fā)明考慮了使用CpnlO與其他的治療方法結(jié)合以治療疾病和功能障礙的聯(lián)合治療。例如，CpnlO可用于治療病毒性疾病，該疾病對I型干擾素(如IFNp或IFNa)的治療有反應(yīng)。另外，由于以前有報(bào)道激動(dòng)劑誘導(dǎo)的TLR7和TLR9的活化能增強(qiáng)腫瘤對放射治療的反應(yīng)，因此CpnlO可與放射治療結(jié)合用于治療癌癥。對于這種聯(lián)合治療，聯(lián)合治療的每種組分可在同一時(shí)間給藥，或以任何次序連續(xù)給藥，或在不同時(shí)間給藥，以便得到所需的效應(yīng)?；蛘?，這些組分可在單一劑量單位中配制在一起作為組合產(chǎn)物。當(dāng)單獨(dú)給藥時(shí)，這些組分可優(yōu)選通過相同的給藥途徑給藥，盡管并不需要那么去做。CpnlO根據(jù)本發(fā)明的各個(gè)方面和實(shí)施方式，對需要治療的受試者給予有效量的CpnlO。在特殊的實(shí)施方式中，要被治療的受試者是人，且因此，CpnlO多肽是人CpnlO多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員將要理解的是，根據(jù)本發(fā)明所使用的CpnlO的準(zhǔn)確同源性可根據(jù)許多因素而發(fā)生變化，例如要被治療的物種，這樣選擇的CpnlO可來源于要被治療的物種。CpnlO—般是重組CpnlO。Morton等人，2000(/附m柳o/CW/所o/78:603-607),Ryan等人，1995(J所o/270:22037-22043)和Johnson等人，2005C/7ew280:4037-4047)中描述的方法是重組CpnlO蛋白的合適生產(chǎn)方法的實(shí)例，盡管技術(shù)人員將理解本發(fā)明并不限于所使用的純化或生產(chǎn)方法，且任何其他的方法可用來生產(chǎn)用于根據(jù)本發(fā)明的方法和本發(fā)明的組合物的CpnlO。根據(jù)本發(fā)明使用的CpnlO多肽和肽片段可使用標(biāo)準(zhǔn)的重組核酸技術(shù)來獲得，或例如使用傳統(tǒng)的液相或固相合成技術(shù)來合成?？捎靡环N或多種蛋白酶，如endoLys-C、endoArg-C、endoGlu-C和葡萄球菌V8-蛋白酶，消化多肽來產(chǎn)生CpnlO肽。已消化的肽片段可通過例如高效液相色譜(HPLC)技術(shù)來純化。本發(fā)明的實(shí)施方式也考慮了編碼CpnlO的多核苷酸的給藥。在這種情況下，多核苷酸一般可操作地與啟動(dòng)子連接，這樣在將多核苷酸給予受試者后產(chǎn)生合適的多肽序列。多核苷酸可在載體中給予受試者。載體可以是質(zhì)粒載體、病毒載體或適合用于插入外源序列的任何其他合適的載體，這些載體導(dǎo)入至真核細(xì)胞中并表達(dá)被導(dǎo)入的序列。一般載體是真核表達(dá)載體，且可包括表達(dá)控制和加工序列，如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、多腺苷酸化信號(hào)和轉(zhuǎn)錄終止序列。要給藥的核酸構(gòu)建物可包括裸露的DNA或可以是組合物的形式，結(jié)合以一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。CpnlO多肽可以具有，但不限于，如SEQIDN0:1所示的氨基酸序列。編碼CpnlO的多核苷酸的核苷酸序列可以是如SEQIDN0:4所示、或顯示與其足夠的序列同源性而與SEQIDNO:4的序列雜交。在另外可選的實(shí)施方式中，多核苷酸的核苷酸序列可與SEQIDNO:4中所示的序列具有至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、96%、97%、98%或99%的同源性。包括在本文所使用的術(shù)語"多肽"和"多核苷酸"的范圍內(nèi)的還有其片段和變異體。僅作為實(shí)例，如WO95/15338中所述的Cpnl0的肽片段可用于根據(jù)本發(fā)明的各個(gè)方面和實(shí)施方式中。術(shù)語"片段"是指編碼全長Cpn10蛋白的組成部分或作為全長Cpn10蛋白的組成部分的核酸或多肽序列。就多肽而言，片段具有與全長蛋白性質(zhì)相同的生物學(xué)活性。根據(jù)本發(fā)明使用的Cpn10的生物學(xué)活性片段可典型地具有至少大約50%的相應(yīng)全長蛋白的免疫調(diào)節(jié)活性，更典型地具有至少大約60%的這種活性，更典型地至少大約70%的這種活性，更典型地至少大約80°/。的這種活性，更典型地至少大約卯％的這種活性，和更典型地至少大約95%的這種活性。本文所使用的術(shù)語"變異體"是指基本上相似的分子。通常，核酸序列變異體編碼的多肽具有性質(zhì)上相同的生物學(xué)活性。通常，多肽序列變異體也具有性質(zhì)上相同的生物學(xué)活性。此外，這些多肽序列變異體還可具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99°/。的序列同源性。而且，多肽變異體可包括類似物，其中術(shù)語"類似物"所指的多肽是CpnlO的衍生物，衍生物包括添加、去除、置換一個(gè)或多個(gè)氨基酸，這樣該多肽保留了與天然CpnlO基本上相同的功能。本領(lǐng)域公知的是多肽內(nèi)的一些氨基酸可被改變而不改變多肽的活性(保守置換)。術(shù)語"保守氨基酸置換"是指在多肽鏈內(nèi)(蛋白的基本序列)，一個(gè)氨基酸置換或替換為具有相似特性的另一個(gè)氨基酸。例如，帶電荷的氨基酸谷氨酸(Glu)置換為帶類似電荷的氨基酸天冬氨酸(Asp)將是保守氨基酸置換。氨基酸添加可來自CpnlO多肽或其片段與第二種多肽或肽的融合，如多組氨酸標(biāo)記、麥芽糖結(jié)合蛋白融合、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶融合、綠色熒光蛋白融合、或加入例如FLAG或c-myc的表位標(biāo)記。例如，野生型人CpnlO多肽可包括N-末端處的附加GSM三肽部分(SEQIDN0:2;參見，例如WO95/15338，其公開內(nèi)容引入本文作為參考)或N-末端處的附加丙氨酸(A)殘基(SEQIDNO:3;WO2004/041300，其公開內(nèi)容引入本文作為參考)。CpnlO的其他突變形式包括在澳大利亞臨時(shí)專利申請第2005904765號(hào)中公開的那些，該申請的公開內(nèi)容引入本文作為參考。本發(fā)明也考慮了編碼CpnlO的這些修飾形式的CpnlO的多核苷酸的應(yīng)用。CpnlO變異體可通過CpnlO蛋白的誘變或編碼核酸的誘變來產(chǎn)生，例如使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法通過隨機(jī)誘變或定點(diǎn)誘變。這些方法可見于，例如"分子生物學(xué)的通用方法(CwreW/VotocoAy/"Afo/ecw/ar所o/ogy)"(第9章)，Ausubel等人，1994，JohnWiley&Sons，Inc.，NewYork,其公開內(nèi)容引入本文作為參考。變異體和類似物也包括與其他化學(xué)部分絡(luò)合的多肽、融合蛋白或是翻譯后修飾的。合適的修飾作用的實(shí)例在共同未決的國際專利申請PCT/AU2005/000041;WO2005/067959中描述，其公開內(nèi)容引入本文作為參考。此外，CpnlO多肽或其片段可具有其他的翻譯后修飾作用，包括側(cè)鏈修飾作用，例如乙?；?、酰胺化(纖idination)、氨甲酰化、還原烷化和本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的其他修飾作用。CpnlO多肽可進(jìn)一步包括，但不限于，與如本文所定義的CpnlO多核苷酸在高嚴(yán)格性條件下雜交的任何多核苷酸。如本文所使用的術(shù)語"高嚴(yán)格性"是指兩個(gè)多核苷酸可雜交的條件，并可包括，例如，溶液中鹽和/或去垢劑的濃度、在兩個(gè)多核苷酸雜交過程中所使用的溶液的溫度、和雜交的持續(xù)時(shí)間。因此，如本文所使用的術(shù)語"高嚴(yán)格性"是指僅當(dāng)兩個(gè)多核苷酸具有高度同源性時(shí)有助于兩個(gè)多核苷酸雜交的溶液條件。同源性程度可包括但不限于，大約50%至99%的范圍。因此，"高嚴(yán)格性"條件可涉及但不限于，在大約60°C-70°C的溫度范圍內(nèi)使用洗滌緩沖液，該洗滌緩沖液包括0-10%的十二烷基硫酸鈉和/或O-lx氯化鈉-檸檬酸鈉，或緩沖液、溫度或產(chǎn)生用于雜交的"高嚴(yán)格性"溶液的時(shí)間期限的任何其他組合。給藥途徑組合物可通過標(biāo)準(zhǔn)途徑進(jìn)行給藥。通常，組合物可通過胃腸外(例如，靜脈內(nèi)、脊柱內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi))、經(jīng)口或局部途徑給藥。給藥可以是全身性的、區(qū)域性的或局部的。在任何指定的情況下要使用的具體給藥途徑將取決于許多因素，包括要治療的病癥的性質(zhì)、病癥的嚴(yán)重性和程度、要被遞送的具體化合物的所需劑量、和該化合物的潛在副作用。本發(fā)明的組合物可以是適合注射給藥的形式、適合口服攝入的劑型形式(例如膠囊、片劑、小膠囊(caplet)、酏劑)、適合局部給藥的軟膏、乳膏或洗劑形式、適合以滴眼劑遞送的形式、適合吸入給藥(如通過鼻內(nèi)吸入或經(jīng)口吸入)的氣霧劑形式、適合胃腸外給藥(即皮下、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)注射)的形式。對于作為可注射溶液或懸液的給藥，無毒性的胃腸外可接受的稀釋劑或載體可包括林格氏溶液、等滲鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、乙醇和1,2丙二醇。稀釋劑、載體、輔料和賦形劑通常，合適的組合物可根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知的方法來制備，并可包括藥學(xué)上可接受的稀釋劑、輔料和/或賦形劑。就與該組合物的其他成分相容而言，稀釋劑、輔料和賦形劑必須是"可接受的"，且對其接受者無害。藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑的實(shí)例包括但不限于，軟化水或蒸餾水、鹽水溶液、植物基油如花生油、紅花油、橄欖油、棉籽油、玉米油、芝麻油、花生油或椰子油；硅油，包括聚硅氧烷，如甲基聚硅氧垸、苯基聚硅氧烷和甲基苯基聚硅氧烷；揮發(fā)性硅酮；礦物油，如液體石蠟、軟石蠟或角鯊垸；纖維素衍生物，如甲基纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、或羥丙基甲基纖維素；低級鏈垸醇，例如乙醇或異丙醇；低級芳烷醇(aralkanol);低級聚烷撐二醇或低級垸撐二醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1,3-丁二醇或丙三醇；脂肪酸脂，如棕櫚酸異丙酯、肉豆蔻酸異丙酯或油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；瓊脂；角叉菜膠；黃蓍膠或阿拉伯膠、和凡士林油。一般，載體或多種載體將占組合物的10wt%-99.9wt%。用于口服的合適的載體、稀釋劑、賦形劑和輔料的一些實(shí)例包括，但不限于花生油、液體石蠟、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、海藻酸鈉、阿拉伯膠、黃蓍膠、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、明膠和卵磷脂。另外，這些口服制劑可含有合適的調(diào)味劑和著色劑。當(dāng)用于膠囊形式中時(shí)，膠囊可用能延緩崩解的化合物來包被，如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。輔料一般包括但不限于，潤滑劑、乳化劑、增稠劑、防腐劑、殺菌劑和緩沖劑。用于口服給藥的固體形式可含有，但不限于，人和獸用制藥學(xué)實(shí)踐中可接受的粘合劑、增甜劑、崩解劑、稀釋劑、調(diào)味劑、包衣衣料、防腐劑、潤滑劑和/或延時(shí)劑。合適的粘合劑包括但不限于，阿拉伯膠、明膠、玉米淀粉、黃蓍膠、海藻酸鈉、羧甲基纖維素或聚乙二醇。合適的增甜劑包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿斯巴特(aspartame)或糖精。合適的崩解劑包括但不限于，玉米淀粉、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、瓜爾豆膠、黃原膠、膨潤土、海藻酸或瓊脂。合適的稀釋劑包括但不限于，乳糖、山梨醇、甘露醇、右旋糖、高嶺土、纖維素、碳酸鈣、硅酸鈣或磷酸二鈣。合適的調(diào)味劑包括但不限于，薄荷油、冬青油、櫻桃、橙子或樹莓調(diào)味劑。合適的包衣衣料包括但不限于，丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或其酯的聚合物或共聚物、蠟、脂肪醇、玉米蛋白、蟲膠或谷蛋白。合適的防腐劑包括但不限于，苯甲酸鈉、維生素E、Ot生育酚、抗壞血酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯或亞硫酸氫鈉。合適的潤滑劑包括但不限于，硬脂酸鎂、硬脂酸、油酸鈉、氯化鈉或滑石。合適的延時(shí)劑包括單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。用于口服給藥的液體形式除了上述藥劑以外，可含有液體載體。合適的液體載體包括但不限于，水、油類，如橄欖油、花生油、芝麻油、向日葵油、紅花油、花生油、椰子油、液體石蠟、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丙三醇、脂肪醇、甘油三酯或其混合物。用于口服給藥的懸液可進(jìn)一步包括分散劑和/或懸浮劑。合適的懸浮劑包括但不限于，羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸鈉或乙酰醇。合適的分散劑包括但不限于，卵磷脂、脂肪酸(如硬脂酸)的聚氧乙烯酯、聚氧乙烯山梨糖醇單-或二-油酸酯、-硬脂酸酯或-月桂酸酯、聚氧乙烯去水山梨糖醇單-或二-油酸酯、-硬脂酸酯或-月桂酸酯和類似物。用于口服給藥的乳劑可進(jìn)一步包括一種或多種乳化劑。合適的乳化劑包括但不限于，如上所舉例的分散劑或天然膠，如瓜爾豆膠、阿拉伯膠或黃蓍膠。用于制備可胃腸外給藥的組合物的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，其更多的細(xì)節(jié)描述在，例如，"雷明頓藥物科學(xué)(Remington'sPharmaceuticalScience)"，第15版，MackPublishingCompany,Easton，Pa.中，該書引入本文作為參考。本發(fā)明的局部制劑包括活性組分以及一種或多種可接受的載體，和任選地任何其他的治療性組分。適合局部給藥的制劑包括但不限于，適合滲透皮膚至需要治療的部位的液體或半液體制劑，如搽劑、洗劑、乳膏、軟膏或糊劑，和適合眼、耳或鼻給藥的滴劑。根據(jù)本發(fā)明的滴劑可包括無菌水性或油性溶液或懸液。這些制劑可通過將活性組分溶解在殺菌劑和/或殺真菌劑和/或任何其他合適的防腐劑并任選地包括表面活性劑的水溶液中來制備。生成的溶液隨后可通過過濾澄清，轉(zhuǎn)移至合適的容器中并滅菌。滅菌可通過下面的方法來完成在9(TC-10(TC下高壓滅菌或保持半小時(shí)，或通過過濾，然后采用無菌操作轉(zhuǎn)移至容器中。適合包含在滴劑中的殺菌劑和殺真菌劑的實(shí)例是硝酸苯汞或乙酸苯汞(0.002%)、苯扎氯銨(0.01%)和乙酸洗必泰(0.01%)。用于制備油性溶液的合適溶劑包括但不限于，甘油、稀醇和丙二醇。根據(jù)本發(fā)明的洗劑包括適合敷于皮膚或眼的洗劑。眼洗劑可包括任選地含有殺菌劑的無菌水溶液，并可通過與上述關(guān)于制備滴劑的類似方法來制備。用于敷于皮膚的洗劑或搽劑也可包括但不限于，快速干燥和冷卻皮膚的藥劑(例如醇或丙酮)、和/或濕潤劑(如甘油)、或油(如蓖麻油或花生油)。根據(jù)本發(fā)明的乳膏、軟膏或糊劑是外用的活性組分的半固體制劑。它們可通過將單獨(dú)或在水性或非水性液體中的溶液或懸液中的、微?