專利名稱：貓人參揮發(fā)油在制藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及貓人參揮發(fā)油的用途，尤其是在制藥中的用途。
背景技術(shù)：
隨著人類生活水平的提高，抗菌素、化學(xué)藥物的大量應(yīng)用，導(dǎo)致某些菌類產(chǎn)生抗藥性，這對人類生產(chǎn)生活造成了嚴(yán)重威脅。世界各國醫(yī)學(xué)專家們不斷致力于尋找毒副作用小、菌類不易產(chǎn)生抗藥性的防治藥劑。我國中草藥資源豐富，高效低毒，成本低廉。廣大的中藥工作者，對中草藥防菌抑菌的活性作了大量有益的嘗試，積累了不少經(jīng)驗。
貓人參為獼猴桃科獼猴桃屬植物大籽獼猴桃Actinidia macrospermaC.F.Liang或?qū)喃J猴桃Actinidia.valvata Dunn。前者在中藥中俗稱“紅貨”，后者俗稱“白貨”。主要分布于我國華東及華南地區(qū)，集中在廣東、湖南、湖北、江西、浙江、江蘇、安徽等省。根據(jù)中藥大詞典記載該藥味苦、性寒、歸肺、胃經(jīng)；根莖入藥；具有清熱解毒、祛風(fēng)除濕、消腫去癤的功效；臨床用于治療皮膚瘡瘍膿腫、麻風(fēng)、骨髓炎、風(fēng)濕痹痛、白帶異常、肝硬化黃疸腹水等疾病，民間還用于肺癌和消化道腫瘤的治療。貓人參在抑制腫瘤生長，改善生命征象方面有獨(dú)特的效果，經(jīng)過反復(fù)實(shí)踐，逐漸形成了以貓人參為主的各種治療腫瘤的驗方，引起中醫(yī)藥界的關(guān)注。由于貓人參在抗腫瘤提高免疫力方面的良好療效，以至于其它藥理作用被大大忽視了，藥典及各種本草中均無有關(guān)于貓人參揮發(fā)油藥用的記載。到目前為止，還未見關(guān)于該中藥揮發(fā)油化學(xué)成分、藥理作用及其應(yīng)用的文獻(xiàn)報道。對貓人參的應(yīng)用，也僅僅限于將其整體加工后，作為復(fù)方藥的原料之一與其他的原料共同制成中成藥，尚未發(fā)現(xiàn)以貓人參為原料特別是作為單一原料進(jìn)行加工并/或?qū)⒓庸こ龅奶崛∥镏苯幼鳛樗幬锸褂玫闹圃旆椒捌渲瞥善贰?br> 引證文獻(xiàn)①.裘寶林等。浙江植物志(第四卷)。浙江浙江科學(xué)技術(shù)出版社，1993177。
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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供貓人參的活性成分揮發(fā)油的新用途，即在制藥中的用途。
本發(fā)明特點(diǎn)是，貓人參揮發(fā)油在制備抗菌抑菌藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明具體涉及貓人參活性成分揮發(fā)油在制備抗菌抑菌單方或復(fù)方藥物中的新應(yīng)用。
本發(fā)明以貓人參揮發(fā)油為原料，可將其作為活性成分與制藥學(xué)上可接受的載體或藥用輔料開發(fā)成相宜的抗菌抑菌藥物制劑，如注射劑、膠囊劑(軟膠囊、硬膠囊)、滴丸劑、片劑、顆粒劑、散劑、口服液等。
為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面用貓人參揮發(fā)油的體外抑菌活性研究和急性毒性實(shí)驗的結(jié)果來說明其在制備抗菌抑菌藥物中的用途。
