專利名稱：：一種脈絡(luò)寧注射用粉針劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種以中藥復(fù)方提取物為有效成分的注射制劑，具體而言，是一種脈絡(luò)寧注射用粉針劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
：脈絡(luò)寧注射液是在著名醫(yī)方“四妙勇安湯”的基礎(chǔ)上研制而成的中藥復(fù)方注射劑，由牛膝、玄參、石斛、金銀花四味中藥組成，廣泛應(yīng)用于血栓閉塞性脈管炎、動(dòng)脈硬化性閉塞癥、腦血栓形成及后遺癥、多發(fā)性大動(dòng)脈炎、四肢急性動(dòng)脈栓塞癥、糖尿病壞疽、靜脈血栓形成及血栓性靜脈炎等。中國(guó)專利CN1557398A公開了其還具有預(yù)防和治療心絞痛的作用。但是現(xiàn)有的脈絡(luò)寧注射液的制備工藝采用水提醇沉法將四種藥材同時(shí)提取，然后再用乙酸乙酯萃取得有效成分(見“脈絡(luò)寧注射液的工藝方法”，公開號(hào)CN1078148A)，然而方中含有綠原酸等對(duì)光照和空氣不穩(wěn)定性成分，在貯存過程中容易出現(xiàn)注射液色澤變化、有效成分含量降低等現(xiàn)象，同時(shí)方中存有有機(jī)酸與生物堿等成分，在水針狀態(tài)下這些成分極易發(fā)生絮凝沉淀，嚴(yán)重影響到脈絡(luò)寧注射液臨床應(yīng)用的安全性和有效性。中國(guó)專利CN1682928A公開了一種制備脈絡(luò)寧注射液的新方法，該方法將牛膝和玄參醇提，石斛用醇浸泡，回流提取，二者提取物合并后上大孔吸附樹脂，得提取物X；金銀花水超聲提取后上D101大孔吸附樹脂，水洗液離心后超濾膜超濾，得提取物Y；或者水超聲提取后尚NKA-II型大孔吸附樹脂，收集醇洗脫液，得提取物Y；將X和Y合并，制成制劑。盡管該工藝對(duì)有效成分的提取比較充分，但是非常繁瑣，其中的超聲處理在工業(yè)生產(chǎn)很難應(yīng)用，大孔吸附樹脂處理則存在處理周期長(zhǎng)等不足。因此，開發(fā)出更加安全、有效、穩(wěn)定且制備工藝簡(jiǎn)潔、實(shí)用的脈絡(luò)寧注射制劑是廣大醫(yī)藥工作者一直渴望解決的問題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種安全、有效、穩(wěn)定、工藝簡(jiǎn)潔實(shí)用的脈絡(luò)寧注射用粉針劑。本發(fā)明的另一目的是提供該脈絡(luò)寧注射用粉針劑的制備方法。本發(fā)明是通過下面的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的脈絡(luò)寧注射制劑包括由牛膝、玄參、石斛、金銀花為原料制得的提取物和注射制劑中可接受的賦形劑，其中牛膝、玄參、石斛和金銀花的重量配比為1～4∶1～4∶1～4∶1～4；優(yōu)選配比為1～2∶1～2∶1～2∶1～2；最佳配比為1∶1∶1∶1。本發(fā)明的脈絡(luò)寧注射用凍干粉針劑，其中原料藥和賦形劑具有以下重量份配比牛膝2000～8000玄參2000～8000石斛2000～8000金銀花2000～8000甘露醇200～500PVP3～8。優(yōu)選地，其原料藥和賦形劑具有以下重量份配比牛膝5000玄參5000石斛5000金銀花5000甘露醇330PVP6。本發(fā)明的脈絡(luò)寧注射用粉針劑，由包括下述步驟的方法制備而成(1)按照下述重量配比稱取原料藥備用石斛1～4份金銀花1～4份牛膝1～4份玄參1～4份；(2)取處方量的上述藥材，乙醇滲漉提取，滲漉液濃縮成浸膏，離心，加水，靜置，過濾，濾液減壓濃縮成浸膏，過濾，濾液調(diào)節(jié)pH值，乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯后干燥得提取物；(3)加水溶解提取物，冷藏，過濾，濾液超濾，收集超濾液，加入賦形劑，制成粉針劑。優(yōu)選地，本發(fā)明的脈絡(luò)寧注射用粉針劑，由包括下述步驟的方法制備而成(1)按照下述重量配比稱取原料藥備用石斛14份金銀花1～4份牛膝1～4份玄參1～4份；(2)取處方量的上述藥材粉碎，用50～90％乙醇滲漉提取，收集8～16倍生藥量的滲漉液，低溫減壓回收乙醇，減壓濃縮成浸膏，離心去除不溶性雜質(zhì)，加2～8倍量水，充分?jǐn)嚢瑁o置過夜，過濾，濾液減壓濃縮成浸膏，過濾，調(diào)節(jié)pH值至1～6，乙酸乙酯萃取2～8次，合并萃取液，回收乙酸乙酯后真空干燥得提取物；(3)在提取物中加注射用水加熱煮沸使溶解，自然放冷，冷藏，過濾，濾液超濾，收集超濾液，濾液中加入賦形劑，補(bǔ)加注射用水至處方量，調(diào)pH值，除菌過濾，濾液分裝于西林瓶中，加塞，冷凍干燥，包裝，得凍干粉針劑。