；蚍勰┬问降幕钚越M分，與油脂或非油脂基質(zhì)混合而制成。該基質(zhì)可包括烴，如硬、軟或液體石蠟、甘油、蜂蠟、金屬皂；粘液；天然來源的油，如杏仁、玉米、花生、蓖麻或橄欖油；羊毛脂或其衍生物、或脂肪酸(如硬脂酸或油酸)以及醇(如丙二醇和聚乙二醇)。組合物可加入任何合適的表面活性劑，如陰離子、陽離子或非離子性表面活性劑，如脫水山梨糖醇酯或其聚氧乙烯衍生物。也可包括懸浮劑，如天然膠、纖維素衍生物或無機(jī)物質(zhì)，如含硅的硅酸鹽(silicaceoussilicas)、和其他組分，如羊毛脂。組合物也可以以脂質(zhì)體的形式給藥。脂質(zhì)體一般來源于磷脂或其他脂類物質(zhì)，并通過分散在水性介質(zhì)中的單-或多層水合液晶形成。可使用能形成脂質(zhì)體的任何無毒性的、生理學(xué)可接受的和可代謝的脂質(zhì)。脂質(zhì)體形式的組合物可含有穩(wěn)定劑、防腐劑、賦形劑和類似物。優(yōu)選的脂質(zhì)是磷脂和磷脂酰膽堿(卵磷脂)，都是天然的和合成的。形成脂質(zhì)體的方法是本領(lǐng)域中所公知的，關(guān)于此的具體文獻(xiàn)見Prescott，Ed.，"細(xì)胞生物學(xué)方法(MethodsinCellBiology)",第XW巻，AcademicPress,NewYork,N.Y.(1976),p.33及以下等等，其內(nèi)容引入本文作為參考。組合物可與一系列聚乙二醇(PEG)衍生物共軛。將PEG加入至蛋白中(PEG化)是一種非常確定的用于降低蛋白質(zhì)血漿清除率，從而增加其功效的方法(Nucci等人，1991,爿dv.i>wg/)e/.Zev.6:133)。PEG化的其他益處可包括，蛋白質(zhì)較高的穩(wěn)定性、免疫原性降低、溶解度增加和蛋白水解的易感性下降(SheffieldW.2001，CWrZ>wg7^rgeteCaWowwc//iaemato/D&wc/.1:1-22)。PEG分子含有-(00"13092)11-011的基本重復(fù)結(jié)構(gòu)，且根據(jù)其分子量分為幾組。PEG衍生物與蛋白質(zhì)共軛以增加其流體動(dòng)力學(xué)半徑，且通常，其半衰期的增加直接與附著的PEG鏈的大小有關(guān)(SheffieldW.2001，Oz/rZ>wg7^/'g幼CVWovo^cT/ioema/o/Z)^o7'c/.1:1-22)。組合物也可以以微粒的形式給藥。由聚交酯(PLA)、聚丙交酯-乙交酯共聚物(polylactide-co-glycolide,PLGA)和s-己內(nèi)酯U-己內(nèi)酯)形成的生物可降解的微粒已經(jīng)廣泛地用作藥物載體以增加血漿半衰期，并因此延長功效(R.Kumar,M.,2000,JP/zarwP/zarwaceM/3(2)234-258)。微粒已經(jīng)被配制用來遞送多種藥物候選物，這些候選物包括疫苗、抗生素和DNA。而且，這些制劑己經(jīng)被開發(fā)用于多種遞送途徑，包括胃腸外皮下注射、靜脈注射和吸入。組合物可加入控釋基質(zhì)，該基質(zhì)由乙酸異丁酸蔗糖酯(SAIB)和有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑混合物組成。聚合物添加劑可加入至媒介中作為釋放修飾劑以進(jìn)一步增加粘度和減慢釋放速率。SAIB是公知的食品添加劑。其是非常疏水的、完全酯化的蔗糖衍生物，其異丁酸酯和乙酸酯基團(tuán)的額定比例為6:2。作為混合酯，SAIB不會(huì)結(jié)晶但以清亮的粘稠液體存在。將SAIB與藥學(xué)上可接受的有機(jī)溶劑(如乙醇或苯甲醇)混合能充分降低混合物的粘度以允許注射?；钚运帉W(xué)組分可加入至SAIB遞送媒介物中以形成SAIB溶液或懸液制劑。當(dāng)制劑經(jīng)皮下注射時(shí)，溶劑從基質(zhì)中擴(kuò)散出來，使SAIB-藥物或SAIB-藥物-聚合物混合物建立原位成型儲(chǔ)庫(formingdepot)。為了本發(fā)明的目的，分子和藥劑可作為治療性或預(yù)防性組合物給予受試者。在治療性應(yīng)用中，組合物給予已經(jīng)患有疾病的患者，其用量足以治愈或至少部分地抑制疾病及其并發(fā)癥。該組合物應(yīng)該提供足量的分子或藥劑以有效地治療患者。對于任何特定的患者治療上有效的劑量水平將取決于多種因素，包括被治療的功能障礙和該功能障礙的嚴(yán)重性；使用的分子或藥劑的活性；使用的組合物；患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食；給藥時(shí)間；給藥途徑；該分子或藥劑的螯合(sequestration)率；治療的持續(xù)時(shí)間；與該治療聯(lián)合或同時(shí)使用的藥物，以及醫(yī)學(xué)中己知的其他相關(guān)因素。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠通過常規(guī)的試驗(yàn)來確定需要治療適用疾病的藥劑或化合物的有效的、無毒性的用量。通常，有效劑量期望在大約0.0001mg至大約1000mg每千克體重每24小時(shí)的范圍內(nèi)；典型地為大約0.001mg至大約750mg每千克體重每24小時(shí)；大約0.01mg至大約500mg每千克體重每24小時(shí)；大約O.lmg至大約500mg每千克體重每24小時(shí)；大約O.lmg至大約250mg每千克體重每24小時(shí)；大約l.Omg至大約250mg每千克體重每24小時(shí)。更典型地，有效劑量范圍期望在大約1.0mg至大約200mg每千克體重每24小時(shí)的范圍內(nèi)；大約l.Omg至大約100mg每千克體重每24小時(shí)；大約l.Omg至大約50mg每千克體重每24小時(shí)；大約l.Omg至大約25mg每千克體重每24小時(shí)；大約5.0mg至大約50mg每千克體重每24小時(shí)；大約5.0mg至大約20mg每千克體重每24小時(shí)；大約5.0mg至大約15mg每千克體重每24小時(shí)?；蛘撸行┝靠蛇_(dá)到大約500mg/m2。通常，有效劑量期望在大約25至大約500mg/n^的范圍內(nèi)，優(yōu)選大約25至大約350mg/m2，更優(yōu)選大約25至大約300mg/m2，還更優(yōu)選大約25至大約250mg/m2，甚至更優(yōu)選大約50至大約250mg/m2，甚至還更優(yōu)選大約75至大約150mg/m2。典型地，在治療性應(yīng)用中，治療將針對疾病狀態(tài)的持續(xù)時(shí)間。另外，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員很顯然的是，個(gè)體用藥劑量的最佳數(shù)量和間隔時(shí)間將由被治療的疾病狀態(tài)的性質(zhì)和程度、給藥的形式、途徑和部位、以及被治療的特定個(gè)體的性質(zhì)來確定。這種最佳條件也可通過常規(guī)技術(shù)來確定。對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員也很顯然的是，治療的最佳時(shí)程，例如指定的組合物每天的用藥次數(shù)持續(xù)規(guī)定的天數(shù)，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用治療確定試驗(yàn)的常規(guī)過程來確定。CpnlO激動(dòng)劑和拮抗劑本發(fā)明也考慮了CpnlO激動(dòng)劑和拮抗劑的應(yīng)用、以及篩選和生產(chǎn)這些激動(dòng)劑和拮抗劑的方法。CpnlO激動(dòng)劑和拮抗劑可根據(jù)其對Toll樣受體信號(hào)傳導(dǎo)和免疫調(diào)節(jié)劑分泌的效應(yīng)來特異性地設(shè)計(jì)或篩選?？贵w可用作CpnlO、或其片段或類似物的激動(dòng)劑或拮抗劑。優(yōu)選從CpnlO多肽的不連續(xù)區(qū)域或片段，尤其是那些參與賦予蛋白酶活性和/或伴侶分子或底物結(jié)合性質(zhì)的區(qū)域或片段，來制備合適的抗體?？乖訡pnlO多肽含有至少大約5個(gè)，且優(yōu)選至少大約10個(gè)氨基酸。產(chǎn)生合適抗體的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是很容易理解的。例如，抗-CpnlO單克隆抗體，典型地含有Fab部分，可使用"抗體一實(shí)驗(yàn)室手冊(Antibodies-ALaboratoryManual)",Harlow禾卩Lane編輯，ColdSpringHarborLaboratory,N.Y.(1988)中所述的雜交瘤技術(shù)來制備。實(shí)際上，在針對Cpn10、或其片段或類似物的單克隆抗體的制備中，可使用能提供由培養(yǎng)的連續(xù)細(xì)胞系生產(chǎn)抗體分子的任何技術(shù)。這些技術(shù)包括由Kohler等人，1975,Atowe,256:495-497最初開發(fā)的雜交瘤技術(shù)、以及三源雜交瘤(trioma)技術(shù)、人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等人，1983，/mmw"o/ogy7bc/qy,4:72)、和EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等人，"單克隆抗體禾口癌癥治療(M"oc/oa/爿"WoWayQmcerTTzerapj)"，pp.77-96,AlanR.Liss，Inc.,(1985))產(chǎn)生人單克隆抗體。產(chǎn)生抗體的永生細(xì)胞系可通過融合之外的其他技術(shù)來建立，例如用致癌DNA直接轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞，或用Epstein-Barr病毒轉(zhuǎn)染。參見，例如，M.Schreier等人，"雜交瘤技術(shù)(HybridomaTechniques)"(1980);Hammerling等人，"單克隆抗體和T-細(xì)胞雜交瘤(MonoclonalAntibodiesandT-cdlHybridomas)"(1981);Kennett等人，"單克隆抗體(MonoclonalAntibodies)"(1980)?？傊?，通過產(chǎn)生雜交瘤(其產(chǎn)生單克隆抗體)的手段，骨髓瘤或其他自身永生化細(xì)胞系與淋巴細(xì)胞融合，該淋巴細(xì)胞是從用其識(shí)別因子-結(jié)合部分、或識(shí)別因子、或其來源特異性的DNA結(jié)合部分超免疫的哺乳動(dòng)物的脾臟獲得的。用于實(shí)施本發(fā)明的產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤，通過其與該識(shí)別因子發(fā)生免疫反應(yīng)的能力和其抑制靶細(xì)胞中特異轉(zhuǎn)錄活性的能力而被識(shí)別。用于實(shí)施本發(fā)明的單克隆抗體，可通過啟動(dòng)包括含有雜交瘤的營養(yǎng)培養(yǎng)基的單克隆雜交瘤培養(yǎng)物來產(chǎn)生，該雜交瘤分泌具有合適抗原特異性的抗體分子。在足以使雜交瘤分泌抗體分子至培養(yǎng)基的條件和持續(xù)時(shí)間下維持培養(yǎng)物。然后收集含有抗體的培養(yǎng)基。然后抗體分子可進(jìn)一步通過公知的技術(shù)來分離。同樣，本領(lǐng)域中己知有多種步驟可用于產(chǎn)生多克隆抗體。對于抗CpnlO多克隆抗體的產(chǎn)生，多種宿主動(dòng)物可用CpnlO或其片段或類似物注射來免疫，這些動(dòng)物包括但不限于馬、奶牛、兔、雞、小鼠、大鼠、綿羊、山羊等。另外，CpnlO多肽或其片段或類似物可與免疫原載體，例如牛血清白蛋白(BSA)或鑰孔戚血藍(lán)素(KLH)共軛。各種輔料也可用來增加免疫學(xué)反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑(完全和不完全)、例如氫氧化鋁的礦物凝膠、表面活性物質(zhì)，如溶血卵磷脂、聚醚多元醇(pluronicpolyol)、多聚陰離子、肽、油乳劑、鑰孔戚血藍(lán)素、二硝基酚、和可能有用的人佐劑，如BCG(卡介苗)和小棒狀桿菌。篩選所需的抗體也可通過本領(lǐng)域中己知的多種技術(shù)來完成。抗體的特異性免疫結(jié)合試驗(yàn)可包括但不限于，放射免疫測定、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))、夾心免疫測定(sandwichimmunoassay),免疫放射測定、凝膠擴(kuò)散沉淀反應(yīng)、免疫擴(kuò)散測定、原位免疫測定、Western印跡、沉淀反應(yīng)、凝集測定、補(bǔ)體結(jié)合測定、免疫熒光測定、蛋白A測定、和免疫電泳測定、和類似試驗(yàn)(參見，例如，Ausubel等人，主編，1994，"分子生物學(xué)的通用方法(CurrentProtocolsinMolecularBiology)",Vol.1，JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork)?？贵w的結(jié)合可通過一級抗體上的可檢測標(biāo)記來檢測。或者，抗體可通過其與被適當(dāng)標(biāo)記的二級抗體或試劑的結(jié)合來檢測。在本領(lǐng)域中已知有許多方法在免疫測定中用于檢測結(jié)合，且這些方法在本發(fā)明的范圍內(nèi)。針對CpnlO或其片段或類似物培養(yǎng)的抗體(或其片段)具有與CpnlO的結(jié)合親合力。優(yōu)選地，抗體(或其片段)的結(jié)合親合力或親合性大于大約105M-'，更優(yōu)選大于大約106M—'，更優(yōu)選還大于大約107M—1，且最優(yōu)選大于大約IOSNT1。就獲得合適量的根據(jù)本發(fā)明的抗體而言，可使用用無血清培養(yǎng)基分批發(fā)酵來制造抗體。在發(fā)酵后，抗體可經(jīng)結(jié)合了色譜法和病毒滅活/清除步驟的多步步驟純化。例如，抗體可首先通過蛋白A親合色譜來分離，然后用溶劑/去垢劑處理以滅活任何脂質(zhì)包膜病毒。進(jìn)一步純化(典型地通過陰離子和陽離子交換色譜)可用來去除殘余的蛋白質(zhì)、溶劑/去垢劑和核酸。純化的抗體可進(jìn)一步使用凝膠過濾柱純化并配制在0.9%鹽水中。然后可將制成的批量制劑滅菌并過濾病毒和分配。本發(fā)明也包括抗體之外的激動(dòng)劑和拮抗劑?？赏ㄟ^與Toll樣受體和任選的Toll樣受體激動(dòng)劑形成分子絡(luò)合物的能力來鑒定候選的激動(dòng)劑或拮抗劑。此外，可通過阻止或破壞包括CpnlO和Toll樣受體或Toll樣受體激動(dòng)劑的分子絡(luò)合物形成的能力來鑒定候選的拮抗劑。用于鑒定和產(chǎn)生激動(dòng)劑和拮抗劑的技術(shù)和步驟是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，包括例如合成化合物文庫(例如組合文庫)的篩選分子文庫、計(jì)算機(jī)輔助篩選結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫、計(jì)算機(jī)輔助建模和/或設(shè)計(jì)、或檢測分子結(jié)合相互作用的更傳統(tǒng)的生物物理學(xué)技術(shù)?，F(xiàn)在將參考下列的具體實(shí)施例來進(jìn)一步更詳細(xì)地描述本發(fā)明，這些具體實(shí)施例不應(yīng)理解為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例重似Q"70對于下面實(shí)施例1至4中所述的試驗(yàn)，如Johnson等人，2005(J說'o/C7zem280:4037-4047)中所述，重組人Cpnl0(GenBank登記號(hào)X75821)在大腸桿菌中產(chǎn)生，其N-末端為丙氨酸殘基。通過SDS-PAGE測定純度>97%。僅在使用之前將Cpn10的等分樣品解凍。在GroEL介導(dǎo)的硫氰酸生成酶重折疊化驗(yàn)中，所有批次的Cpn10顯示了與大腸桿菌GroES相同的摩爾活性(數(shù)據(jù)未顯示)。實(shí)施例l-在Polyl:C的存在下產(chǎn)生抗病毒細(xì)胞因子IFNB進(jìn)行試驗(yàn)以測定當(dāng)與TLR3的選擇性激動(dòng)劑，PolyI:C(聚肌苷酸-聚胞苷酸)聯(lián)合給藥時(shí)，CpnlO對抗病毒細(xì)胞因子干擾素-P(IFNP)的產(chǎn)生的作用。