專利名稱：：葡萄糖可誘導(dǎo)的胰島素表達和治療糖尿病的方法葡萄糖可誘導(dǎo)的胰島素表達和治療糖尿病的方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明主要涉及治療和預(yù)防糖尿病的方法，更具體的涉及為了治療糖尿病而受調(diào)控地表達胰島素。在具有正常血液葡萄糖調(diào)控的個體中，胰腺激素胰島素響應(yīng)于升高的血糖水平而分泌。通常在飯后出現(xiàn)血液葡萄糖增加，其是由于胰島素作用在外周組織比如骨骼肌和脂肪上而產(chǎn)生的。胰島素刺激這些外周組織的細胞活躍地從血液中攝取葡萄糖并將其轉(zhuǎn)化成儲藏的形式。這一過程也被稱為葡萄糖棄量(glucosedisposal)。個體在一天中的血液葡萄糖水平從低到正常再到高發(fā)生變化，其取決于此人是處于禁食狀態(tài)、中間狀態(tài)、還是才聶食狀態(tài)。這些水平也分別被稱為低血糖、正常血糖、和高血糖。在糖尿病患者個體中，由于胰島素分泌的缺陷或者作用的缺陷，這些葡萄糖動態(tài)平衡方面的變化失調(diào)，導(dǎo)致了慢性的高血糖癥。糖尿病是一種常見疾病，其發(fā)病率約為4-5%。糖尿病發(fā)生的風(fēng)險隨體重的增加而增加，多達卯。/。的成年型糖尿病患者;U巴胖的。因此，由于肥胖成年人的高出現(xiàn)率，成年型糖尿病患者的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)正在升高。糖尿病分為三個主要類型。II型糖尿病是一種類型，也被稱為非胰島素依賴性糖尿病(NIDDM)或者成年型糖尿病。I型糖尿病是第二種類型，其被稱為胰島素依賴性糖尿病(IDDM)。第三種糖尿病是遺傳性的，其是由于控制胰島p細胞功能的基因發(fā)生突變造成的。盡管胰島素的診斷基于葡萄糖檢測，對所有患者進行準確分類卻不總是可行的。II型糖尿病在成人中更加普遍，而I型糖尿病在兒童和十幾歲的青少年中占主要。I型和II型糖尿病都與預(yù)期壽命的縮短相關(guān)，并且與其它并發(fā)癥比如心血管疾病和動脈石更化相關(guān)。為預(yù)防后期并發(fā)癥，糖尿病的長期處置通常包括胰島素治療，而無論患者分類是I型還是II型。I型糖尿病是自身免疫性疾病，其與產(chǎn)生胰島素的胰腺P細胞的幾乎完全喪失有關(guān)。p細胞的這種喪失導(dǎo)致終生的胰島素依賴。I型糖尿病可發(fā)生在任何年齡，并且據(jù)估計在所有剖宮產(chǎn)新生兒中有約0.3-1%在他們的一生中會發(fā)生此疾病。治療I型糖尿病和在一定程度上治療II型糖尿病的普遍使用的方法在傳統(tǒng)上由胰島素維持療法組成。此療法的最筒單的形式需要在々反后或者一天中以有規(guī)律的間隔時間，將純化的或重組的胰島素注射到患者體內(nèi)，以維持正常的血液葡萄糖水平。這些注射最好需要以每天4次的頻率進行。盡管上述治療方法給患者提供了一些益處，但是胰島素治療的這種方法仍然受到對血液葡萄糖控制不足的困擾，并且需要患者極大的M。I型糖尿病的另一個治療方法包括使用比如胰島素泵的裝置，其使得可以定期遞送胰島素。此方法對于上文描述的方法是優(yōu)選的，因為不需要經(jīng)常的注射。但是，胰島素泵療法的使用也有缺陷，因為其仍需^隔三天替換一次針頭。類似于胰島素維持療法，胰島素泵方法也不能達到最優(yōu)的葡萄糖調(diào)控，因為胰島素的遞送不是根據(jù)血液葡萄糖水平的變化來調(diào)控的。因此這些治療糖尿病的方法是繁瑣且不足的。另外，這些方法對于平均成人壽命的時間而言也不是完全有效的，或者顯示出對于預(yù)防此疾病是有效的。已經(jīng)嘗試了用于代替生物活性胰島素i^糖尿病患者個體的多種細胞治療方法。這些包括基因療法、免疫療法和應(yīng)用人工p細胞。用于胰島素或其它多肽表達的體內(nèi)基因療法包括在動物模型中肝臟靶向的病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。但是，這些方法不提供葡萄糖調(diào)控的胰島素以治療有效量的遞送，它們也不能恢復(fù)或再生產(chǎn)生胰島素的P細胞，并且在患者中的應(yīng)用是有限的。例如，對于I型糖尿病的胰島素基因療法優(yōu)選包括合適的調(diào)控系統(tǒng)，使得胰島素將響應(yīng)血液葡萄糖水平的升高而產(chǎn)生，并且隨著血液葡萄糖的降低而抑制。為達到使用自然中存在的葡萄糖調(diào)控啟動子產(chǎn)生葡萄糖應(yīng)答胰島素，已經(jīng)做出了多種努力。但是，所使用的啟動子不能達到足夠高的轉(zhuǎn)錄活性，并且在非禁食條件下所治療的動物中顯示出至少中等的高血糖。因此，需要具有有效葡萄糖應(yīng)答的細胞特異性表達元件，和能夠以恢復(fù)生成胰島素的(5細胞的生理能力的方式在糖尿病個體中調(diào)控葡萄糖動態(tài)平衡的方法。本發(fā)明滿足了這一需求，同時也提供了相關(guān)的優(yōu)點。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供分離的組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子，其具有位于至少一個三聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件3，側(cè)的聚合酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件具有肝細胞核因子-1(HNF-1)元件、CAAT/增強子結(jié)合蛋白(C/EBP)應(yīng)答元件和葡萄糖應(yīng)答元件(GRE)。所述啟動子可包含第二個或第三個三聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件。本發(fā)明也提供包含了本發(fā)明組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子的宿主細胞。還提供了治療或預(yù)防糖尿病的方法。所述方法包括將有效量的具有包含了組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子的載體的病毒顆粒施用給個體，所述組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子包含在至少一個三聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件3，側(cè)的聚合酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件具有肝細胞核因子-1(HNF-1)元件、CAAT/增強子結(jié)合蛋白(C/EBP)應(yīng)答元件和葡萄糖應(yīng)答元件(GRE)，所述元件可操縱地連接到編碼胰島素的核酸上，其中編碼胰島素的核酸的表達是組織特異性的及葡萄糖應(yīng)答的。圖1顯示順式調(diào)控元件的三拷貝組件的生成，用以構(gòu)建合成啟動子文庫。(A)pcDNA3.1載體中的原始多克隆位點(MCS)被新的MCS所替換，產(chǎn)生pcDNA3-NewMCS。(B)用于構(gòu)建三拷貝組件的3個不同順式調(diào)控元件的可能組合。將葡萄糖應(yīng)答元件(G)、C/EBP結(jié)合元件(C)和HNF-1結(jié)合元件(H)相混合并按順序地連接至pcDNA3-NewMCS中的f/ml/S"柳m^c^V和五"iV/EcoiI位點，產(chǎn)生三拷貝SP-D3。圖2顯示合成啟動子文庫的產(chǎn)生。(A)pGL3-Enhancer載體中的原始MCS被新的MCS所替換，產(chǎn)生pGL3E-NewMCS。(B)含有三、六和九拷貝的順式調(diào)控元件的合成啟動子的示意圖。LPK啟動子(-96/十12，相對于轉(zhuǎn)錄起始位點而言)的鄰近區(qū)域被用作產(chǎn)生合成啟動子-報告子構(gòu)建物的基本啟動子。來自三拷貝SP-D3的三拷貝組件被轉(zhuǎn)移到pLPK(-96/+12)丄1^的1/7"1/五《^1位點，產(chǎn)生三拷貝的SP-Luc報告質(zhì)粒。另外的三拷貝組件以相同(五"RI/Y/^1)或相反方向(X/^I/7V/^1)被插入三拷貝SP-Luc,產(chǎn)生六拷貝SPXE-Luc和六拷貝SPXN-Luc質(zhì)粒。通it^六拷貝SPXE-Luc的X/^I/7V/^I位點導(dǎo)入另外三拷貝組件產(chǎn)生九拷貝SP-Luc質(zhì)粒。箭頭指示三拷貝組件的方向。具有3個順式元件的盒表示含有單一元件的三拷貝組件的單個位置。圖3顯示在體外，合成啟動子相比于CMV啟動子的比較性螢光素酶活性。(A)三拷貝合成啟動子的螢光素酶活性。(B)六拷貝合成啟動子的螢光素酶活性，其具有CMV啟動子活性的8%以上。每種合成啟動子螢光素酶構(gòu)建體被轉(zhuǎn)染入H4IIE細胞并且在轉(zhuǎn)染后一天檢測螢光素酶活性。按照CMV啟動子活性的百分率來計算合成啟動子構(gòu)建體的螢光素酶活性。LPK表示pLPK-Luc質(zhì)粒。螢光素酶測定在至少兩輪不同的轉(zhuǎn)染中重復(fù)實施四次。所有值為平均值士S.D.。圖4顯示了在合成啟動子構(gòu)建體中順式調(diào)控元件的組成。(A)六拷貝SPXI-Luc質(zhì)粒顯示CMV啟動子活性的8%以上和(B)九拷貝SP-Luc質(zhì)粒顯示CMV啟動子活性的25%以上，顯示了上述情形下順式元件的排布。研究了超過300個克隆的六拷貝SPXN-Luc和六拷貝SPXE-Luc的轉(zhuǎn)錄活性。其中，選擇17個顯示活性超過CMV啟動子活性8。/。的質(zhì)粒，用于產(chǎn)生九拷貝SP-Luc質(zhì)粒，其是通過插入另外三個順式元件拷貝完成的。所選擇的九拷貝合成啟動子用于產(chǎn)生腺病毒以確定它們的體內(nèi)作用。六拷貝SPXN的組成沒有顯示。圖5顯示(A)六拷貝SPXE-Luc、(B)六拷貝SPXN-Luc和(C)九拷貝SPXN-Luc的轉(zhuǎn)錄活性的分布圖樣。來自六拷貝SPXE、六拷貝SPXN、和九拷貝SP-Luc的每個DNA被轉(zhuǎn)染ii^H4IIE細胞，然后進行螢光素酶測定。合成啟動子構(gòu)建物的螢光素酶活性4艮據(jù)CMV啟動子活性的百分比計算。該圖顯示了具有所指示螢光素酶活性％的構(gòu)建體的數(shù)量。圖6顯示rAd-CMV-rINSfur在STZ謙導(dǎo)的糖尿病NOD.scid小鼠中降低血液葡萄糖水平的作用。rAd-CMV-rINSfur病毒以不同的劑量(5xl010、10xl01Q、5xl(f和10xl(^個病毒顆粒)施用給糖尿病動物。該圖顯示來自每個劑量組的代表性數(shù)據(jù)。#代表在該天接受治療動物的死亡。，5xl010個病毒顆粒；o，101()個病毒顆粒；T，5xi()9個病毒顆粒；△，109個病毒顆粒。圖7顯示rAd-23142-rlNSfur在STZ誘導(dǎo)的糖尿病NOD.scid小鼠中降低血液葡萄糖水平的作用。rAd-23142-rlNSfur病毒以不同的劑量((A)5xl010(n=4)、(B)10xl010(n=7)和(C)5xl09(n=6)病毒顆豐立)施用給糖尿病小鼠。所有值均為平均值士S.D.。圖8顯示rAd-23137-rlNSfur在STZ謙導(dǎo)的糖尿病NOD.scid小鼠中降低血液葡萄糖水平的作用。(A)rAd-23137-rlNSfur在糖尿病動物中降低血液葡萄糖水平的作用。rAd-23137-rlNSfur和rAd-CMV-rINSfur病毒被施用給STZ誘導(dǎo)的糖尿病NOD.scid小鼠，并且監(jiān)控血液葡萄糖7JC平。使用沒有用病毒治療的糖尿病NOD.scid小鼠作為陰性對照。，rAd國23137-rlNSfur(n=7);o，糖尿病NOD.scid小鼠(n=4);T，rAd-CMV-rINSfur(n=8)。所有值均為平均值士S.D.。(B)在接受治療的動物肝臟中重組腺病毒基因組的情況。在病毒施用后的不同時間點，從用rAd-CMV-rINSfur(5xl09)或rAd-23137-rlNSfur病毒(IO1。個病毒顆粒)治療過的小鼠獲得肝臟。從肝臟中提取全DNA，然后使用大鼠胰島素基因的引物進4亍PCR以檢測腺病毒基因組。1道，第5天的rAd-CMV-rINSfur;2道，第10天的rAd-23137-rINSfur;3道，第25天的rAd-23137-rINSfur;4道，第50天的rAd-23137-rlNSfur;5道，作為陽性對照的pAd國23137-rlNSfur質(zhì)粒。圖9顯示在經(jīng)rAd-23137-rlNSfur治療的NOD.scid小鼠中的葡萄糖耐受檢驗。正常血糖的動物在接受rAd-23137-rlNSfur治療之后禁食16小時，并且通過^M內(nèi)注射來施用葡萄糖(每kg體重2g)。在葡萄糖負荷之后1、15、30、60、卯、120、180、240和270分鐘時，測量血液葡萄糖水平。，經(jīng)rAd-23137-rlNSfur治療的NOD.scid小鼠；o，正常對照小鼠；T，糖尿病對照小鼠。所有值均為平均值土S.D.。圖10顯示在經(jīng)rAd-23137-rlNSfur治療的細胞系中，肝細胞特異性胰島素基因的表達。rAd-23137-rlNSfur或rAd-CMV-rINSfur病毒經(jīng)感染進入如下一些細胞系(A)H4IIE(大鼠肝細胞瘤細胞系)，(b)L929(小鼠成纖維細胞細胞系)，(C)L6(小鼠肌肉細胞系)，(C)HeLa(人宮頸癌細胞系)，(D)NRK(正常大鼠腎細胞系)，(E)3T3-L1(小鼠成纖維細胞細胞系)。使用抗大鼠胰島素的特異性抗體對細胞進行染色。用沒有被病毒感染的細胞作為陰性對照。圖11顯示在經(jīng)rAd-23137-rlNSfur治療的NOD.scid小鼠中，肝特異性胰島素基因的表達。rAd-CMV-rINSfur和rAd-23137-rlNSfur病毒被施用給STZ誘導(dǎo)的糖尿病NOD.scid小鼠。在受治療動物顯示出正常葡萄糖水平之后，處死它們并取出多個器官，其包含腎臟(K)、脾臟(S)、肝臟(L)、肺(Lu)、和心臟(H)。分離總RNA，并使用大鼠胰島素或HPRT的引物進4亍RT-PCR。(A)rAd-CMV-rINSfur，HPRT，(B)rAd-CMV-rINSfur，大鼠胰島素，(C)rAd-23137-rlNSfur，HPRT和(D)rAd-23137-rlNSfur，大鼠胰島素。圖12顯示rAd-23137-rlNSfur在自發(fā)性糖尿病NOD小鼠中降低血液葡萄糖水平的作用。將rAd-23137-rlNSfur病毒(3xl0^個病毒顆粒，n=4)通過尾靜脈經(jīng)靜脈內(nèi)注射施用給糖尿病NOD小鼠。在施用后幾天，使用rAd-23137-rlNSfur治療的動物顯示出正常血液葡萄糖水平，并且正常的血液葡萄糖水平保持長達十天。所有值均為平均值士S.D.。具體實施方式本發(fā)明涉及用于體內(nèi)胰島素受控表達的組織特異性、葡萄糖應(yīng)答啟動子的構(gòu)建和應(yīng)用。本發(fā)明的合成啟動子顯示出響應(yīng)葡萄糖的體內(nèi)胰島素表達受嚴格調(diào)控的肝臟特異性活性。這些功能性特征表明本發(fā)明受調(diào)控的啟動子可用于在人體內(nèi)通過胰島素基因療法治療或治愈糖尿病。另外，本發(fā)明的葡萄糖應(yīng)答啟動子表現(xiàn)出多個優(yōu)點，其可有益于體內(nèi)調(diào)控胰島素表達。例如，本發(fā)明合成啟動子相比于天然葡萄糖應(yīng)答啟動子，轉(zhuǎn)錄活性較高，使得體內(nèi)血液葡萄糖水平保持在正常范圍內(nèi)。所述合成啟動子也誘導(dǎo)胰島素基因的肝臟特異性表達，其可幫助減輕由于體內(nèi)基因治療期間胰島素的普#達帶來的不希望的副作用。另外，相比于天然葡萄糖應(yīng)答啟動子，本發(fā)明合成啟動子也表現(xiàn)出更有效的葡萄糖應(yīng)答能力，從而快速清除外源導(dǎo)入的葡萄糖，然后使胰島素表達快速下降。在一個實施方案中，生成由3個不同的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件隨機組合構(gòu)成的合成啟動子。肝臟富含的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件用于所述合成啟動子的構(gòu)建。肝細胞核因子-1(HNF-1)元件和CAAT/增強子結(jié)合蛋白(C/EBP)應(yīng)答元件用于增強肝臟特異性轉(zhuǎn)錄活性。葡萄糖應(yīng)答元件(GRE)用于賦予葡萄糖應(yīng)答性。合成各個元件并組裝產(chǎn)生三拷貝組件，其包括三拷貝的各個順式元件的所有可能組合。將由三個三拷貝組件組成的合成啟動子克隆到報告質(zhì)粒上以鑒定具有高體外轉(zhuǎn)錄活性的合成啟動子。在非禁食狀態(tài)的免疫缺陷STZ豫導(dǎo)NOD.scid小鼠和免疫活性糖尿病NOD小鼠中，所得的啟動子驅(qū)動響應(yīng)葡萄糖變化的肝臟特異性胰島素基因表達，并且有效地維持血液葡萄糖水平在正常范圍內(nèi)。在另一個實施方案中，體內(nèi)肝臟靶向的胰島素表達對于胰島素基因治療具有益處，因為它是胰島素作用的主要靶器官，并在葡萄糖動態(tài)平衡中起重要作用(Taylor,R.&Agius，L.(1988).Thebiochemistryofdiabetes.肌oc/^附./.，250:625-640)。另外，肝臟具有必需的葡萄糖匪感受組分，例如葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(Rencurel，F(xiàn).,Waeber,G.，Antoine,B.,Rocchiccioli,F"Maulard,P"Girard,J.等(1996).Requirementofglucosemetabolismforregulationofglucosetransportertype2(GLUT2)geneexpressioninliver.所oc/ie柳./"314(Pt3),903-909)和葡萄糖激酶(Bonini，C.，F(xiàn)errari,G"Verzeletti,S.,Servida,P"Zappone,E.，Ruggieri，L.等(1997)HSV誦TKgenetransferintodonorlymphocytesforcontrolofallogeneicgraft-versus-leukemia.5We"ce276:1719-1724)(Rencurel,F"Waeber，G"Antoine，B.,Rocchiccioli，F(xiàn).，Maulard，P"Girard,J.等(1996).Requirementofglucosemetabolismforregulationofglucosetransportertype2(GLUT2)geneexpressioninliver.所ocAe附./.，314(Pt3),卯3-卯9)。因此，像胰腺p細胞一樣，肝臟具有內(nèi)在的響應(yīng)血液葡萄糖濃度變化的能力。從這一點看，肝臟是I型糖尿病的胰島素基因療法的適合靶器官。如本文所使用的，術(shù)語"糖尿病(diabetes)"意指已知為糖尿病(diabetesmellitus)的糖尿病病癥。糖尿病是慢性疾病，其特征為胰島素的相對或者絕對缺乏，這導(dǎo)致了葡萄糖不耐性。該術(shù)語的意思包含所有類型的糖尿病，包括例如I型、II型以及遺傳性糖尿病。I型糖尿病也被稱為胰島素依賴性糖尿病(IDDM)，其還包含例如青少年型糖尿病。I型糖尿病主要是由于胰腺P細胞遭到破壞所致。II型糖尿病也被稱為非胰島素依賴性糖尿病(NIDDM)，其特征部分地在于餐后的胰島素釋放減少。胰島素抵抗也可能是導(dǎo)致II型糖尿病發(fā)生的因素。遺傳性糖尿病是由于突變造成的，該突變擾亂了(3細胞的功能和調(diào)控。糖尿病的特征在于禁食時血液葡萄糖的水平大于或等于約140mg/dl或者血漿葡萄糖7JC平大約或等于約200mg/dl，此評定是在口服約75g的葡萄糖負載量之后約2個小時作出的。術(shù)語"糖尿病，，也意指包括具有高血糖的那些個體，包舍艮性高血糖和削弱的葡萄糖耐受性。高血糖個體中的血漿葡萄糖水平包括例如葡萄糖濃度高于正常值，如通過可靠的診斷指示劑所確定的。這些高血糖個體具有發(fā)展出明顯糖尿病臨床癥狀的風(fēng)險，或傾向于此。如本文所使用的，術(shù)語"治療"意為改善糖尿病的指示性臨床癥狀。臨床癥狀的改善包括，例如，在所治療的個體中，相對于治療之前的水平或者相對于患有糖尿病的個體，其血液葡萄糖水平下降或者葡萄糖從血液中清除的速率上升。術(shù)語"治療"也包括在患有失調(diào)性高血糖的個體中誘導(dǎo)出正常血糖應(yīng)答。正常血糖指臨床上確立為正常的，或者在低血糖范圍以上而在高血糖范圍以下的血液葡萄糖水平范圍。因此，正常血糖應(yīng)答指刺激葡萄糖攝取以降低血漿葡萄糖濃度到正常水平。對于大多數(shù)成年人，這一水平對應(yīng)的濃度范圍是約60-105mg/dL血液葡萄糖，優(yōu)選約70-100mg/dL之間，但是取決于例如個體的性別、年齡、體重、飲食以及整體健康狀況而可以在個體間有所變化。例如，對糖尿病個體的有效治療將是降低所述個體的高血糖或升高的血液葡萄糖水平到標(biāo)準或正常血糖水平，此降低的直接原因是由于胰島素的分泌。作為替代的，有效治療應(yīng)該是將禁食時血液葡萄糖降低到低于或等于約140mg/dL的水平。術(shù)語"治療"也意指包括降低與糖尿病相關(guān)的病理狀況或慢性并發(fā)癥的嚴重程度。這些病理狀況或慢性并發(fā)癥被列于表1，包括例如肌肉萎縮、酮酸中毒、糖尿、多尿癥、多飲、糖尿病微血管病或者小血管病、動脈粥樣硬化血管病或者大血管病、神經(jīng)病和白內(nèi)障。表l.與糖尿病有關(guān)的病理狀況腎臟腎小球ait營病彌漫性腎小球政化癥結(jié)節(jié)性腎小球^更化癥(基-威病(Kimmel-stiel-Wilsondisease))尿路感染急性腎盂腎炎腎衰竭壞死性乳頭炎氣性腎盂腎炎糖原性腎病(阿-埃損傷)眼視網(wǎng)膜病非增殖性視網(wǎng)膜病毛細血營微動脈瘤、視網(wǎng)膜水腫滲出、和出血增殖性視網(wǎng)膜病小血管增生視力喪失出血性纖維化、視網(wǎng)膜脫落白內(nèi)障晶狀體滲透壓改變造成的暫時性屈光不正虹膜中血管增生導(dǎo)致的音光眼感染神經(jīng)系統(tǒng)腦血管動脈粥樣硬化病中風(fēng)、死亡外周神經(jīng)病外周感覺神經(jīng)和運動神經(jīng)、顱神經(jīng)、自主神經(jīng)皮肢感染毛囊炎導(dǎo)致癰糖尿病性脂性漸進性壞死由于微血管病昔瘤繼發(fā)千高脂血癥心血管系統(tǒng)冠狀動脈粥樣硬化心l使死、死亡外周動脈粥樣硬化肢體缺血、壞疽生殖系統(tǒng)增高的胎兒死亡率(胎盤病、新生兒呼吸窘迫綜合征、感染)全身對感染的敏感性增高延緩創(chuàng)傷愈合另外的并發(fā)癥也包含，例如，對感染和創(chuàng)傷愈合的敏感性的普遍增高。