最佳地，本發(fā)明的脈絡(luò)寧注射用粉針劑，由包括下述步驟的方法制備而成(1)按照下述重量配比稱取原料藥備用石斛1～4份金銀花1～4份牛膝1～4份玄參1～4份；(2)取處方量的上述藥材粉碎成粗粉，用50～90％乙醇以100～300ml/min速度滲漉提取，收集10～14倍生藥量的滲漉液，低溫減壓回收乙醇，減壓濃縮至50℃下相對(duì)密度為1.0～1.3的浸膏，離心去除不溶性雜質(zhì)，加4～8倍量水，充分?jǐn)嚢瑁o置過夜，過濾，濾液減壓濃縮至50℃下相對(duì)密度為1.0～1.3的浸膏，過濾，去除沉淀，調(diào)節(jié)pH值至1～4，等體積乙酸乙酯萃取4～8次，合并萃取液，回收乙酸乙酯，50～80℃真空干燥得提取物；(2)在提取物中加注射用水加熱煮沸8～15分鐘，自然放冷，冷藏，過濾，濾液以截留分子量為3000～8000的超濾膜超濾，收集超濾液，濾液中加入賦形劑，補(bǔ)加注射用水至處方量，調(diào)pH值6.5～7.0，除菌過濾，濾液分裝于西林瓶中，加塞，冷凍干燥，包裝，得凍干粉針劑。其中，以上步驟(3)中所述的賦形劑選自甘露醇、PVP、葡聚糖、乳糖、右旋糖苷、蔗糖一種或多種；優(yōu)選自甘露醇、PVP、右旋糖苷、乳糖中的一種或多種；更優(yōu)選自甘露醇、PVP、右旋糖苷中的一種或多種。其中所述提取物中綠原酸含量為不低于5％，優(yōu)選為8～20％，更優(yōu)選為8～18％，進(jìn)一步優(yōu)選為10～15％。其中所述提取物中肉桂酸含量為不低于0.05％，優(yōu)選為0.05～0.20％，更優(yōu)選為0.06～0.12％.進(jìn)一步優(yōu)選為0.07～0.10％。其中所述提取物中濱蒿內(nèi)酯含量為不低于0.05％，優(yōu)選為0.05～0.15％，更優(yōu)選為0.05～0.10％，進(jìn)一步優(yōu)選為0.05～0.08％。本發(fā)明的脈絡(luò)寧注射用粉針劑的制備方法，包括以下步驟(1)按照下述重量配比稱取原料藥備用石斛1～4份金銀花1～4份牛膝1～4份玄參1～4份；(2)取處方量的上述藥材，乙醇滲漉提取，滲漉液濃縮成浸膏，離心，加水，靜置，過濾，濾液減壓濃縮成浸膏，過濾，濾液調(diào)節(jié)pH值，乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯后干燥得提取物；(3)加水溶解提取物，冷藏，過濾，濾液超濾，收集超濾液，加入賦形劑，制成粉針劑。優(yōu)選地，本發(fā)明的脈絡(luò)寧注射用粉針劑的制備方法包括以下步驟(1)按照下述重量配比稱取原料藥備用石斛1～4份金銀花1～4份牛膝1～4份玄參1～4份；(2)取處方量的上述藥材粉碎，用50～90％乙醇滲漉提取，收集8～16倍生藥量的滲漉液，低溫減壓回收乙醇，減壓濃縮成浸膏，離心去除不溶性雜質(zhì)，加2～8倍量水，充分?jǐn)嚢瑁o置過夜，過濾，濾液減壓濃縮成浸膏，過濾，調(diào)節(jié)pH值至1～6，乙酸乙酯萃取2～8次，合并萃取液，回收乙酸乙酯后真空干燥得提取物；(3)在提取物中加注射用水加熱煮沸使溶解，自然放冷，冷藏，過濾，濾液超濾，收集超濾液，濾液中加入賦形劑，補(bǔ)加注射用水至處方量，調(diào)pH值，除菌過濾，濾液分裝于西林瓶中，加塞，冷凍干燥，包裝，得凍干粉針劑。最佳地，本發(fā)明的脈絡(luò)寧注射用粉針劑的制備方法包括以下步驟(1)按照下述重量配比稱取原料藥備用石斛1～4份金銀花14份牛膝1～4份玄參14份；(2)取處方量的上述藥材粉碎成粗粉，用50～90％乙醇以100～300ml/min速度滲漉提取，收集10～14倍生藥量的滲漉液，低溫減壓回收乙醇，減壓濃縮至50℃下相對(duì)密度為1.0～1.3的浸膏，離心去除不溶性雜質(zhì)，加4～8倍量水，充分?jǐn)嚢瑁o置過夜，過濾，濾液減壓濃縮至50℃下相對(duì)密度為1.0～1.3的浸膏，過濾，去除沉淀，調(diào)節(jié)pH值至1～4，等體積乙酸乙酯萃取4～8次，合并萃取液，回收乙酸乙酯，50～80℃真空干燥得提取物；(3)在提取物中加注射用水加熱煮沸8～15分鐘，自然放冷，冷藏，過濾，濾液以截留分子量為3000～8000的超濾膜超濾，收集超濾液，濾液中加入賦形劑，補(bǔ)加注射用水至處方量，調(diào)pH值6.5～7.0，除菌過濾，濾液分裝于西林瓶中，加塞，冷凍干燥，包裝，得凍干粉針劑。其中，以上步驟(3)中所述的賦形劑選自甘露醇、PVP、葡聚糖、乳糖、右旋糖苷、蔗糖一種或多種；優(yōu)選自甘露醇、PVP、右旋糖苷、乳糖中的一種或多種；更優(yōu)選自甘露醇、PVP、右旋糖苷中的一種或多種。本發(fā)明的脈絡(luò)寧注射用粉針劑是大量科學(xué)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，提取方法每個(gè)步驟都經(jīng)過反復(fù)地實(shí)驗(yàn)和驗(yàn)證。下面通過典型的具體試驗(yàn)說明本發(fā)明制備方法的科學(xué)性。脈絡(luò)寧注射制劑制備工藝的研究1.