如Johnson等人，2005(/所o/C77em280:4037-4047)中所述，在鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7(ATCC登記號(hào)TIB71)中進(jìn)行試驗(yàn)。簡言之，RAW264.7細(xì)胞以2x105細(xì)胞/孔接種在24孔板中，并培養(yǎng)過夜(37°C,5%C02)。重組人CpnlO(以10i!g/ml至200昭/ml之間的濃度)或緩沖液以雙份加入至細(xì)胞中2小時(shí)-，然后加入polyl:C(tlrl-pic,InvivoGen，SanDiego，CA)至100jig/ml的終濃度。24小時(shí)后，收集上清液并使用特異性ELISA根據(jù)生產(chǎn)廠商的說明書(CatNo.42400-1,R&DSystemsInc，Minneapolis,MN)分析IFN|3水平。如圖1中所示，未刺激的RAW264.7細(xì)胞沒有將可檢測到的IFN(3釋放進(jìn)入培養(yǎng)上清液中。在沒有CpnlO的情況下，用100昭/ml的polyl:C刺激使292pg/ml的IFN卩釋放進(jìn)入RAW264.7培養(yǎng)上清液中。加入從10嗎/ml至200嗎/ml的劑量不斷增加的Cpn10，導(dǎo)致劑量依賴性地增加培養(yǎng)上清液中的IFN(3水平，在150昭/mlCpnlO時(shí)達(dá)到900pg/ml的最高水平。實(shí)施例2-RAW264.7細(xì)胞上清液的抗病毒活性將從上面實(shí)施例1中所述的試驗(yàn)中獲得的細(xì)胞培養(yǎng)上清液冷凍并保存在-2(TC，之后用于在L細(xì)胞細(xì)胞病變效應(yīng)減少(CPER)測定中分析總抗病毒活性(I型干擾素的總釋放量)。簡言之，3xl(^L細(xì)胞接種在96-孔板中，并在37。C靜置4h以進(jìn)行貼壁。將雙份的IFN標(biāo)準(zhǔn)品和檢測上清液以半-log10系列稀釋液加入至培養(yǎng)板中。標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的IFN活性范圍是從1-104IU/ml。培養(yǎng)板孵育過夜15h，去除培養(yǎng)基，并將塞姆利基森林病毒(SemlikiForestvims)以組織培養(yǎng)物IDs。的100倍滴度加入至各孔中。培養(yǎng)板在37。C下孵育3天，然后對細(xì)胞活力進(jìn)行評分。每塊培養(yǎng)板含有沒有IFN或檢測上清液的兩排細(xì)胞用作最大細(xì)胞死亡的對照。相對于國立衛(wèi)生研究院標(biāo)準(zhǔn)(NationalInstitutesofHealthstandard)Ga02901511測定IFN滴度，作為對50%細(xì)胞提供保護(hù)的IFN濃度。如圖2中所示，加入Cpn10導(dǎo)致在polyl:C的存在下，I型干擾素的釋放發(fā)生顯著地劑量反應(yīng)性增力口(在100嗎/mlCpnlO下達(dá)到最大)。實(shí)施例1和2中所顯示的數(shù)據(jù)表明在病毒感染的情況下(其中病毒核酸可被釋放)給予CpnlO，或當(dāng)與TLR3激動(dòng)劑共同給藥時(shí)，導(dǎo)致刺激較高水平的抗病毒免疫。實(shí)施例3-表達(dá)TLR7的HEK293細(xì)胞中的NF-kB活化在人胚腎細(xì)胞系HEK293中研究人CpnlO調(diào)節(jié)經(jīng)由Toll樣受體TLR7的信號(hào)傳導(dǎo)的能力。表達(dá)TLR7和TLR4的HEK293的穩(wěn)定細(xì)胞系如Latz等人，2002(J歷o/C/7em277:47834-47843)中所述建立，并以每孔2"04細(xì)胞的密度接種在96-孔培養(yǎng)板中。生長過夜后，為了測定NF-kB活化，細(xì)胞用NF-kb-螢光素酶報(bào)告子構(gòu)建物(按照Latz等人，2002，J歷o/C7zew277:47834-47843)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，該構(gòu)建物包括由驅(qū)動(dòng)螢火蟲螢光素酶基因表達(dá)的5NF-kB位點(diǎn)與結(jié)構(gòu)性活性/em7fo螢光素酶報(bào)告子基因的多聚體組成的人工報(bào)告子。在細(xì)胞培養(yǎng)過夜后，將重組人CpnlO以50(ig/ml的終濃度單獨(dú)或與下列試劑之一同時(shí)給予細(xì)胞TLR7選擇性激動(dòng)劑瑞喹莫德R848、硫代磷酸酯CpG寡核苷酸(MWGBiotech)(TLR9選擇性激動(dòng)劑)、TLR4選擇性激動(dòng)劑脂多糖(LPS)或蛋白激酶C激活物佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)，作為對照。然后通過使用雙重-螢光素酶測定報(bào)告子系統(tǒng)(Dual-LuciferaseAssayReporterSystem),根據(jù)生產(chǎn)廠商的說明書(Promega，MadisonWI)、和測定板讀數(shù)光度計(jì)(PerkinElmer)測量熒光素酶活性，在刺激后5小時(shí)測定NF-kB活化并定量。結(jié)果顯示在圖3中，表示為NF-kB活化倍數(shù)。在沒有刺激時(shí)(單獨(dú)使用培養(yǎng)基)，不誘導(dǎo)NF-kB活化。相反，在0.32-40的濃度范圍內(nèi)，TLR7選擇性激動(dòng)劑R848經(jīng)TLR7誘導(dǎo)超過5-倍的NF-kB活化。但在50|ig/mlCpnlO的存在下，這種活化減少了大約2-倍。實(shí)施例4-表達(dá)TLR9的HEK293細(xì)胞中的NF-kB活化也在HEK293細(xì)胞中研究人CpnlO調(diào)節(jié)經(jīng)由Toll樣受體TLR9的信號(hào)傳導(dǎo)的能力。如實(shí)施例3中所述進(jìn)行測定。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的表達(dá)TLR9的HEK293細(xì)胞的兩個(gè)單獨(dú)克隆中進(jìn)行測定。結(jié)果顯示在圖4中。在沒有刺激的情況下(單獨(dú)使用培養(yǎng)基)，不誘導(dǎo)NF-kB活化。但用CpGDNA以0.08-10pM濃度范圍活化HEK-TLR9，誘導(dǎo)高達(dá)大約33-倍的NF-kB活化。在50嗎/mlCpnlO的存在下，這種活化減少了5-至10-倍。為了進(jìn)一步研究CpnlO對表達(dá)TLR9的HEK293細(xì)胞對CpGDNA的反應(yīng)性的作用，使用不同濃度的Cpnl0-12.5昭/ml、25嗎/ml、50嗎/ml和100嗎/ml進(jìn)行類似于上述的試驗(yàn)(見圖5)。這些結(jié)果證實(shí)了上面觀察到的CpnlO-介導(dǎo)效應(yīng)(圖4)，并舉例說明了CpnlO-介導(dǎo)效應(yīng)對TLR9信號(hào)傳導(dǎo)的劑量反應(yīng)性。實(shí)施例5-人外周血單核細(xì)胞的細(xì)胞因子釋放為了確定CpnlO調(diào)節(jié)原代人細(xì)胞中細(xì)胞因子釋放的能力，使用從健康志愿者供體中分離的人外周血單核細(xì)胞(PBMC)。如Johnson等人，2005(J歷o/C7zem280:4037-4047)所述，通過浮力密度梯度離心從肝素化的血液中分離PBMC。如Latz等人，2004(胸匿/wmw"o/5:190-198)中所述，使用抗-BDCS-2-APC柱(Miltenyi)處理一半的分離PBMC以去除漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(PDC)。PDC是PBMC群體內(nèi)I型干擾素IFNa的主要來源。己知PDC表達(dá)TLR7和TLR9，并是人類用于識(shí)別單鏈核酸的關(guān)鍵細(xì)胞類型。對于含有PDC的PBMC和去除PDC的PBMC，兩種細(xì)胞都以106活細(xì)胞/ml的密度以200(il接種在96-孔板中，并如Johnson等人，2005CAem280:4037-4047)中所述進(jìn)行培養(yǎng)。簡言之，加入Cpnl0至1嗎/ml、10昭/ml或50|ig/ml的終濃度，在加入LPS(非再純化的或再純化的)之前將培養(yǎng)板孵育1小時(shí)。然后細(xì)胞在37°C和5%C02下進(jìn)一步孵育20小時(shí)。收集上清液并使用特異性的ELISA根據(jù)生產(chǎn)廠商的說明書(R&DSystems,Inc.,Minneapolis,MN)分析致炎細(xì)胞因子TNF-a(圖6)和抗炎細(xì)胞因子IL-IO(圖7)的產(chǎn)生。如圖6和7中所示，在缺少LPS時(shí)，單獨(dú)使用培養(yǎng)基或CpnlO都不誘導(dǎo)TNF-a或IL-10的產(chǎn)生。向未處理的PBMC培養(yǎng)物中加入再純化的LPS(0.01-10ng/ml)引起TNF-a的產(chǎn)生，在高達(dá)10pg/mlCpnlO的存在下，這種產(chǎn)生劑量反應(yīng)性地降低(最大32%)(圖6A)。但在去除PDC的PBMC中，CpnlO喪失了對TNF-ot的產(chǎn)生的影響(圖6B)。因此，CpnlO對LPS-誘導(dǎo)的TNF-oc的產(chǎn)生的效應(yīng)，需要PDC的存在，缺少PDC時(shí)這種效應(yīng)消失。這個(gè)發(fā)現(xiàn)有點(diǎn)令人驚奇，因?yàn)镻DC不表達(dá)TLR4，因此對LPS的刺激沒有反應(yīng)，因而表明CpnlO對TLR4引導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)作用可能是間接的。在IL-IO(圖7)的情況下，來自PBMC的上清液證明在CpnlO存在時(shí)，IL-10的產(chǎn)生增加，盡管從去除PDC的PBMC的上清液證明，IL-10的產(chǎn)生的劑量反應(yīng)性(直至10|ig/mlCpnlO)增加(圖7B)比具有PDC的未處理PBMC中所觀察到的增加(圖7A)程度要高。實(shí)施例6-CpnlO對TLR3活化的調(diào)節(jié)本研究是用來確定與其他TLR相比，CpnlO是否有差別地調(diào)節(jié)對TLR3結(jié)合的反應(yīng)，其可指示分子相互作用的靶標(biāo)。特異激動(dòng)劑對TLR的刺激能激發(fā)兩種下游信號(hào)傳導(dǎo)通路的活化，MyD88-依賴性或非依賴性的。MyD88是一種對于除TLR3以外的所有TLR很普遍的銜接分子。該分子的功能是將IL-lR-相關(guān)激酶(IRAK)和TNFR-相關(guān)因子6(TRAF6)募集在一起以活化IkB(IKK)激酶復(fù)合體，然后該復(fù)合體磷酸化IkB(x，引起核轉(zhuǎn)位和DNA與NF-kB結(jié)合。TLR的MyD88-非依賴性活化涉及誘導(dǎo)IFN-P的含Toll/IL-IR結(jié)構(gòu)域的適配子(TRIF)的活化。這導(dǎo)致了NF-kb和IFN調(diào)節(jié)因子3(IRF3)的活化延遲，從而導(dǎo)致IFN-(3的產(chǎn)生和IFN-誘導(dǎo)性基因的表達(dá)。TLR3的結(jié)合主要活化TRIF通路，而TLR4能活化MyD88-和TRIF-依賴性兩種通路。本研究的目的之一是確定與其他TLR相比，CpnlO是否能調(diào)節(jié)由于TLR3活化引起的反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)，并從而為CpnlO的靶標(biāo)和作用方式提供一些信息。6.1—般材料CpnlO批號(hào)CH003禾QGroES，與LPS(Sigma)禾nPoly(I:C)(Invivogen)—起使用或不一起使用。使用的細(xì)胞系包括RAW264-pNifty2-LUC禾BRAW264.7。6.2結(jié)果6.2.1CpnlO不通過TLR3抑制NF-kB活化小鼠巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞系RAW264.7用受ELAM1啟動(dòng)子(RAW264-pNifty2-LUC)驅(qū)動(dòng)的質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。ELAM1啟動(dòng)子靠近5個(gè)NF-kB位點(diǎn)并響應(yīng)細(xì)胞中核轉(zhuǎn)位和NF-kB轉(zhuǎn)錄因子的活化而驅(qū)動(dòng)螢光素酶報(bào)告子基因的表達(dá)。如圖8中所示，很寬濃度范圍CpnlO的存在不能改變用Poly(I:C)刺激的RAW264-pNifty2-LUC細(xì)胞中TLR3-誘導(dǎo)的NF-kB活化的動(dòng)力學(xué)。Poly(I:C)是雙鏈RNA的合成類似物，其分子模式與病毒感染有關(guān)，通過與TLR3的相互作用活化NF-kB。6.2.2CpnlO響應(yīng)TLR3和TLR4的結(jié)合而劑量反應(yīng)性地增加I型IFN的產(chǎn)生RAW264.7細(xì)胞與CpnlO預(yù)孵育2小吋，然后用LPS或Poly(I:C)刺激24小時(shí)。在此時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞上清液，并如以前所述(Hamilton等人，(1996)JImmunol156(7):2553)使用細(xì)胞病變減少生物測定(cytopathiceffectreductionbioassay)來分析IFNa/卩抗病毒活性。如下面的圖9中所示，在CpnlO的存在下，通過TLR4(LPS)或TLR3[Poly(I:C)]刺激24小時(shí)能上調(diào)I型IFN。然后RAW264.7細(xì)胞以2.5x10Vml接種在無菌24孔板中，并貼壁16-20小時(shí)。在滴定的Cpn10的存在下對細(xì)胞預(yù)孵育，然后用LPS(TLR2/4)或Poly(I:C)刺激4或6小時(shí)。收集細(xì)胞溶胞產(chǎn)物，并在-7(TC下冷凍或立即處理而用于使用Dynabead直接進(jìn)行mRNA分離。mRNA用寡聚(dT)引物逆向轉(zhuǎn)錄，用SuperscriptIIIFirst-StrandSynthesisSystem進(jìn)行RT-PCR。得到的cDNA使用小鼠IFN(3特異引物在PCR中擴(kuò)增。為了證實(shí)等量模板加入至每個(gè)反應(yīng)中并確認(rèn)進(jìn)行了一致的擴(kuò)增，對每個(gè)樣品轉(zhuǎn)錄GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)并進(jìn)行擴(kuò)增。在瓊脂糖凝膠上分離PCR產(chǎn)物，并如圖10中所示在溴化乙啶染色后進(jìn)行顯影。除了來自小鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞系RAW264.7的數(shù)據(jù)以外，如圖11中所示，也證明了用Poly(I:C)刺激的人PBMC顯示，在CpnlO的存在下，I型IFN(IFN-a)的產(chǎn)生增加。6.2.3CpnlO的大腸桿菌同系物，GroES，不能增加Poly(I:C)-誘導(dǎo)的IFN-(3產(chǎn)生為了確定CpnlO-介導(dǎo)的增加Poly(I:C)-誘導(dǎo)的IFN-p產(chǎn)生的特異性，檢測大腸桿菌CpnlO同系物，GroES。如圖12中所示，GroES不能調(diào)節(jié)Poly(I:C)通過TLR3誘導(dǎo)的IFN-(3產(chǎn)生。6.2.4與CpnlO預(yù)孵育然后洗滌，消除了Poly(I:C)-誘導(dǎo)的IFN-p的產(chǎn)生的劑量反應(yīng)性增加在LPS刺激測定中，在加入LPS之前用CpnlO預(yù)孵育然后通過PBS洗滌，不影響CpnlO調(diào)節(jié)NF-KB活化的能力。但是，如圖13中所示，在Poly(I:C)測定中，RAW264細(xì)胞與CpnlO預(yù)孵育然后通過PBS洗滌，極大地減少了CpnlO劑量反應(yīng)性增加Poly(I:C)刺激的IFN-卩的產(chǎn)生。