術(shù)語"治療"也意指包括糖尿病個體相比于未治療個體而言平均預(yù)期壽命的增加。其它病理狀況、慢性并發(fā)癥或者疾病表型顯現(xiàn)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，它們可類似的用作對糖尿病治療的衡量，只要與所述疾病有關(guān)的這些狀況、并發(fā)癥或者顯現(xiàn)的嚴重程度有所減輕即可。如本文所使用的，術(shù)語"預(yù)防"意指阻止指示糖尿病的臨床癥狀。此阻止包括例如在所述疾病明顯癥狀出現(xiàn)之前或者診斷出所述疾病之前，維持具有發(fā)生糖尿病風(fēng)險的個體體內(nèi)血液葡萄糖的正常水平。因此，術(shù)語"預(yù)防，，包含對個體的預(yù)防性治療以避免他們出現(xiàn)糖尿病。在個體中預(yù)防糖尿病也意指包括抑制或阻止所述疾病的t艮。抑制或阻止所述疾病的發(fā)展包括例如抑制或阻止異常葡萄糖代謝的發(fā)生，例如葡萄糖從血漿到細胞轉(zhuǎn)運的障礙。因此，有效的預(yù)防糖尿病包括維持葡萄糖動態(tài)平衡，其是由于在易患糖尿病的個體，例如肥胖個體或者具有糖尿病家族史的個體內(nèi)葡萄糖調(diào)控的胰島素表達所致。抑制或阻止所述疾病的發(fā)展也包括例如抑制或阻止與糖尿病有關(guān)的一種或多種病理狀況或者慢性并發(fā)癥的t艮。與糖尿病有關(guān)的這些病理狀況的例子在表1中列出。如本文所使用的，術(shù)語"葡萄糖應(yīng)答"意指通過葡萄糖水平的改變調(diào)控核酸序列的表達。例如，葡萄糖應(yīng)答表達包括通過升高的葡萄糖水平誘導(dǎo)啟動子活性。這樣的葡萄糖應(yīng)答啟動子包含三聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件(例如HNF-1、C/EBP結(jié)合元件和GRE)。這樣的葡萄糖應(yīng)答啟動子也包括多于一個的三聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件，其包括2、3或4個或更多的三聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件。含有一個或多個三聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件的葡萄糖應(yīng)答啟動子的具體實例被顯示在例如圖3和4中。葡萄糖應(yīng)答啟動子也可含有無組織特異性或增強子元件的GRE。在其它啟動子中存在的葡萄糖應(yīng)答元件的具體實例包括例如具有序列CATGTGAAAACGTCGTG(SEQIDNO:ll)的大鼠ACC(-122);具有序列CACGTGGTGGCCCTGTG(SEQIDN0:12)的大鼠S14(-1439);具有序列CACGCTGGAGTCAGCCC(SEQIDNO:13)的小鼠S14(-1439);具有序歹'JCACGGGGCACTCCCGTG(SEQIDNO:14)的大鼠L-PK(-166);具有序列CATGTGCCACAGGCGTG(SEQIDNO:15)的大鼠FAS(-7210)。當(dāng)針對調(diào)控基因表達使用時，術(shù)語"葡萄糖"意為包含葡萄糖和葡萄糖代謝物，只要這樣的代謝物可造成葡萄糖應(yīng)答啟動子表達的升高即可。葡萄糖代謝物包括葡萄糖代謝的中間產(chǎn)物，例如葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、3-褲酸甘油醛、2-磷酸甘油酸和丙酮酸。如本文所使用的，當(dāng)針對一個或多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件的接近度而使用時，術(shù)語"基本上"或"基本上相同"意指元件足夠接近以允許結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子與另一反式結(jié)合因子(包含聚合酶)之間相互作用。在轉(zhuǎn)錄因子順式元件之間足夠?qū)嵤┓词浇Y(jié)合因子功能的距離是本領(lǐng)域^^P的，例如可在BolouriandDavidson,7VW/.5W.USA100:9371-9376(2003)和Davidsonetal,5We/i",295:1669-78(2002)中找到描述。如本文所使用的，術(shù)語"可操縱性的連接"或者語法上的等同物，意指核酸組件根據(jù)7>知的遺傳學(xué)和細胞學(xué)原理相連接，其允許每個組件的必需功能在它的耙核酸上實施。因此，形成三聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件的順式元件組可操縱性連地連在一起，從而引起相關(guān)編碼區(qū)域序列的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控。相似的，可操縱性連接的胰島素編碼核酸的編碼區(qū)被連接到它的啟動子和三聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件，使得所述啟動子將引起胰島素編碼核酸的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控。如本文所使用的，術(shù)語"表達"或者語法上的等同物，意指通過細胞轉(zhuǎn)錄、翻譯和加工核酸。表達可以是例如組成型或調(diào)控型的，例如通過可i秀導(dǎo)型啟動子或者組織或細胞特異性啟動子。兩個或更多個核酸序列也可同時表達，或者作為替代的，與其它所需核酸各自進行表達。表達兩個或更多個核酸序列的具體實例包括胰島素A鏈和B鏈的共表達。取決于氨基酸或待表達核酸序列的數(shù)量和功能，可使用其它共表達模式的多種組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解或可確定何種共表達模式可用于達到特定目的或滿足預(yù)期的需要。使用三聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件的組織特異性和可誘導(dǎo)表達的實例都在下文實施例1中進一步描述。如本文所使用的，術(shù)語"胰島素，，用于指能夠響應(yīng)升高的葡萄糖水平從而刺激細胞攝取葡萄糖的多肽。胰島素可對應(yīng)于來自多種脊推動物(例如人、豬、馬、大鼠或牛)的JIJ^酸序列或其任意部分，只要所得的表達分子保持至少一種生物活性功能，例如刺激葡萄糖攝取、糖原合成、氨基酸攝取或者蛋白質(zhì)合成。該術(shù)語也包含具有氨基酸取代的胰島素的修飾形式，其增強或不顯著減小所述多肽刺激細胞葡萄糖攝取的生物活性。胰島素也可包含氨基酸殘基的添加或缺失，只要它保持胰島素生物活性即可。因此，生物活性的胰島素可具有與野生型胰島素相似或者相比于野生型胰島素較高或較低的活性，只要所述生物活性的胰島素刺激細胞的葡萄糖攝取即可。一般地，人胰島素分子量約5.8kDa。提供人胰島素A鏈和B鏈序列怍為本發(fā)明胰島素多肽的典型序列。人胰島素A鏈對應(yīng)于核苷酸2496-2591(SEQIDNO:7)并且具有SEQIDNO:8所示的^J^斷列，人胰島素B鏈對應(yīng)于核苷酸3477-3542(SEQIDNO:9)并且具有SEQIDNO:IO所示的M酸序列。人胰島素基因序列儲存于GenBank序列號J00265下。人胰島素#^酸序列儲存于GenBank序列號AAA59172下。人胰島素cDNA序列可在GenBank序列號X70508處找到。來自除人之外物種的胰島素多肽的核苷酸和M酸序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。所有這些序列和能夠保持胰島素生物活性的基本等同物以及其功能性片段包含在本文使用的術(shù)語"胰島素"內(nèi)。大致上，胰島素由經(jīng)二硫鍵連接的B鏈區(qū)和A鏈區(qū)組成。胰島素A鏈和B鏈可來源于胰島素原，其是胰島素的前體形式。本發(fā)明的胰島素原多肽可以是M酸序列或其一部分，其對應(yīng)于多種脊推動物物種(例如人、豬、馬、大鼠或牛)，只要它含有胰島素的A鏈或B鏈區(qū)或者其功能性片段即可。本發(fā)明的胰島素原包括胰島素原的修飾形式，只要前體多肽或者修飾形式可被加工成胰島素的生物活性形式或者能夠組裝成胰島素生物活性形式的胰島素A鏈或B鏈區(qū)即可。胰島素原多肽的前體區(qū)可以基本上是任何氨基酸序列，只要它不對將胰島素原加工成胰島素、其A鏈、其B鏈、或其功能性片^負面影響即可。因此，前體區(qū)序列可以是例如胰島素前肽(例如介于A鏈和B鏈序列之間的胰島素原序列)。作為替代，這樣的前體區(qū)可以是例如任何多種氨基酸序列，例如接頭序列，、其通常不出現(xiàn)在,推動物胰島素，、分子中。上文給出了，為本發(fā)人員已知的。所有這些序列和k基本等^]物以及其^能性片段包含在本文說明書第12/50頁胰島素生物活性形式的胰島素A鏈或B鏈區(qū)域的能力。胰島素原可以由例如連接至B鏈和A鏈序列的C鏈組成。如本文所使用的，術(shù)語"宿主細胞"指用根據(jù)本發(fā)明的核酸、載體或病毒顆粒所轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞。該術(shù)語也指能夠被包含了本發(fā)明的組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子作為其基因組的病毒顆粒感染的細胞。如本文所使用的，當(dāng)針對施用病毒顆粒使用時(所述病毒顆粒含有以組織特異性葡萄糖應(yīng)答形式表達胰島素的載體)，術(shù)語"有效量，，意指施用的病毒顆粒數(shù)量足夠感染靶組織，并且在葡萄糖誘導(dǎo)下以降低一種或多種糖尿病癥狀的水平從病毒顆粒的基因組表達胰島素。例如，表達胰島素的有效量的病毒顆粒由造成血液葡萄糖水平降低或?qū)е缕咸烟莿討B(tài)平衡或兩者皆有的病毒顆粒的數(shù)量組成。另外，如上文表l中所述的糖尿病的臨床表現(xiàn)也可用作病毒顆粒有效量的量度。相似的，病毒顆粒的有效量也意指可被施用并導(dǎo)致胰島素在葡萄糖調(diào)控下表達的病毒顆粒的數(shù)量，其表#表達胰島素的有效量的病毒顆粒將導(dǎo)致在攝取食物情況下的正常血糖。根據(jù)本文提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)以及本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的知識，對于人類個體來說有效量的病毒顆?？梢岳鐝目煽康奶悄虿游锬Ｐ椭型馔瞥鰜怼τ谛∈髣游锬Ｐ?，病毒顆粒的有效量例如包括在約lxl()S-lxlO"之間，優(yōu)選在約lxl0、8xl0"之間，更優(yōu)選在約lxlO"-lxlO"之間。一個特別有用的有效量是約3xl0"個病毒顆粒。如本文所使用的，術(shù)語"藥用可接受載體"意指適于施用給個體的溶液或介質(zhì)。這些溶液或介質(zhì)可維持化合物與多肽的穩(wěn)定性，以及細胞的存活力。藥用可接受載體是本領(lǐng)域公知的，其包括水溶液比如磷酸鹽緩沖溶液或者介質(zhì)。藥用可接受載體也包括其它的部分、化合物和/或制劑，其增強或增加病毒顆粒乾向、附著或感染它們的體內(nèi)宿主細胞或組織的能力和/或用于定時釋放遞送或者出于免疫保護目的的作用。這些部分、化合物和/或制劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且可包含，例如，受體配體、細胞外基質(zhì)分子或其組分，以及化學(xué)遞送制劑。如本文所使用的，術(shù)語"分離的"意指基本上不含有如自然中通常所存在的污染物或材料的核酸。因此，術(shù)語"分離的"包含基本上純的核酸以及導(dǎo)入到異源細胞或組織的核酸。設(shè)計并生產(chǎn)用于治療糖尿病的本發(fā)明的合成啟動子。根據(jù)本文提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)，應(yīng)理解本文所描述的方法可應(yīng)用于大范圍的人病理學(xué)方法的設(shè)計和治療。這樣的病理學(xué)方法包括基因替換治療和可通過導(dǎo)入一種或多種基因產(chǎn)物調(diào)控生理系統(tǒng)的療法。因此，本發(fā)明描述了有關(guān)用于治療糖尿病的胰島素基因替換治療，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解可4吏用本發(fā)明的組合物和方法產(chǎn)生用于除糖尿病之外多種疾病的合成啟動子和基因的受調(diào)控表達。簡言之，用于胰島素基因替換治療的一組標(biāo)準包M擇合適的靶細胞，其具有類似于(3細胞的生化特征但是沒有自身免疫攻擊。所述耙細胞也應(yīng)該含有將胰島素原加工成為成熟的活性胰島素必需的生化機制。可響應(yīng)葡萄糖水平表達和釋放胰島素的調(diào)控系統(tǒng)也有益于保持葡萄糖動態(tài)平衡。對于靶細胞，肝臟可用作合適的胰島素生產(chǎn)替代器官，因為它是胰島素作用的主要位置，在葡萄糖動態(tài)平衡中起重要作用(Nguyen,T.H.&Ferry，N.(2004).Livergenetherapy:advancesandhurdles.G^we77^.11S叩pl:S76-84.S76-S84)。另夕卜，肝臟中的干細胞具有類似于胰腺p細胞中所發(fā)現(xiàn)的葡萄糖感受系統(tǒng)，其涉及葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白2(Rencurel，F(xiàn).,Waeber，G"Antoine,B.,Rocchiccioli,F"Maulard，P"Girard，J.etal.(1996).Requirementofglucosemetabolismforregulationofglucosetransportertype2(GLUT2)geneexpressioninliver,fi"c/ie附./"314(Pt3),903醒卯9)和葡萄糖激酶(Gould,GW.&Holman,CiD.(1993).Theglucosetransporterfamily:structurefunctionandtissue-specificexpression,g&c/^附./295(Pt2)，329-341;Iynedjian，P.B.(1993).Mammalianglucokinaseanditsgene,fi/oc/ie附./293(Pt1),1-13)。因此，類4以于胰腺P細胞，肝臟具有內(nèi)在的響應(yīng)血液葡萄糖濃度變化的能力。肝細胞還含有已充分表征過的弗林蛋白內(nèi)切酶，其具有已充分研表征過的切割i口、別序列(Arg-Xaa-Lys/Arg-Arg(Van,d"V，Roebroek,A.J.,&VanDuijnhoven,H丄.(1993).Structureandfunctionofeukaryoticproproteinprocessingenzmesofthesubtilisinfamilyofserineproteases.CW說ev.Owa7g.,4:115-136)。切割識別序列可摻入胰島素原作為其天然切割位點的異源取代，以使得加工成為胰島素A鏈和B鏈。弗林蛋白酶切割位點的摻入可包括改變堿性氨基酸殘基，將B/C(Arg-Arg)和C/A(Lys-Arg)連接改變?yōu)樗膲A性序列(Arg-X-Lys-Arg;SEQIDNO:16)，其被弗林蛋白酶識別?；蛘?，胰島素A鏈和B鏈可作為成熟的可分泌多肽共表達，并允許自組裝成異源二聚體胰島素。另外，將正常P細胞的調(diào)控賦予所述胰島素基因也是有益的，其使得將響應(yīng)血液葡萄糖水平升高而產(chǎn)生和釋放胰島素，并隨著血液葡萄糖濃度的下降而受到抑制。葡萄糖調(diào)控包括除了轉(zhuǎn)錄調(diào)控和分泌之外的一些因素，其包括需要的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白功能(Rencurel，F(xiàn).,Waeber，G,Antoine，B.，Rocchiccioli,F"Maulard，P"Girard，J.etal.(1996).Requirementofglucosemetabolismforregulationofglucosetransportertype2(GLUT2)geneexpressioninliver.所。c/^附./"314(Pt3)，卯3國909)、葡萄糖激酶功能和鉀/釣通道，其用于響應(yīng)細胞外葡萄糖濃度改變而分泌胰島素。已經(jīng)作出了一些使用肝臟特異性和葡萄糖應(yīng)答啟動子重建肝臟中胰島素的葡萄糖應(yīng)答生物合成的嘗試。但是，轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)在上調(diào)和下調(diào)胰島素生物合成上都具有相對慢的動力學(xué)，因此分別表現(xiàn)出高血糖狀態(tài)的延長或者導(dǎo)致低血糖。本發(fā)明提供非天然啟動子，其嚴格響應(yīng)葡萄糖調(diào)控胰島素產(chǎn)生，以規(guī)避這些慢的動力學(xué)。本發(fā)明提供分離的組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子。所述啟動子包含與至少一個三聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件的3，相連的聚合酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件具有肝細胞核因子-1(HNF-1)元件、CAAT/增強子結(jié)合蛋白(C/EBP)應(yīng)答元件和葡萄糖應(yīng)答元件(GRE)。本發(fā)明的組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子將具有聚合酶結(jié)合位點或結(jié)構(gòu)域，其足以被聚合酶識別并起動轉(zhuǎn)錄。所述聚合酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域可由，例如，II型聚合酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成。這樣的聚合酶與多種本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄因子相互作用，以增加或調(diào)控mRNA轉(zhuǎn)錄。但是，也可應(yīng)用其它的聚合酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中對順式結(jié)合元件作出相應(yīng)修飾以使得適應(yīng)于所選擇的聚合酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域。聚合酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域的具體例子是肝臟丙酮酸激酶(LPK)啟動子片段，其具有相對于如下文實施例1中所述轉(zhuǎn)錄起始位點的從-96位到+12位核苷酸。根據(jù)本文提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知啟動子和方法。本發(fā)明的組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子包含至少一個三聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件。所述三聯(lián)元件含有一個或多個增加轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子順式結(jié)合元件。如下文進一步描述的，基于在肝臟中增強轉(zhuǎn)錄來選擇順式結(jié)合元件。但是，為了將本發(fā)明應(yīng)用到肝臟之外的組織，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道當(dāng)其它靶組織用于基因替換治療時，在肝臟中有活性的順式結(jié)合元件可被在其它靶組織中有活性的順式結(jié)合元件所替代。這樣的對于非肝臟組織有活性的或特異性的其它轉(zhuǎn)錄因子順式結(jié)合元件是本領(lǐng)域中公知的。因此，下文關(guān)于肝臟中有活性的順式元件的描述是舉例性的。產(chǎn)生并選擇肝臟特異性葡萄糖應(yīng)^成啟動子，以包含一個或多個增加例如肝臟中轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子順式結(jié)合元件。多種具有3，連接到LPK啟動子的轉(zhuǎn)錄因子順式結(jié)合元件的啟動子示例在實施例1中描述并在圖3和4中顯示。為達到以肝臟特異性形式的快速轉(zhuǎn)錄激活，本發(fā)明啟動子將肝細胞富含的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件導(dǎo)入到葡萄糖應(yīng)答系統(tǒng)中。肝臟特異性啟動子和增強子以及順式作用調(diào)控元件的相對位置和它們與肝調(diào)控因子的相互作用是本領(lǐng)域公知的。任何已知的或鑒定的增加轉(zhuǎn)錄或控制的轉(zhuǎn)錄因子可用于本發(fā)明啟動子。參與肝臟特異性基因表達正調(diào)控的示例性肝臟特異性轉(zhuǎn)錄因子順式元件包含肝細胞核因子1(HNF-1)、CAAT/增強子結(jié)合蛋白(C/EBP)、和肝細胞核因子4(HNF-4)(Cereghini，S.(1996).Liver-enrichedtranscriptionfactorsandhepatocytedifferentiation,/^y五fi/,10:267-282)。兩個或更多個這些因子以不同的組合協(xié)同作用以在成體肝細胞中刺激給定基因的細胞特異性轉(zhuǎn)錄和增強轉(zhuǎn)錄看起來需要這些順式元件的特定組合(De,S.,V&Cortese,R.(1992).Transcriptionfactorsandliver-specificgenes.S/0cA/附.5/o/7^j^.y4"fl.，1132:119-126)。對于本發(fā)明肝臟特異性啟動子的具體實例，三聯(lián)序列可包含這些因子中的一個或多個以增加肝臟中胰島素的轉(zhuǎn)錄。為了轉(zhuǎn)錄活性和胰島素調(diào)控，也可包含協(xié)同作用的兩個或更多個的組合。協(xié)同作用的組合包含，例如，圖1-4中所示的顯示出高活性的那些組合其。