提取工藝研究1.1提取工藝的比較研究四味藥主要活性成分水溶性與醇溶性均較好，既可用水提取也可用醇提取。然而各種成分在不同溶媒中不同提取方式下其提取效果并不一致，須對(duì)其進(jìn)行對(duì)比研究。工藝研究中應(yīng)以金銀花中的綠原酸、玄參中的肉桂酸、石斛中的濱蒿內(nèi)酯三個(gè)主要活性成分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，然而，本方遣方復(fù)雜，評(píng)價(jià)指標(biāo)較多，單指標(biāo)評(píng)價(jià)存在片面性，因此其提取效果優(yōu)劣應(yīng)以眾指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)判定?？v觀本方理法方藥，方中玄參清熱涼血兼滋陰，加用金銀花宣散清熱，使邪熱自氣分而解，共為臣藥，較之石斛其權(quán)重系數(shù)分別設(shè)為0.4；石斛養(yǎng)陰清熱，為治療虛熱不退、津傷口渴之要藥，既可固護(hù)胃氣，又可養(yǎng)陰生脈、利血行，方中以為佐使之用，較之玄參銀花二味權(quán)重系數(shù)可定為0.2，因此綜合指標(biāo)評(píng)分可用下式計(jì)算綜合指標(biāo)評(píng)分＝綠原酸轉(zhuǎn)移率×0.4+肉桂酸轉(zhuǎn)移率×0.4+濱蒿內(nèi)酯轉(zhuǎn)移率×0.21.1.1藥材的前處理取金銀花(批號(hào)021202)、牛膝(批號(hào)021205)、玄參(批號(hào)021203)、石斛(批號(hào)021204)各約25kg，分別凈制，低溫干燥，粉碎機(jī)中打成粗粉(過二號(hào)篩)，備用。1.1.2操作方法分別準(zhǔn)確稱取上述四味藥材粗粉各100g，混合均勻，作為供試藥材，同樣操作準(zhǔn)備供試藥材共三份，作下述試驗(yàn)。第一份以70％乙醇滲漉提取，流速4ml/min，接收滲漉液4800ml，HPLC法測(cè)定樣品中綠原酸、肉桂酸、濱蒿內(nèi)酯的含量。第二份以70％乙醇回流提取二次。第一次用7倍量70％乙醇在攪拌下回流提取3小時(shí)，第二次加入5倍量70％乙醇在攪拌下回流提取2小時(shí)。合并二次乙醇提取液，同濃度乙醇定容，同上測(cè)定樣品中綠原酸、肉桂酸、濱蒿內(nèi)酯的含量。第三份以水煎煮提取二次。第一次以7倍量水在攪拌下煎煮提取3小時(shí)，第二次加入5倍量水在攪拌下煎煮提取2小時(shí)。合并二次水提取液，以蒸餾水定容后同上測(cè)定樣品中綠原酸、肉桂酸、濱蒿內(nèi)酯的含量。1.1.3結(jié)果三組實(shí)驗(yàn)提取液測(cè)定體積和綠原酸、肉桂酸、濱蒿內(nèi)酯的含量，計(jì)算提取率及各活性成分的綜合提取率。結(jié)果如表1所示。表1三種提取方法的對(duì)比注綜合提取率＝綠原酸提取率×0.4+肉桂酸提取率×0.4+濱蒿內(nèi)酯提取率×0.2由表1可見，以70％乙醇滲漉提取，各指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率及各成分綜合提取率均高于其它兩種提取方式，而固形物的收率較低，因此乙醇滲漉法同現(xiàn)有技術(shù)常用的乙醇回流或者水煎煮法相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)，采取乙醇滲漉法為宜。1.2萃取工藝研究1.2.1正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方中活性成分大多偏酸性，中等極性，可調(diào)節(jié)其水溶液至偏酸性，使各成分在游離狀態(tài)下用乙酸乙酯萃取純化。影響萃取效果的主要因素有三個(gè)萃取的次數(shù)、溶液pH值及溶液相對(duì)密度。就此三個(gè)因素，各設(shè)立3個(gè)水平，萃取液回收乙酸乙酯至凈，定容，測(cè)定樣品中綠原酸、肉桂酸、濱蒿內(nèi)酯及固形物含量，每個(gè)因素各取三個(gè)水平以正交表L9(34)進(jìn)行三因素三水平的正交試驗(yàn)。表2因素水平表1.2.2樣品的制備將水沉溶液樣品1分別準(zhǔn)確量取1000ml，九份。按表2因素水平表進(jìn)行試驗(yàn)，以溶液等量的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，收集萃取液，減壓回收乙酸乙酯至凈，定容，備用。1.2.3指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率和固形物收率的測(cè)定取上述各樣品，HPLC法測(cè)定綠原酸、肉桂酸、濱蒿內(nèi)酯及固形物的轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見表3。