6.2.5CpnlO對Poly(I:C)-或LPS-誘導(dǎo)反應(yīng)的調(diào)節(jié)需要I型干擾素通路的正反饋在I型IFN受體的IFNAR1(干擾素相關(guān)受體l)成分中具有無效突變的小鼠的特征是，與對病毒感染的易感性增加相對應(yīng)，完全缺少抗病毒反應(yīng)，且喪失了對IFNa/(3的抗增殖反應(yīng)(Hwang等人，(1995)尸rac.Ato/.^cad>SW.92:11284)。IFNAR1缺陷小鼠(IFNAR1/-)缺少構(gòu)成性IFN活性，并在包括巨噬細(xì)胞的造血細(xì)胞的比例和反應(yīng)方面有異常。使用從野生型(wt)或IFNAR1-A小鼠中分離的骨髓來源的巨噬細(xì)胞(BMM)，來先體外后體內(nèi)評價(jià)CpnlO在IFN"預(yù)激(priming)"反應(yīng)中的作用。分離BMM并在劑量滴定的CpnlO的存在下，用一組TLR激動(dòng)劑(Poly(I:C)-TLR3或LPS-TLR4)活化。24小時(shí)后收集上清液，并使用BD鼠炎癥CBA和鼠IFNPELISA試劑盒分析細(xì)胞因子水平。來自這些測定的結(jié)果表明，CpnlO對Poly(I:C)-誘導(dǎo)的IFN卩產(chǎn)生(圖14)和LPS-誘導(dǎo)的TNF-a產(chǎn)生(圖15)的調(diào)節(jié)作用，經(jīng)IFNAR1受體的正反饋反應(yīng)是必需的。這些數(shù)據(jù)，將IFN反饋通路與CpnlO-介導(dǎo)活性聯(lián)系在一起，進(jìn)一步確認(rèn)了來自鼠內(nèi)毒素血癥研究的體內(nèi)結(jié)果。在此膿毒癥的鼠模型中，小鼠用100嗎CpnlO經(jīng)靜脈注射給藥預(yù)處理30分鐘，然后靜脈注射10jagLPS。1.5小時(shí)后收集血清，并使用BD鼠炎癥CBA和IFNf3ELISA分析致炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。如圖16中所示，用CpnlO共同處理的小鼠血清TNFot水平的顯著降低(p<0.05)，與血清IFNf3水平的顯著降低(p<0.01)相關(guān)。6.3討論和結(jié)論CpnlO-介導(dǎo)的NF-kB調(diào)節(jié)模式的至少一種例外涉及通過TLR3配體Poly(I:C)活化細(xì)胞。在此TLR3系統(tǒng)中，發(fā)現(xiàn)CpnlO響應(yīng)細(xì)胞的Poly(I:C)刺激而對NF-kB活化沒有作用。另外，發(fā)現(xiàn)CpnlO能響應(yīng)Poly(I:C)而誘導(dǎo)協(xié)同性地增加I型干擾素的產(chǎn)生。對這種明顯異常的一種解釋是，CpnlO參與了預(yù)激或反饋回路反應(yīng)的調(diào)節(jié)。例如，I型干擾素已經(jīng)顯示在LPS-調(diào)控反應(yīng)中或直接地或間接地(例如，通過S0CS1)發(fā)揮重要作用。這是理解CpnlO的作用機(jī)制中的重大進(jìn)展，因?yàn)樗砻鰿pnlO通過減輕由I型IFN引起的早期細(xì)胞預(yù)激而下調(diào)致炎細(xì)胞因子，如TNFa。實(shí)施例7-CpnlO對小鼠塞姆利基森林病毒(SFV)感染的調(diào)節(jié)本系列研究用來確定CpnlO的給藥是否影響小鼠模型中塞姆利基森林病毒(SFV)的致死率，以及CpnlO是否響應(yīng)TLR活化而調(diào)節(jié)I型IFN的產(chǎn)生。該體內(nèi)模型涉及塞姆利基森林病毒(SFV)的全身性感染以初步確定對I型IFN抗病毒活性的調(diào)節(jié)?？梢栽谛律∈笾羞M(jìn)行該模型，其中包括腦在內(nèi)的所有器官都被感染，根據(jù)劑量在4-6天內(nèi)引起死亡，因此優(yōu)點(diǎn)是感染的敏感性和劇烈度?；蛘?，該模型可在成年鼠中進(jìn)行檢測，由于有I型IFN的產(chǎn)生，成年鼠對病毒的易感性較小。要理解的是，在病毒感染后第一個(gè)24-48小時(shí)內(nèi)，IFN的產(chǎn)生引起病毒滴度降低。該模型能進(jìn)行"慢性"反應(yīng)分析，包括血清分析和免疫應(yīng)答。該體外研究包括一系列測定以檢測CpnlO響應(yīng)TLR活化而對細(xì)胞因子產(chǎn)生的調(diào)節(jié)作用受巨噬細(xì)胞預(yù)激的影響，包括比較從WT和IFNAR缺陷小鼠新鮮分離的骨髓巨噬細(xì)胞。7.1材料和方法CpnlO批號(hào)CH003以5.0mg/ml(在50mMTris、150mMNaCl中，內(nèi)毒素<0.01EU/ml)使用。稀釋制劑緩沖液包括50mMTris和150mMNaCl。Pam3cys和polyl:C來自Invivogen。小鼠為C57BL/6。對于體內(nèi)研究，在小鼠中進(jìn)行涉及病毒滴定的前瞻性研究以確定合適的病毒批號(hào)和劑量。對于全部的研究，每組使用10-13只鼠，每個(gè)病毒劑量使用3組小鼠。各組如下進(jìn)行處理(A)僅有病毒；(B)病毒+濃度A的CpnlO;(C)病毒+濃度B的CpnlO。大約6-9天齡的新生小鼠腹腔內(nèi)注射CpnlO(或制劑緩沖液)和SFV，并由其母親撫育。另外，6-8周齡的成年鼠(wt型和IFNAR缺陷型)腹腔內(nèi)注射SFV，在病毒注射的第一周內(nèi)每12小時(shí)腹腔內(nèi)注射Cpn10，其劑量使用己確定的劑量。對于體外研究，采用CpnlO響應(yīng)TLR活化而對細(xì)胞因子產(chǎn)生的調(diào)節(jié)作用受巨噬細(xì)胞預(yù)激的影響和比較WT和IFNAR缺陷性巨噬細(xì)胞。來自WT和IFNAR缺陷小鼠的骨髓來源的巨噬細(xì)胞(BMM)用TLR激動(dòng)劑pam3cys(TLR2)、polyl:C(TLR3)禾卩LPS(TLR4)在一定劑量范圍的CpnlO下進(jìn)行處理。7.2結(jié)果來自體內(nèi)新生鼠病毒感染研究的數(shù)據(jù)表明，用CpnlO處理的SFV感染小鼠的生存率顯著增加。本研究包括以下各組6-9天齡新生C57BL/6小鼠:A組SFV(n=13);B組SFV+CpnlO20嗎(n=13);C組SFV+CpnlO50嗎(n=13)。B組和C組腹腔注射20和50昭CpnlO，然后(3小時(shí)后)對所有三組注射50plSFV(30xTCID50)。小鼠與其母親圈養(yǎng)在一起，并在整個(gè)試驗(yàn)過程中小心護(hù)理。以規(guī)律的間隔時(shí)間(12/24小時(shí))小心地監(jiān)測這些新生小鼠健康狀態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)指征，包括活動(dòng)狀況、身體狀況、行為等。在72小時(shí)時(shí)，54%和69%的20和50嗎CpnlO處理小鼠仍然存活，而相比在未處理小鼠中生存率為15%(圖17)。也注意到在最高劑量組中的小鼠到處走動(dòng)，而其他兩組則很不健康，躺在一邊。在84小時(shí)時(shí)，所有僅用SFV處理的小鼠都死于病毒的感染，而31%的B組和C組小鼠仍然存活。7.3討論和結(jié)論如72小時(shí)數(shù)據(jù)可見，CpnlO的給藥以劑量依賴方式延長了病毒感染后的生存率。在感染后96小時(shí)，用CpnlO注射的小鼠有18。/。存活，而所有未處理小鼠在感染后88小時(shí)時(shí)都已死亡。在兩個(gè)CpnlO處理組中，在感染后72小時(shí)時(shí)的小鼠生存率為50%和70%，相比未處理組中生存率為18%，在給予大劑量病毒的情況下這種差異是很顯著的。也值得注意的是，這種結(jié)果是在CpnlO單次給藥后獲得的。這些數(shù)據(jù)表明CpnlO誘導(dǎo)了抗病毒保護(hù)作用。實(shí)施例8-Cpnl0與CD14-非依賴性LPS受體簇聯(lián)合細(xì)胞的質(zhì)膜由多個(gè)側(cè)面異質(zhì)物(lateralheterogeneity)、斑塊(patch)和微結(jié)構(gòu)域組成。這些膜微結(jié)構(gòu)域或脂質(zhì)筏富含鞘糖脂和膽固醇，且與膜分選和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)之類的細(xì)胞過程有關(guān)。本發(fā)明人認(rèn)為在LPS信號(hào)聚簇的過程中，CpnlO可通過直接與TLR4或與聚簇的其他成員之一結(jié)合而集中在脂質(zhì)筏上以破壞信號(hào)傳導(dǎo)。8.1材料和方法Fi^r游鄰應(yīng)標(biāo)記。MonoMac6細(xì)胞(人單核細(xì)胞系)用供體交聯(lián)抗體(Cy3)和受體交聯(lián)抗體(Cy5)的100pl混合物標(biāo)記。對于CpnlO的標(biāo)記，使用抗-CpnlO兔多克隆抗體。細(xì)胞用PBS/0.02%BSA漂洗兩次，然后用4%甲醛固定15min。固定細(xì)胞是為了防止在試驗(yàn)進(jìn)程中蛋白質(zhì)可能發(fā)生的再重組。^覆煮成;t。細(xì)胞在CarlZeiss,Inc.LSM510共聚焦顯微鏡(裝有Axiovert200熒光顯微鏡)上使用1.4NA63xZeiss物鏡成像。使用LSM2.5圖像分析軟件(CarlZeiss,Inc.)分析圖像。使用合適的濾光片組檢測Cy3和Cy5。對于圖像采集使用典型的曝光次數(shù)(小于5s)，使用Cy5濾光片從Cy3-標(biāo)記的樣品未觀察到熒光，使用Cy3濾光片組也未檢測到Cy5熒光。F/￡r#/#。FRET是非侵入性成像技術(shù)，用于確定分子接近度。FRET可在1-10nm的距離上發(fā)生，并可有效增加光學(xué)顯微鏡對分子水平的分供體分子的激發(fā)態(tài)非輻射性地轉(zhuǎn)移至合適的受體上(Wu和Brand(1994)爿"a/.5/oc/犯m.218:1-13)。能量轉(zhuǎn)移的速率與供體與受體之間距離的6次冪成反比(Kenworthy禾PEdidin(1998)Jowma/o/Ce〃歷o/ogy142:69-84;Kenworthy和Edidin(1998)Gelb，M.H.(Ed.)"分子生物學(xué)的方法(MeAo山/""w/ec'w/w歷o/ogy)".HumanaPressInc，Totowa,NJpp37-49)。能量轉(zhuǎn)移(E)的效率根據(jù)r和Ro(特征性的F6rster距離)來定義E=l/[l+(r/R0)6][l]在本研究中，使用如以前所述(Kenworthy和Edidin(1998)/owr"a/0/Ce諸o/，142:69-84;Kenworthy和Edidin(1998)Gelb，M.H.(Ed.)"分子生物學(xué)的方法(MeAocfemo/ecw/ar所o/ogy)"HumanaPressInc，Totowa，NJpp37-49)的方法測定FRET。簡言之，樣品用供體和受體交聯(lián)抗體標(biāo)記，能量轉(zhuǎn)移檢測為受體分子完全光致褪色后供體熒光的增加(脫淬滅)。使用僅用26ic-Cy3探針標(biāo)記的細(xì)胞以便測定褪色(bleach)Cy3所需的最少時(shí)間。采用弧光燈使用Cy3濾光片通過設(shè)定為5分鐘的連續(xù)激發(fā)將Cy3褪色。在這些條件下，Cy5未被褪色。通過下式從受體光致褪色后供體熒光的增加計(jì)算FRET圖像E(%)x100=10，000x[(Cy3褪色后-Cy3褪色前)/Cy3褪色后][2]使用10,000的換算系數(shù)來將E擴(kuò)展至12-位圖像的標(biāo)度。8.2結(jié)果和討論在表1中所示的第一組數(shù)據(jù)中，F(xiàn)RET用來確定在脂質(zhì)筏中參與LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞活化(MonoMac6細(xì)胞)的受體分子濃度。通過進(jìn)行FRET實(shí)驗(yàn)，有可能研究Cpn10(批號(hào)P003-04或CH003)、Hsp60、大腸桿菌GroES和其他分子是否與脂質(zhì)筏共同定位(co-localising)。FRET測量的是在受體熒光基團(tuán)完全光致褪色后對供體熒光的脫淬滅。在破壞受體后供體熒光的增加表明由于能量轉(zhuǎn)移，供體熒光在受體的存在下被淬滅了。使用陽性對照來檢測系統(tǒng)中的能量轉(zhuǎn)移效率，即mAbs至GM1(神經(jīng)節(jié)苷脂，脂質(zhì)筏關(guān)聯(lián)分子)分子上不同表位之間的轉(zhuǎn)移，顯示最大的能量轉(zhuǎn)移效率(E%)為37±1.0。也可使用FITC-GM1和羅丹明-MHC之間的陰性對照，它顯示沒有明顯的能量轉(zhuǎn)移(3±0.4)。這個(gè)本底FRET值被認(rèn)為是因?yàn)閮煞N物種均以高濃度存在而由隨機(jī)FRET所產(chǎn)生的。表1.在供體-受體對之間的能量轉(zhuǎn)移效率值<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>在受體光致褪色后，從供體熒光的增加檢測到不同配對之間的能量轉(zhuǎn)移。數(shù)據(jù)表示為多個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差。表l中顯示的數(shù)據(jù)證明，CD14位于脂質(zhì)筏中，但在LPS刺激前沒有發(fā)現(xiàn)TLR4和脂質(zhì)筏發(fā)生聯(lián)合，很顯然是在LPS刺激后被募集至該處。下一組數(shù)據(jù)描述了再次使用FRET得到的CpnlO與TLR4聚簇的接近度。在表2中，陽性對照是TLR4本身，得到36士2.0的最大能量轉(zhuǎn)移效率(E%)。表2.供體-受體對之間的能量轉(zhuǎn)移效率值<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>在受體光致褪色后，從供體熒光的增加檢測不同配對之間的能量轉(zhuǎn)移。數(shù)據(jù)表示為多個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差。如表2中所示，在缺少LPS時(shí)，CpnlO與Hsp70、Hsp90或CXCR4無關(guān)，但證明在LPS刺激后與這些LPS活化簇的成員發(fā)生聯(lián)系。雖然證明在LPS刺激之前CpnlO與TLR4是否有聯(lián)系的數(shù)據(jù)在此沒有顯示，但在LPS刺激過程中，CpnlO與TLR4有很強(qiáng)的聯(lián)系。這些數(shù)據(jù)也證明，在LPS刺激細(xì)胞之前或之后，Hsp60與TLR4、CD14或脂質(zhì)筏無關(guān)。重要的是，CpnlO的大腸桿菌同系物GroES，其在CpnlO作為免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑的活性的檢測試驗(yàn)中常規(guī)用作陰性對照，其也與脂質(zhì)筏或CD14-非依賴性LPS活化簇的其他成員無關(guān)。實(shí)施例9-CpnlO與TLR聚簇相互作用，并位于PBMC表面的脂質(zhì)筏內(nèi)為了確定內(nèi)源性產(chǎn)生的CpnlO是否在PBMC的表面上與TLR、TLR-相關(guān)分子和脂質(zhì)微結(jié)構(gòu)域的組分相互作用，本發(fā)明人使用熒光基團(tuán)標(biāo)記的抗-CpnlO抗體采用FRET分析新鮮分離的人貼壁單核細(xì)胞對LPS刺激的反應(yīng)。由于在成像之前沒有重組CpnlO加入至細(xì)胞培養(yǎng)中，因此在細(xì)胞表面上識(shí)別的CpnlO將是從細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)庫中輸出的。9.1材料和方法IfF/五『游邀匸游#記。從健康供體血液中使用密度梯度離心經(jīng)Ficoll-Hyp叫ue分離PBMC，并制備貼壁細(xì)胞。沖洗細(xì)胞以便去除非貼壁細(xì)胞。余下的貼壁細(xì)胞單層(l-2xl()S單核細(xì)胞/L)在24孔板中添加了0.01%L-谷氨酰胺和40pg/ml慶大霉素的無血清培養(yǎng)基(Gibco)中培養(yǎng)。一份富含單核細(xì)胞的制劑通過流式細(xì)胞儀來常規(guī)地評價(jià)純度(>80%純度)?