任何這樣的組合可包含在本發(fā)明啟動子的三聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件中。本發(fā)明組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子的葡萄糖應(yīng)答可通過，例如，包含葡萄糖/碳水化合物應(yīng)答元件(G1RE或ChoRE)來達到。也可使用除G1RE之外的轉(zhuǎn)錄因子順式結(jié)合位點作為本發(fā)明的葡萄糖應(yīng)答元件。G1RE元件可在一些響應(yīng)葡萄糖的基因的3'調(diào)控區(qū)域中找到，所述基因包括，例如，LPK和Spot14(Doiron，B.,Cuif，M.H.,Kahn,A.,&az-Guerra，M.J.(1994).Respectiverolesofglucose,fructose,andinsulinintheregulationoftheliver-specificpyruvatekinasegenepromoter.丄5/oAC7^附.，269:10213-10216;Shih,H.M.,Liu,Z.,&Towle，H.C.(1995).TwoCACGTGmotifswithproperspacingdictatethecarbohydrateregulationofhepaticgenetranscription.丄丑/o/.C/re附.270:21991-21997;Shih,H.M.&Towle，H.C.(1992).Definitionof仇ecarbohydrateresponseelementoftheratS14gene.Evidenceforacommonfactorrequiredforcarbohydrateregulationofhepaticgenes./.忍/o/.C/ie附.,267:13222-13228)并且含有兩個拷貝的與c-myc家族轉(zhuǎn)錄因子的共有結(jié)合位點CCTGTG相關(guān)的基序。此結(jié)合位點對葡萄糖應(yīng)答調(diào)控是足夠的。但是，GIRE需要輔助位點，例如對于LPK是HNF-4以及對于S14的未知轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點，以支持對葡萄糖的完整應(yīng)答(Shih，H.M.，Liu，Z.，&Towle,H.C.(1995).TwoCACGTGmotifswithproperspacingdictatethecarbohydrateregulationofhepaticgenetranscription./.jB/o/.C/re附.270:21991-21997)。本發(fā)明的組織斗異性葡萄糖應(yīng)答啟動子與HNF-4結(jié)合元件和LPK啟動子組合產(chǎn)生雜交元件，稱為GRE，其實現(xiàn)了葡萄糖應(yīng)答活性的增強?；谒媒M織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子的活性來選擇轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件的順序。簡言之，啟動子和增強子的調(diào)控區(qū)域由一些順式調(diào)控元件的組合組成，并且所述元件的組成和排列通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控子之間的組合相互作用確定調(diào)控區(qū)域的特性(Carey,M.(1998).Theenhanceosomeandtranscriptionalsynergy.CW/，92:5-8)?？赏ㄟ^與同類順式元件結(jié)合的多個活化子與許多不同的能夠有轉(zhuǎn)錄協(xié)同作用的轉(zhuǎn)錄因子組合的組合作用和協(xié)同作用增加轉(zhuǎn)錄效率和活性水平。這些相互作用的一個好處在于有限數(shù)量的活化子可布置成多個可能的組合，其每個在生物學(xué)上可以是不同的(Struhl,K.(2001).Generegulation.Aparadigmforprecision.5W^i"293:1054-1055)?；谶@些特性，建立文庫并篩選特別有用的組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子，其含有隨機順序的三順式調(diào)控元件用于肝臟特異性增強轉(zhuǎn)錄活性的HNF-l和C/EBP;以及用于葡萄糖應(yīng)答的合成啟動子的與HNF-4結(jié)合的葡萄糖應(yīng)答元件(GRE)。在所述合成啟動子文庫中使用培養(yǎng)的大鼠肝細胞瘤細胞系篩選表現(xiàn)出高轉(zhuǎn)錄活性的啟動子，接著使用動物模型進行體內(nèi)確認。用于構(gòu)建本發(fā)明組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子文庫的HNF-l轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件長約27個威基，如SEQIDNO:l所示。但是，用于本發(fā)明啟動子的HNF-l順式元件可包含較大和較小的片段，只要保持HNF-l轉(zhuǎn)錄活性即可。例如，HNF-l轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件可在約15-100個核苷酸的范圍內(nèi)，優(yōu)選約20-50個核香酸，更優(yōu)選約25-30個核苦酸。用于構(gòu)建本發(fā)明組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子文庫的C/EBP轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件長約22個核苷酸，如SEQIDNO:2所示。但是，用于本發(fā)明啟動子的C/EBP順式元件可包含較大和較小的片段，只要保持C/EBP轉(zhuǎn)錄活性即可。例如，C/EBP轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件可在約12-100個核苷酸的范圍內(nèi)，優(yōu)選約16-50個核苷酸，更優(yōu)選約20-25個核香酸。用于構(gòu)建本發(fā)明組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子文庫的GRE轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件長約48個核苷酸，如SEQIDNO:3所示。但是，用于本發(fā)明啟動子的GRE順式元件可包含較大和較小的片段，只要保持GRE轉(zhuǎn)錄活性即可。例如，GRE轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件可在約15-100個核苦酸的范圍內(nèi)，優(yōu)選約25-75個核苷酸，更優(yōu)選約45-50個核苷酸。在本發(fā)明三聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件中的順式元件如下文實施例1所述可被并入多種不同組合。所述組合可包含不同順序的各個元件，其包含所有可能的組合和排列以及各個順式元件之間和三聯(lián)元件和啟動子元件之間的空間變化?？臻g變化可包括，例如，順式元件基本上鄰近另一元件或與另一元件直接不間斷的相連。另外，轉(zhuǎn)錄因子也可在多種空間位置操縱，其中在間隔區(qū)域中具有足夠的彈性，以使得，當(dāng)兩個因子發(fā)生物理相互作用而它們的同類順式結(jié)合區(qū)域彼此間具有實質(zhì)距離時，核酸可形成環(huán)。因此，可調(diào)整間隔，以在本發(fā)明轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件之間包含寬范圍的間插序列。本發(fā)明啟動子可包括其它修飾，其包括，例如，如上所述的三聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件的大小。本發(fā)明啟動子的具體組合和序列在實施例1和圖1-4中進一步舉例說明。本發(fā)明的組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子含有至少一個三聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件。三聯(lián)順式元件在下文舉例說明，其具有HNF-1、C/EBP和GRE的多種組合。上文和下文所述的其它元件也可取代或包括在此三聯(lián)元件中以達到提高組織特異性表達或葡萄糖應(yīng)答。另外，對于三聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件的順式元件組分的多種組合和排列而言，多種組合、排列和更高重復(fù)次數(shù)的三聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件可包括在本發(fā)明的啟動子中，以進一步增加它們的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控控制。例如，兩個或更多個三聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件可基本鄰近地、連續(xù)地或者含有間插序列地進行組合，以產(chǎn)生具有六個或更多順式元件組分的啟動子。兩個或更多個三聯(lián)元件可以相同方向或頭對腳方向組合或連接。或者，兩個或更多個三聯(lián)元件可以相反或頭對頭方向組合。如在實施例中進一步舉例說明的，任一種方向都將實現(xiàn)可用于本發(fā)明方法的轉(zhuǎn)錄活性和控制。在實施例中例舉的是單個三聯(lián)元件以及以基本鄰近方式結(jié)合的兩個和三個三聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件組合，在每個三聯(lián)元件之間只有限制性識別序列。這些組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子的活性在實施例中描述并且在圖l-12的一些測定中舉例說明。除了單個、兩個或三個三聯(lián)元件之外，其它更高的重復(fù)次數(shù)可包括在本發(fā)明的啟動子中。添加的多于3個的三聯(lián)順式元件類似，彼此之間可以是相同或相反方向的相同、相反或任意組合。因此，本發(fā)明提供組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子，其具有l(wèi)、2、3、4或5個或更多的三聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件。組成三串聯(lián)重復(fù)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件的轉(zhuǎn)錄因子順式元件可以包括HNF-1、C/EBP或GRE。上文和下文所述的其它元件也可取代或包含在此三聯(lián)元件中，以達到組織特異性表達或葡萄糖應(yīng)答的提高。除了在培養(yǎng)的細胞中構(gòu)建、篩選和鑒定全部有活性的組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子之外(本文也稱為體外)，本發(fā)明啟動子的轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控控制也在體內(nèi)進行確認。筒言之，使用腺病毒載體用于遞送在本發(fā)明啟動子控制下的編碼異源基因的核酸，相比于培養(yǎng)物中的測量，其確認了含有本發(fā)明啟動子的多種三聯(lián)體的的類似體內(nèi)轉(zhuǎn)錄和調(diào)控活性。因此，本發(fā)明也提供了宿主細胞和具有含本發(fā)明組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子的細胞的宿主，所述啟動子能夠表達乾核酸。如下文進一步描述的，所述耙核酸可以是胰島素、胰島素原、胰島素A鏈、胰島素B鏈或者胰島素A鏈和B鏈。在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了宿主細胞或者表達胰島素原的細胞群體，所述胰島素原可以以組織特異性葡萄糖應(yīng)答的方式被加工成胰島素。本發(fā)明的宿主細胞基本上可來源于4壬何組織或器官。一個特別可應(yīng)用于治療的細胞類型是在本發(fā)明肝臟特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子控制下表達胰島素原的肝細胞，所述胰島素原可被加工成胰島素。但是，任何細胞類型都可用作本發(fā)明的宿主細胞，并且可基于其預(yù)期的應(yīng)用進行選擇，所述應(yīng)用包括，例如，治療、診斷或研究目的。對于宿主原代細胞，應(yīng)該選擇易得的且含有表現(xiàn)出所需生長和表達特性的細胞的組織。當(dāng)選擇組織來源時，其它的考慮包括對組織的選擇，所述組織含有可被分離、培養(yǎng)和修飾以表達生物活性胰島素的細胞。除了肝臟之外，組織來源的例子包括胰腺、肌肉、脂肪、腸、神經(jīng)內(nèi)分泌細胞或皮膚組織，以及造血細胞來源的。因此，在這些組織之中的細胞類型可以被^f務(wù)飾以組織特異性和葡萄糖調(diào)控的形式表達耙基因，并且可以被分離并用于包括例如實驗研究、載體保持和傳代的目的，以及用于細胞治療方案。這樣的細胞類型包括，例如，肝細胞、P胰島細胞、肌肉(平滑肌、骨骼肌或心肌)細胞、成纖維細胞、肝臟細胞、脂肪細胞、造血細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞、內(nèi)分泌細胞、外分泌細胞、腎細胞、膀胱細胞、脾臟細胞、干細胞和生殖細胞。特別有用的宿主細胞是肝細胞，包括能夠分化成肝細胞的祖細胞和干細胞。類似的其它細胞類型是本領(lǐng)域已知的，其能夠被修飾以表達葡萄糖應(yīng)答的胰島素，并且可如上文所述類似的從組織來源中獲得或分離到。盡管對于治療目的來講，人組織來源是有益的，但是細胞來源的物種基本上可以是任何哺乳動物，只要所述細胞表現(xiàn)出允許將胰島素原表達加工成生物活性的胰島素并分泌的特性即可。本發(fā)明也提供治療或預(yù)防糖尿病的方法。所述方法包括將有效量的具有包含了組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子的載體的病毒顆粒施用給個體，所述啟動子包含與至少一個三聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件的3，相連的聚合酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件具有肝細胞核因子-1(HNF-1)元件、CAAT/增強子結(jié)合蛋白(C/EBP)應(yīng)答元件和葡萄糖應(yīng)答元件(GRE)，所述元件可操縱的連接到編碼胰島素的核酸上，其中編碼胰島素核酸的表達是組織特異性的及葡萄糖應(yīng)答的。在另一個實施方案中，任何本發(fā)明的組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子可以可操縱的連接到胰島素編碼核酸(例如胰島素原)并用于基因替換治療。如下文進一步描述的，可以應(yīng)用本領(lǐng)域公知的多種方法中的任意方法將組織特異性葡萄糖應(yīng)答胰島素編碼核酸導(dǎo)入到靶細胞或組織中，用于體內(nèi)產(chǎn)生胰島素和治療糖尿病。用于靶向和摻入在本發(fā)明啟動子控制下的胰島素編碼基因的一個特別有用的方法是將基因構(gòu)建體摻入到病毒載體以產(chǎn)生病毒顆粒。施用這樣的含有本發(fā)明載體的病毒顆粒能夠在感染后以組織特異性和葡萄糖應(yīng)答的方式表達生物活性胰島素用于治療和預(yù)防糖尿病。在這一點上，如在下文實施例1中進一步舉例的，可產(chǎn)生重組腺病毒，其在本文所述組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子的控制下表達胰島素編碼核酸(例如胰島素原基因)，所述病毒可被注射進入個體用于感染并將本發(fā)明的編碼核酸和啟動子摻入受體宿主細胞。取決于所述病毒載體，表達可以是，例如，附加體型的或者是通過整合進宿主細胞基因組的。編碼胰島素的核酸可以是人的，并被修飾以導(dǎo)入弗林蛋白酶識別位點，其用于在肝臟中將胰島素原加工成成熟胰島素。腺病毒載體在基因替換治療中是特別有用的，因為它們已經(jīng)被充分的研究過并容易用于人類基因治療。因此，在本發(fā)明方法中典型的病毒顆粒是腺病毒載體顆粒。但是，如之前和下文對所述載體進一步描述的，根據(jù)本文提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，寬范圍的病毒顆?？捎糜诮M織特異性葡萄糖應(yīng)答胰島素基因遞送、生物活性胰島素的表達和分泌。不論是腺病毒、其它基于DNA病毒的、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它的病毒，帶有含本發(fā)明組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子控制下的治療基因的栽體作為其基因組的病毒顆?？捎糜诒景l(fā)明方法以治療或預(yù)防糖尿病。本發(fā)明的病毒顆?？梢岳缡褂帽绢I(lǐng)域公知的多種方法中任意方法產(chǎn)生，用于包裝病毒基因組。這樣的方法在下文關(guān)于帶有本發(fā)明載體的腺病毒顆粒的實施例1中有舉例。可通過多種施用途徑和方法使用上文所述病毒顆粒治療缺少葡萄糖動態(tài)平衡的糖尿病個體。使用本領(lǐng)域公知的臨床標(biāo)準和糖尿病預(yù)后指標(biāo)選擇適于使用本發(fā)明方法治療的個體。根據(jù)至少一種糖尿病癥狀或與糖尿病相關(guān)的病理狀況(如本文之前所述)確定的臨床診斷準許施用本發(fā)明的細胞。在表l中列舉了典型的病理狀況。根據(jù)已知的預(yù)后指標(biāo)比如家族史、禁食血液葡萄糖水平或降低的葡萄以葡萄糖調(diào)控的方式表達胰島素原和蛋白酶的細胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認識到或知道如何診斷患有糖尿病或葡萄糖攝取失調(diào)的個體，并且，根據(jù)疾病的程度或嚴重性，可對何時施用本發(fā)明的病毒顆粒作出合適的判斷，并且也可選擇最適當(dāng)?shù)氖┯媚Ｊ?。例如，盡管患有長期I型糖尿病的人可能需要即刻施用病毒顆粒以便感染和分泌在組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子控制下的胰島素編碼核酸，而患有長期II型糖尿病的人可推遲治療，直至有跡象表明指定的其它治療缺少有效性?？蓪⒑休d體的病毒顆粒施用給已經(jīng)確定為需要治療糖尿病以緩解他們的疾病或者可以從中受益的個體，所述載體包含可操縱性連接著組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子的胰島素編碼核酸(例如胰島素原)?？墒┯盟霾《绢w粒以改善糖尿病的一種或多種體征或癥狀。例如，可在作出疾病診斷之后對糖尿病個體施用具有包含本發(fā)明組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子的基因組的病毒顆粒，所述啟動子被可操縱地連接到胰島素編碼核酸用于葡萄糖調(diào)控表達、加工和分泌生物活性胰島素。所述病毒顆粒將感染靶組織和細胞，并且通過在體內(nèi)表達其載體基因組而以葡萄糖調(diào)控的方式表達生物活性胰島素。胰島素的產(chǎn)生將導(dǎo)致例如葡萄糖動態(tài)平衡的恢復(fù)。糖尿病得到有效治療的個體在產(chǎn)生了異源生成的胰島素后，將顯示出指示該疾病的至少一種癥狀嚴重程度的降低。癥狀嚴重程度的降低是可被檢測的，且對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。也可以向患有輕度糖尿病的個體施用本發(fā)明的病毒顆粒。對這些個體是否需要治療的判斷可由本領(lǐng)域技術(shù)人員作出。例如，對標(biāo)準治療方法沒有反應(yīng)或反應(yīng)不佳的糖尿病個體可使用本發(fā)明的方法進行治療。例如，II型糖尿病患者，其已經(jīng)盡力但未能成功地維持長期的體重降低或堅持鍛煉方案，這樣的患者可通過移植本發(fā)明的細胞群體來治療它們的胰島素抵抗。本發(fā)明的方法也可用于提高其它糖尿病療法的療效。本發(fā)明的方法可與先前存在的或其它的治療方法聯(lián)合使用以提高其它方法的療效或使用簡便性。例如，在對接受每天注射胰島素的患者或使用胰島素泵的患者施用本發(fā)明的病毒顆粒后，可產(chǎn)生生產(chǎn)胰島素的肝臟細胞。施用和感染含有可操縱連接到胰島素編碼核酸的本發(fā)明組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子的病毒顆粒以及之后生物活性胰島素的受調(diào)控產(chǎn)生可降低此類患者注射胰島素的頻率。也可對未接受胰島素治療但接受了行為矯治治療(例如節(jié)食和運動以減輕體重)的糖尿病個體施用本發(fā)明的病毒顆粒。在這些個體中施用含有可操縱連接到胰島素編碼核酸的本發(fā)明組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子的病毒顆粒，并聯(lián)合減輕體重和鍛煉方案，可以降低疾病復(fù)發(fā)的可能性或者可改善疾病的體征或癥狀。也可應(yīng)用本發(fā)明含有可操縱連接到胰島素編碼核酸的本發(fā)明組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子的病毒顆粒治療針對內(nèi)源胰島素分泌細胞具有自身免^應(yīng)的糖尿病患者。這些糖尿病個體經(jīng)常通過針對自身免M應(yīng)的免疫治療性介入進行治療。這些個體可另外通過生物活性胰島素的肝臟特異性葡萄糖應(yīng)答產(chǎn)生來治療，以達到相比于單獨使用免疫療法時更好的療效。可以將本發(fā)明的含有可操縱連接到胰島素編碼核酸的組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子的本發(fā)明病毒顆粒施用給個體，以使葡萄糖動態(tài)平衡增加。病毒顆?；蚪M的整^f吏得葡萄糖動態(tài)平衡延長，其是由于胰島素功能的表達性恢復(fù)所致?？