表3正交試驗(yàn)表及結(jié)果注綜合評(píng)分＝綠原酸轉(zhuǎn)移率×0.4+肉桂酸轉(zhuǎn)移率×0.4+濱蒿內(nèi)酯轉(zhuǎn)移率×0.21.2.4結(jié)果分析由表3直觀法分析R值可知，影響萃取轉(zhuǎn)移率的因素從大到小依次為A＞B＞C，A因素中水平的重要性依次為A3＞A2＞A1；B因素中各水平的重要性依次為B3＞B2＞B1；C因素中水平的重要性依次為C2＞C3＞C1，最佳條件應(yīng)為A3B3C2；影響萃取的固形物收率的因素從大到小依次為C＞B＞A，A因素中水平的重要性依次為A3＞A2＞A1；B因素中各水平的重要性依次為B1＞B2＞B3；C因素中水平的重要性依次為C3＞C1＞C2，最佳條件應(yīng)為A3B1C3。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4和表5表4綜合評(píng)分方差分析表F1-0.05(2，2)＝19.00F1-0.01(2，2)＝99.00表5固形物方差分析表F1-0.05(2，2)＝19.00F1-0.01(2，2)＝99.00由方差分析可知，因素A，B，C水平間差異均有顯著性意義，A3＞A2＞A1，B3＞B2＞B1，C2＞C3＞C1，優(yōu)選條件A3B3C2；影響固形物收率的因素A，B，C有顯著性，A因素中水平的重要性依次為A3＞A2＞A1；B因素中各水平的重要性依次為B1＞B2＞B3；C因素中水平的重要性依次為C3＞C1＞C2，最佳條件應(yīng)為A3B1C3。由結(jié)果可以看出固形物收率影響較小，活性成分轉(zhuǎn)移率應(yīng)是考慮的主要因素。因此綜合考慮成分轉(zhuǎn)移率和純度兩個(gè)指標(biāo)，最優(yōu)選A3B3C2，即取水沉液濃縮至相對(duì)密度1.15(50℃)，過濾后20％鹽酸調(diào)節(jié)pH值至1～2，等倍量乙酸乙酯萃取6次。2.制劑工藝研究2.1超濾工藝研究本品提取物水溶解后顏色呈深棕色，且含有微量樹脂、鞣質(zhì)類雜質(zhì)，可利用活性成分與這些雜質(zhì)成分分子量的不同，選用超濾法除去色素類大分子物質(zhì)及相關(guān)雜質(zhì)，選擇截留分子量5000的超濾膜進(jìn)行試驗(yàn)。取本品提取物三份，每份50g，加注射用水300ml，加熱使溶解，并繼續(xù)煮沸10分鐘，溶液自然放冷，冷藏24h后微孔濾膜濾過，濾液以截留分子量為5000的超濾膜超濾，當(dāng)回流濃縮液至約50ml，濾過通量明顯下降時(shí)，加入回流濃縮液等量注射用水繼續(xù)超濾，如此重復(fù)兩次，收集超濾液并以注射用水定容至400ml。HPLC法測(cè)定超濾液中綠原酸、肉桂酸、濱蒿內(nèi)酯及總固形物的含量，結(jié)果見表6。表6超濾前后指標(biāo)成分的轉(zhuǎn)移率和固形物收率超濾前后的溶液分別按《中國(guó)藥典》方法檢測(cè)樹脂、鞣制、蛋白質(zhì)項(xiàng)，結(jié)果見表15所示。表7超濾前后檢測(cè)項(xiàng)目結(jié)果的對(duì)比結(jié)果表明本品經(jīng)超濾后所檢測(cè)的相關(guān)物質(zhì)均能達(dá)到中藥注射劑的要求，溶液色澤、澄明度得到明顯改善，而活性成分轉(zhuǎn)移率均能達(dá)到90％以上，工藝可行。2.2凍干支架劑的選擇及其用量的確定本品溶液中總固體含量較低，在凍干過程中，容易出現(xiàn)藥物與水蒸氣飛散的現(xiàn)象，從而在凍干過程中使藥物呈結(jié)構(gòu)松散的絨毛狀，藥物移出凍干箱后又很快消散而萎縮，藥物外觀質(zhì)量差。因此，必須加入一定量的支架劑以改善其外觀品質(zhì)。根據(jù)本品活性成分及其作用特點(diǎn)，選擇加入甘露醇為支架劑，并對(duì)此進(jìn)行研究。取前述超濾液150ml，分成三等份，分別加入甘露醇4g、5.5g、7g攪拌使溶解，濾過，濾液灌注于7ml西林瓶中，每瓶3ml，置凍干機(jī)里試凍干，結(jié)果如表8所示。表8凍干支架劑用量選擇表結(jié)果表明，本品支架劑用量在11％以上時(shí)，凍干品成形良好，色澤均勻，因此凍干支架劑用量選擇為溶液總量的11％。本發(fā)明的脈絡(luò)寧注射用粉針劑采用簡(jiǎn)潔、適合工業(yè)化生產(chǎn)的制備工藝提高了有效成分的提取率，節(jié)省了藥材用量，最大程度去除雜質(zhì)，且粉針制劑更加穩(wěn)定，克服了液體制劑中不穩(wěn)定的有效成分降解、絮凝等問題的出現(xiàn)，從而保證了制劑更加安全、有效。為了更好的理解本發(fā)明，以下通過實(shí)驗(yàn)例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明藥物的有益效果，實(shí)驗(yàn)例包括本發(fā)明藥物的藥效學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)與穩(wěn)定性試驗(yàn)。