一、體外抑菌實(shí)驗1.實(shí)驗材料與方法1.1菌株 實(shí)驗菌株包括兩種革蘭氏陽性菌金色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 25923)和枯草桿菌(Bacillus subtilis ATCC26633)；兩種革蘭氏陰性菌大腸桿菌(Escherichia coli ATCC 25922)和綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853)；三種真菌酵母菌(Candida albicans ATCC 10231)，煙曲霉(Aspergillus fumigatus ATCC 9142)和犬小孢子菌(Microsporum canis ATCC 36299)。各菌種的臨床病癥表現(xiàn)見表1。
表1各菌種的臨床病癥表現(xiàn)

1.2實(shí)驗方法 采用紙片瓊脂擴(kuò)散法對體外抑菌活性進(jìn)行初測。采用微量稀釋法測定最小抑制濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)和最小殺菌濃度(minimum bactericidal or fungicidal concentration，MBC/MFC)。
2.實(shí)驗結(jié)果結(jié)果見表2、表3。
貓人參揮發(fā)油對革蘭氏陽性菌有一定抑制作用，對革蘭氏陰性菌有較強(qiáng)抑制作用(除綠膿桿菌這一普遍抗藥菌株外)，最小抑制濃度MIC為0.78～25.50μl/ml，最小殺菌濃度1.56～50.0μl/ml；在真菌的測試中，貓人參揮發(fā)油表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制活性，最小抑制濃度MIC為0.78～1.56μl/ml，最小殺菌濃度0.78～3.12μl/ml。
表2貓人參揮發(fā)油的體外抑菌活性初測(紙片法)a，b

a抑菌圈直徑7～13mm表示微弱活性；抑菌圈直徑≥14mm表示較強(qiáng)活性b-表示沒有活性；nd表示沒有檢測。
表3貓人參揮發(fā)油的最小抑制濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC/MFC)(微量稀釋法)

根據(jù)對貓人參揮發(fā)油化學(xué)成分的分析和相關(guān)藥理文獻(xiàn)的報道，我們發(fā)現(xiàn)貓人參揮發(fā)油中的芳樟醇具有明顯抗菌活性，并有鎮(zhèn)痛、解痙、抗白血病的作用；2-己烯醛能作為傷口消毒劑，具抗菌抑菌活性；另外，葉綠醇、α-松油醇、香葉醇和棕櫚酸等化合物也具有一定的抑菌活性。
二、急性毒性實(shí)驗1.實(shí)驗材料與方法1.1動物昆明種小白鼠18～22g，雌雄各半，檢疫后備用。
1.2實(shí)驗方法 小鼠按體重均衡分為5個劑量組，每組20只。實(shí)驗前禁食不禁水12小時，根據(jù)預(yù)實(shí)驗結(jié)果，各組劑量分別為2.00ml/kg、2.56ml/kg、3.20ml/kg、4.00ml/kg、5.00ml/kg，將貓人參揮發(fā)油用色拉油稀釋給小鼠灌胃，給藥后連續(xù)觀察4h、24h、48h、72h各觀察一次。72h記錄小白鼠毒性反應(yīng)及死亡數(shù)，用改良寇氏法計算小白鼠的半致死劑量LD50及95％的置信區(qū)間。
2.實(shí)驗結(jié)果結(jié)果如表4。經(jīng)測定，LD50值為3.27ml/kg，95％可信限為3.04～3.54ml/kg(P＞0.05)。根據(jù)測定，1ml揮發(fā)油重為1.17259g，因此LD50值為3834mg/kg，95％可信限為3565～4150mg/kg；按急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)判定，該樣品屬實(shí)際無毒類。
表4貓人參揮發(fā)油對小鼠急性毒性試驗死亡率的影響

綜上所述，貓人參揮發(fā)油在體外抑菌尤其是抑制真菌方面有良好療效，且毒副作用小，有著良好的開發(fā)應(yīng)用前景。