上蚧加刑悄虿〉膫€體施用有效量的病毒顆粒以減輕或預(yù)防糖尿病。這些個體可具有約140mg/dl或更高的禁食血液葡萄糖水平。適于感染的病毒顆粒有效量由在范圍內(nèi)的顆粒大小或顆粒數(shù)目組成，所述范圍對于含有可操縱地與胰島素編碼核酸連接的本發(fā)明組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子的顆粒是可獲得的或可被修改的，所述病毒顆粒的有效量足以在病毒感染i^體內(nèi)受益于治療的靶細胞或組織(例如肝臟)之后表達大量葡萄糖調(diào)控的生物活性胰島素。對于人類個體來說，病毒顆粒的有效量可以是例如根據(jù)本文提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)以及本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的知識，從可靠的糖尿病動物模型中推導(dǎo)出來。對于小鼠動物模型而言，病毒顆粒的有效量例如包括在約lxloS-lxlO"之間，優(yōu)選在約lxl0、8xl011之間，更優(yōu)選在約lxlO"-lxlO"之間。特別有用的有效量是約3xl0"個病毒顆粒。對病毒顆粒數(shù)量的選擇可取決于顆粒的來源、接受個體的狀況、以及所需的胰島素分泌水平。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道如何使用本領(lǐng)域公知的方法確定產(chǎn)生治療效果的病毒顆粒的合適數(shù)量。可以采用多種途徑施用本發(fā)明病毒顆粒用于遞送在本發(fā)明肝臟特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子控制下的胰島素編碼核酸。除靜脈內(nèi)注射(i.v.)之外，有效量的病毒顆粒也可通過例如肌肉內(nèi)注射、皮下注射、腹膜內(nèi)注射、或者注射到組織或器官位置而施用給個體。用以施用的病毒顆?？赏ㄟ^本領(lǐng)域公知的方法獲得和制備，并混懸在合適的生理載體中。例如，病毒顆?？赏ㄟ^連接在含有所述顆粒的裝置上的導(dǎo)管(所述導(dǎo)管插入靜脈)而直接注入，或者可直接注射進入組織。所述病毒顆粒在藥用可接受栽體中被注入，該載體在上文定義并在下文進一步討論。所述病毒顆粒也可與其它促進遞送、靶向和/或療效的分子一起施用。病毒顆?？梢愿鶕?jù)需要單次或多次施用，以使得葡萄糖調(diào)控的生物活性胰島素實現(xiàn)治療水平的足夠表達。然后可通過檢測進食后的胰島素分泌水平來監(jiān)測使用病毒顆粒治療的個體，以觀察其療效。這一檢測可由例如對胰島素血液水平的放射性免疫法檢測或ELISA組成。作為替代的，對施用病毒顆粒后個體中禁食葡萄糖水平的測量可用來確定治療效力。根據(jù)葡萄糖耐受測試所確定的葡萄糖消除速率的降低也可被用來驗證治療效力。另外，至少一種與糖尿病有關(guān)的癥狀的減輕也可用來確定治療效力。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道評價和診斷治療效力的合適方法。本發(fā)明也可用于預(yù)防糖尿病。例如，含有可操縱連接著胰島素編碼核酸的本發(fā)明組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子的病毒顆?？勺鳛轭A(yù)防藥施用給具有發(fā)生糖尿病風(fēng)險或患有高血糖的個體。本發(fā)明也可用于比如遺傳上易發(fā)生糖尿病的個體或具有發(fā)生胰島素抵抗或高血糖失調(diào)風(fēng)險的肥胖個體。這些個體在臨床上明顯的高血糖發(fā)作之前或期間，可接受有效量的含有可操縱性連接著胰島素編碼核酸的本發(fā)明組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子的病毒顆粒，用于感染靶細胞并且隨后分泌葡萄糖調(diào)控的胰島素。后一種情況可視為預(yù)防該疾病，但是也可視為治療該疾病，因為在慢性高血液葡萄糖水平顯示出來以前，獲得了正常的葡萄糖動態(tài)平衡。除了施用含有可操縱性連接著胰島素編碼核酸的本發(fā)明組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子的病毒顆粒以在個體中感染和產(chǎn)生葡萄糖調(diào)控的生物活性胰島素之外，本發(fā)明的載體也可直接施用到個體用于遺傳修飾，例如用于離體或體內(nèi)治療。本發(fā)明的含有可操縱性連接著胰島素編碼核酸的本發(fā)明組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子的病毒顆?；蜉d體可直接導(dǎo)入到人體或配制成為藥用組合物，其包含藥用可接受載體。藥用可接受載體是本領(lǐng)域公知的，包含水溶液比如水、生理緩沖鹽水、或其它溶劑，或者載體比如二元醇類、甘油、油類比如橄欖油或可注射有機酯。藥用可接受載體可包含生理可接受化合物，其用于例如穩(wěn)定或增加病毒顆粒的感染、載體核酸序列的吸收、或兩者皆有。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道對藥用可接受載體包括生理可接受化合物的選擇取決于例如施用含有可操縱連接到胰島素編碼核酸的本發(fā)明組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子的病毒顆粒的途徑以及病毒顆粒的具體特征，例如，病毒顆粒是基于DNA病毒還是逆轉(zhuǎn)錄病毒。如果需要的話，藥用組合物也可被摻入水包油型乳劑、微乳、膠束、混合膠束、脂質(zhì)體、孩i球或其它多聚物基質(zhì)中(Gregoriadis，Z^pso附eT^/mo/柳，Vols.ItoIII，2nded.,CRCPress,BocaRaton,FL(1993);Fraleyetal.,Trends歷oc/^附6:77(1981))。例如，由磷脂或其它脂質(zhì)組成的脂質(zhì)體是無毒的、生理可接受并可代謝的載體，它們的制備和施用相對簡單。另外，脂質(zhì)體是特別有用的，因為它們可高效率包封本發(fā)明的含有可操縱連接到胰島素編碼核酸的本發(fā)明組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子的載體，而不損害試劑的生物學(xué)活性，優(yōu)先地并充分地結(jié)合于耙細胞，并高效的將嚢泡中的水性內(nèi)容物遞送到靼細胞中(見Mannimoetal.,所otec/m/,s6:682(1988))。用于遞送本發(fā)明載體到個體的脂質(zhì)體靶向可以是被動的或主動的。被動靶向例如利用了脂質(zhì)體在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)細胞中和在器官比如肝臟中累積的趨勢，肝臟中含有竇狀毛細血管。這些配制為脂質(zhì)體的載體可直接輸注入肝臟的門靜脈，并且將有效修飾肝臟細胞以表達胰島素，這是由于肝臟中RES細胞濃度和肝臟中循環(huán)系統(tǒng)的竇狀特性所致。含有載體的脂質(zhì)體的主動靶向可通過將特異性配體與脂質(zhì)體相偶聯(lián)來實現(xiàn)。這些配體包含單克隆抗體、糖、糖脂或蛋白質(zhì)比如由靶細胞所表達受體的配體。選擇哪一種靶向方法取決于待修飾以用于胰島素表達的細胞類型或組織的位置。給個體施用含有可操縱連接到胰島素編碼核酸的本發(fā)明組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子的病毒顆?；蜉d體，可以是單次治療或者多次治療，其取決于所需產(chǎn)生胰島素的水平或待修飾細胞的數(shù)量。用于遞送編碼多肽的核酸序列的方法是本領(lǐng)域已知的，例如，如Feigneretal.，美國專利No.5,580,859(1996年12月3日頒證)所述。也可實施多次施用以增加修飾細胞的比例，增加每細胞的可操縱連接到本發(fā)明組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子的胰島素編碼核酸的拷貝數(shù)，或者在所需時期內(nèi)維持修飾細胞的有效數(shù)量。如果至少一種糖尿病癥狀緩解或減輕，則達到了體內(nèi)治療的療效。在所治療的個體中，糖尿病癥狀嚴重程度的減輕可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)前文所述進行測定。用于導(dǎo)入和表達在組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子控制下的胰島素編碼核酸的基因替換療法的典型模式在下文例舉。這樣的模式包括應(yīng)用腺病毒載體，以及組織特異性例如肝臟。在設(shè)計和優(yōu)化用于治療疾病的基因替換療法時，要考慮三個通常的部分。這些部分包含傳遞基因的載體、用于將所述載體遞送到合適組織或器官的裝置和方法、以及治療性基因?？苫诒绢I(lǐng)域公知的標(biāo)準選擇或調(diào)整每個部分，其取決于感興趣的特定疾病的具體特征。已經(jīng)開發(fā)了許多基因轉(zhuǎn)移載體，其中任一都可用于與本發(fā)明的組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子的聯(lián)合，以遞送受調(diào)控的治療基因?；蜣D(zhuǎn)移載體可大致分為病毒型和非病毒型基因遞送系統(tǒng)。病毒遞送系統(tǒng)基于能夠?qū)⑦z傳信息遞送iiyV宿主細胞的復(fù)制病毒。通常，復(fù)制病毒的基因組含有編碼區(qū)和順式作用調(diào)控元件。所述編碼序列負責(zé)產(chǎn)生病毒結(jié)構(gòu)和調(diào)控蛋白，其對于感染性病毒的復(fù)制是必需的，而順式作用序列是病毒基因組包裝和整合進宿主細胞所必需的。所述病毒的編碼區(qū)被治療性基因所替換，留下完整的順式作用序列以產(chǎn)生復(fù)制缺陷型病毒時，含有治療性基因遺傳信息的復(fù)制缺陷型病毒顆粒在這些細胞中產(chǎn)生。目前可用于基因治療的病毒載體基于不同的病毒?；谙傧嚓P(guān)病毒(AAV)和逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體具有將它們的基因組整合到宿主細胞染色體DNA中的能力，其將有可能實現(xiàn)終生的基因表達?；谙俨《竞虸型單純皰瘆病毒(HSV-1)的載體代表了非整合型載體。這些載體將它們的基因組遞送進靼細胞的細胞核內(nèi)，在其中它們?nèi)匀皇歉郊芋w。逆轉(zhuǎn)錄病毒是有包膜RNA病毒的一個大家族，其在所有脊推動物中都有發(fā)現(xiàn)并且可分為致癌逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒和泡沫病毒。他們具有兩拷貝的7-llkb的線性、正義、單鏈RNA基因組。在進入耙細胞之后，通過病毒逆轉(zhuǎn)錄酶將所述RNA基因組轉(zhuǎn)變成線性雙鏈DNA并整合進細胞染色質(zhì)(Goff，S.P.(2004).Retrovirusrestrictionfactors.AfoAO//,16:849-859.)。所有逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組在它們的末端具有兩個長末端重復(fù)(LTR)序列(Wilhelm，M.&Wilhelm,F.X.(2001).ReversetranscriptionofretrovirusesandLTRretrotransposons.CW/Mo/.!^5W"58:246-1262)。在病毒基因表達、和包裝、逆轉(zhuǎn)錄以及基因組整合的過程中，LTR和鄰近序列以順式起作用。位于LTR旁側(cè)的gag、pol和env基因分別編碼結(jié)構(gòu)核心蛋白質(zhì)、核酸聚合酶/整合酶和表面糖蛋白。慢病毒在它們的基因組中具有另外兩個基因，例如tat和rev，其對于所述基因組表達是必需的，以及一組可變的輔助性基因(Roebuck,K.A.&Saifuddin，M.(1999).RegulationofHIV-Itranscription.GWie^/w:8:67-84)。由于大部分順式作用序列的位置在終止區(qū)，通常產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒作為病毒基因傳遞載體。最高8kb的替代病毒基因的治療性基因可被插入并表達。為了包裝逆轉(zhuǎn)錄載體，在包裝細胞系中以反式提供了結(jié)構(gòu)蛋白(Marni，R.，Mulligan,R.C.,&Baltimore,D.(1983).Constructionofaretroviruspackagingmutantanditsusetoproducehelper-freedefectiveretrovirus.CW/，33:153-159)。為避免同源重組，已經(jīng)開發(fā)了表達來自獨立構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)蛋白的包裝細胞(Danos，O.&Mulligan,R.C.(1988).Safeandefficientgenerationofrecombinantretroviruseswithamphotropicandecotropichostranges.iVoc.7V(^L4cflrf.iS^/.t/.51.^4,85:6460-6464.)。病毒衣殼糖蛋白通過其與靶細胞上受體的相互作用決定了逆轉(zhuǎn)錄病毒的宿主范圍。所述細胞趨性可通過名為假分型的過程將特定病毒Env替換成來自不同病毒的另一種Env來進行調(diào)對Naldini，L.,Blomer，U.,Gage，F(xiàn).H.,Trono,D.,&Verma,I.M.(1996).Efficienttransfer,integration,andsustainedlong-termexpressionofthetransgeneinadultratbrainsinjectedwithalentiviralvector.P/w.iV,L4aw/.iSW.U.S.A.,93:11382-11388;Zufferey,R.,Nagy,D.，Mandel,RJ.,Naldini,L.,&Trono，D.(1997).Multiplyattenuatedlentiviralvectorachievesefficientgenedeliveryinvivo.TV^AV^c/mo/.,15:871-875)。該方法可通過摻入來自無關(guān)病毒的A列擴展逆轉(zhuǎn)錄載體的宿主范圍。例如，使用皰滲性口炎病毒(VSV-G)的G糖蛋白假型的逆轉(zhuǎn)錄病毒可感染大部分細胞并且可被濃縮到超過lxlO"轉(zhuǎn)導(dǎo)單位/ml的效價(Burns,J.C.,Friedma叫T.,Driever,W.,Burrascano，M.,&Yee,J.K.(1993).VesicularstomatitisvirusGglycoproteinpseudotypedretroviralvectors:concentrationtoveryhightiterandefficientgenetransferintomammalianandnonmammaliancells.iVoc.iVflf/.ylcflrf.iSc/.t/.5^.，卯:8033誦8037)。逆轉(zhuǎn)錄載體整合進靶細胞基因組的能力是對基因治療應(yīng)用有用的特性。核膜的破壞對于前整合復(fù)合體是必需的，以整合i^染色質(zhì)(Roe,T.,Reynolds,T.C.,Yu,G，&Brown,P.O.(1993).IntegrationofmurineleukemiavirusDNAd印endsonmitosis./,12:2099-2108.)，逆轉(zhuǎn)錄載體的生產(chǎn)性轉(zhuǎn)導(dǎo)取決于進入后不久靶細胞的有絲分裂(Miller,D.G.，Adam,M.A.，&Miller,A.D.(1990).Genetransferbyretrovirusvectorsoccursonlyincellsthatareactivelyreplicatingatthetimeofinfection-Mo/.CW/10:4239-4242.)。因此，逆轉(zhuǎn)錄載體可應(yīng)用于增殖性乾標(biāo)，例如淋巴細胞和造血祖細胞(Halene,S.&Kohn，D.B.(2000).Genetherapyusinghematopoieticstemcells:Sisyphusapproachesthecrest.H誕G麼77^"11:1259-1267)。有超過50種不同的人腺病毒血清型。其中，目前的載體主要來源于已知為血清型2和5的那些載體。另外，使用不同血清型衣殼的次級載體遞送已經(jīng)被證明可在動物才莫型中用于載體的重施用(Morral,N.，O'Neal,W.，Rice,K.,Leland,M.，Kaplan,J.，Piedra，P.A.etal.(1999).Administrationofhelper-dependentadenoviralvectorsandsequentialdeliveryofdifferentvectorserotypeforlong-termliver-directedgenetransferinbaboons.戶n^.A^L4cfl^.SdU.S.A.,96:12816-12821;Parks,R.,Evdegh，C.,&Graham,F.(1999).Useofhelper-dependentadenoviralvectorsofalternativeserotypespermitsrepeatvectoradministration,7%^:,6:1565-1573)。細胞趨向或免疫應(yīng)答的改變已導(dǎo)致來自不同血清型的病毒纖維蛋白的改變，其負責(zé)主要的病毒-細胞受體結(jié)合(Curiel,D.T.(1999).Strategiestoadaptadenoviralvectorsfortargeteddelivery.Jw/i.A^IL4cflrf.5W.，886:158-171.;Wickham，T.J.(2000).Targetingadenovirus.(7ewerAer"7:110-114)。i^細胞后，所述病毒顆粒含有允許有效內(nèi)涵體裂解和脫離的蛋白，其允許所述基因組進入細胞核(Kasamatsu,H.&Nakanishi，A.(1998).HowdoanimalDNAvirusesgettothenucleus爿/f/i".Jev.Af/cro辦/o/"52:627-686.)。一個細胞可產(chǎn)生多達10,000個病毒顆粒，并且通常可達到純化濃度為lxl013個載體顆粒/ml(Vorburger,S.A.&Hunt,K.K.(2002).Adenoviralgenetherapy.Owa/og/st，7:46-59.)。已知E3基因在免iO^見中起作用；但是，它們對于病毒的生命周期卻不是必要的(Woid，w.s.&Gooding,L.R.(1991).RegionE3ofadenovirus:acassetteofgenesinvolvedinhostimmunosurveillanceandvirus-cellinteractions.Ww/。^，184:1-8.)。移去這一區(qū)域提供了用于插入最高8kb的較大外源DNA的額外空間。有用的載體含有El和E2和/或E4基因的缺失(Lusky,M.，Christ,M.,Rittner,K.,Dieterle,A.,Dreyer,D.，Mourot,B.etal.(1998).InvitroandinvivobiologyofrecombinantadenovirusvectorswithEl,E1/E2AorE1/E4deleted.丄Wra/.，72:2022-2032;Armentano，D.,Smith,M.P.,Sookdeo，C.C.,Zabner,J.,Perricone，M.A.，StGeorge,J.A.etal.(1999).E40RF3requirementforachievinglong-termtransgeneexpressionfromthecytomegaloviruspromoterinadenovirusvectors./Wro/.73:7031-7034;Gorziglia，M.I.，Lapcevich,C,Roy,S.，Kang，Q.,Kadan,M.，Wu，V.et.al.(1999).GenerationofanadenovirusvectorlackingEl，e2a,E3,andallofE4exceptopenreadingframe3./Wra/.73:6048-6055;Christ,M.,Louis,B.,Stoeckel,F"Dieterle,A.，Grave,L.，Dreyer,D.etal.(2000).ModulationoftheinflammatorypropertiesandhepatotoxicityofrecombinantadenovirusvectorsbytheviralE4geneproducts.//"柳.(7erte7%^;11:415-427)。為降低可能的病毒毒性，輔助病絲賴型載體系統(tǒng)是可利用的，其中輔助病*^有所有復(fù)制所需的病毒基因同時在包裝結(jié)構(gòu)域中帶有條件性缺陷，防止它被包裝進病毒衣殼(Morsy,M.A.&Caskey，C.T.(1999).Expanded-capacityadenoviralvectors—thehelper-dependentvectors.MCM^f.Tirfflj;,5:18-24)。第二個載體只含有病毒倒置末端重復(fù)序列(ITR)、治療性基因序列和正常的包裝識別信號，其允許該基因組被選擇性包裝并從細胞釋放。由于缺乏除包裝區(qū)域之外的病毒基因組，這些栽體具有降低的毒性(Balague，C"Zhou，J"Dai,Y"Alemany，R.，Josephs,S.F"Andreason,Getal.(2000).Sustainedhigh-levelexpressionoffull-lengthhumanfactorVIIandrestorationofclottingactivityinhemophilicmiceusingaminimaladenovirusvector.95:820-828;Morral，N.，Parks,R.J.，Zhou,H.,Langston，C.,Schiedner,G,Quinones，J.etal.(1998).Highdosesofahelper-dependentadenoviralvectoryieldsupraphysiologicallevelsofalpha1-antitrypsinwithnegligibletoxicity.Fw附.GWieT7r^:,9:2709-2716)。