下面試驗(yàn)旨在進(jìn)一步說明本發(fā)明藥物的作用，而非對(duì)本發(fā)明的限制。本實(shí)驗(yàn)例采用的發(fā)明藥物是按實(shí)施例15制備而成。藥效學(xué)試驗(yàn)1.實(shí)驗(yàn)材料1.1藥品受試藥物脈絡(luò)寧凍干粉，由貴陽(yáng)懋源醫(yī)藥科技有限公司提供，規(guī)格8.2g生藥/ml，生產(chǎn)批號(hào)031028。陽(yáng)性對(duì)照藥脈絡(luò)寧注射液，金陵藥業(yè)股份有限公司南京金陵制藥廠產(chǎn)品，生產(chǎn)批號(hào)200312072，國(guó)家準(zhǔn)字Z32021102；香丹注射液，江蘇康怡制藥有限公司產(chǎn)品，生產(chǎn)批號(hào)0307101，國(guó)家準(zhǔn)字Z32020159。陰性對(duì)照氯化鈉注射液，由江西制藥有限責(zé)任公司產(chǎn)品，批號(hào)030710-1。1.2試劑氯代三苯基四氮唑(紅四氮唑或TTC)，由Fluka產(chǎn)品，瑞士分裝，規(guī)格10g/瓶；白色粉末，用生理鹽水配置成2％溶液備用。多聚甲醛，天津市化學(xué)試劑研究所，批號(hào)20020308，規(guī)格10g/瓶；水合氯醛，五聯(lián)化工廠(中國(guó)上海)，批號(hào)w20021122，規(guī)格250g/瓶；磷酸氫二鈉，廣州新成化工廠產(chǎn)品，批號(hào)20020308，規(guī)格500g/瓶；磷酸二氫鈉，北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，批號(hào)20020308，規(guī)格500g/瓶。ADP，Sigma公司產(chǎn)品，終濃度為35μmol/L。SOD、MDA試劑盒，均有南京建成生物生物工程公司產(chǎn)品。1.3儀器DH-150人工動(dòng)物呼吸機(jī)，浙江大學(xué)儀器廠產(chǎn)品；電熱恒溫干燥箱，長(zhǎng)沙醫(yī)療器械廠；B12000醫(yī)學(xué)圖象系統(tǒng)，四川省成都泰盟科技有限公司；TYXN-91型智能血小板聚集儀(上海伯奧生物科技有限公司)；LDZ5-2離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；SystemCA-530血凝儀(日本)。尼龍線，活力牌，直徑為0.205或0.235mm，由臺(tái)灣產(chǎn)；微型動(dòng)脈夾等。1.4動(dòng)物清潔級(jí)昆明種小鼠，體重18-22g，雌雄各半，合格證號(hào)2001A030；清潔級(jí)SD大鼠，雄性體重240-280g，合格證號(hào)2001A029；新西蘭大白兔，體重1.5-2.5kg，雌雄不限，合格證號(hào)2001A033；以上均由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心產(chǎn)品。1.5劑量設(shè)置通過本發(fā)明藥物對(duì)小鼠全腦缺血缺氧(小鼠斷頭呼吸時(shí)間和次數(shù))以及凝血時(shí)間的影響預(yù)試得出14.6g生藥/kg為較佳有效劑量，取其1/2為低劑量，2倍為高劑量，低、中、高劑量分別為7.3、14.6、29.2g生藥/kg。通過體表面積折算得，大鼠低、中、高劑量分別為5.0、10.0、20.0g生藥/kg。脈絡(luò)寧注射液，人用量為15ml/天，通過體表面積換算，小鼠約為1.95ml/kg，大鼠約為1.35ml/kg；香丹注射液香丹注射液，人用量為20ml/天，通過體表面積換算，小鼠約為2.6ml/kg，大鼠約為1.8ml/kg。藥物稀釋方法、給藥途徑及體積取同一批號(hào)的各實(shí)驗(yàn)所用藥品，用生理鹽水配制，每日現(xiàn)配制現(xiàn)用。給藥途徑靜脈注射或腹腔注射。各種單位給藥容積分別為小鼠為0.15ml/10g體重；大鼠為0.4mV100g體重。1.6數(shù)據(jù)處理所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示。計(jì)量數(shù)據(jù)由SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析及組間檢驗(yàn)。2.方法與結(jié)果2.1對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈栓線法局灶性腦缺血(MCAO)再灌注損傷模型的治療作用2.1.1分組及給藥取雄性SD大鼠，按隨機(jī)分組原則分成7組，分別為假手術(shù)組(生理鹽水)、模型組(生理鹽水)、脈絡(luò)寧凍干粉低(5.0g生藥/kg)、中(10.0g生藥/kg)、高(20.0g生藥/kg)劑量組、脈絡(luò)寧注射液(1.35mg/kg)組和香丹注射液(1.8ml/kg)組。