本發(fā)明的貓人參揮發(fā)油所用的原料為貓人參新鮮葉子，而非根莖，這將一定程度上緩解貓人參生藥材供應(yīng)的不足的現(xiàn)象，提高貓人參的有效利用率。本發(fā)明所述的方法工藝簡單，符合中國藥典的要求，無須特殊設(shè)備。經(jīng)過藥理研究，發(fā)現(xiàn)其具有明顯的抑菌活性，尤其是對真菌的抑制作用(經(jīng)實(shí)驗證實(shí)，貓人參揮發(fā)油細(xì)菌最小抑制濃度MIC為0.78～25.50μl/ml，真菌最小抑制濃度MIC為0.78～1.56μl/ml)。且貓人參揮發(fā)油具有毒副作用小的優(yōu)點(diǎn)，有著良好的開發(fā)應(yīng)用前景，可以與其他中草藥成分配伍，或單獨(dú)直接作為藥物，進(jìn)一步開發(fā)成有效的抑菌新藥，使得貓人參的藥用成分得以充分利用，從而填補(bǔ)了我國中草藥利用的一項空白，具有實(shí)用價值。
本發(fā)明中的貓人參揮發(fā)油采用通常的水蒸氣蒸餾法、溶劑提取法或超臨界萃取法等適合于工業(yè)化生產(chǎn)的方法進(jìn)行制備。得到的貓人參揮發(fā)油呈淡黃色，主要含有芳樟醇(Linalool)、1，2-二甲基-2，3-二氫吲哚(1，2-dimethyl，Lindoline)、亞麻酸甲酯(Linolenic acid，methylester)、葉綠醇(Phytol)、亞麻酸(α-Linolenic acid)、2-己烯醛(2-Hexenal)、α-松油醇(α-Terpineol)、香葉醇((E)-3，7-dimethyl--2，6-Octadien-1-ol)和棕櫚酸(n-Hexadecanoic acid)等化合物。含油量為0.10～0.25％，即每100g生藥含揮發(fā)油0.1～0.25g。
上述的水蒸氣蒸餾法通過油水分離器分離揮發(fā)油，其步驟為按重量份計算，稱取貓人參葉0.1～20份，加水0.5～200份，水蒸氣蒸餾3～5小時，溫度控制在80～105℃(蒸餾前期溫度可設(shè)置得高些，后期只要保持小沸即可)，進(jìn)行油水分離；用油水分離器分離得含水貓人參揮發(fā)油；乙醚萃取后，冷凍干燥(-20℃下冷凍干燥24小時以上)或無水硫酸鈉干燥(24小時以上)、過濾，去除水相，濃縮得到貓人參揮發(fā)油。
上述的溶劑提取法，其步驟為取貓人參葉0.1～20份，加入有機(jī)溶劑正己烷或環(huán)己烷0.6～120份重量份，進(jìn)行回流提取，溫度控制在60～70℃，回流2～3小時，待回流液溫度降至常溫時，放出回流液，回收有機(jī)溶劑，即可得到揮發(fā)油粗品；加入無水乙醇0.01～0.05重量份，與揮發(fā)油粗品充分混合，放置-20℃冰柜中放置24小時以上，將渾濁液過濾除蠟；繼續(xù)放置冰柜中重復(fù)除蠟過程，直到液體澄清；將含有揮發(fā)油的乙醇液濃縮，即得貓人參揮發(fā)油。
上述的超臨界萃取法，其步驟為取貓人參葉加入萃取釜，萃取釜壓力10～50Mpa，溫度20～70℃，進(jìn)行超臨界CO2萃取，萃取時間為0.5～15小時，從萃取釜出來的CO2進(jìn)入分離系統(tǒng)，一級分離溫度30～50℃，壓力10～15Mpa；二級分離溫度20～40℃，壓力4～7Mpa，得到貓人參揮發(fā)油，CO2流速為15～25升/h，分離出來的CO2再經(jīng)過濾和制冷系統(tǒng)加壓后循環(huán)利用。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)例用以進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不由此限制本發(fā)明范圍。
實(shí)施例1取貓人參鮮葉100g，加10倍量水，水蒸氣蒸餾5小時；用油水分離器分離含水揮發(fā)油；乙醚少量多次萃取后，用無水硫酸鈉干燥過夜，過濾濃縮得到貓人參揮發(fā)油。揮發(fā)油呈淺黃色透明液樣，有特殊清香味，得油率為0.10％，即100g貓人參鮮含揮發(fā)油0.10g。