；蛘撸鶕?jù)己發(fā)表的方案(Bender,A等人，1996.J^wmmo/M"/jody196:121-135)在FRET測定之前，從富貼壁外周血單核細(xì)胞中將單核細(xì)胞來源的DC與GM-CSF和IL-4(R&DSystems)培養(yǎng)5天?；旧先缫郧鞍l(fā)表的那樣(Triantafilou，K2001.Ato/"ww"o/2:338-345)進(jìn)行用于FRET分析的細(xì)胞標(biāo)記。新鮮分離的人單核細(xì)胞或單核細(xì)胞來源的DC用100ng/mlLPS(來自Sw/m7^oto,ListLabs,CA的Re-LPS)、10ng/ml金黃色葡萄球菌LTA(由ThomasHartung，Konstanz,Germany饋贈(zèng))、0.1ng/mlpoly(I:C)、20ng/ml咪喹莫特、1(aMCpGODN(Invivogen)、25pg/ml從柯薩奇病毒B3純化的ssRNA、或緩沖液對照刺激10min，洗滌，然后用供體交聯(lián)抗體(Cy3)和受體交聯(lián)抗體(Cy5)的l:l混合物標(biāo)記。然后固定細(xì)胞以防止蛋白質(zhì)可能的再重組。貧沐。在FRET分析中使用的抗體包括CpnlO(Johnson,B.2005.J:所o/C/zem280:4037-4047)、Hsp70、CXCR4、TLR3、TLR7、TLR9(SantaCruz)、TLR2(Genentech)、Hsp90(Bioquote)、CD14(26ic,ATCC，來自HB246雜交瘤)、GM1(GM1-1，Calbiochem，GM1-2b,NorthStarBioproducts,Liverpool,UK)、I類MHC(MCA115,Serotec)、TLR4(HTA125,HyCult)?？贵w使用FluoroLink標(biāo)記試齊lj盒(AmershamPharmacia)用Cy3或Cy5進(jìn)《亍氺示記。Fi￡rM#。用氦/氖激光在543nm處發(fā)射來激發(fā)Cy3，用氦/氖激光在633nm處發(fā)射來激發(fā)Cy5。細(xì)胞在CarlZeiss,Inc.LSM510META共聚焦顯微鏡(裝有Axiovert200熒光顯微鏡)上使用1.4NA63xZeiss物鏡成像。使用LSM2.5圖像分析軟件(CarlZeiss,Inc.)分析圖像。使用合適的濾光片組檢測Cy3和Cy5。對圖像采集使用典型的曝光次數(shù)(小于5s)，從Cy3-標(biāo)記的樣品未觀察到熒光。僅用一個(gè)激光連續(xù)地對軌跡進(jìn)行掃描，在每次掃描時(shí)各個(gè)檢測器通道都處于打開狀態(tài)。FRET測量的是在受體熒光基團(tuán)完全光致褪色后對供體熒光的脫淬滅。能量轉(zhuǎn)移(E)效率根據(jù)r和Ro(特征性的Forster距離)來定義E=l/[1+(r/Ro)6](29)。該FRET測量方法以前曾有描述(30)。9.2結(jié)果如表3中所示，發(fā)現(xiàn)在LPS剌激后，內(nèi)源性產(chǎn)生的Cpnl0與TLR4和TLR4信號(hào)復(fù)合體的其他成員發(fā)生聯(lián)系。LPS刺激之前鑒定到的Cpnl0與脂質(zhì)筏部分的相互作用，表明其是從死細(xì)胞中釋放的，或由于純化過程中對細(xì)胞的物理操作所引起的上調(diào)。內(nèi)源性Cpnl0在脂質(zhì)筏結(jié)構(gòu)域內(nèi)的證明，表明了其遞送至細(xì)胞表面上和細(xì)胞外分泌的方式。表3.如FRET所測定，內(nèi)源性CpnlO與PBMC上的TLR4信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)合體的脂質(zhì)筏和膜發(fā)生聯(lián)合<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>數(shù)據(jù)表示為幾個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差。本發(fā)明人也試圖使用FRET分析和新鮮分離的細(xì)胞確定CpnlO是否與其他的TLR直接發(fā)生聯(lián)系。FRET測量的是在受體熒光基團(tuán)完全光致褪色后對供體熒光的脫淬滅。如表4中所示，在存在配體但不是缺少配體的情況下，在CpnlO和位于細(xì)胞表面上和單核細(xì)胞來源的DC(MoDC)的內(nèi)涵體中的大多數(shù)TLR之間(除了TLR3以外)觀察到很大的脫淬滅。(注意與MoDC上TLR7和9的陽性FRET信號(hào)最可能說明，在細(xì)胞的MoDC群體中存在小量的pDC。)表4.如FRET所測定，在配體存在但不是缺少配體的情況下，<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>在受體光致褪色后，從供體熒光的增加檢測不同配對之間的能量轉(zhuǎn)移(E士AE(%))。對于每個(gè)配對，供體(Cy3)為CpnlO，例外是對照試驗(yàn)中供體(Cy3)為TLR4;受體(Cy5)是TLR。通過下式從受體光致褪色后供體熒光的增加計(jì)算FRET:E%x100=10,000[供體褪色后-供體褪色前)/供體褪色后]。數(shù)據(jù)表示為幾個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差。實(shí)施例10-TLR結(jié)合對C。n10的作用為了確定TLR結(jié)合與CpnlO之間的關(guān)系，尤其是檢測CpnlO是否是免疫系統(tǒng)的內(nèi)源性調(diào)節(jié)劑，本發(fā)明人檢驗(yàn)了內(nèi)源性CpnlO是否是以TLR結(jié)合或細(xì)胞因子活化的形式由細(xì)胞應(yīng)激誘導(dǎo)的。本發(fā)明人也檢驗(yàn)了當(dāng)經(jīng)受了合適的刺激時(shí)，CpnlO是否能從細(xì)胞中釋放，以及CpnlO是否能限制其他TLR的配體誘導(dǎo)的信號(hào)。10.1材料和方法試#〃?；旧先缜八?Johnson,B.2005.乂歷o/CTzem280:4037-4047)由BresaGenLimited(Adelaide,Aus)生產(chǎn)GMP規(guī)格的重組人Cpn10。通過SDS-PAGE測定CpnlO的純度要〉99%，且在GroEL-介導(dǎo)的硫氰酸生成酶重折疊化驗(yàn)中(Brinker等人，2001.Ce〃,107:223-233)顯示與GroES相同的摩爾活性(數(shù)據(jù)未顯示)。對于FACS分析，將半胱氨酸殘基加工至CpnlO的C-末端上，并根據(jù)生產(chǎn)廠商的說明書標(biāo)記以AlexFluor647(Invitrogen)。通過Endosafe化驗(yàn)(CharlesRiverLaboratories)測定CpnlO的LPS污染通常要<0.2EU/mg蛋白。TLR配體和細(xì)胞因子包括大腸桿菌LPS(菌株055:B5，Sigma)、大腸桿菌超純LPS(0111:B4Sigma)、金黃色葡萄球菌LTA、枯草芽孢桿菌LTA、金黃色葡萄球菌PGN、枯草芽孢桿菌PGN、來自釀酒酵母的酵母多糖細(xì)胞壁、poly(I:C)、咪喹莫特R837、CpGODN1826和ODN2216、GpCODN1826對照(所有都來自Invivogen，SanDiego,CA)、重組鼠IFNy(Chemi匿)、IL-1(3(PeproTech)和重組人TNF-a(Invivogen)。貧伴。培養(yǎng)針對CpnlO的兔多克隆抗體，并通過CBio親和純化。識(shí)別磷酸化信號(hào)蛋白(人和鼠均有)的流式細(xì)胞小球微陣列術(shù)(CytometricBeadArray,CBA)FlexSets來自BD，上述信號(hào)蛋白包括ERKl/2(T202/Y204)、JNK1/2(T183/Y185)、p38/MAP激酶(T180/Y182)、CD14和FcBlock(CD16/CD32)。存糴、潘;^,y激浙^動(dòng)7分橋。pCAT/LUC-CPN啟動(dòng)子構(gòu)建物由M.Ryan禾卩N.Hoogenraad(LaTrobeUniversity,Melbourne)提供。使用GeneJuice(Novagen)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞。24h后收獲細(xì)胞，通過臺(tái)盼藍(lán)染料排除試驗(yàn)來評價(jià)細(xì)胞活力。細(xì)胞接種在24孔板中，熱休克(43。C15min(輕度)、30min(中度)或60min(重度))，然后在37°C恢復(fù)，或18h后刺激。細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)裂解試劑(CellCultureLysisReagent,CCLR，Promega)中洗滌并收獲，使用螢光素酶測定系統(tǒng)(Promega)禾卩WallacVictor2多標(biāo)記計(jì)數(shù)儀(Perkin-Elmer)來測量螢火蟲螢光素酶信號(hào)?！獙?shí)好尸CT。RAW264.7細(xì)胞以2.5xlOVml接種在無菌24孔板中，并在刺激之前貼壁16-20小時(shí)。對每種條件測定重復(fù)樣品。使用Dynabeads(Dynal)分離mRNA，用寡聚(dT)引物和SuperscriptIIIFirst-StrandSynthesisSystem逆轉(zhuǎn)錄而進(jìn)行RT-PCR(Invitrogen)。生成的cDNA以雙份在IO^qPCR反應(yīng)中進(jìn)行擴(kuò)增，每份含有2.5pl稀釋的(20%)cDNA模板、6.25piPlatinumSYBRGreenqPCRSupermix-UDG(Invitrogen)和0.25pi各10的正義和反義引物。反應(yīng)條件如下95。C2分鐘，以95。C10秒、60°C15秒和72'C20秒進(jìn)行40循環(huán)，最后的熔化步驟為72-95°C50秒。在Rotor-Gene3000儀器(CorbettResearch)上進(jìn)行qPCR反應(yīng)。靶基因表達(dá)根據(jù)看家基因?qū)φ者M(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并如前所述進(jìn)行分析(Livak，KJ.,和T.D.Schmittgen.2001,A/eAoA25:402-408)。引物18S正義CGGCTACCACATCCAAGGAA(SEQIDNO:5)，18S反義GCTGGAATTACCGCGGCT(SEQIDNO:6);反義CAGGCTCAATCTCTCCACTC(SEQIDNO:8);Pbgd正義CCTGGTTGTTCACTCCCTGA(SEQIDNO:9)，Pbgd反義CAACAGCATCACAAGGGTTTT(SEQIDNO:10)。潘應(yīng)潛養(yǎng)J:塘I、激應(yīng)罄應(yīng)產(chǎn)激截崇孝i^^/^源絲Q"/0游定著。未轉(zhuǎn)染的RAW264.7細(xì)胞如上所述進(jìn)行處理，濃縮培養(yǎng)上清液。評價(jià)細(xì)胞的活力，將每種條件下的細(xì)胞集中在一起(n=4)，離心成片狀，并重新懸浮在CCLR中。通過改良Bradford測定法(BioRad)對總細(xì)胞蛋白含量進(jìn)行定量。通過ELISA(檢出限0.195ng/ml)分析細(xì)胞上清液和提取物(每個(gè)樣品25昭)中的CpnlO水平。在進(jìn)入研究時(shí)通過ELISA檢測臨床試驗(yàn)受試者血清中的循環(huán)CpnlO水平。根據(jù)GCP指導(dǎo)原則進(jìn)行這些試驗(yàn)，并在樣品檢測之前每位受試者簽署書面的知情同意書。由當(dāng)?shù)刂行牡娜祟悅惱砦瘑T會(huì)批準(zhǔn)試驗(yàn)方案。T^『2似.7-///K-丄77Mt/C^/定。如前所述進(jìn)行RAW264.7-HIV-LTR-LUC測定(Johnson,B.2005.編C/zem280:4037-4047)。細(xì)胞與CpnlO或?qū)φ站彌_液預(yù)孵育2小時(shí)，然后加入一定劑量范圍的TLR配體。在每個(gè)測定試驗(yàn)中，CpnlO的檢測濃度范圍是25-10(HLg/ml，使用的配體濃度要形成尖銳的劑量反應(yīng)曲線，即大腸桿菌LPS為0.2-5ng/ml，超純大腸桿菌LPS為5-10ng/ml，LTA和PGN為10-100嗎/ml，酵母多糖為10-100ng/ml，poly(I:C)為10-100嗎/ml，咪喹莫特為1-10pg/ml，且CpGODN為3.25-16.25嗎/ml。優(yōu)化與每種激動(dòng)劑的孵育時(shí)間以保證信號(hào)足以在本底之上。作為人Cpn10的陰性對照，常規(guī)使用稱為GroES的Cpn10的大腸桿菌同系物(基本上如以前所述進(jìn)行純化(Brinker，2001.Ce//107:223-233))。注意在Cpn10和GroES制劑和TLR配體試劑中的內(nèi)毒素污染物水平已知要小于以前在這些測定中用于誘導(dǎo)HIV-LTR活化的濃度下使用這種細(xì)胞系所顯示的水平(Johnson,B.2005.J.所o/C7zem280:4037-4047)。乂尸SMC,智應(yīng)茵子#/定。從健康志愿者的血液中通過在Ficoll-PaquePlus(AmershamBiosciences)上進(jìn)行浮力密度梯度離心而分離PBMC。PBMC用Cpn10(或緩沖液對照)預(yù)處理1h，然后用激動(dòng)劑在37°C和5%C02下刺激20h，然后收集培養(yǎng)上清液。使用CBA(BD)或ELISA(BenderMedSystems)分析細(xì)胞因子水平。^^錄麼眾游澄,。RAW264.7或PBMC用CpnlO孵育2h，然后用LPS朿U激30min，離心，用0.1%SDS/PBS溶解片狀物。溶胞產(chǎn)物煮沸5min，冷卻，通過離心將細(xì)胞碎片成團(tuán)，如上測定上清液的蛋白濃度。使用用于p38、ERK1/2和JNKl/2的BDCBAFlexSets來檢測磷酸化的信號(hào)蛋白?；蛘?，RAW264.7用Cytofix/Cytoperm(BD)處理，并雙重染色細(xì)胞內(nèi)p38和細(xì)胞表面CD14。使用BDFACSArrayBioanalyzer以FCAP陣列軟件分析樣品。統(tǒng)^學(xué)分叛。使用單側(cè)ANOVA禾nTukey多重比較檢驗(yàn)(Tukey，sMultipleComparisonTest)在最佳激動(dòng)劑濃度下比較未刺激條件與剌激條件以評價(jià)細(xì)胞刺激后啟動(dòng)子活性的變化。使用單側(cè)ANOVA和Tukey多重比較事后檢驗(yàn)(Tukey，sMultipleComparisonPostTest)來對受試者血清樣品中的CpnlO的組間顯著性進(jìn)行檢驗(yàn)。10.2結(jié)果10.2丄TLR結(jié)合誘導(dǎo)Cpnl0啟動(dòng)子RAW264.7細(xì)胞用報(bào)告子構(gòu)建物進(jìn)行轉(zhuǎn)染，在該構(gòu)建物中螢光素酶的產(chǎn)生處于Cpnl0啟動(dòng)子的控制下。純化的重組IFNy、TNF-a和IL-lf3作為非TLR激動(dòng)劑進(jìn)行檢測。用中度熱休克(43°C，30min)處理的細(xì)胞證明在6h的恢復(fù)時(shí)間點(diǎn)時(shí)，Cpnl0啟動(dòng)子有明顯的誘導(dǎo)，18h時(shí)返回到基線水平(圖18A)。隨后確定TLR激動(dòng)劑劑量依賴性地誘導(dǎo)Cpn10啟動(dòng)子，20小時(shí)后觀察到最大活化(圖18A和圖19C)。然后優(yōu)化激動(dòng)劑濃度以誘導(dǎo)最大啟動(dòng)子反應(yīng)(圖18B-G)。比較對TLR和非TLR激動(dòng)劑的反應(yīng)表明Cpn啟動(dòng)子活性具有獨(dú)特的特征曲線(圖18H)。觀察到作為對TLR2、7和9的配體的反應(yīng)，Cpn10有明顯的上調(diào)，表明與MyD88-依賴性TLR信號(hào)傳導(dǎo)通路有關(guān)。使用可采用TRIF-依賴性信號(hào)傳導(dǎo)通路的TLR配體(TLR3和4)則沒有觀察到CpnlO啟動(dòng)子有顯著的上調(diào)。而且，非TLR激動(dòng)劑IFNY、IL-l卩和TNF-a不能誘導(dǎo)Cpn10啟動(dòng)子的實(shí)質(zhì)性上調(diào)，表明在Cpn10的轉(zhuǎn)錄控制方面有一定程度的特異性。