藥物用生理鹽水配制成相應(yīng)的濃度，使給藥體積均為0.4ml/100g大鼠。預(yù)先腹腔注射(ip)給藥兩次，分兩天，一天各一次。造模前0.5h先靜脈注射(iv)給藥1次；造模后6h和12h分別進(jìn)行第2、3次給藥(ip)，即總共給藥5次。模型組和假手術(shù)組大鼠給予生理鹽水，給藥時(shí)間及體積同上。2.1.2造模方法將大鼠用10％水合氯醛3.5ml/kg腹腔注射麻醉，頸正中切口，分離、結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及其分支動(dòng)脈。在頸內(nèi)動(dòng)脈近端備線、遠(yuǎn)端放置動(dòng)脈夾，頸總動(dòng)脈分叉處切口，插入4-0尼龍線，其深度為17～20mm，栓線進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，入顱至大腦前動(dòng)脈，阻斷大腦中動(dòng)脈所有血流來源。撤掉動(dòng)脈夾，扎緊備線，剪去多余線頭，傷口以碘伏消毒，最后縫合皮膚，手術(shù)完畢回籠飼養(yǎng)。假手術(shù)組除不插線外，其余步驟同上。其余各組大鼠按上述手術(shù)方法造模。造模成功的標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物手術(shù)后有明顯手術(shù)側(cè)(即左側(cè))Horner癥(左側(cè)眼瞼下垂，眼球凹陷)及手術(shù)側(cè)(即左側(cè))偏癱體癥(不能完全伸展左前肢，行走時(shí)向左側(cè)傾倒或轉(zhuǎn)圈)。依上述標(biāo)準(zhǔn)將能夠存活24h的大鼠確定為最后的實(shí)驗(yàn)對(duì)象，并進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分及快速斷頭取腦。2.1.3觀察指標(biāo)2.1.3.1行為學(xué)評(píng)分存活24h大鼠，觀察大鼠行為學(xué)變化，進(jìn)行神經(jīng)病學(xué)評(píng)分。參考ZeaLonga的5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)0分，無神經(jīng)損傷癥狀；1分，不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分，向外側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，向?qū)?cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。2.1.3.2腦含水量測(cè)定神經(jīng)病學(xué)評(píng)分后，快速斷頭取鼠大腦。取左側(cè)半腦后半部分分別稱濕重，置120℃烤箱烘干至恒重，按以下公式計(jì)算腦組織含水量，腦組織含水量(％)＝(濕重-干重)/濕重×100％。2.1.3.3腦組織勻漿測(cè)定生化指標(biāo)腦組織勻漿液的制備迅速斷頭取腦，取左側(cè)半腦前半部分放于液氮中保存待測(cè)。從液氮中取出半腦同一部位稱取100mg，后置于9倍的生理鹽水中，用研磨器于冰塊上研磨，制成100％(W/V)腦勻漿液，3500轉(zhuǎn)/min，離心10min。檢測(cè)腦組織中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的水平或含量。檢測(cè)方法MDA測(cè)定采用硫代巴比妥酸法，SOD活力檢測(cè)采用黃嘌呤氧化法。2.1.3.4腦梗塞范圍的測(cè)定造模后24h每組取8只大鼠，快速取全腦，去掉嗅球、小腦和低位腦干，冰凍25分鐘。然后冠狀切四刀，將全腦切成五片。第一刀位于腦前極與視交叉連線中點(diǎn)處，第二刀位于視交叉，第三刀在漏斗部，第四刀在漏斗柄與葉尾極之間。接著迅速將腦片置2％紅四氮唑(TTC)中，避光，37℃溫孵30分鐘，其間每隔7～8min翻動(dòng)一次，染色后以4％多聚甲醛固定。染色結(jié)果正常組織呈紅色，梗塞組織呈白色。拍照并用BI2000醫(yī)學(xué)圖象分析系統(tǒng)計(jì)算腦梗塞面積百分比。2.1.3.5病理檢查造模后24h每組取8只大鼠腦，于視交叉處行冠狀切面取左側(cè)腦中間一部分放入4％多聚甲醛磷酸鹽緩沖液保存超過48h。每個(gè)組織塊均酒精梯度脫水，石蠟包埋，切片厚約4μm，進(jìn)行HE染色。光鏡下觀察腦組織病理學(xué)變化。2.1.4結(jié)果2.1.4.1行為學(xué)評(píng)分結(jié)果MCAO大鼠麻醉清醒后出現(xiàn)中風(fēng)體征，表現(xiàn)為不同程度的手術(shù)對(duì)側(cè)前肢內(nèi)收，肩內(nèi)旋，肌張力降低，推右肩向?qū)?cè)移動(dòng)，抵抗阻力降低，還出現(xiàn)不停地向一側(cè)轉(zhuǎn)圈，甚至有些動(dòng)物出現(xiàn)向?qū)?cè)傾倒或不能自主活動(dòng)現(xiàn)象。