所述載體DNA基因組以附加體形式存在，并且不在轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞中復(fù)制。因此，由于在復(fù)制細胞中的稀釋或者在非分裂的細胞中附加體基因組的降解，轉(zhuǎn)基因表達可隨時間喪失。通過另外施用所述治療載體可恢復(fù)表達。盡管大多數(shù)腺病毒栽體通過靜脈內(nèi)施用主要轉(zhuǎn)導(dǎo)肝臟，直接注射腺病毒載體也可轉(zhuǎn)導(dǎo)大部分組織(VranckenPeeters,M.J.,Perkins,A丄.，&Kay,M.A.(1996).Methodformultipleportalveininfusionsinmice:quantitationofadenovirus-mediatedhepaticgenetransfer.所oto^w/《wes,20:278-285)。這些載體已經(jīng)用于臨床前動物研究以轉(zhuǎn)導(dǎo)肝臟、骨骼肌、心臟、腦、肺、胰腺和腫瘤(Bramson,J丄.，Graham,F.L.,&Gauldie,J.(1995).Theuseofadenoviralvectorsforgenetherapyandgenetransferinvivo.Cw/T力/7/rt.5/她c/r助/.6:590-595)。AAV是依賴型病毒的成員，細小病毒的亞家族。所述病毒是非病原性的并且不能自我復(fù)制。因此，它需要輔助病毒，例如腺病毒，以介導(dǎo)生產(chǎn)性感染(Muzyczka,N.(1992).Useofadeno-associatedvirusasageneraltransductionvectorformammaliancells.CVifr.Tb/.M/cn^/o/./附附《</.158:97-129)。有六種已知的血清型，每種可有不同的細胞趨向。因為AAV的非病原性特性，它可作為特別有用的基因治療的載體。所述病毒基因組由兩個基因組成rep和cap。所述cap基因編碼形成病毒衣殼的結(jié)構(gòu)蛋白，而調(diào)控蛋白則由rep基因產(chǎn)生(Muzyczka,N.(1992).Useofadeno-associatedvirusasageneraltransductionvectorformammaliancells.C"fr.7b/7.M/cn^/o/./柳柳"/!/.158:97-129;Russdl,D,W.&Kay，M.A.(1999).Adeno-associatedvirusvectorsandematology.j5/ood,94:-874.;Monahan，P.E.&Samulski，R.J.(2000).AAVvectors:isclinicalsuccessonthehorizonGcrterAer"7:24國30;Tal,J.(2000).Adeno-associatedvirus-basedvectorsingenetherapy.7:279-291)。這兩個基因側(cè)翼是長145個核苷酸的病毒ITR。每個病毒顆粒含有單一雙鏈基因組。AAV的包裝容量約為5.0kb,其是此載體系統(tǒng)的主要限制(Monahan,P.E.&Samulski，R.J.(2000).Adeno-associatedvirusvectorsforgenetherapy:moreprosthanconsMo/JVf^/.7i^w，6:433-440)。存在rep的野生型病毒具有整合^人19號染色體特定區(qū)域的傾向。但是，由于缺少rep基因，此傾向在載體中喪失(McCarty,D.M.,Young,S.M.,Jr.,&SamulskiR.J.(2004).Integrationofadeno-associatedvirus(AAV)andrecombinantAAVvectors.^4www.Jev.G"ewC38:819-845)。AAV載體可通過用啟動子和轉(zhuǎn)基因序列替換rep和cap基因來產(chǎn)生。在重組AAV產(chǎn)生過程中，cap和rep序列由輔助質(zhì)粒提供，以及通過腺病毒共感染來簡單地援助傳染性病毒(Matsushita,T.，Elliger,S.,Elliger,C"Podsakoff,G，Vilarreal,L.,Kurtzman,GLJ.etal.(1998).Adeno-associatedvirusvectorscanbeefficientlyproducedwithouthelpervirus.GeneTher"5:938-945;Xiao,X.，Li，J.,&Samulski,R.J.(1998).Productionofhigh-titerrecombinantadeno-associatedvirusvectorsintheabsenceofhelperadenovirus.Mra/.,72:2224-2232)。已經(jīng)開發(fā)了其它載體產(chǎn)生系統(tǒng)，其不需要復(fù)制型腺病毒(Xiao,X"Li，J"&Samulski,R.J.(1998).Productionofhigh-titerrecombinantadeno-associatedvirusvectorsintheabsenceofhelperadenovirus.丄Wra/.，72:2224-2232)，降低了野生型腺病毒污染的可能。AAV載體已經(jīng)顯示了既通過附加體轉(zhuǎn)基因表達又通過隨機的染色體整合來轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞(Nakai,H.，Iwaki，Y"Kay,M.A"&Couto，L.B.(1999).Isolationofrecombinantadeno-associatedvirusvector-cellularDNAjunctionsfrommouseliver./Wra/,73:5438-5447;Miao,C.H.，Snyder,R.O.,Schowalter,D.B.，Patijn,GA.,Donahue,B.，Win仇er,B.etal.(1998).ThekineticsofrAAVintegrationintheliver.TV"t(7^iC"19:13-15)。AAV載體也允許將基因或表達盒分成兩個載體并且同時施用給肌肉組織或肝臟(Yan，Z.,Zhang,Y"Duan,D.,&Engelhardt，J.F.(2000).Trans-splicingvectorsexpandtheutilityofadeno-associatedvirusforgenetherapy.Pnc.7V"fL4o^Sc/.U.S.A,97:6716-6721;Sun,L.，Li,J.，&Xiao,X.(2000).Overcomingadeno-associatedvirusvectorsizelimitationthroughviralDNAheterodimerization.6:599-602;Nakai，H.，Storm,T.A.，&Kay，M.A.(2000》IncreasingthesizeofrAAV-mediatedexpressioncassettesinvivobyintermolecularjoiningoftwocomplementaryvectors.TVfl^B/otec/m^/.,18:527-532)。另外，因為AAV載體基因組缺少病毒編碼序列，所以除了通過載體ssDNA退火或者在載體基因組連接形成串聯(lián)體之后合成第二鏈產(chǎn)生dsDNA之外，載體自身與毒性或任何炎癥應(yīng)答無關(guān)(Nakai，H.,Storm,T.A.，&Kay,M.A.(2000).Recruitmentofsingle-strandedrecombinantadeno-associatedvirusvectorgenomesandintermolecularrecombinationareresponsibleforstabletransductionofliverinvivo./Mra/"74:9451-9463;Vincent-Lacaze,N.,Snyder,R.O.,Gluzman，R.,Bohl,D.,Lagarde,C，&DanosO.(1999).Structureofadeno-associatedvirusvectorDNAfollowingtransductionoftheskeletalmuscle./Ww/"73:1949-1955;Duan,D.,Yan，Z.,Yue，Y"&Engelhardt，丄F.(1999).Structualanalysisofadeno-associatedvirustransductioncircularintermediates.FZra/ogy,261:8-14;Yang，J.,Zhou,W"Zhang,Y.,Zidon,T.,Ritchie,T.,&Engelhardt,J.F.(1999).Concatamerizationofadeno-associatedviruscirculargenomesoccursthroughintermolecularrecombination.腸/"73:9468-9477;Ferrari,F.K.,Samulski,T"Shenk,T"&Samulski,R.J.(1996).Second-strandsynthesisisarate-limitingstepforefficienttransductionbyrecombinantadeno-associatedvirusvectors./Wra/.,70:3227-3234;Fisher,K.J.,GaoGP.,Weitzman，M.D.,DeMatteo,R.，Burda,J.F"&WilsonJ.M.(1996).Transductionwithrecombinantadeno-associatedvirusforgenetherapyislimitedbyleading-strandsynthesis./.Mra/.,70:520-532)。所述載體顆粒通過體內(nèi)施用可被遞送進許i不同的器官，例如中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)、肝臟、肺和肌肉(Monahan,P.E.&Samulski,R.J.(2000).AAVvectors:isclinicalsuccessonthehorizonGWieTT^r.7:24-30)，并且已發(fā)現(xiàn)AAV載體有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂細胞(Miao，C.H.,Nakai，H.，Thompson,A.R.,Storm,T.A.,Chiu，W"Snyder,R.O.etal.(2000).Nonrandomtransductionofrecombinantadeno-associatedvirusvectorsinmousehepatocytesinvivo:cellcyclingdoesnotinfluencehepatocytetransduction./Wra/.74:3793-3803)。I型單純皰滲病毒(HSV-1)是為了基因轉(zhuǎn)移目的而改造的皰滲病毒。所述載體表現(xiàn)出用于插入至少30kb非HSV序列的外源基因的大容量，其容許大的單基因或協(xié)同表達或同時表達的多轉(zhuǎn)基因(Krisky,D.M.,Marconi,P.C.，Oligino,T.J.,Rouse,R.J.，F(xiàn)ink,D.J.，Cohen,J.B.etal.(1998).Developmentofherpessimplexvirusreplication-defectivemultigenevectorsforcombinationgenetherapyapplications.G^/ie.7^f:5:1517-1530)。HSV擴增子載體系統(tǒng)基于HSV-1包裝含有順式作用序列、ori(病毒DNA復(fù)制起始位點)和pac(包裝和切割信號)的缺陷型基因組的能力。HSV擴增子載體不含除順式作用元件之外的病毒基因(Spaete，R.R.&Frenkel,N.(1982).TheherpessimplexvirusampHcon:aneweucaryoticdefective-viruscloning-amplifyingvector.0〃，30:295-304)。它們通常約15kb長。為了產(chǎn)生顆粒并包裝基因組長度的串聯(lián)體化載體DNA,標(biāo)準擴增子系統(tǒng)需要輔助HSV的功能。通過使用缺失包裝信號的輔助病毒基因組質(zhì)粒提高了擴增子載體的產(chǎn)生；輔助病毒基因組作為細菌人工染色體在細菌中增殖(Saeki,Y.,Ichikawa,T"Saeki，A"Chiocca,E.A"Tobler,K"Ackermann，M.etal.(1998).Herpessimplexvirustype1DNAamplifledasbacterialartificialchromosomeinEscherichiacoli:rescueofreplication-competentvirusprogenyandpackagingofampliconvectors.(^"e77^:,9:2787-2794)。此包裝系統(tǒng)顯著的降低了可復(fù)制病毒的產(chǎn)生與細胞毒性。非病毒載體也表現(xiàn)出某些優(yōu)點，其包括(1)它們易于制備和放大，(2)它們對于待轉(zhuǎn)移的DNA大小而言更加靈活，(3)它們在體內(nèi)通常是安全的，和(4)它們使特定免疫應(yīng)答的誘發(fā)最小化，并且因此可重復(fù)施用。已經(jīng)有許多使用棵DNA、DNA-陽離子-月旨質(zhì)體復(fù)合物、DNA聚合物復(fù)合物及它們的組合的研究才艮道(Lollo，C.P.，Banaszczyk,M.G,&Chiou，H.C.(2000).Obstaclesandadvancesinnon-viralgenedelivery.C"frewZMo/ecw/flf*T^ra/ew^s1,2:136-142;Feigner,P.L.,Barenholz,Y"Behr,J.P.,Cheng,S.H.,Cullis,P"Huang,Letal.(1997).Nomenclatureforsyntheticgenedeliverysystems,^fw附fl/1G^rte7^m/7y,8:511-512;Zauner,W"Ogris,M.，&Wagner,E.(1998).Polylysine-basedtransfectionsystemsutilizingreceptor-mediateddelivery,y^v"wc^/"rwgDCV^viw'ovs1,30:97-113;Ledley，F(xiàn).D.(1995).Nonviralgenetherapy:Thepromiseofgenesaspharmaceuticalproducts.J^m挑朋GeweT7rmi/7j;,6:1129-1144)。多種用于人體治療的基因的非病毒藥用制劑也是可用的，特別是具有配體引導(dǎo)靶向的DNA-陽離子-月旨質(zhì)體復(fù)合物(Lipoplexes)。與配體(例如葉酸、轉(zhuǎn)鐵蛋白或抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體)結(jié)合的Lipoplexes已經(jīng)在人乳腺、前列腺、頭和頸癌中實現(xiàn)了靶向基因遞送和表達(Rolland,A.P.(1998).Fromgenestogenemedicines:recentadvancesinnonviralgenedelivery.O/ft'oi/iev/^s7/i77imi/7^/cDragCVimVriS^ste柳s,15:143-198;Audouy,S.A丄.，deLeij,L.F.M.H.，Hoekstra，D.，&Molema，G(2002).Invivocharacteristicsofcationicliposomesasdeliveryvectorsforgenetherapy.PAfl簡flc^/cfl/^s^fl/rA，19:1599-1605)。合成的化學(xué)載體也可用作遞送的載體，這是由于它們的穩(wěn)定性和潛在的化學(xué)修飾的簡便性。另外，低成本的穩(wěn)定的生產(chǎn)標(biāo)準，較高的安全性和高靈活性也4吏得這些化合物特別有用(Lollo,C.P.,Banaszczyk，M.G.，&Chiou，H.C.(2000).Obstaclesandadvancesinnon-viralgenedelivery.CMfTdif(7/7/"/。w/"77^ra/ewf/cs,2:136-142)。另夕卜,非病毒制劑可用于不同的組合，以提供為達到特定治療目的的靈活性。使用物理基因遞送方法，將棵DNA直接遞送到細胞質(zhì)中，避開了內(nèi)涵體和溶酶體，并且因此避免了酶降解。例如，皮膚基因治療通常與直接遞送方法相結(jié)合，其包括基因槍(biolistic)或微發(fā)射(microprojectile)i秀導(dǎo)、局部施用、直接注射和電穿孔(Vogel，J.C.(2000).Nonviralskingenetherapy.//柳《(7erte7%m^，11:2253-2259)。目前用于基因治療的一種非病毒基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)是將棵質(zhì)粒DNA(pDNA)注射A^部組織或全身循環(huán)(Horn,N.A.,Meek,J.A.，Budahazi,G,&Marquet,M.(1995).CancergenetherapyusingplasmidDNA:PurificationofDNAforhumanclinicaltrials./TwwiflwG^weT^ra/^,6:565-573)。例如，已有報道，以棵DNA分子形式注射入肌肉組織或肝臟組織的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體可,皮肌肉和肝臟細胞吸收并表達(Herwdjer,H.&Wolff,J.A.(2003).Progressandprospects:nakedDNAgenetransferandtherapy.77^f:，10:453-458)?？肈NA基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)由質(zhì)粒組成，所述質(zhì)粒含有處于多種真核調(diào)控元件的轉(zhuǎn)錄控制下的治療性基因cDNA(Hartikka,J.,Sawdey，M.，Cornefert-Jensen,F.,Margalith，M.,Barnart,Nolasco，M.etal.(1996).AnimprovedplasmidDNAexpressionvectorfordirectinjectionintoskeletalmuscle.^Tm附朋G^weT^era/^,7:1205-1217;Lui,V.W"Falo,L.D.，Jr.,&Huang,L.SystemicproductionofIL-12bynakedDNAmediatedgenetransfer:toxicityandattenuationoftransgeneexpressioninvivo.77^JowfTifl/0/G^weM^//"Vie，7:384-393)?？墒褂么篌w積注射來避免棵DNA的降解(Christianson,S.W.,Shultz，L.D.,&Leiter,E.H.(1993).AdoptivetransferofdiabetesintoimmunodeficientNOD-scid/scidmice.RelativecontributionsofCD4+andCD8+T-cellsfromdiabeticversusprediabeticNOD.NON-Thy-ladonors.Z)/fl&tes,42:44-55)，其誘導(dǎo)了在內(nèi)部器官中(例如肝臟)有效的基因轉(zhuǎn)移。由大體積的含質(zhì)粒溶液造成的物理壓力直接將pDNA遞送進細胞，導(dǎo)致了轉(zhuǎn)基因在靼細胞中的表達(Schultz,J.,Pavlovic,J.，Strack，B.,Nawrath，M.，&Moelling,K.(1999).Long-lastinganti-metastaticefficiencyofinterleukin12-encodingplasmidDNA.//w附aw(7ewer力m/昆10:407-417;Blezinger,P"Wang,J.,Gondo,M.,Quezada，A.，Mehrens,D.,French,M.etal.(1999).Systemicinhibitionoftumorgrowthandtumormetastasesbyintramuscularadministrationoftheendostatingene.7V"似re^B/她cAwo/o^j，17:343-348)。電轉(zhuǎn)移也可用作遞送載體或核酸的才莫式，所述載體或核酸含有與胰島素編碼核酸可操縱連接的本發(fā)明組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子。簡言之，對在大體積生理溶液中的pDNA進行肌肉內(nèi)注射，使得DNA通it^t流在組織中分布。接著施加電脈沖，通常4吏用外部電極。體內(nèi)pDNA電轉(zhuǎn)移的參lblL本領(lǐng)域已知的，并且可用于本發(fā)明的方法。另夕卜，含DNA溶液的噴射注射也可用于轉(zhuǎn)移基因到皮膚、肌肉、脂肪和乳腺組織。已開發(fā)了一些噴射注射器，其通常被用來應(yīng)用空氣推進系統(tǒng)遞送皮質(zhì)類固醇和麻醉溶液到人皮膚中。另一個基因遞送模式包括超聲。治療性超聲誘導(dǎo)細胞膜變?yōu)榭赏ㄍ傅?，以增加棵pDNA進入骨骼肌和其它組織的轉(zhuǎn)染效率。例如，超聲造影劑，Optison(MolecularBiosystems,SanDiego,USA),含有充滿氣體的人白蛋白微球，其通過與質(zhì)粒^目混合可加載DNA。Optison可增強棵pDNA的體內(nèi)和體外轉(zhuǎn)染效率(tTaniyama,Y.，Tachibana，K.,Hiraoka,K.，Aoki，M.，Yamamoto，S.,MatsumotoK.etal.。002).Developmentofsafeandefficientnovelnonviralgenetransferusingultrasound:EnhancementoftransfectionefficiencyofnakedplasmidDNAinskeletalmuscle.(7eweT7^y^;,9:372-380)。另外，與微泡增強的超聲聯(lián)合的子宮內(nèi)注射棵DNA已顯示出在胎小鼠中產(chǎn)生高水平的蛋白質(zhì)表達(Endoh,M.