作為TLR-誘導(dǎo)的Cpn10轉(zhuǎn)錄的另一證據(jù)，使用實(shí)時(shí)PCR分析顯示LTA對RAW264.7細(xì)胞的刺激引起了濃度依賴性地誘導(dǎo)Cpn10mRNA，在18h時(shí)達(dá)到最大誘導(dǎo)，刺激后24h返回至基線水平附近(圖181)。10.2.2.在TLR結(jié)合后CpnlO從細(xì)胞中釋放為了檢驗(yàn)當(dāng)經(jīng)受合適的刺激時(shí)，Cpn10是否從細(xì)胞中釋放，本發(fā)明人用LTA刺激RAW274.7細(xì)胞，通過ELISA監(jiān)測內(nèi)源性CpnlO的存在、以及由細(xì)胞釋放至培養(yǎng)基中的CpnlO。細(xì)胞溶胞產(chǎn)物的分析顯示LTA處理的細(xì)胞和對照細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)CpnlO水平變化很小(圖19A)。但培養(yǎng)上清液的分析則顯示，在30h后可溶性CpnlO較未受刺激的對照細(xì)胞增加了3倍(圖19B)。另外，刺激細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外CpnlO水平與CpnlO啟動(dòng)子活性隨時(shí)間變化而見到的增加是相關(guān)的(圖19C)。這些數(shù)據(jù)表明在免疫激發(fā)的條件下產(chǎn)生的一部分新合成的CpnlO是由細(xì)胞釋放的。接受輕度、中度或重度熱休克(HS)的細(xì)胞(RAW264.7或pCAT/LUC-CPN-轉(zhuǎn)染的RAW264.7細(xì)胞)的培養(yǎng)上清液分析證明，與用LTA刺激的細(xì)胞上清液相比，細(xì)胞外CpnlO的積聚很少(圖19D)。這些數(shù)據(jù)表明CpnlO被HS誘導(dǎo)以協(xié)助線粒體蛋白錯(cuò)折疊，而特異性免疫激發(fā)引起CpnlO的細(xì)胞外積聚。為了獲得CpnlO可在疾病中被調(diào)節(jié)的證據(jù)，本發(fā)明人檢測了患有慢性炎性疾病的患者的CpnlO基線血清水平，并將其與健康志愿者組群進(jìn)行比較。如圖19E中所示，患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者中的CpnlO循環(huán)水平明顯高于多發(fā)性硬化癥患者、銀屑病患者或健康受試者(分別為1.32ng/ml±L41，n=23;0.44ng/ml士0.46，n=46;0.55ng/ml±0.52,n=25;0.45ng/ml±0.32,n=24)。因此各個(gè)CpnlO血清水平與個(gè)體正在發(fā)生的炎癥和/或疾病水平有關(guān)聯(lián)。不管是否是由于細(xì)胞裂解后的被動(dòng)釋放或是炎性激發(fā)過程中免疫細(xì)胞刺激后的刺激性釋放引起的，很清楚的是CpnlO積聚在細(xì)胞外環(huán)境中，且某些細(xì)胞刺激會(huì)增強(qiáng)其排出。10.2.3.CpnlO限制TLR信號(hào)傳導(dǎo)的動(dòng)力學(xué)本發(fā)明人檢驗(yàn)了重組CpnlO是否能限制其他Toll樣受體的配體所誘導(dǎo)的信號(hào)。此報(bào)告子細(xì)胞系與最佳濃度的CpnlO預(yù)孵育2小時(shí)，然后用各種TLR配體(其范圍從革蘭氏陽性細(xì)菌肽聚糖(PGN)和脂磷壁質(zhì)酸(LTA)至合成的RNA和DNA基序)刺激，與缺少外源性CpnlO時(shí)刺激的細(xì)胞相比，導(dǎo)致NF-KB-誘導(dǎo)的螢光素酶活性明顯降低。除了合成的TLR3配體聚肌苷酸-聚胞苷酸(poly(I:C))以外，在用所有其他被測的TLR配體刺激的細(xì)胞培養(yǎng)物中，CpnlO的存在導(dǎo)致螢光素酶活性20-80%的抑制(圖20A)。這些結(jié)果表明CpnlO能調(diào)節(jié)由大多數(shù)TLR的配體所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答信號(hào)的強(qiáng)度。用LPS刺激細(xì)胞能觸發(fā)MyD88-依賴性和非依賴性信號(hào)級聯(lián)反應(yīng)。MyD88-依賴性級聯(lián)反應(yīng)是除了TLR3以外所有TLR所共用的，并涉及NF-kB和促分裂原活化蛋白(MAP)激酶(MAPK),包括p38、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)和c-JunN-末端激酶(JNK)。兩個(gè)通路的終點(diǎn)是免疫應(yīng)答的啟動(dòng)和動(dòng)力學(xué)的調(diào)節(jié)。為了闡明剌激細(xì)胞后CpnlO調(diào)節(jié)NF-kB活化和細(xì)胞因子產(chǎn)生所經(jīng)歷的事件，本發(fā)明人分析了參與MAP激酶信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平。如圖20B-D中所示，在鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞系(RAW264.7)和新鮮分離的人PBMC中，CpnlO都劑量反應(yīng)性地降低LPS誘導(dǎo)的p38、ERK1/2和JNK1/2的磷酸化水平。由于MAPK通路的活化與細(xì)胞因子產(chǎn)生的炎性級聯(lián)反應(yīng)的誘導(dǎo)密切相關(guān)，這些數(shù)據(jù)證明了在配體誘導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生中，CpnlO-介導(dǎo)的變化來自TLR信號(hào)級聯(lián)反應(yīng)中的變化。為了證實(shí)CpnlO產(chǎn)生由多種TLR配體刺激的新鮮分離的人細(xì)胞所引起的細(xì)胞因子的活性，本發(fā)明人用CpnlO或不用CpnlO預(yù)處理來自健康供體的PBMClh，然后用選定范圍的TLR配體刺激20小時(shí)。然后使用ELISA或流式細(xì)胞小球微陣列術(shù)(CBA)分析細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的細(xì)胞因子水平。如圖20E中所示，在CpnlO的存在下，由TLR2、TLR2/6或TLR4(PGN、LTA、酵母多糖、LPS)的激動(dòng)劑(包括TNF-a、IL-ip、IL-6和IL-10)所誘導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生被抑制。值得注意的是，盡管CpnlO介導(dǎo)對LPS-誘導(dǎo)的IL-10的產(chǎn)生的輕微誘導(dǎo)，但數(shù)據(jù)證明其響應(yīng)其他的TLR配體而減少IL-IO的產(chǎn)生。同樣，與沒有CpnlO的對照培養(yǎng)物相比，在CpnlO的存在下用TLR7或9的激動(dòng)劑與咪喹莫特或CpGODN剌激PBMC，引起TNF-a的產(chǎn)生減少，并增加IFNa。10.3討論本研究揭示了以前沒有認(rèn)識(shí)到的CpnlO作為免疫系統(tǒng)的內(nèi)源性調(diào)節(jié)劑的作用。經(jīng)受體的TLR系統(tǒng)而不是通過TNF-a、IFNy或IL-l卩受體剌激細(xì)胞，誘導(dǎo)了CpnlO啟動(dòng)子和可在細(xì)胞外培養(yǎng)基中檢測到的CpnlO蛋白的產(chǎn)生。重組CpnlO的加入劑量反應(yīng)性地限制TLR-驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞活化(通過NF-kB活化來評價(jià))、MAPK磷酸化、以及鼠細(xì)胞系和新鮮分離的人PBMC在體外產(chǎn)生細(xì)胞因子。這些證明免疫損傷(insult)誘導(dǎo)CpnlO的結(jié)果，以及顯示CpnlO-介導(dǎo)的限制炎性反應(yīng)大小的數(shù)據(jù)，提供了強(qiáng)有力的證據(jù)證明，CpnlO是對免疫應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)很重要的負(fù)反饋通路的重要成員。實(shí)施例11-在LPS刺激后CpnlO-誘導(dǎo)的對TLR4表達(dá)的改變本發(fā)明人設(shè)法確定了Cpnl0對RAW264細(xì)胞中TLR4表達(dá)的影響，以便檢驗(yàn)在LPS刺激后CpnlO是否能影響TLR4的表面表達(dá)。11.1材料和方法LPS源自大腸桿菌(Sigma)，抗-鼠TLR4/MD-2-生物素和抗生蛋白鏈菌素-藻紅蛋白來自eBioscience，且抗-鼠IFN-y來自BD。在存在或不存在100嗎/mlCpnlO的懸液中，細(xì)胞培養(yǎng)指定的時(shí)間。然后細(xì)胞轉(zhuǎn)移至10ml試管中，計(jì)數(shù)，聚團(tuán)并重新懸浮在新鮮培養(yǎng)基中。將100pl細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至Eppendorf管(106細(xì)胞/管)中。在置于孵箱中的Eppendorf管中進(jìn)行4小時(shí)CpnlO處理和LPS刺激，每15分鐘輕輕地進(jìn)行混合。細(xì)胞用PBS/0.2%FBS洗滌3次?？?鼠TLR4-生物素(1^在50piPBS/0.2%FBS中)或?qū)φ湛贵w(抗-鼠IFN-y-生物素)與細(xì)胞在冰上孵育1小時(shí)。細(xì)胞在1mlPBS/0.2%FBS中洗滌3次，然后用50nlPBS/10%FBS在4°C下封閉45min。然后以1/100稀釋液加入抗生蛋白鏈菌素-PE，并在冰上繼續(xù)孵育l小時(shí)。3次洗滌后，細(xì)胞固定在1Q/。多聚甲醛/PBS中，并使用CellQuest軟件在FACSCaliber上進(jìn)行分析。11.2結(jié)果C戶70與W腔似潘應(yīng)4V、好f改變7XW表這。使用抗-鼠TLR4/MD-2-生物素然后使用抗生蛋白鏈菌素-PE很容易在RAW264細(xì)胞的表面上檢測到TLR4(圖21)。對照抗體不能顯示明顯的染色(數(shù)據(jù)未顯示)。CpnlO處理4小時(shí)或?qū)φ站彌_液的處理都不能改變TLR4表達(dá)。丄尸S7^源JZ/^^7Qrt"游嚴(yán)喊。加入2ng/mlLPS使加入LPS2小時(shí)后的TLR4表達(dá)輕微的減少(圖22)，20ng/mlLPS引起TLR4表達(dá)幾乎完全消失(圖23)。Cpn10孵育4小時(shí)不顯著地改變加入LPS后TLR4的行為。當(dāng)CpnlO處理延長至過夜時(shí)，與緩沖液處理的細(xì)胞(圖24和25)相比，TLR4表達(dá)輕微地減少(圖24和25)。當(dāng)給予細(xì)胞2ng/mlLPS時(shí)，在CpnlO處理的細(xì)胞中LPS-介導(dǎo)的TLR4表達(dá)的減少稍微更顯著一些(圖24)。當(dāng)細(xì)胞用20ng/mlLPS處理時(shí)，在所有組中TLR4表達(dá)基本上都消失(圖25)。11.3討論和結(jié)論由4小時(shí)CpnlO處理所介導(dǎo)的LUC活性減少，引起LPS-誘導(dǎo)的NF-kB活化減少30-50%。這種作用不可能是由于CpnlO-介導(dǎo)的TLR4表達(dá)下調(diào)所引起的，因?yàn)檫@種處理對TLR4的表達(dá)水平改變很小。由2ng/mlLPS所介導(dǎo)的下調(diào)可能在4小時(shí)CpnlO處理后稍微顯著一些，在CpnlO處理過夜后當(dāng)然更顯著一些。這些結(jié)果表明CpnlO能改變加入LPS后TLR4表達(dá)的動(dòng)力學(xué)。實(shí)施例12-CpnlO限制對廣譜的TLR激動(dòng)劑的細(xì)胞反應(yīng)本發(fā)明人要證明CpnlO-介導(dǎo)的對許多TLR配體所誘導(dǎo)的NF-kB活化的抑制作用的廣泛性。12.1材料和方法大腸桿菌LPS055:B5來自Sigma,而大腸桿菌LPS0111:B4超純(1x106EU/mg)、金黃色葡萄球菌脂磷壁質(zhì)酸(LTA)(12.5EU/mg)、金黃色葡萄球菌肽聚糖(PGN)(<0.125EU/mg)、枯草芽孢桿菌脂磷壁質(zhì)酸(LTA)(12.5EU/mg)、枯草芽孢桿菌肽聚糖(PGN)(0.25EU/mg)、釀酒酵母酵母多糖(<0.125EU/ml)、咪喹莫特R837、CpGODN1826(鼠)、CpGODN2216(人)禾卩GpCODN1826(非刺激性對照)都來自Invivogen。重組鼠IL-1卩來自R&DSystems，重組鼠IFNy和重組鼠TNFa來自Chemicon。流式細(xì)胞小球微陣列來自BD。Wff2^-///r-L7^-丄t/C生激#定法?；旧先鏙ohnson,B.等人，2005.JAo/C72em280:4037-4047中所述進(jìn)行生物測定。在每個(gè)測定中，Cpn10以25-100(ig/ml的濃度范圍進(jìn)行檢測，使用的刺激物濃度要形成尖銳的劑量反應(yīng)曲線，即大腸桿菌LPS為0.2-5ng/ml，超純大腸桿菌LPS為5-10ng/ml，金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌LTA和PGN為10-100|ig/ml，釀酒酵母酵母多糖為10-100pg/ml。要注意的是，在Cpnl0制劑和TLR配體中的內(nèi)毒素污染水平，己知要小于以前在這些測定中用于誘導(dǎo)HIV-LTR活化的濃度下使用該細(xì)胞系所顯示的水平(Johnson,B.等人2005./歷o/C77em280:4037-4047)。在下面顯示的數(shù)據(jù)中，要注意的是以NF-kb活化來描述此細(xì)胞系的刺激的讀出，其基于下述理解:HIVLTR已知對NF-kB活化具有高度的反應(yīng)性，因此是該轉(zhuǎn)錄因子活化的間接量度。乂/Zy^i孝孩:智應(yīng)覷定。從健康志愿者的肝素化血液中通過浮力密度梯度離心經(jīng)Ficoll-PaquePlus(AmershamBiosciences)分離PBMC。PBMC用作新鮮分離的細(xì)胞，或者將母液保存在冷凍管中在液氮中備用。PBMC以8x1()S活細(xì)胞/ml的密度以200lil/孑L分酉己至96孑L組纟只培養(yǎng)板(GreinerBio-One,Kremsmuenster，Austria)中。加入Cpnl0保持1小時(shí)，然后用激動(dòng)劑在37°C和5%C02下刺激20小時(shí)，然后收集培養(yǎng)上清液。使用市售的ELISA試劑盒(R&DSciences)和流式細(xì)胞小球微陣列(BD)分析細(xì)胞因子水平。澄^Z/f號(hào)i^7游)^浚眾^t乎。RAW264.7或PBMC與Cpnl0孵育2h，然后LPS刺激30min，離心，片狀物用0.1%SDS/PBS溶解。溶胞產(chǎn)物煮沸5min，冷卻，通過離心使細(xì)胞碎片成團(tuán)，如上檢測上清液中的蛋白濃度。使用用于p38、ERK1/2和JNK1/2的BDCBAFlexSets檢測磷酸化信號(hào)蛋白?；蛘撸肅ytofix/Cytoperm(BD)處理RAW264.7，并雙重染色細(xì)胞內(nèi)p38和細(xì)胞表面CD14。采用BDFACSArrayBioanalyzer使用FCAP陣列軟件分析樣品。12.2結(jié)果2Xi激動(dòng)淑誘導(dǎo)游fl7F-L77游活眾。圖26中的數(shù)據(jù)證明了Cpn10在鼠巨噬細(xì)胞RAW264-HIV-LTR-LUC細(xì)胞中調(diào)節(jié)NF-kB活化的能力，該細(xì)胞用一定濃度范圍的TLR配體刺激。我們已檢測了大量TLR的配體，包括超純LPS(僅TLR4)和非再純化的LPS(描述為同時(shí)刺激TLR2和TLR4)、來自兩種革蘭氏陽性細(xì)菌(枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌)的LTA(TLR2)、和來自上述兩種革蘭氏陽性細(xì)菌的PGN(TLR2)。另外，細(xì)胞用從酵母釀酒酵母的細(xì)胞壁分離的制劑，酵母多糖(TLR2/TLR6)和合成的雙鏈RNA，poly(I:C)刺激，上述poly(I:C)能結(jié)合TLR3并通過其刺激細(xì)胞。