下表1可見模型組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯高于假手術(shù)組，10.0、20.0g/kg脈絡(luò)寧凍干粉組、1.35mg/kg脈絡(luò)寧注射液組和1.8mg/kg香丹注射液組術(shù)后24h的行為評(píng)分明顯低于模型組大鼠(P＜0.05或P＜0.01)。表1對(duì)MCAO大鼠神經(jīng)行為學(xué)的影響()與模型組比較*P＜0.05；**P＜0.012.1.4.2對(duì)腦組織含水量的影響下表2可見模型組腦含水量顯著高于假手術(shù)組；脈絡(luò)寧凍干粉10.0g/kg、20.0g/kg組、脈絡(luò)寧注射液組與香丹注射液組腦含水量顯著低于模型對(duì)照組(P＜0.05或P＜0.01)，脈絡(luò)寧凍干粉5.0g/kg組的腦含水量有降低作用，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表2對(duì)MCAO大鼠腦含水量的影響()與模型組比較*P＜0.05；**P＜0.012.1.4.3對(duì)腦組織中SOD和MDA含量的影響下表3可見模型組腦組織SOD活性明顯降低，MDA含量明顯提高，與假手術(shù)相比較均有顯著性差異(P＜0.01)。脈絡(luò)寧凍干粉各劑量組與模型對(duì)照組比較，SOD活性明顯升高，MDA含量顯著下降(P＜0.05或P＜0.01)；兩個(gè)陽(yáng)性對(duì)照組也使損傷腦組織中SOD明顯升高，MDA顯著下降。表3對(duì)MCAO大鼠腦組織中SOD和MDA含量的影響(n＝8)<tablesid="table12"num="012"><tablewidth="682">組別劑量(g/kg)MDA含量(％)SOD含量假手術(shù)組模型對(duì)照組脈絡(luò)寧凍干粉組脈絡(luò)寧注射液組香丹注射液組--5.010.020.01.35ml1.8ml27.08±6.98**44.30±6.9137.40±5.36*33.76±5.58**30.76±6.06**32.07±5.51**34.26±4.55*P＜0.05；146.00±15.75**85.55±20.02100.34±19.80114.20±17.46**126.82±19.35**119.43±18.65**112.04±24.49*</table></tables>與模型組比較*P＜0.05；**P＜0.012.1.4.4對(duì)大鼠腦梗塞范圍的影響本實(shí)驗(yàn)是腦梗塞后24h利用TTC染色技術(shù)檢查腦梗塞程度，染色結(jié)果顯示造模組大鼠呈不同程度的梗死。由表4可見模型組大鼠腦缺血24h后腦組織梗塞程度明顯，脈絡(luò)寧凍干粉5.0、10.0、20.0g/kg組，脈絡(luò)寧注射液和香丹注射液給藥后，使腦梗塞面積百分比明顯下降(P＜0.05或P＜0.01)。假手術(shù)組動(dòng)物未見腦梗塞發(fā)生。表4對(duì)MCAO大鼠腦梗死面積的影響()<tablesid="table13"num="013"><tablewidth="688">組別劑量(g/kg)動(dòng)物數(shù)腦梗死面積(％)假手術(shù)組模型對(duì)照組脈絡(luò)寧凍干粉組脈絡(luò)寧注射液組香丹注射液組--5.010.020.01.35ml1.8ml88888880.50±0.53**35.51±8.5629.83±9.4425.59±6.49*23.16±5.15**26.28±6.21*24.36±6.26*</table></tables>與模型組比較*P＜0.05；**P＜0.012.1.4.5組織形態(tài)學(xué)變化及脈絡(luò)寧凍干粉的影響大鼠經(jīng)腦栓塞術(shù)后24h，病灶側(cè)腦呈表面蒼白、無光等缺血異常改變，假手術(shù)組則無異常改變。鏡下各組大鼠腦組織病理學(xué)改變?nèi)缦录偈中g(shù)組神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，無明顯水腫。神經(jīng)細(xì)胞的胞漿豐富，核膜清楚，核仁清晰，可見尼氏小體。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞核仁清晰，腦漿透亮或淡染，小血管、毛細(xì)血管周圍間隙極小；有2例腦細(xì)胞呈輕度腫脹變性。模型對(duì)照組腦組織病變區(qū)域較多，間質(zhì)疏松，水腫明顯，水腫區(qū)域的神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、小血管及毛細(xì)血管周圍間隙明顯變寬，多數(shù)細(xì)胞腫脹變形、著色加深，尼氏小體消失，胞漿、胞核界線明顯不清，部分細(xì)胞胞核呈不規(guī)則形，核膜模糊，核仁不清或消失。