，Koibuchi,N.，Sato,M.,Morishita,R.，Kanzaki,T"Murata,Y.etal.(2002).FetalGeneTransferbyIntrauterineInjectionwithMicrobubble-EnhancedUltrasound.Mo/eo//^77^ni/^,5:501-508)。通過聯(lián)合位點特異性配體，超聲造影劑微泡能夠增強基因靶向到特定組織。另外，通過共注射載有基因的載體(例如脂質(zhì)體)和所述孩t泡，有可能增加有效載荷(Priee，R.J.&Kaul，S.(2002》Contrastultrasoundtargeteddrugandgenedelivery:Anupdateonanewtherapeuticmodality.Jowmfl/6>/C^nZ/omscM/flf*jPAfl環(huán)flco/6^vflwrf7^m/7^/cs,7:171-180)。當(dāng)全身施用時，使用pDNA的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移可利用遞送系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體或陽離子聚合物)以保護其免受降解。加入聚陽離子導(dǎo)致對pDNA分子的陰離子電荷的靜電中和，并且濃縮多核苷酸結(jié)構(gòu)，由此保護其免受核酸酶消化。pDNA和陽離子兩性分子可以按不同的比例配制，以產(chǎn)生不同大小和表面電荷性質(zhì)的復(fù)合物。另外，所帶凈電荷為正的復(fù)合物顯示出與帶負電細胞膜的結(jié)合增強，導(dǎo)致細胞攝取增加(Rolland,A.P.(1998).Fromgenestogenemedicines:recentadvancesinnonviralgenedelivery.OWcfl/Wev/eH^T/iT^m^M^/cZ)rwgCVzmVriSy他柳s1，15:143-198)。使用DNA-P日離子-月旨質(zhì)體復(fù)合物(lipoplexes)的基因轉(zhuǎn)移也已經(jīng)作為遞送治療性基因的方法凈皮成功應(yīng)用。陽離子lipoplexes的生產(chǎn)通常是簡便且不昂貴的。它們由非毒性和非免疫原性材料制成，并可遞送大的多核苷酸到體細胞中。另外，這些試劑易于在實驗室中進行改造以加入新的生物學(xué)功能，或者產(chǎn)生新的可篩選其體內(nèi)活性的制劑。而且，脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移不產(chǎn)生任何抗病毒免疫應(yīng)答，并具有較低的產(chǎn)生致癌突變的風(fēng)險，因為所遞送的基因具有低整合頻率并且通常不在所轉(zhuǎn)染的細胞中復(fù)制。顆?；蛑|(zhì)體的穩(wěn)定性通常增加生物相容性，降低免疫應(yīng)答，增加體內(nèi)穩(wěn)定性并延^c循環(huán)中的清除。使用膠原蛋白、乳酸或羥基乙酸、或聚酸酐的基于聚合物的系統(tǒng)是用于體內(nèi)遞送治療性基因的另外的模式。首先，聚合物中的pDNA分子可得到保護免于在循環(huán)系統(tǒng)中被降解，直至它們被釋放進入靶細胞。第二，注射或移植聚合物^體內(nèi)可簡單的操作以靶向特定的細胞類型或組織。例如，通過使用細胞耙向配體(例如對于T細胞的抗CD3和抗CD5抗體，或?qū)τ谝恍┠[瘤細胞的轉(zhuǎn)鐵蛋白)修飾基因載體可達到基因轉(zhuǎn)移的靶向(Gijsens,A.,Derycke,A.,Missiaen,L,DeVos，D.,Huwyler,J.,Eberle,A.etal.(2002》TargetingofthepliotocytotoxiccompoundAIPcS4toHelacellsbytransferringconjugatedPEG-liposomes./"te附flrtVmfl//冊r冊/6>/C騰w,101:78-85;Hofland,H.E.J.，Masson，C,Iginla,S.，Osetinsky,J.，Reddy,J.A.,Leamon,C.P.etal.(2002).Folate-TargetedGeneTransferinVivo.7to卿，5:739-744;Bohl,K.E.,Bergstrand,N.,Carlsson，J.,Edwards,K.，Johnsson,M.,Sjoberg,S.etal.(2002).DevelopmentofEGF-conjugatedliposomesfortargeteddeliveryofboronatedDNA-bindingagents.5,Wwy"g.C7ie附"13:737-743)。另外，已顯示與葉酸綴合的基于陽離子-脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染復(fù)合物特異地轉(zhuǎn)染葉酸-受體-表達細胞和腫瘤，提示它A^M內(nèi)癌癥的潛在療法(Reddy,J.A.，Abburi，C，Hofland，H.,Howard,S.J.，Vlahov,L,Wils,P.etal.(2002).Folate-targeted,cationicliposome-mediatedgenetransferintodisseminatedperitonealtumors.G"騰T7^ra/7j;,9:1542-1550)。轉(zhuǎn)導(dǎo)靶向是一種遞送模式，其可用于體內(nèi)治療性基因替換療法。例如，可應(yīng)用病毒栽體特異地靶向組織或細胞類型或者可應(yīng)用它們廣泛地導(dǎo)入基因到大范圍的細胞類型中，其取決于所使用的病毒和其宿主細胞特異性。在這一點上，重組AAV載體在基因治療應(yīng)用上是有益的，因為它們允許轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)基因進入寬范圍的靶細胞。增加病毒載體對特定細胞群體的效率和特異性將由于允許較低的待施用病毒裝載來增強基因治療的安全性。修飾所述載體的衣殼以實現(xiàn)組織靶向(轉(zhuǎn)導(dǎo)靶向)也可用于本發(fā)明的方法，所述衣殼在確定細胞趨向上起重要作用。有許多調(diào)整基因轉(zhuǎn)移載體細胞趨向的方法，例如假分型、使用具有特定受體結(jié)合性質(zhì)的分子接頭綴合衣殼和趨向的遺傳耙向。一種轉(zhuǎn)導(dǎo)重靶向的形式是假分型，其不需要多少特異性病毒相互作用的現(xiàn)有技術(shù)。假分型包括將來自一個病毒血清型的衣殼替換成來自另一個病毒血清型的衣殼。假分型已經(jīng)用于產(chǎn)生選擇性逆轉(zhuǎn)錄病毒和選擇性嵌合腺病毒載體(Somia,N.&Verma，J.M.(2000).Genetherapy:trialsandtribulations.Ato.Wev.(7^iW.，1:91-99)。另外，側(cè)翼是AAV2倒置末端重復(fù)序列的AAV載體基因組也被成功地交叉包裝在不同血清型的衣殼中，建立了一組具有不同特異性的假型(Rabinowitz,J.E"Rolling,F.,Li,C,Conrath,H.,Xiao,W"Xiao,X.etal.(2002).Cross-packagingofasingleadeno-associatedvirus(AAV)type2vectorgenomeintomultipleAAVserotypesenablestransductionwithbroadspecificity./Wro/.,76:791-801.;Grimm,D.&Kay,M.A.(2003).Fromvirusevolutiontovectorrevolution:useofnaturallyoccurringserotypesofadeno-associatedvirus(AAV)asnovelvectorsforhumangenetherapy.C"fr.G^weT7ref:3:281-304;Gao,GP"Alvira,M.R.,Wang,L，Calcedo,R.，Johnston,J.，&Wilson,J.M.(2002).Noveladeno-associatedvirusesfromrhesusmonkeysasvectorsforhumangene仇erapy.iVoc.TVarf.爿cflrf.Sd.USA,99:11854-11859)。與具有特定受體結(jié)合性質(zhì)的分子接頭綴合的病毒衣殼也可用于遞送含有與胰島素編碼核酸可操縱連接的本發(fā)明組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子的載體。用于將載體衣殼靶向到不同細胞群的第二種方法已使用含特定受體結(jié)合性質(zhì)的分子接頭綴合衣殼。此方法已經(jīng)用于增強多種培養(yǎng)細胞類型的轉(zhuǎn)導(dǎo)，其使用了腺病毒(Douglas,J.T.,Miller,C.R.,Kim,M.,Dmitriev，J.,Mikheeva,G，Krasnykh，V.etal.(1999).Asystemforthepropagationofadenoviralvectorswithgeneticallymodifiedreceptorspecificities.N虹5/W^7mo/"17:470-475)、逆轉(zhuǎn)錄病毒(Snitkovsky,S.&Young,J.A.(2002).TargetingretroviralvectorinfectiontocellsthatexpressheregulinreceptorsusingaTVA-heregulinbridgeprotein.Mra/ogj;,292:150-155)和AAV載體(Ponnazhagan,S.,Mahendra,G,Kumar,S.，Thompson,J.A.，&Castilas，M.,Jr.(2002).Conjugate-basedtargetingofrecombinantadeno-associatedvirustype2vectorsbyusingavidin-linkedligands./,/.,76:12900-12卯7)。施用可操縱連接了胰島素編碼核酸的本發(fā)明啟動子的第三種方法是遺傳改造衣殼基因以破壞重組載體的正常受體結(jié)合能力或者將用于可選擇受體結(jié)合的小肽配體加入到衣殼結(jié)構(gòu)中。此轉(zhuǎn)導(dǎo)重靶向的遺傳方法已經(jīng)在一些研究中成功的重導(dǎo)向了腺病毒載體的趨向(Hidaka,C，Milano,E.，Leopold,P丄.，Bergelson,J.M.，Hackett，N.R.,Finberg,R.W.etal.(1999).CAR-dependentandCAR隱independentpathwaysofadenovirusvector-mediatedgenetransferandexpressioninhumanfibroblasts./C7/w.J羅W，103:579-587)。轉(zhuǎn)錄靶向是另一個選擇性遞送治療性基因的模式。本發(fā)明的組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子作為表達的轉(zhuǎn)錄靶向肝臟的例子。例如，相比于強病毒啟動子，可應(yīng)用強真核啟動子(例如本文所描述的那些)來實現(xiàn)體內(nèi)的長期表達(Verma，M.(2003).Viralgenesandmethylation.爿"".7V.i:爿c"rf,5W.,983:170-180)。應(yīng)用細胞選擇性真核啟動子提供了另外的特異性表達轉(zhuǎn)基因的益處。關(guān)于啟動子結(jié)構(gòu)和設(shè)計考慮的指導(dǎo)在下文進一步描述，其包括，例如，核心啟動子結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄因子和啟動子的合理設(shè)計。此指導(dǎo)可用于設(shè)計和使用本發(fā)明的組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子。簡言之，真核基因表達通常通過RNA聚合酶II(RNAPII)的活性和基本轉(zhuǎn)錄因子進行控制，所i^本轉(zhuǎn)錄因子與在每個真核基因中存在的核心啟動子元件相結(jié)合(Orphanides,G&Reinberg，D.(2002).Aunifiedtheoryofgeneexpression.CW/，108:439-451)。所述RNAPII和它的基本轉(zhuǎn)錄因子(例如TFIIB和TFIID)根據(jù)一些調(diào)控元件被組裝到跨越了相對于轉(zhuǎn)錄起始位點從-35到+35bp區(qū)域的核心啟動子(Roeder,R.G(1996).TheroleofgeneralinitiationfactorsintranscriptionbyRNApolymeraseII.7>^iA所m/^柳.5W.，21:327-335)。在含有TATA盒的啟動子中，所述調(diào)控元件含有TATA盒和TFIIB識別元件(BRE);而在不含TATA的啟動子中，有起始子(initiator)和下游結(jié)合元件(DBE)。在許多真核基因的調(diào)控區(qū)域中TATA盒通常位于-25bp，但是在許多看家基因的啟動子中明顯缺少(Smale，S.T.(1997).TranscriptioninitiationfromTATA-lesspromoterswithineukaryoticprotein-codinggenes.所oc/w'附.折o/7/i".v4"fl.,1351:73-88)。所述起始子(Inr)通常位于轉(zhuǎn)錄起始位點的-3到+5bp，并且能夠支持沒有TATA盒情況下的轉(zhuǎn)錄，或者在兩者都存在時與其協(xié)同作用(Martinez,E.,Zhou,Q.，L'Etoile,N.D.，Oelgeschlager,T.,Berk,AJ.,&RoederR.G(1995).Corepromoter-specificfuctionofamutanttranscriptionfactorTFIIDdefectiveinTATA隱boxbinding./Voc.A^L4c"rf.5W.U.S.A.,92:11864-11868)。所述DPE也凈嫂現(xiàn)用。在提供啟動子相連的TFIID和RNAPII之間橋接中起作用的BRE位于TATA盒的上游(Littlefield,0.，Korkhhi,Y"&Sigler,P.B.(1999).ThestructuralbasisfortheorientedassemblyofaTBP/TFB/promotercomplex.iVW/.5W.U.S.A.，96:13668-13673)。許多參與轉(zhuǎn)錄的基本轉(zhuǎn)錄因子被用來通過這些基序?qū)NAPII動員至啟動子，因此形成前起始復(fù)合體(PIC)以在起始位點開始轉(zhuǎn)錄(Cornetta,K.,Morgan,R.A.，Gillio，A.，Sturm,S.，Baltrcki,L.,O'Rdly,R.etal.(1991).Noretroviremiaorpathologyinlong-termfollow-upofmonkeysexposedtoamurineamphotropicretrovirus,^w柳.(7eweT^r.,2:215-219)。PIC中的轉(zhuǎn)錄因子包含基本轉(zhuǎn)錄機制中的細胞類型特異性組分(Albright,S.R.&Tjian，R.(2000).TAFsrevisited:moredatarevealnewtwistsandconfirmoldideas.G匿,242:1-13;Freiman,R.N.,Albright,S.R.，Zheng,S.，Sha,W.C.,Hammer,R.E.,&Tjian，R.(2001).Requirementoftissue-selectiveTBP-associatedfactorTAFII105inovariandevelopment.5W^ice,293:2084-2087)。另外，還可以應(yīng)用組織特異性基本組分通過聯(lián)合轉(zhuǎn)錄因子/基本因子相互作用進一步增加組織特異性(Holmes,M.C.&Tjian，R.(2000).Promoter-selectivepropertiesoftheTBP-relatedfactorTRT1.288:867-870;Rabenstein,M.D.，Zhou,S.，Lis,J.T.,&Tjian,R.(1999).TATAbox-bindingprotein(TBP)畫rdatedfactor2(TRF2),athirdmemberoftheTBPfamily.戶rac.7V",L4c"rf.5W.U.S.A,96:4791-4796;Yamit-Hezi,A.&Dikstein,R.(1998).TAFII105mediatesactivationofantiapoptoticgenesbyNF-kappaB.皿BO/"17:5161-5169)?；?^制是體外產(chǎn)生基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄所必需的，它與其它順式作用調(diào)控因子的相互作用提供了另外的控制水平。這些順式元件被基因-、刺激-或組織-特異性轉(zhuǎn)錄因子所識別，其作為基因表達的反式-激活子或-抑制子起作用，其取決于背景。轉(zhuǎn)錄因子通常通過共調(diào)控子(coregulator)控制基本機制的活性，所述共調(diào)控子作為基本因子和轉(zhuǎn)錄因子之間中介體起作用(Glass,CK.&Rosenfeld,M.G(2000).Thecoregulatorexchangeintranscriptionalfunctionsofnuclearreceptors.G^/jMi)ev"14:121-141;Lemon,B.&Tjian，R.(2000).Orchestratedresponse:asymphonyoftranscriptionfactorsforgenecontrol,(^rt^l^v.,14:2551-2569)。這些共調(diào)控子在>生啟動子-和組織-特異性基因表達上起重要作用并且可用于進一步增加本發(fā)明啟動子的組織特異性。它們也是細胞能夠影響整個轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)所憑借的手段，并且響應(yīng)多種刺激和在多種發(fā)育階段協(xié)調(diào)基因表達(Lemon,B.&Tjian,R.(2000).Orchestratedresponse:asymphonyoftranscriptionfactorsforgenecontrol.G^i^i)ev.,14:2551-2569)。因此，結(jié)合于這些因子的短順式元件提供了用于靶向和控制根據(jù)葡萄糖應(yīng)答元件的異源轉(zhuǎn)基因表達的啟動子選擇和設(shè)計的范圍，并且對于調(diào)整表達以實現(xiàn)特異性靶向或應(yīng)答尤其有用。轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點位于轉(zhuǎn)錄起始位點的上游或下游。結(jié)合于這些元件的轉(zhuǎn)錄因子通過激活過程中間插DNA的成環(huán)與所述啟動子接近。也可利用對用于轉(zhuǎn)錄靶向的啟動子的合理設(shè)計來產(chǎn)生本發(fā)明的組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子。在這一點上，對轉(zhuǎn)錄機制的深入理解不是生成新合成啟動子的前提?？梢詰?yīng)用對如實施例1所述啟動子構(gòu)建體的功能性篩選來鑒定含有所需活性的不同元件的最優(yōu)組合，其可在短的長度上隨機合成或者通過將不同順式元件隨機組合成合成啟動子來產(chǎn)生(Edelman，GM.，Meech，R.，Owens，GC.，&Jones，F(xiàn).S.(2000).Syntheticpromoterelementsobtainedbynucleotidesequencevariationandselectionforactivity.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，97:3038-3043;Li,X.,Eastman,E.M.,Schwartz,R.J.，&Draghia-Akli,R.(1999).Syntheticmusclepromoters:activitiesexceedingnatuallyoccurrngregulatorysequences.Nat.Biotechnol.,17:241-245.)。應(yīng)當(dāng)理解的是，不在實質(zhì)上影響本發(fā)明多種實施方案功能的修改也包括在本文所提供的對本發(fā)明的定義中。因此，以下實施例意在舉例說明而不限制本發(fā)明。實施例1用于治療I型糖尿病的胰島素基因療法此實施例顯示了多聯(lián)葡萄糖應(yīng)答啟動子的產(chǎn)生和選擇以及它們在給糖尿病動物提供受調(diào)控的胰島素水平上的應(yīng)用。通過首先產(chǎn)生3拷貝順式元件組件來構(gòu)建合成啟動子文庫。所述組件含有3拷貝的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件，所述轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件為肝細胞核因子-l(HNF-1)元件、CAAT/增強子結(jié)合蛋白(C/EBP)應(yīng)答元件和葡萄糖應(yīng)答元件(GRE)的所有可能的組合。如下文所述，通過在如圖IB中所示的3個限制性酶位點順序插入各個順式元件產(chǎn)生所述組合。這些3拷貝組件被轉(zhuǎn)移到pLPK(-96/十12)-Luc質(zhì)粒以產(chǎn)生如圖2所示的3拷貝的SP-Luc。另外，通過插入3拷貝模塊到3拷貝SP-Luc質(zhì)粒中產(chǎn)生6拷貝的SP-Luc質(zhì)粒。簡言之，為構(gòu)建帶有啟動子的質(zhì)粒，pGL3-增強子載體(PromegaMadison，WI,USA)的原始多克隆位點(MCS)凈皮新的依次含有Xhol、Kpnl、BamHI、EcoRV、EcoRI和Nhel位點的MCS所替換，產(chǎn)生pGL3E-NewMCS質(zhì)粒(圖1A)。通過將PCR擴增的LPK啟動子區(qū)域(相對于轉(zhuǎn)錄起始位點的-3200bp/+12bp)直接插入到TA克隆載體(Invitrogen,Burlington,ON,Canada)中來構(gòu)建pLPK畫TA質(zhì)粒。