細(xì)胞用CpGDNA(TLR9)或咪喹莫特(R837)刺激后也進(jìn)行檢測，咪喹莫特(R837)是一種低分子量的合成分子，其在Cpn10的存在下經(jīng)TLR7MyD88-依賴性通路活化細(xì)胞。數(shù)據(jù)顯示在被檢測的四種TLR(TLR2、4、7、9)結(jié)合后，CpnlO能誘導(dǎo)調(diào)節(jié)NF-KB的活化。圖27描繪了由各種TLR配體刺激的RAW264-HIV-LTR-LUC細(xì)胞中CpnlO誘導(dǎo)的螢光素酶活性抑制的最大百分比。盡管被測的大多數(shù)配體的反應(yīng)模式都非常相似，即平均抑制50%的HIV-LTR活化，但CpnlO似乎不響應(yīng)poly(I:C)而改變TLR3-誘導(dǎo)的NF-kB活化。而且，CpnlO對酵母細(xì)胞壁制劑酵母多糖活化的細(xì)胞發(fā)揮的NF-icB抑制作用有限，大約為20%。Q"M對瓶敏^,號(hào)^^游錄麼眾欣影賄。LPS剌激RAW264細(xì)胞活化了幾種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路，包括IkappaB激酶(IKK)-NF-kB通路和三種促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)l禾n2、c-JimN-末端激酶(JNK)和p38。在更遠(yuǎn)的下游，這些信號(hào)傳導(dǎo)通路活化許多轉(zhuǎn)錄因子，包括NF-kB和AP-1，然后它們協(xié)調(diào)地誘導(dǎo)編碼炎性介質(zhì)的基因。為了評價(jià)CpnlO對這些信號(hào)系統(tǒng)的影響，本發(fā)明人測定了在存在或不存在CpnlO的情況下，用LPS刺激30分鐘的細(xì)胞中磷酸化的p38、JNK1/2和ERK1/2的水平。本發(fā)明人顯示了CpnlO劑量反應(yīng)性地限制信號(hào)傳導(dǎo)通路的每個(gè)這些成員的LPS-誘導(dǎo)的磷酸化(圖2S)。為了證實(shí)CpnlO對用多種TLR配體刺激的新鮮分離人細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的活性，本發(fā)明人用CpnlO預(yù)處理來自健康供體的PBMC1h，然后用選定范圍的TLR配體刺激20h。然后使用ELISA或流式細(xì)胞小球微陣列來測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的細(xì)胞因子水平。如圖29A-D中所示，在CpnlO的存在下，由TLR2或TLR4(PGN、LTA、酵母多糖、LPS)的激動(dòng)劑，包括TNF-ouIL-1(3、IL-6和IL-10所誘導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生減少了。同樣，圖29E中的數(shù)據(jù)指示，與不使用CpnlO的對照培養(yǎng)物相比，在CpnlO的存在下用TLR7或9的激動(dòng)劑以及咪喹莫特或CpG(ODN2216)刺激PBMC，引起細(xì)胞因子的產(chǎn)生減少。C戶M厥/A/,然后洗^不嚴(yán)喊Q""銜煮fL尸&誘導(dǎo)游M^^活眾游激力。本發(fā)明人以前已經(jīng)證明，在用LPS刺激之前用CpnlO與RAW264-HIV-LTR-LUC細(xì)胞預(yù)孵育2小時(shí)，使螢光素酶活性的劑量反應(yīng)性降低達(dá)到最佳化。如圖30所示，現(xiàn)在也己證明在LPS刺激之前與Cpnl0預(yù)孵育2小時(shí)，然后進(jìn)行PBS洗滌，不改變CpnlO-介導(dǎo)的螢光素酶活性(作為NF-kb活化的量度)降低。求7X7激動(dòng)^/遂導(dǎo)游7VF-W^眾。為了進(jìn)一步表征CpnlO的活性，本發(fā)明人檢測了CpnlO對許多非TLR激動(dòng)劑的調(diào)節(jié)作用。作為此非TLR試驗(yàn)方案的一部分，在CpnlO的存在下，RAW264.7細(xì)胞用l-10ng/ml的低內(nèi)毒素(2.24EU/mg)重組鼠IFNj刺激6小時(shí)(圖31)。收集細(xì)胞上清液并使用ELISA分析TNF-a。發(fā)現(xiàn)CpnlO能促進(jìn)IFN-y誘導(dǎo)的TNF-a產(chǎn)生。當(dāng)在IFN-y刺激之前細(xì)胞與CpnlO預(yù)孵育2小時(shí)時(shí)，對TNF-a的產(chǎn)生的這種顯著協(xié)同增效作用被增強(qiáng)。在CpnlO存在2小時(shí)或4小時(shí)的情況下，在用IFN-y刺激的RAW264-HIV-LTR-LUC細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物中也測定到較高的NF-KB-誘導(dǎo)的螢光素酶水平。12.3討論和結(jié)論本發(fā)明人己經(jīng)證明了CpnlO調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞對多種TLR(包括TLR2、4、7和9)-特異性配體的反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)的能力，并因此證明了CpnlO對NF-kB活化和細(xì)胞因子產(chǎn)生的上游的信號(hào)傳導(dǎo)分子的磷酸化的影響，上述信號(hào)傳導(dǎo)分子是信號(hào)傳導(dǎo)蛋白的MAPK家族成員，包括ERK、JNK和p38。本發(fā)明人也己經(jīng)顯示在被LPS活化的細(xì)胞中，Cpn10劑量反應(yīng)性地減少細(xì)胞內(nèi)磷酸化MAPK的水平。在本實(shí)施例中所示的數(shù)據(jù)證明，CpnlO劑量反應(yīng)性地調(diào)節(jié)在體外用許多TLR配體刺激的巨噬細(xì)胞中的先天性免疫應(yīng)答的動(dòng)力學(xué)。由這些分子觸發(fā)的CpnlO-誘導(dǎo)的抑制NF-kB活化的最大水平為在用TLR7激動(dòng)劑(R837)刺激RAW264-HIV-LTR-LUC細(xì)胞系后為大約80%。在另一種數(shù)值范圍下，以10-100|ig/ml的濃度范圍加入CpnlO不會(huì)影響酵母細(xì)胞壁制劑酵母多糖與TLR2/6結(jié)合的動(dòng)力學(xué)超過20%。對于CpnlO減少NF-kB活化的至少一種例外的模式包括聚肌苷酸-聚胞苷酸(poly(I:C))所引起的活化。Poly(I:C)是雙鏈RNA的合成類似物，其分子模式與經(jīng)與TLR3的相互作用活化NF-kB的病毒感染有關(guān)。CpnlO響應(yīng)此激動(dòng)劑而劑量反應(yīng)性地增加I型干擾素的產(chǎn)生，而不限制NF-kB的活化信號(hào)。實(shí)施例13-細(xì)胞表面受體與交聯(lián)于固體基質(zhì)的CpnlO結(jié)合的鑒定13.1材料和方法分/^薪主潘應(yīng)i^合C戶川游殳謬。使用CpnlO(由CBioLtd提供，批號(hào)CH003)制備親和柱(NHS-活化的Hi-Trap)(AmershamPharmacia)。CpnlO透析入pH8.3的碳酸氫鹽緩沖液中，并根據(jù)生產(chǎn)廠商的說明書交聯(lián)在柱上。使用NP-40溶解緩沖液(0.05%w/v)溶解人單核細(xì)胞。全部細(xì)胞溶胞產(chǎn)物通過CpnlO親和柱，用PBS洗掉未結(jié)合的分子。使用b-辛基-葡糖苷(b-OG)洗脫緩沖液(15mM三乙醇胺，pH11.5，140mMNaCl和30mMb-OG)洗脫CpnlO-結(jié)合受體分子，用pH5的1M2-(N-嗎啉代)乙磺酸中和，并經(jīng)PBS透析。作為對照，細(xì)胞溶胞產(chǎn)物也通過其上不交聯(lián)蛋白的柱子。使用CentriprepYM-10(Millipore)濃縮洗脫液，濃縮至1ml并通過SDS-PAGE(圖32)或2D凝膠(圖33)電泳進(jìn)行分析。對于2D凝膠電泳，在分析之前該濃縮的洗脫溶液使用再水化緩沖液(8M尿素，2%CHAPS，10mMDTT，0.2%Bio-Lyte)(Biorad)進(jìn)行緩沖液交換。切下目的條帶或斑點(diǎn)，胰蛋白酶消化并送去進(jìn)行MALDI-TOF分析。遞過7D凝殿冶欲分蓐歪^。洗脫的溶液用2xSDS-PAGE還原緩沖液(4mll0o/。SDS、2.5ml0.5MTris-HClPH:6.8、5g甘油、1mll4.3M巰基乙醇和5mg溴酚藍(lán))處理，并置于沸水中5分鐘。為了運(yùn)行樣品，使用CriterionTris-HC1Precast4-20%梯度凝膠(Biorad)。全范圍RAINBOW分子量標(biāo)記(2pi)裝入第一個(gè)孔中，剩余的孔裝入40|il樣品。然后凝膠置于電泳槽中，并加入運(yùn)行緩沖液。運(yùn)行緩沖液由0.025MTris、0.2M甘氨酸、0.1。/。SDS組成，并調(diào)節(jié)至pH8.3。以200V恒定電壓進(jìn)行電泳50分鐘。電泳后，取出凝膠，用固定緩沖液(40%乙醇、10%乙酸、50%H2O)固定過夜，用考馬斯藍(lán)染料(50%考馬斯藍(lán)(0.3w/v)、25%甲醇、5%乙酸、20%H2O)染色1.5小時(shí)。該凝膠最后用脫色液(10%乙醇、10%乙酸、80%H2O)洗漆幾次以脫色。遞過2D/凝i冶妖分/f"歪力。使用非線性固化pH梯度(3-10ReadyStripIPG膠條llcm)作為第一向。吸取等分的200jLil樣品至聚焦盤中，然后將IPG膠條置于其上，膠側(cè)向下，浸入含有樣品和緩沖液的溶液中。礦物油置于IPG膠條上以避免尿素沉淀。膠條在被動(dòng)條件下在2(TC再水化12小時(shí)。然后膠條以恒定的每膠條50(iA，6000-7000伏特聚焦，大約52,000v-hr。為了制備用于第二向的ReadyStripIPG膠條，將其從聚焦盤中取出，并在5ml含50mMTrisHCl，pH8.8、6M尿素、2%SDS、30%甘油、1。/。DTT的緩沖液中平衡。在5ml體積的相同緩沖液中進(jìn)行第二次平衡，該緩沖液中用1.5。/。碘乙酰胺替代DTT。平衡后，將ReadyStripIPG膠條置于Criterion凝膠(4-20%梯度)上，并覆蓋以帶有微量巰基乙醇的0.5%瓊脂糖。該凝膠在Criterion電泳槽(cell)中以200V運(yùn)行60min。電泳后取出凝膠，用固定緩沖液(40%乙醇、10%乙酸、50%H2O)固定過夜，用考馬斯藍(lán)染料(50%考馬斯藍(lán)(0.3w/v)、25%甲醇、5%乙酸、20%H2O)染色1.5小時(shí)。該凝膠最后用脫色液(10%乙醇、10%乙酸、80%H2O)洗滌幾次進(jìn)行脫色。13.2結(jié)果遞i^葉,色譜f/7SAS7^C^冶欲分/^"Cp"/0-翁會(huì)歪A。本發(fā)明人使用如下所述的方法進(jìn)行了初步的研究，并使用質(zhì)譜分析鑒定了幾種CpnlO-結(jié)合蛋白，如表5中所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>為了驗(yàn)證這些結(jié)果并確定未被鑒定的蛋白的同源性，本發(fā)明人通過親和色譜重復(fù)地分離CpnlO-結(jié)合蛋白，并通過SDS-PAGE(圖32)以及2-向凝膠電泳(圖33)來分析洗脫的分子。對照試驗(yàn)證明在SDSPAGE上沒有蛋白條帶(數(shù)據(jù)未顯示)，在該對照試驗(yàn)中，細(xì)胞溶胞產(chǎn)物在沒有交聯(lián)蛋白的親和柱上通過。13.3討論和結(jié)論此質(zhì)譜數(shù)據(jù)能鑒定幾種蛋白，這些蛋白對于CpnlO與宿主細(xì)胞的結(jié)合以及CpnlO的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸具有潛在的重要性。尤其是肌動(dòng)蛋白抑制蛋白(profilin)，一種很小的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，其能調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白的聚合動(dòng)力學(xué)，它似乎是一種CpnlO-結(jié)合蛋白。在調(diào)節(jié)CpnlO反應(yīng)中另一個(gè)很重要的分子是GRP78。GRP78是參與CpnlO運(yùn)輸?shù)陌閭H蛋白。實(shí)施例14-CpnlO對用polvI:C體外刺激的細(xì)胞的抗羅斯河病毒反應(yīng)的影響本發(fā)明人想要使用已知對IFNa/|3的抗病毒效應(yīng)高度敏感的病毒來檢測CpnlO是否能影響polyl:C-誘導(dǎo)的抗病毒耐受性。14.1材料和方法Q"M。CpnlO溶解在pH7.6的Tris-鹽水緩沖液中，并分成多個(gè)等分試樣在干冰中冰凍，儲(chǔ)存在-20。C下。在使用前將等分試樣解凍。Po(y/.'C。對于圖34中顯示的數(shù)據(jù)，Polyl:C(由Invivogen提供)以5mg/ml溶解在無菌鹽水中，冰凍保存在-2(TC下。將小瓶解凍，并稀釋至培養(yǎng)基中。對于緩沖液對照，將相同體積的無菌鹽水加入至細(xì)胞培養(yǎng)孔中。對于圖35中顯示的數(shù)據(jù)，PolyI:C以5mg/ml溶解在無菌鹽水中，然后以25jil/500|il進(jìn)行等分，加入62.5(il100%乙醇(2.5倍體積)以沉淀dsRNA。這些試管保存在-7(TC下。在測定當(dāng)天，這些等分試劑以最高轉(zhuǎn)速(13,000rpm)在40°C下離心30分鐘。在70%乙醇DEPC-處理的蒸餾水中將團(tuán)塊洗滌一次，成團(tuán)，去除上清液，在罩內(nèi)將團(tuán)塊干燥(大約15分鐘)，并重新懸浮在100plRPMI1640中。使用BioPhotometer(Eppendorf)的RNA定量特征測定，測定的dsRNA回收率為大約50%。在圖中指定的所有dsRNA濃度都假設(shè)為50%回收率。^"瘋毒試殺。RAW264.7細(xì)胞在瓶中培養(yǎng)成為貼壁培養(yǎng)物，將其刮下(即，非胰蛋白酶化)，然后接種至96-孔板中。將HeLa細(xì)胞以標(biāo)準(zhǔn)的方式進(jìn)行胰蛋白酶化然后接種。細(xì)胞以雙份接種在96-孔板中(對于RAW264.7細(xì)胞5x103細(xì)胞，對于HeLa細(xì)胞為104，每孔50pl培養(yǎng)基)。4小時(shí)后，加入CpnlO(以50pl稀釋在培養(yǎng)基中)，另外30分鐘后加入polyl:C(以50pl稀釋在培養(yǎng)基中)。然后細(xì)胞在96孔板中孵育過夜，然后加入RRV(在50pl中，對于RAW264.7細(xì)胞MOK，對于HeLa細(xì)胞MOI=10)。3天后，固定細(xì)胞，用結(jié)晶紫染色，洗滌，干燥，用100%甲醇萃取染料，并如文獻(xiàn)所述在A595nm處讀數(shù)(Antalis等人，JExpMed1998，187(11):1799)。14.2結(jié)果po(y/:CW/^『2".7謝應(yīng)游^。起初，polyl:C以0-100嗎/ml的范圍滴定至RAW264.7細(xì)胞中。polyl:C濃度>5-10|ig/ml使細(xì)胞顯示明顯的毒性征象，細(xì)胞變圓并在三天的測定時(shí)間內(nèi)生長很差。對于HeLa細(xì)胞則沒有觀察到這種毒性(圖34)。Q"70f/7，/_y/:C。進(jìn)行滴定以確定對于RAW264.7細(xì)胞和HeLa細(xì)胞誘導(dǎo)抗病毒耐受性所需的劑量。然后，使用合適濃度范圍的polyl:C，對CpnlO是否能增加dsRNA的抗病毒活性的假設(shè)進(jìn)行檢驗(yàn)。如圖35所示，在測量細(xì)胞活力的此三天試驗(yàn)中被檢測的polyl:C和CpnlO在各種濃度下，在存在或不存在CpnlO的情況下，RAW264.7細(xì)胞或HeLa細(xì)胞在其抗病毒耐受性方面都未顯示任何差異。14.3討論和結(jié)論在此研究中，CpnlO不影響合成dsRNA-誘導(dǎo)的針對a病毒-誘導(dǎo)CPE的抗病毒耐受性。在此顯示的數(shù)據(jù)并不能支持下面的觀點(diǎn)CpnlO可通過dsRNA影響信號(hào)傳導(dǎo)。dsRNA可經(jīng)TLR3、PKR、RIG-l/mda-5和/或ATF-2/c-Jun發(fā)生信號(hào)傳導(dǎo)，由細(xì)胞質(zhì)dsRNA觸發(fā)其他信號(hào)傳導(dǎo)通路，盡管人們相信TLR3是細(xì)胞外dsRNA的主要感受器。