揮發(fā)油加少量無水乙醇溶解后進(jìn)行GC-MS分析，結(jié)果如表5。色譜條件石英毛細(xì)管柱HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)，載氣為氦氣，柱流量1ml/min。汽化室溫度260℃，升溫程序為從50℃開始以10℃/min升溫至260℃；質(zhì)譜條件EI電離源，電離能量70eV，離子源溫度230℃，掃描范圍30～500amu，進(jìn)樣量1.0μL，分流比10∶1。
表5貓人參揮發(fā)油成分分析結(jié)果(水蒸汽蒸餾法)

實(shí)施例2取貓人參新鮮葉100g，加入正己烷600ml，回流2小時；含油正己烷減壓濃縮，加少量無水乙醇10ml熱溶，放置-20℃冰柜中放置24小時低溫除蠟，過濾；除蠟步驟重復(fù)3次，直到油液澄清；過濾殘留物用無水乙醇重新微熱溶，低溫放置過濾，最后合并濾液；濃縮含油乙醇液，過濾濃縮得到貓人參揮發(fā)油。揮發(fā)油呈淺黃色透明液樣，有特殊清香味，得油率為0.20％，即100g貓人參鮮葉含揮發(fā)油0.20g。
揮發(fā)油加少量無水乙醇溶解后進(jìn)行GC-MS分析，結(jié)果如表6。色譜條件石英毛細(xì)管柱HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)，載氣為氦氣，柱流量1mL/min。汽化室溫度260℃，升溫程序為從50℃開始以10℃/min升溫至260℃；質(zhì)譜條件EI電離源，電離能量70eV，離子源溫度230℃，掃描范圍30～500amu，進(jìn)樣量1.0μL，分流比10∶1。
表6貓人參揮發(fā)油成分分析結(jié)果(溶劑提取法)

實(shí)例3取貓人參葉加350g投入萃取釜，萃取釜壓力20Mpa，溫度30℃；一級分離溫度30℃，壓力10Mpa；二級分離溫度20℃，壓力4Mpa。超臨界流體靜態(tài)浸泡原料1小時，設(shè)備穩(wěn)定后進(jìn)行動態(tài)萃取，由接收器收集產(chǎn)品。最后得貓人參揮發(fā)油0.87g，揮發(fā)油呈淺黃色透明液樣，有特殊清香味，得油率為0.25％，即100g貓人參鮮葉含揮發(fā)油0.25g。
揮發(fā)油加少量無水乙醇溶解后進(jìn)行GC-MS分析，結(jié)果類似于實(shí)例1、2，發(fā)現(xiàn)至少含有芳樟醇、1，2-二甲基-2，3-二氫吲哚、亞麻酸甲酯、葉綠醇、亞麻酸、2-己烯醛、α-松油醇、香葉醇和棕櫚酸等成分。
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權(quán)利要求
1.貓人參揮發(fā)油在制備抗菌抑菌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及貓人參揮發(fā)油在制藥中的用途。以貓人參新鮮葉為原料，采用通常的提取方法提取揮發(fā)油。揮發(fā)油至少包含芳樟醇、1，2－二甲基－2，3－二氫吲哚、亞麻酸甲酯、葉綠醇、亞麻酸、2－己烯醛、α－松油醇、香葉醇和棕櫚酸等。藥理研究結(jié)果表明，貓人參揮發(fā)油具有良好的抗菌抑菌作用，尤其是對真菌的抑制；且毒副作用小。因此其可用于制成各種抗菌藥劑，如注射劑、膠囊劑、滴丸劑、片劑、顆粒劑、散劑、口服液或其它劑型。
文檔編號A61P31/04GK1895305SQ20061005200
公開日2007年1月17日 申請日期2006年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月16日
發(fā)明者陸胤, 陳紹瑗, 范捷, 王之燦, 陳建龍, 李樹坤, 傅承新 申請人:浙江大學(xué)