2.5kbp的LPK啟動子的Sacl/Hindlll消化片段被從pLPK-TA質(zhì)粒上移去并克隆進pGL3-增強子的相同位點，產(chǎn)生pLPK-luc質(zhì)粒，其用作啟動子測定的陽性對照。108bp的LPK啟動子的Nhel/Hindlll消化片段(相對于轉(zhuǎn)錄起始位點的-96bp/+12bp)被從pLPK-TA上移去并被插入pGL3E-NewMCS質(zhì)粒的相同位點，以產(chǎn)生pLPK(-96/+12)-luc質(zhì)粒，其用作本研究中所生成的所有合成啟動子的基本啟動子，并在圖1B中顯示。通過轉(zhuǎn)移pGE3-增強子的HindlII/Xbal位點的螢光素酶基因到pcDNA3.1/Hygro質(zhì)粒的相同位點來生成pCMV-Luc質(zhì)粒，pcDNA3.1/Hygro質(zhì)粒從Invitrogen(Burlington,ON,Canada)購買。為產(chǎn)生隨機排列的各個順式元件，所有27個不同的3拷貝SP-Luc質(zhì)粒以10pg的量混合。另外，從3拷貝SP-D3質(zhì)粒上切下的3拷貝模塊一起混合并與使用相同酶切處理過的3拷貝SP-Luc的混合物連接，產(chǎn)生6拷貝SP-Luc。為了覆蓋6順式元件(3)可能組合的數(shù)目，我們從6拷貝SPXE-和SPXN-luc質(zhì)粒分離了大于300個克隆。為了生成合成啟動子文庫，為每個控制元件合成兩個互補的寡核苷酸，磷酸化并退火產(chǎn)生短DNA片段。所述寡聚核苷酸序列如下HNF-1(正義)，5'-CTAGCTGGTTAATGATTAACCAGGACT-3'(SEQIDNO:l);匪F畫1(反義),5'-CTAGCTGGTTAATGATTAACCAGGACT-3'(SEQIDNO:4);C/EBP(正義),5'-TCGCAAGTTGCGCAATATCGCG-3'(SEQIDNO:2);C/EBP(反義),5'-TCGCAAGTTGCGCAATATCGCG-3'(SEQIDNO:5);葡萄糖應(yīng)答元件(正義)，5,_GGGCGCACGGGGCACTCCCGTGGTTCCTGGACTCTGGCCCCCAGTGTA-3'(SEQIDNO:3);葡萄糖應(yīng)答元件(反義)，5，畫TACACTGGGGGCCAGAGTCCAGGAACCACGGGAGTGCCCCGTGCGCCC-3'(SEQIDNO:6)。合成的所有合成片段在寡核苷酸兩端帶有特定的限制性酶粘末端，用于產(chǎn)生所述合成啟動子文庫。導(dǎo)入的限制性酶位點如下Kpnl/BamHI、BamHI/EcoRV和EcoRV/EcoRI。兩個互補的寡核苷酸(每個100pmol)在20nl的退火溶液(10mMTris畫HClpH7.9,2mMMgCl2,50mMNaCl，和lmMEDTA)中相互混合，然后在卯。C孵育5分鐘，并讓其在室溫緩慢冷卻。使用T4聚核苷酸激酶(NEB，Beverly,MA,USA)在50pl的反應(yīng)混合物中(70mMTris-HClpH7.6,10mMMgCl2,5mMDTT)37。C下對退火的寡聚核苷酸片段磷酸化30分鐘，接著在70'C下熱失活10分鐘。通過苯酚/氯仿/異戊醇萃取來純化退火/磷酸化的DNA片段，接著其被用于合成啟動子文庫的生成。首先，每個含有Kpnl/BamHI粘末端的三順式元件被克隆進用同樣酶消化的pcDNA3-NewMCS質(zhì)粒，產(chǎn)生1拷貝的SP-D3質(zhì)粒，其中另一個三順式元件片段被順序地克隆進BamHI/EcoRV和EcoRV/EcoRI位點以產(chǎn)生3拷貝的SP-D3質(zhì)粒(圖1)。為產(chǎn)生合成的啟動子-報告子質(zhì)粒，來自3拷貝SP-D3質(zhì)粒的Kpnl/EcoRI消化的DNA片段(3拷貝組件)被亞克隆進pGL3E-NewMCS的相同位點，產(chǎn)生3拷貝的SP-Luc質(zhì)粒(圖2B)。為產(chǎn)生6拷貝的SP-Luc質(zhì)粒，10照的每個3拷貝SP-D3相混合并使用XhoI/EcoRI或XhoI/Nhel消化，接著^M提取3拷貝組件。同時，所有的3拷貝SP-Luc質(zhì)粒以相同方式混合并JU吏用相同酶組消化。洗脫的3拷貝組件被亞克隆進XhoI/EcoRI或XhoI/Nhel消化的3拷貝SP-Luc庫，產(chǎn)生與之前插入的3拷貝組件相同方向(6拷貝SPXN-Luc)或相反方向(6拷貝XPXE-Luc)的6拷貝的合成啟動子文庫(圖2B)。培養(yǎng)含有6拷貝SPXN-Luc或6拷貝SPXE-Luc質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體，并收獲，用于使用miniprep試劑盒(Qiagen，Mississauga，ON，Canada)的質(zhì)凈立制備。在對高轉(zhuǎn)錄活性的合成啟動子進行篩選之后，來自3拷貝SP-D3的另外3拷貝合成啟動子片段被插入所選擇的6拷貝SPXE-Luc的XhoI/Nhel位點以產(chǎn)生9拷貝SP-Luc質(zhì)粒。對合成啟動子文庫的篩選如下文所述進行。首先，待篩選高轉(zhuǎn)錄活性的大量克隆對評估有代表性數(shù)量的不同啟動子組合來說提出了實際難題。為解決這一問題，使用了低質(zhì)量質(zhì)粒以取代需要耗時和耗力進行純化步驟的高質(zhì)量質(zhì)粒。盡管低質(zhì)量質(zhì)粒表現(xiàn)出高質(zhì)量質(zhì)粒約10%的轉(zhuǎn)染效率，但是t現(xiàn)低質(zhì)量和高質(zhì)量質(zhì)粒的啟動子活性是相似的，這表示從低質(zhì)量質(zhì)粒得到的結(jié)果可代表從高質(zhì)量質(zhì)粒得到的結(jié)果。因此，所有轉(zhuǎn)染實驗都使用了低質(zhì)量質(zhì)粒。使用Qiagen的miniprep試劑盒，根據(jù)制造商的說明制備所有用于最初篩選合成啟動子轉(zhuǎn)染實驗的質(zhì)粒。應(yīng)用Midiprep試劑盒(Qiagen,Mississauga,ON,Canada)分離質(zhì)粒以{更與來自miniprep試劑盒的〈^^"量質(zhì)粒比較轉(zhuǎn)染效率。如下文所述培養(yǎng)H4IIE細胞。轉(zhuǎn)染前一天，將細胞以5000個細胞/孔的量接種到96孔板中。根據(jù)制造商的說明使用lipofectamineplus試劑(Invitrogen，Burlington,ON,Canada),用150ng/孔的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，并在轉(zhuǎn)染后24小時收集。使用Glo裂解緩沖液(Promega,Madison,WI,USA)裂解細胞，并使用Steady-Glo螢光素酶測定系統(tǒng)(Promega，Madison,WI，USA)檢測螢光素酶活性。在至少兩輪不同的轉(zhuǎn)染中，進行四次重復(fù)測定。按照合成啟動子篩選的第一步驟使用大鼠肝細胞瘤細胞系檢測3拷貝SP-Luc質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果在圖3A中顯示。應(yīng)用CMV啟動子作為對照，該啟動子驅(qū)動乾基因的強普i44達。另外，應(yīng)用LPK啟動子(天然的肝臟特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子)作為天然啟動子對照。大部分3拷貝SP-Luc質(zhì)粒具有的活性在CMV啟動子活性的2-5%之間，并且與LPK啟動子活性相仿。僅由單元件多聚化組成的啟動子具有低于LPK啟動子的活性(圖3A)，其與之前的凈艮道一致(Li,X.，Eastman,E.M.,Schwartz,R.J.,&Draghia-Akli,R.(1999).Syntheticmusclepromoters:activitiesexceedingnaturallyoccurringregulatorysequence.NatBiotechnol"17:241-245)。另一個3拷貝組件以與之前構(gòu)建的3拷貝組件相同的或相反的方向被摻入到3拷貝SP-Luc中，以檢測6拷貝SP-Luc的轉(zhuǎn)錄活性和元件方向的影響(圖2B)。檢測來自XE和XN的多于300個克隆的轉(zhuǎn)錄活性。沒有發(fā)現(xiàn)在圖5A和B中所示的兩組中轉(zhuǎn)錄活性的分布存在顯著差異。這些結(jié)果表明元件組合中的方向?qū)τ诤铣蓡幼拥霓D(zhuǎn)錄活性是不太重要的。在兩組中，大多數(shù)轉(zhuǎn)錄活性低于CMV啟動子活性的6%。但是，一些來自兩組的合成啟動子顯示出高于LPK啟動子兩倍的活性及超過CMV啟動子活性8%。為確定是否有何種才莫式與強轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)，對所選擇的顯示出高于來自6拷貝SP(XE)-Luc組的CMV啟動子活性8%的6拷貝SP-Luc質(zhì)粒進行測序。結(jié)果在圖4A中顯示并表明在各個合成啟動子之間的元件順序沒有相似之處，并且在順式元件的組成上沒有發(fā)現(xiàn)共同的模式。也研究了通過加入3拷貝組件造成的合成啟動子轉(zhuǎn)錄活性的增強。加入的組件被插入所選擇的6拷貝SPXE-Luc質(zhì)粒的XhoI/Nhel位點。選擇了總共17個來自6拷貝SPXE-Luc質(zhì)粒的具有大于CMV啟動子活性8。/。的合成啟動子以進一步延長順式元件，產(chǎn)生如圖4B所示的9拷貝SP-Luc質(zhì)粒。從各個6拷貝SPXE-Luc質(zhì)粒產(chǎn)生多于40個克隆的9拷貝SP-Luc質(zhì)粒以覆蓋所有添加3拷貝組件可能出現(xiàn)的組合。9拷貝SP-Luc質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄活性的分布在圖5C中顯示。9拷貝SP-Luc質(zhì)粒的總體活性相對于原始6拷貝SPXE-Luc質(zhì)粒要高。它們大部分的活性低于CMV啟動子活性12%(圖5C)。但是，很明顯有相當(dāng)數(shù)量的克隆顯示其活性高于CMV啟動子活性12%,其大于6拷貝SPXE-Luc質(zhì)粒，這表明順式元件數(shù)量的增加對轉(zhuǎn)錄活性有正作用。另外，一些克隆顯示出其活性高于CMV啟動子活性25%，其相當(dāng)于LPK啟動子活性的7倍。檢測這些合成啟動子中順式元件的組成并在圖4B中顯示。觀察到在所述合成啟動子中的順式元件順序中沒有相似性。為調(diào)查合成啟動子的體內(nèi)活性，產(chǎn)生重組腺病毒，其表達在所選擇9拷貝合成啟動子控制下的胰島素基因。我們選擇了SP23137、SP23142和7325，其顯示高于CMV啟動子活性30。/。。作為普遍的強病毒啟動子控制，在這些實驗中應(yīng)用CMV的調(diào)控區(qū)。因為耙器官是肝臟，使用弗林蛋白酶可切割的胰島素原，其在合成后可被加工成成熟胰島素。簡言之，根據(jù)制造商的說明使用Transpose-ADTM腺病毒載體系統(tǒng)(Qbiogene，Carlsbad,CA)構(gòu)建重組腺病毒。弗林蛋白酶可切割的大鼠胰島素cDNA(rINSfur)從VR3503質(zhì)粒中獲得，該質(zhì)粒含有在B鏈和C肽接頭具有弗林蛋白酶切割位點的大鼠胰島素基因(Abai,A.M.,Hobart，P.M.,&Barnhart,K.M.(1999).InsulindeliverywithplasmidDNA.(^we77^f:,10:2637-2649)。rINSfurDNA片段在Xbal位點,皮消化并且克隆進pCR276腺病毒轉(zhuǎn)移載體，產(chǎn)生pCR276-rlNSfur，其用作進一步構(gòu)建含有合成啟動子的腺病毒載體的骨架。通過將來自pCR276-rlNSfur的rINSfur區(qū)插入pCR259腺病毒轉(zhuǎn)移載體產(chǎn)生pCMV-rINSfur,所述pCR259腺病毒轉(zhuǎn)移栽體具有驅(qū)動轉(zhuǎn)基因表達的CMV啟動子。含有合成啟動子、弗林蛋白酶可切割的大鼠胰島素cDNA、多聚A區(qū)域和SV40增強子的經(jīng)Notl/Sall消化的SP-rINSfur片段,皮克隆進PCR276轉(zhuǎn)移載體的相同位點，產(chǎn)生PCR276-SP-rlNSfur質(zhì)粒。所得的質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化進High-QTranspose-AD294化學(xué)感受態(tài)細胞，其中來自重組腺病毒轉(zhuǎn)移載體的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)座到Transpose-294質(zhì)粒，產(chǎn)生pAd-SP-rINSfur質(zhì)粒。從pCMV-rINSfur以相同方式產(chǎn)生pAd-CMV-rINSfur質(zhì)粒。>^生轉(zhuǎn)座的白色菌^_取的DNA4皮再次轉(zhuǎn)化進化學(xué)感受態(tài)HighA-lTM細胞，以分離并擴增來自腺病毒轉(zhuǎn)移載體的pAd-SP-rINSfur質(zhì)粒。分離的pAd-SP-rINSfur質(zhì)粒接著被純化進入HEK293細胞以產(chǎn)生重組腺病毒(pAd-SP-rINSfur)，其表i^L合成啟動子控制下的胰島素基因。rAd-CMV-rINSfur病毒以同樣方式產(chǎn)生。重組病毒在HEK293細胞中大量擴增并且通過兩次CsCl密度-梯度離心進行純化，以及用腺病毒稀釋緩沖液透析(10mMTris-ClpH8.0，2mMMgCl2，4%蔗糖)。透析的病毒被保持在-80。C保存。通#260nm處測量O.D.來確定病毒效價。在通過^內(nèi)注射將劑量為140mg/kg體重的pH4.0檸檬酸緩沖液中的鏈脲菌素(STZ)施用給NOD/SCID小鼠之后，施用病毒。在血液葡萄糖增加到400mg/dL并持續(xù)連續(xù)3天之后，通i^C靜脈靜脈內(nèi)施用重組腺病毒。通過葡萄糖氧化酶方法，使用尾血液和One-TouchProfile便攜式血液葡萄糖監(jiān)控儀(Lifescan，MilpitasCA)測定血液葡萄糖。最先檢測^使用CMV啟動子的不受控的強啟動子驅(qū)動的胰島素基因表達的效果。如上文所述產(chǎn)生在CMV啟動子控制下可產(chǎn)生胰島素蛋白的重組腺病毒(rAd-CMV-rINSfur)。這些病毒以效價為5xl01。(n=5)，1010(n=6)，5xl09(n=4)和109(n=4)的病毒顆粒通itvC靜脈靜脈內(nèi)施用進STZ誘導(dǎo)的糖尿病NOD.scid小鼠。如圖6所示，用最高效價的rAd-CMV-rINSfur處理過的動物在治療后兩天內(nèi)死亡。盡管使用較低效價病毒治療過的小鼠存活比用較高效價病毒處理過的小鼠存活時間更長，但是最終所有小鼠由于低血液葡萄糖水平而死亡。所有的動物在死前患有嚴重的低血糖，如圖6所示，其中血液葡萄糖水平降低到低于20mg/dl。也檢測了9拷貝合成啟動子的體內(nèi)活性，其選自使用大鼠肝細胞瘤細胞系體外測定的啟動子。通過施用5xl01Q(n=5)、10"(n=6)和5xl09(n=6)不同劑量病毒顆粒的rAd-23142-rlNSfur來檢測所述合成啟動子的劑量影響。使用最高劑量治療的動物顯示出在幾天內(nèi)血液葡萄糖水平很快降低到正常水平，而使用101()病毒顆粒治療的動物顯示出血液葡萄糖濃度相對慢的降低(圖7)。在血液葡萄糖水平到達正常范圍之后，在使用1010病毒顆粒治療的小鼠中正常血糖維持最長達l個月，而在使用5xl0"病毒顆粒治療的小鼠中維持的時間更長。相比于使用較高劑量病毒治療的小鼠，使用rAd-23142-rlNSfur的5xl09病毒顆粒治療的動物顯示出血液葡萄糖水平的中等降低，其表明源于此效價病毒的胰島素的量不足以將高血液葡萄糖水平降低到正常范圍。如圖7所示，經(jīng)rAD-23142-rlNSfur治療的動物不顯示任何有害的低血糖事件，其與經(jīng)rAD-CMV-rINSfur治療的動物相反。盡管在使用5xl(^病毒顆粒治療的小鼠中在早期觀察到相對低的血液葡萄糖水平，但是它不造成動物死亡。也檢測了圖4B顯示的在所選擇合成啟動子SP23137和SP23142之間的轉(zhuǎn)錄活性差異，其前6拷貝組件具有相同的順式元件和后3拷貝組件不同的元件。生成用于胰島素基因表達的含有SP23137的重組腺病毒并通過尾靜脈以10病毒顆粒的效^h^脈內(nèi)施用給STZ謙導(dǎo)的糖尿病NOD.scid小鼠。如圖8所示，所述治療的動物在一周內(nèi)顯示出正常的血液葡萄糖水平，并且正常血糖維持長達1個月，其與經(jīng)rAd-23142-rlNSfur治療的動物類似。在經(jīng)rAd-23142-rlNSfur和rAd-23137-rlNSfur治療的動物之間沒有顯著差異。所有經(jīng)rAd-23142-rlNSfur或rAd-23137-rlNSfur治療的糖尿病NOD.scid小鼠在病毒治療后一個月顯示出高血糖的復(fù)發(fā)。此結(jié)果可通過只缺乏EIA基因的第一代腺病毒發(fā)生短暫基因表達來解釋。因此，在病毒施用后10、25和50天時檢測腺病毒基因組的存在。從經(jīng)rAd-23137-rlNSfur治療的NOD.scid小鼠中獲得肝臟，分離基因組DNA，以及4吏用針對大鼠胰島素基因的特異性引物在腺病毒基因組中進行PCR擴增。簡言之，在病毒施用后IO、25和50天時，使用DNeasyTissueKit(Qiagen，Mississauga，ON,Canada)才艮據(jù)制造商的說明從rAd-23137-rlNSfur治療的糖尿病NOD.scid小鼠中純化DNA。應(yīng)用來自rAd-CMV-rINSfur治療的動物肝臟和pAd-23137-rlNSfur(含有大鼠胰島素基因的腺病毒轉(zhuǎn)移載體)的DNA作為對照。使用100ng的每種DNAj吏用的上游和下游引物如下正義，GTGGATGCGCTTCCTG(SEQIDNO:17);反義，ACAATGCCACGCTTCTG(SEQIDNO:18)。在擴增之后，產(chǎn)物在1。/。瓊脂糖凝膠中電泳，并且通過溴化乙錠染色來檢測。在10和25天觀察到清晰的條帶，而在50天的肝臟中顯示出4艮;敞弱的條帶，在這時動物表現(xiàn)出高血糖狀況的復(fù)發(fā)。這些結(jié)果表明，在治療晚期恢復(fù)的高血糖狀態(tài)是由于肝臟細胞中表達胰島素基因的腺病毒基因組數(shù)量的減少所致。對所述合成啟動子的葡萄糖應(yīng)答也進行了評估。如圖6中所示，胰島素基因不受控的組成型表iiit成在治療實驗動物中的致死效應(yīng)，W明在胰島素基因治療中轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的葡萄糖應(yīng)答的重要性。盡管使用rAd-23137-rlNSfur治療的動物在將血液葡萄糖水平控制在正常范圍內(nèi)的方面看起來是有效的，但是鑒定合成啟動子的葡萄糖應(yīng)答是有益的。為確定它響應(yīng)葡萄糖變化的能力，在正常對照動物、糖尿病對照動物以及rAd-23137-rlNSfur治療的動物中進行葡萄糖耐受實驗。在動物禁食16小時后，以2g/kg體重的劑量皿內(nèi)注射200mM的葡萄糖溶液給禁食動物。在注射葡萄糖之前、在葡萄糖載入后第一個小時中以15分鐘間隔的時間、以及卯分鐘、120分鐘、和240分鐘時，從小鼠尾末端的小切口收集血液樣本。葡萄糖激發(fā)之前的血液葡萄糖水平是99±21mg/dl(正常對照小鼠)、80±21mg/dl(rAd-23137-rlNSfur治療的小鼠)、和368±48mg/dl(糖尿病對照小鼠)(圖9)。盡管使用rAd-23137-rlNSfur治療的動物顯示出比正常對照小鼠較低的血液葡萄糖水平，但是它們是健康的且在禁食期后不顯示出低血糖。糖尿病對照小鼠仍然遭受高血液葡萄糖水平。在葡萄糖1之后，血液葡萄糖水平在30分鐘內(nèi)分別上升到285±47mg/dl(rAd-23137畫rlNSfur治療的小鼠)、252±36mg/dl(正常對照小鼠)和620±48mg/dl(糖尿病對照)。在正常對照小鼠中升高的血液葡萄糖水平在60分鐘內(nèi)快速降低到正常范圍，而rAd-23137-rlNSfur治療的動物相比于正常對照表現(xiàn)出相對延緩的血液葡萄糖降低速率。盡管受治療的動物相比于正常對照表現(xiàn)出相對較低的血液葡萄糖水平，但是在正常對照或rAd-23137-rlNSfur治療的動物中沒有觀察到低血糖。通過所述合成啟動子的肝臟特異性基因表達也在體外和體內(nèi)得到確定。在這一點上，通過感染rAd-23137-rlNSfur病毒iiyV—些來源于不同物種和組織的細胞系，確定所述合成啟動子的體外組織特異性。用rAd-CMV-rINSfur病毒作為對照。各個細胞系的來源如下3T3-L1細胞系來自小鼠胚胎成纖維細胞，HeLa細胞系來自人子宮頸，L6細胞系來自大鼠骨骼肌，L-929細胞系來自小鼠皮下結(jié)締組織，NRK細胞系來自大鼠腎，和H4IIE細胞系來自大鼠肝臟。使用下述步驟進行細胞系的免疫染色。簡言之，所有用于4^研究的細胞在37X:下，在5%<:02/95%潮濕空氣的氣氛中，培養(yǎng)在Dulbecco，smodifiedEagel，s培養(yǎng)基(DMEM)中，該培養(yǎng)基加入了10%胎牛血清(Invitrogen)、青霉素(200IU/ml)、鏈霉素(100ug/ml)和L-谷氨酰胺(2mM)。所使用的細胞如下L6(Dutheil,N.,Shi,F.，Dup謂oir,T.&Linden,R.M.(2000).Adeno-associatedvirussite-specificallyintegratesintoamuscle-specificDNAregion.iVoc.TV^/.Joirrf.Sc/.U.S.A.，97:4862-4866),L929(小鼠皮下結(jié)締組織細胞系)，3T3LI(小鼠成纖維細胞細胞系)，H4IIE(大鼠肝細胞瘤細胞系)，HeLa(人上皮細胞系)，和NRK細胞(大鼠腎細胞系)。細胞以2x104/孔的量接種于特別設(shè)計的玻片(Labtek，NalgeNucc，Naperville，IL，USA),并孵育一天，接著是病毒再感染一天。感染之后，使用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中的4。/o多聚甲醛(PFA)室溫固定細胞15分鐘，接著用PBS中的1。/。tritonX-100進行通透處理。使用封閉緩沖液(PBS中的l%(w/v)BSA和0.2%(v/v)Tween-20)封閉非特異性抗體結(jié)合1個小時。第一抗體(豚鼠抗大鼠胰島素(DAKO，Carpiteria，CA，USA))在封閉緩沖液中稀釋(1/200)，并且施加給細胞持續(xù)1小時。然后細胞在PBS中洗3遍。第二抗體(生物素化的抗豚鼠抗體)在封閉緩沖液中稀釋(1/300)然后施加給細胞1小時。