實(shí)施例15-重組CpnlO在細(xì)胞表面上與APC相互作用本發(fā)明人考慮了細(xì)胞外CpnlO調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答可能采取的方式。為了識(shí)別結(jié)合CpnlO的細(xì)胞的白細(xì)胞亞群，本發(fā)明人使用了在C-末端半胱氨酸殘基上熒光基團(tuán)-標(biāo)記的CpnlO，并證明其保留了與野生型CpnlO在體外相同的伴侶分子和免疫調(diào)節(jié)活性(數(shù)據(jù)未顯示)。在將標(biāo)記的CpnlO與PBMC在4°C下，以及一組用于鑒定獨(dú)立白細(xì)胞亞群的抗體孵育后，證明CpnlO與APC的相互作用最強(qiáng)烈，尤其是髓系DC(CD3.CD4低CD14-CDllc+)、漿細(xì)胞樣DC(CD3.CD4低CD14—CDllc和單核細(xì)胞(CD4ffiCD14+)，與T細(xì)胞的親合力較低(圖36A)。當(dāng)PBMC用LTA刺激時(shí)，與未受刺激的CD14+細(xì)胞相比，4h時(shí)熒光CpnlO與CD14+細(xì)胞表面的結(jié)合水平有大約1.6-倍的增加(圖36B)。這些數(shù)據(jù)表明細(xì)胞外CpnlO對先天性免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)細(xì)胞，APC，發(fā)揮了其生物學(xué)活性。本發(fā)明人也通過共聚焦顯微術(shù)研究了熒光CpnlO進(jìn)入免疫細(xì)胞內(nèi)的攝取通路。當(dāng)人pDC或鼠巨噬細(xì)胞與熒光CpnlO，以及用于識(shí)別細(xì)胞內(nèi)小室的試劑一起孵育時(shí)，證明CpnlO迅速地被攝取，并被運(yùn)輸至酸化的細(xì)胞內(nèi)囊泡中而不進(jìn)入胞質(zhì)或線粒體內(nèi)(圖36C)。這些數(shù)據(jù)顯示CpnlO蛋白與免疫感應(yīng)細(xì)胞發(fā)生聯(lián)合，并集中在信號(hào)顯示有TLR活化基序存在的區(qū)域。實(shí)施例16-用于治療的組合物根據(jù)本文所提供的實(shí)施本發(fā)明的最佳方式，下面概述了具體的優(yōu)選組合物。下面的實(shí)例僅作為組合物的說明性實(shí)施例，且不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例16(a)-用于胃腸外給藥的組合物用于肌肉內(nèi)注射的組合物可被制成為含有1ml無菌緩沖水和1mg合適化合物。同樣，用于靜脈內(nèi)輸注的組合物可包括250ml無菌林格氏溶液和5mg合適化合物。實(shí)施例16(b)-可注射的胃腸外組合物適合用于注射給藥的組合物可通過將lwt。/。合適化合物混合在10vol。/。的丙二醇和水中而進(jìn)行制備。該溶液通過過濾滅菌。實(shí)施例16(V)-膠囊組合物膠囊形式的合適化合物的組合物可通過用粉末形式的50mg藥劑或化合物、100mg乳糖、35mg滑石和10mg硬脂酸鎂填入至標(biāo)準(zhǔn)的兩件式硬凝膠膠囊中而進(jìn)行制備。實(shí)施例16(d)-滴眼劑組合物作為滴眼劑遞送的典型組合物概述如下合適的化合物0.3g羥基苯甲酸甲酯0.005g羥基苯甲酸丙酯0.06g純水至100.00ml左右。羥基苯甲酸甲酯和羥基苯甲酸丙酯在75°C下溶解在70ml純水中，冷卻生成的溶液。然后加入合適的化合物，通過膜濾器(0.22pm孔徑)經(jīng)過濾對該溶液滅菌，并無菌條件下裝入無菌容器中。實(shí)施例16(e)-用于吸入給藥的組合物對于容量為20-30ml的氣霧劑容器10mg合適化合物與0.5-0.8wtM潤滑劑(如聚山梨醇酯85或油酸)的混合物分散在拋射劑(如氟利昂)中，并裝入用于鼻內(nèi)或經(jīng)口吸入給藥的合適氣霧劑容器。實(shí)施例16(f)-軟膏組合物作為軟膏遞送的典型組合物包括l.Og合適化合物，以及白軟石蠟至100.0g，分散產(chǎn)生光滑的均質(zhì)產(chǎn)物。權(quán)利要求1.一種調(diào)節(jié)受試者或其至少一種細(xì)胞、組織或器官中Toll樣受體信號(hào)傳導(dǎo)的方法，其中所述的方法包括給予有效量的伴侶蛋白10，其中Toll樣受體信號(hào)傳導(dǎo)涉及所述伴侶蛋白10與活化簇中的Toll-樣受體之間的結(jié)合。2.—種調(diào)節(jié)受試者或其至少一種細(xì)胞、組織或器官中Toll樣受體信號(hào)傳導(dǎo)的方法，其中所述的方法包括給予有效量的至少一種伴侶蛋白10的拮抗劑，其中Toll樣受體信號(hào)傳導(dǎo)涉及所述伴侶蛋白10與活化簇中的Toll-樣受體之間的結(jié)合，且其中所述拮抗劑阻止伴侶蛋白10與活化簇中的Toll樣受體發(fā)生結(jié)合，和/或阻止活化簇引起信號(hào)傳導(dǎo)。3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的活化簇包括伴侶蛋白10、Toll樣受體和任選地至少一種其他分子。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述至少一種其他分子包括Toll-樣受體激動(dòng)劑。5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的活化簇包括伴侶蛋白10、TLR2和脂磷壁質(zhì)酸(LTA)。6.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的活化簇包括伴侶蛋白IO、TLR3和雙鏈RNA。7.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的活化簇包括伴侶蛋白10、TLR4和LPS。8.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的活化簇包括伴侶蛋白IO、TLR7和單鏈RNA。9.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的活化簇包括伴侶蛋白10、TLR9和包括CpG基序的DNA。10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的伴侶蛋白10包括SEQIDNO:1、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3中所示的多肽序列。11.根據(jù)權(quán)利要求1或3至9中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的伴侶蛋白10以編碼伴侶蛋白10的多核苷酸的形式給藥。12.根據(jù)權(quán)利要求ll所述的方法，其中所述的多核苷酸包括SEQIDNO:4中所示的序列。13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任意一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步包括給予至少一種其他的藥劑。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述至少一種其他的藥劑是選自IFNa或IFN(3的免疫調(diào)節(jié)劑。15.—種治療或預(yù)防受試者疾病或病癥的方法，其中所述方法包括給予受試者有效量的伴侶蛋白IO，其中所述伴侶蛋白IO與活化簇中的Toll-樣受體發(fā)生結(jié)合，且其中活化簇的形成與對所述疾病或病癥的免疫應(yīng)答的啟動(dòng)、增強(qiáng)和/或維持有關(guān)。16.—種治療或預(yù)防受試者疾病或病癥的方法，其中所述方法包括給予受試者有效量的至少一種伴侶蛋白IO的拮抗劑，其中所述拮抗劑阻止伴侶蛋白10與活化簇中的Toll樣受體發(fā)生結(jié)合，和/或阻止活化簇引起信號(hào)傳導(dǎo)，且其中活化簇的形成與所述疾病或病癥的發(fā)生和/或進(jìn)展有關(guān)。17.根據(jù)權(quán)利要求15或權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的疾病或病癥選自病毒或細(xì)菌感染、急性或慢性炎性疾病，包括敗血性休克、炎性腸病、關(guān)節(jié)炎、銀屑病、心臟病、動(dòng)脈粥樣硬化、慢性肺病、惡病質(zhì)、多發(fā)性硬化癥、GVHD和癌癥。18.根據(jù)權(quán)利要求15至17中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的伴侶蛋白10調(diào)節(jié)LTA-誘導(dǎo)的TLR2信號(hào)傳導(dǎo)。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的伴侶蛋白10調(diào)節(jié)TLR2-誘導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)劑的產(chǎn)生和/或分泌。20.根據(jù)權(quán)利要求15至17中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的伴侶蛋白10調(diào)節(jié)雙鏈RNA-誘導(dǎo)的TLR3信號(hào)傳導(dǎo)。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述的伴侶蛋白10調(diào)節(jié)TLR3-誘導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)劑的產(chǎn)生和/或分泌。22.根據(jù)權(quán)利要求15至17中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的伴侶蛋白10調(diào)節(jié)LPS-誘導(dǎo)的TLR4信號(hào)傳導(dǎo)。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述的伴侶蛋白10調(diào)節(jié)TLR4-誘導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)劑的產(chǎn)生和/或分泌。24.根據(jù)權(quán)利要求15至17中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的伴侶蛋白10調(diào)節(jié)病毒單鏈RNA-誘導(dǎo)的TLR7信號(hào)傳導(dǎo)。25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述的伴侶蛋白10調(diào)節(jié)TLR7-誘導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)劑的產(chǎn)生和/或分泌。26.根據(jù)權(quán)利要求15至17中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的伴侶蛋白10調(diào)節(jié)CpG基序誘導(dǎo)的TLR9信號(hào)傳導(dǎo)。27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述的伴侶蛋白10調(diào)節(jié)TLR9-誘導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)劑的產(chǎn)生和/或分泌。28.根據(jù)權(quán)利要求15至27中任意一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步包括給予至少一種其他的藥劑。29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述至少一種其他的藥劑是選自IFNa或IFNj3的免疫調(diào)節(jié)劑。30.—種用于治療或預(yù)防疾病或病癥的組合物，所述組合物包括伴侶蛋白10以及至少一種藥學(xué)可接受的載體、稀釋劑或輔料，其中所述伴侶蛋白10與活化簇中的Toll樣受體發(fā)生結(jié)合，且其中活化簇的形成與對所述疾病或病癥的免疫應(yīng)答的啟動(dòng)、增強(qiáng)和/或維持有關(guān)。31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的組合物，其進(jìn)一步包括至少一種Toll樣受體的激動(dòng)劑和/或至少一種免疫調(diào)節(jié)劑。32.—種用于治療或預(yù)防疾病或病癥的組合物，所述組合物包括至少一種伴侶蛋白10的拮抗劑，其中所述拮抗劑阻止伴侶蛋白10與活化簇中的Toll樣受體發(fā)生結(jié)合，和/或阻止活化簇引起信號(hào)傳導(dǎo)，且其中活化簇的形成與所述疾病或病癥的發(fā)生和/或進(jìn)展有關(guān)。33.伴侶蛋白IO在制造用于治療或預(yù)防疾病或病癥的藥物中的應(yīng)用，其中所述伴侶蛋白10與活化簇中的Toll樣受體發(fā)生結(jié)合，且其中活化簇的形成與對所述疾病或病癥的免疫應(yīng)答的啟動(dòng)、增強(qiáng)和/或維持有關(guān)。34.伴侶蛋白10的拮抗劑在制造用于治療或預(yù)防疾病或病癥的藥物中的應(yīng)用，其中所述拮抗劑阻止伴侶蛋白lO與活化簇中的Tdl樣受體發(fā)生結(jié)合，和/或阻止活化簇引起信號(hào)傳導(dǎo)，且其中活化簇的形成與所述疾病或病癥的發(fā)生和/或進(jìn)展有關(guān)。35.—種調(diào)節(jié)受試者或其至少一種細(xì)胞、組織或器官中一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑的產(chǎn)生和/或分泌的方法，其中所述方法包括給予有效量的伴侶蛋白IO，其中所述伴侶蛋白10與活化簇中的Toll樣受體發(fā)生結(jié)合，且其中活化簇的形成與對一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑的產(chǎn)生和/或分泌的調(diào)節(jié)有關(guān)。36.—種調(diào)節(jié)受試者或其至少一種細(xì)胞、組織或器官中一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑的產(chǎn)生和/或分泌的方法，其中所述方法包括給予有效量的伴侶蛋白IO的拮抗劑，其中所述拮抗劑阻止伴侶蛋白IO與活化簇中的Toll-樣受體發(fā)生結(jié)合，和/或阻止活化簇引起信號(hào)傳導(dǎo)，且其中活化簇的形成與對一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑的產(chǎn)生和/或分泌的調(diào)節(jié)有關(guān)。37.根據(jù)權(quán)利要求35或權(quán)利要求36所述的方法，其中所述的免疫調(diào)節(jié)劑選自TNF-a、IL-1(3、IL-6、IL-IO、IL-12或I型干擾素。38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述的I型干擾素是IFNa或IFN卩。全文摘要本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)受試者或其至少一種細(xì)胞、組織或器官中Toll樣受體信號(hào)傳導(dǎo)的方法，治療或預(yù)防受試者疾病或病癥的方法，調(diào)節(jié)受試者或其至少一種細(xì)胞、組織或器官中一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑的產(chǎn)生和/或分泌的方法，其中所述的方法涉及伴侶蛋白10的給藥，且其中伴侶蛋白10與活化簇中的Toll樣受體結(jié)合。本發(fā)明還涉及其相關(guān)的組合物及其用途。文檔編號(hào)A61K38/16GK101247820SQ200680031144公開日2008年8月20日申請日期2006年7月11日優(yōu)先權(quán)日2005年7月11日發(fā)明者B·J·約翰遜,C·A·多賓,C·B·霍華德,D·J·內(nèi)勒,I·E·A·弗萊施,L·A·沃德申請人:悉生物有限公司