洗三遍之后，HRP綴合的鏈霉親和素在封閉緩沖液中稀釋(1/300)并施加給細胞1個小時，接著使用VectorVIP(VectorLaboratorey)才艮據(jù)制造商的i兌明進行顯影。在使用rAd-CMV-rINSfur病毒感染的所有細胞系中觀察到胰島素表達。結(jié)果在圖10中顯示并表明了CMV啟動子的普遍轉(zhuǎn)錄活性，而SP23137只在H4IIE細胞中誘導(dǎo)胰島素基因表達(圖10A)。在NOD.scid小鼠模型中也檢測到通過合成啟動子的組織特異性靶基因表達。為評估體內(nèi)活性，rAd-23137-rlNSfur病毒被施用給STZ謙導(dǎo)的糖尿病NOD.scid小鼠。rAd-CMV-rINSfur病毒被作為普遍性對照。當(dāng)?shù)竭_正常血糖時，處死受治療的動物。收集一些器官，例如腎臟、脾臟、肝臟、肺、和心臟，以提取總RNA。簡言之，動物的一些器官(肝臟、脾臟、肺、心臟、和腎臟)被置于10體積的RNAlaterRNA穩(wěn)、定試劑(Qiagen，Mississauga，ON,Canada)中，儲存于-80"C。根據(jù)制造商的說明使用RNeasyMiniKit(Qiagen,Mississauga,ON,Canada)分離總RNA，并儲存于-80X:。4吏用5ug的總RNA合成cDNA，其應(yīng)用SuperscriptII逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen，Burlington,ON，Canada)和寡聚(dT)12-18(Invitrogen,Burlington,ON，Canada)。使用大鼠胰島素的特異性引物進行PCR。小鼠次黃噤呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)被用作內(nèi)標(biāo)。所用的上游和下游引物如下大鼠胰島素，正義，GTGGATGCGCTTCCTG(SEQIDNO:19);大鼠胰島素，反義，ACAATGCCACGCTTCTG(SEQIDNO:20);小鼠HPRT,正義GTAATGATCAGTCAACGGGGGAC(SEQIDNO:21);小鼠HPRT,反義CCAGCAAGCTTGCAACCTTAACCA(SEQIDNO:22)。針對每纟且fj物優(yōu)>(匕PCR條件。PCR混合物(Chalkley,GE.&Verrijzer,CP.(1999).DNAbindingsiteselectionbyRNApolymeraseIITAFs:aTAF(II)250-TAF(II)150complexrecognizestheinitiator.五MSO/"18:4835-4845)^^有各0.2mM的每種脫氧核糖核苷三磷酸，各1uM的每種特異性引物，1.5mM或2mM的MgCl2，50mMKCl，10mMTris畫Cl，pH9.0和2.5U的Taq聚合酶(NEB)。在擴增之后，產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳并通過溴化乙錠染色來檢測。RT-PCR結(jié)果在圖11中顯示。由于它的普遍性轉(zhuǎn)錄活性，在來自rAd-CMV-rINSfur治療的NOD.scid小鼠的所有器官中觀察到大鼠胰島素基因表達，其與我們的體外實驗結(jié)果相一致。但是只在來自rAd-23137-rlNSfur治療的NOD.scid動物的肝臟中檢測到胰島素mRNA，其表明合成啟動子SP23137具有肝臟特異性轉(zhuǎn)錄活性。也通過組織學(xué)分析評價了體內(nèi)組織特異性表達。當(dāng)血液葡萄糖水平降到低于150mg/dL時，從病毒治療的NOD.scid小鼠中移除肝臟、腎臟、脾臟和胰臟。在組織移除之前2個小時加載葡萄糖(2g/kg體重)以加強胰島素表達。使用10%緩沖福爾馬林固定樣品，在石蠟中包埋，進行4.5jtm切片，并放置在玻璃載玻片上。使用二甲苯，和100%、卯％、80%、和70。/。乙醇依次處理樣品，并使用自來水沖洗。使用封閉緩沖液(PBS中的l%(w/v)BSA和0.2%(v/v)Tween-20)封閉非特異性抗體結(jié)合1個小時。第一抗體(豚鼠抗大鼠胰島素(DAKO,Carpiteria，CA，USA))在封閉緩沖液中稀釋(1/200)，并且施加給細胞1個小時。然后細胞在PBS中洗3遍。第二抗體(生物素化的抗豚鼠抗體)在封閉緩沖液中稀釋(1/300)然后施加給細胞l個小時。洗三遍之后，HRP綴合的鏈霉親和素在封閉緩沖液中稀釋(1/300)并施加給細胞1個小時，接著根據(jù)制造商的說明使用VectorVIP(VectorLaboratorey，Burlingame，CA,USA)進行顯影。在使用自來水沖洗后，使用Meyer蘇木精溶液對樣品進行反染色。獲得的結(jié)果證實所述合成啟動子的轉(zhuǎn)錄活性被限制于肝臟并且未在其它器官中觀察到。也評估了rAd-23137-rlNSfur在糖尿病動物模型中的療效。為檢測SP23137在NOD小鼠中的轉(zhuǎn)錄活性，將3x101Q病毒顆粒的效價的rAd-23137-rlNSfur病毒施用給糖尿病NOD小鼠。動物在病毒施用之前遭受554±45mg/dl的高血液葡萄糖水平。如圖12中所見，血液葡萄糖水平在2-3天內(nèi)快速降低到正常范圍。這些結(jié)果證明rAd-23137-rlNSfur在具有免疫力的自身免疫I型糖尿病動物模型和免疫缺陷的化學(xué)誘導(dǎo)糖尿病動物模型中具有療效。但是在rAd-23137-治療的NOD小鼠中正常血糖保持10天，然后又復(fù)發(fā)高血糖。在NOD.scid小鼠中血液葡萄糖水平正常后的一個月中觀察到高血糖的復(fù)發(fā)。宿主對于腺病毒載體的免疫應(yīng)答越強烈可能導(dǎo)致NOD小鼠中高血糖的復(fù)發(fā)越早。上述研究的結(jié)果揭示了，大多數(shù)具有3元件拷貝的合成啟動子具有相當(dāng)于天然LPK啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，其中多拷貝的單個元件具有相對低的活性，其與之前的報道一致(Li,X.,Eastman,E.M.,Schwartz,R.J.,&Draghia-Akli,R.(1999).Syntheticmusclepromoters:activitiesexceedingnatuallyoccurrngregulatorysequences.7Vat5/^c/mo/"17:241-245)。但是，最近也已顯示在構(gòu)建體中包含另外的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件可增強基因表達(Walters,M.C.，F(xiàn)iering,S.,Eidemiler，J.,Magis，W"Groudine,M.，&Martin,D.J.(1995).Enhancersincreasetheprobabilitybutnotthelevelofgeneexpression./Vrc.A^"cflflf.5W.U.S.A.,92:7125-7129;Sutherland,H.G,Martin,D.&Whitdaw，E.(1997).Aglobinenhanceractsbyincreasingtheproportionoferythrocytesexpressingalinkedtransgene-Mo/.CW/所o/.，17:1607-1614)。因此，通狄構(gòu)建體中導(dǎo)入另外的3拷貝組件發(fā)現(xiàn)3拷貝合成啟動子轉(zhuǎn)錄活性的增強。為研究方向的影響，以與在先存在組件的相同或相反的方向插入3拷貝組件。這些構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄活性的分布表明它們中的大多數(shù)顯示出與3拷貝合成啟動子相同或較小的轉(zhuǎn)錄活性(圖5A和5B)。但是，一些較高拷貝數(shù)的啟動子顯示出高的多的活性(圖3B)。在具有相同或相反方向的3拷貝組件的構(gòu)建體之間轉(zhuǎn)錄活性的分布沒有顯著的差異。這些整體的觀察表明順式元件的某些組合對于啟動子活性可具有協(xié)同效應(yīng)。但是，在顯示出高于CMV啟動子活性8。/。的合成啟動子中，使用6拷貝或9拷貝組件沒有觀察到共有模式的存在。在9拷貝合成啟動子中轉(zhuǎn)錄活性的分布顯示，它們中的大多數(shù)具有相同或較小的活性，其中有一些相比于它們的母構(gòu)建體具有較高的活性。在具有高活性的9拷貝合成啟動子的各個元件排列順序上沒有發(fā)現(xiàn)相似之處。盡管合成啟動子的轉(zhuǎn)錄活性相比于天然LPK啟動子是增強的，還評估了有關(guān)它們調(diào)控胰島素基因治療能力的葡萄糖應(yīng)答。如圖6所示，在rAd-CMV-rINSfur治療的動物中，通過CMV啟動子的胰島素不受控表達導(dǎo)致了由于低血糖的死亡。相反，在STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型中通過合成啟動子的胰島素表達是響應(yīng)葡萄糖變化而適當(dāng)受控的。值得注意的是，在使用5xl01()病毒顆粒治療的動物中沒有發(fā)現(xiàn)嚴重的低血糖。不進一步增加所述載體劑量以避免第一代腺病毒的病毒毒性。另外，在rAd-SP-rINSfur治療的動物中禁食血液葡萄糖水平是與正常健康動物中相當(dāng)?shù)?，表明胰島素表達響應(yīng)血液葡萄糖水平而被調(diào)控。這些結(jié)果表明本發(fā)明合成啟動子具有響應(yīng)葡萄糖水平的變化來調(diào)控胰島素產(chǎn)生以及在糖尿病動物中維持正常血糖的能力。另外，來自rAd-23137-rlNSfur治療的動物中葡萄糖耐受測試的結(jié)果支持了合成啟動子響應(yīng)葡萄糖變化表達胰島素的能力。在葡萄糖激發(fā)后15和30分鐘處的峰值之后，血液葡萄糖水平降低到與對照類似的正常范圍。但是，對照動物在60分鐘內(nèi)顯示正常葡萄糖，而rAd-23137-rlNSfur治療的動物在葡萄糖加載后120分鐘時顯示相同的水平。另外，在治療的動物中葡萄糖激發(fā)后180到240分鐘之間觀察到相對于正常對照動物較低的血液葡萄糖水平，在270分鐘時回復(fù)到與正常對照動物相似的范圍。這些結(jié)果表明，本發(fā)明的合成啟動子仍然可被進一步優(yōu)化，尤其是_針對負反饋。但是，所述合成啟動子比之前報道的啟動子有效的多，在用之前報道的啟動子治療的動物中非禁食葡萄糖水平有略」敞的高。所述合成啟動子的負調(diào)控可通過導(dǎo)入胰島素應(yīng)答元件來實現(xiàn)，其已經(jīng)顯示出在胰島素存在下抑制啟動子活性(O'brien,R.M.，Streeper，R.S.，Ayala，丄E.,Stadelmaier,B.T"&Hornbuckle，LA.(2001).Insulin-regulatedgeneexpression.所0c/^柳.5W".7)Yms.,29:552-558)。另外，也有可能通過在序列中加入導(dǎo)致快速降解的特定元件控制轉(zhuǎn)基因胰島素mRNA的半衰期(Wilusz，C.J.&Wilusz,J.(2004).BringingtheroleofmRNAdecayinthecontrolofgeneexpressionintofocus.7>dfcG^""20:491-497)，因為胰島素i秀導(dǎo)低血糖的潛在風(fēng)險主要取決于胰島素mRNA的相對穩(wěn)定性(Dong,H.&Woo,S.L.(2001).Hepaticinsulinproductionfortype1diabetes.rmwfc￡"rtflfocn'"d"fl6.，12:441-446)。在本申請中，有多個出版物在括號中被引用。由此，這些出版物公開的內(nèi)容以整體通過引用并入本申請，以更全面的描述與本發(fā)明相關(guān)的技術(shù)狀態(tài)。盡管通過所公開的實施方案描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)容易理解，具體的實施例和上文詳述的研究只是對本發(fā)明的舉例說明。應(yīng)當(dāng)理解在不脫離本發(fā)明精神的情況下，可對本發(fā)明作出各種修改。因此，本發(fā)明只受所附權(quán)利要求的限制。權(quán)利要求1.一種分離的組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子，其包含在至少一個三聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件3’側(cè)的聚合酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述三聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件具有肝細胞核因子-1(HNF-1)元件、CAAT/增強子結(jié)合蛋白(C/EBP)應(yīng)答元件和葡萄糖應(yīng)答元件(GRE)。2.權(quán)利要求l的啟動子，其中所述聚合酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含肝臟丙酮酸激酶(LPK)啟動子。3.權(quán)利要求1的啟動子，其中所述HNF-1元件包含約25-30個核苦酸。4.權(quán)利要求3的啟動子，其中所述HNF-l元件包含SEQIDNO:l。5.權(quán)利要求1的啟動子，其中所述C/EBP應(yīng)答元件包含約20-25個核苷酸。6.權(quán)利要求5的啟動子，其中所述C/EBP應(yīng)答元件包含SEQIDNO:2。7.權(quán)利要求1的啟動子，其中所述GRE包含約45-50個核苷酸。8.權(quán)利要求7的啟動子，其中所述GRE包含SEQIDNO:3。9.權(quán)利要求l的啟動子，其中三聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件內(nèi)的所述HNF-1元件、所述C/EBP應(yīng)答元件和所述GRE是基本上相鄰的。10.權(quán)利要求1的啟動子，其中三聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件內(nèi)的所述HNF-1元件、所述C/EBP應(yīng)答元件和所述GRE是鄰接的。11.權(quán)利要求1的啟動子，其包含選自圖3A中所示元件的三聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件。12.權(quán)利要求l的啟動子，其還包含第二個三聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件。13.權(quán)利要求12的啟動子，其包含選自圖3B或圖4A中所示元件的三聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件。14.權(quán)利要求l的啟動子，其還包含第三個三聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件。15.權(quán)利要求14的啟動子，其包含選自圖4B中所示元件的三聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件。16.權(quán)利要求1的啟動子，其還包含可操縱連接的胰島素編碼核酸或亞基編碼序列。17.—種包含權(quán)利要求1、12或14的組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子的宿主細胞。18.—種治療或預(yù)防糖尿病的方法，其包括給個體施用有效量的含有包含了組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子的載體的病毒顆粒，所述啟動子包含在至少一個三聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件3，側(cè)的聚合酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述三聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件具有肝細胞核因子-1(HNF-1)元件、CAAT/增強子結(jié)合蛋白(C/EBP)應(yīng)答元件和葡萄糖應(yīng)答元件(GRE)，所述元件可操縱的連接胰島素編碼核酸，其中所述胰島素編碼核酸的表達是組織特異性的及葡萄糖應(yīng)答的。19.權(quán)利要求18的組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子，其中所述聚合酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含肝臟丙酮酸激酶(LPK)啟動子。20.權(quán)利要求18的組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子包含約25-30個核普酸。21.權(quán)利要求20的組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子包含SEQIDNO:l。22.權(quán)利要求18的組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子元件包含約20-25個核苷酸。23.權(quán)利要求22的組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子元件包含SEQIDNO:2。24.權(quán)利要求18的組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子45-50個核苷酸。25.權(quán)利要求24的組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子，其中所述GRE包含SEQIDNO:3。26.權(quán)利要求18的組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子，其中所述三聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件內(nèi)的所述HNF-1元件、所述C/EBP應(yīng)答元件和所述GRE，其中所述HNF-1元件，其中所述HNF-1元件，其中所述C/EBP應(yīng)答，其中所述C/EBP應(yīng)答,其中所述GRE包含約是基本上相鄰的。27.權(quán)利要求18的組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子，其中所述三聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件內(nèi)的所述HNF-1元件、所述C/EBP應(yīng)答元件和所述GRE是鄰接的。28.權(quán)利要求18的組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子，其包含選自圖3A中所示元件的三聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件。29.權(quán)利要求18的組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子，其還包含第二個三聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件。30.權(quán)利要求29的組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子，其包含選自圖3B或圖4A中所示元件的三聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件。31.權(quán)利要求18的組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子，其還包含第三個三聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件。32.權(quán)利要求31的組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子，其包含選自圖4B中所示元件的三聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件。33.權(quán)利要求18的方法，其中所述載體包括腺病毒載體。34.權(quán)利要求18的方法，其中所述病毒顆粒在藥用可接受載體中被施用。全文摘要本發(fā)明提供分離的組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子，其具有在至少一個三聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件3’側(cè)的聚合酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件具有肝細胞核因子-1(HNF-1)元件、CAAT/增強子結(jié)合蛋白(C/EBP)應(yīng)答元件和葡萄糖應(yīng)答元件(GRE)。所述啟動子可包含第二個或第三個三聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件。本發(fā)明也提供包含了本發(fā)明組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子的宿主細胞。還提供了治療或預(yù)防糖尿病的方法。所述方法包括將有效量的具有包含了組織特異性葡萄糖應(yīng)答啟動子的載體的病毒顆粒施用給個體，所述啟動子包含在至少一個三聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件3’側(cè)的聚合酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件具有肝細胞核因子-1(HNF-1)元件、CAAT/增強子結(jié)合蛋白(C/EBP)應(yīng)答元件和葡萄糖應(yīng)答元件(GRE)，所述元件可操縱的連接到胰島素的編碼核酸上，其中胰島素編碼核酸的表達是組織特異性的及葡萄糖應(yīng)答的。文檔編號A61K31/70GK101212977SQ200680023956公開日2008年7月2日申請日期2006年5月30日優(yōu)先權(quán)日2005年6月1日發(fā)明者尹址垣申請人:國際創(chuàng)新生物技術(shù)研究所有限公司