腦組織毛細(xì)血管充血，有少量紅細(xì)胞外漏至腦組織，可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。脈絡(luò)寧低劑量5.0g(生藥)/kg組比模型組病變略有改善，腦組織神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、小血管及毛細(xì)血管周圍間隙變寬，細(xì)胞明顯腫脹，染色加深，尼氏小體消失，部分細(xì)胞核固縮，核膜模糊，核仁不清。腦組織毛細(xì)血管充血，有少量紅細(xì)胞外漏至腦組織，可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)?？梢娧装Y細(xì)胞浸潤(rùn)。脈絡(luò)寧中劑量10.0g(生藥)/kg組比模型組病變有較明顯的改善，腦組織神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、小血管及毛細(xì)血管周圍間隙輕、中度變寬，部分細(xì)胞輕度或中度腫脹，胞核和胞漿有些不清，核仁比較模糊。脈絡(luò)寧高劑量20.0g(生藥)/kg組比模型組病變有明顯的改善，腦組織神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、小血管及毛細(xì)血管周圍間隙略變寬，多數(shù)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)接近正常，部分細(xì)胞呈輕度或中度腫脹，胞核和胞漿有些不清，核仁比較模糊，偶見尼氏小體。脈絡(luò)寧注射液1.35ml/kg組腦組織病理形態(tài)改善，其神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、小血管及毛細(xì)血管周圍間隙輕度增寬，神經(jīng)細(xì)胞腫脹較模型組明顯減輕。香丹注射液(1.8ml/kg)組比模型組病變有明顯的改善，腦組織神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、小血管及毛細(xì)血管周圍間隙變寬，部分細(xì)胞呈輕度或中度腫脹，胞核和胞漿有些不清，核仁比較模糊。結(jié)論同模型組比較，脈絡(luò)寧低、中、高劑量組對(duì)MCAO大鼠腦組織和神經(jīng)細(xì)胞的病理?yè)p傷有良好的改善作用，以中、高劑量較為明顯。2.2脈絡(luò)寧凍干粉對(duì)小鼠急性腦缺氧的影響昆明種小鼠70只，體重18-22g，隨機(jī)分成7組，每組10只。受試藥組分別為脈絡(luò)寧凍干粉7.3g/kg、14.6g/kg、29.2g/kg，58.4g/kg組；陽(yáng)性對(duì)照藥香丹注射液2.6ml/kg和脈絡(luò)寧注射液1.95ml/kg；陰性對(duì)照組(給予等容量的生理鹽水)。腹腔注射給藥，共3次，每天1次，末次給藥后15min將小鼠逐只斷頭，立即按秒表記錄小鼠斷頭后至張口喘氣停止時(shí)間及張口次數(shù)作為耐缺氧指標(biāo)。結(jié)果表明，脈絡(luò)寧凍干粉14.6g/kg、29.2g/kg、58.4g/kg組和香丹注射液、脈絡(luò)寧注射液靜脈給藥后均能明顯延長(zhǎng)小鼠斷頭張口次數(shù)及喘息時(shí)間，與對(duì)照組比較呈顯著差異(P＜0.05或P＜0.01)。詳見表5。表5脈絡(luò)寧凍干粉對(duì)小鼠急性腦缺氧的影響(與生理鹽水組比較，*P＜0.05，2.3脈絡(luò)寧凍干粉對(duì)凝血時(shí)間、血小板聚集和血栓形成的影響2.3.1對(duì)小鼠凝血時(shí)間的影響昆明種小鼠84只，體重18-22g，雌雄兼用，按體重和性別隨機(jī)分成12組，給藥容積為0.15ml/10g體重。分別給予靜脈注射生理鹽水溶液，脈絡(luò)寧凍干粉7.3g/kg、14.6g/kg、29.2g/kg、58.4g/kg，香丹注射液(2.6ml/kg)，脈絡(luò)寧注射液1.95ml/kg。給藥后15min，眼球取血，玻片法測(cè)定凝血時(shí)間。由表6可見，脈絡(luò)寧凍干粉、14.6g/kg、29.2g/kg、58.4g/kg均有明顯的延長(zhǎng)小鼠凝血時(shí)間的作用(p＜0.05或P＜0.01)。香丹注射液與脈絡(luò)寧注射液組凝血時(shí)間明顯延長(zhǎng)(p＜0.05)。表6脈絡(luò)寧凍干粉對(duì)小鼠凝血時(shí)間的影響(n＝10)2.3.2對(duì)體外血小板聚集的影響家兔頸總動(dòng)脈放血，用硅化試管取血，以3.8％枸櫞酸鈉(1/10血量)抗凝，800r/min離心10分鐘，吸出上層富血小板血漿(PRP)，再以3000r/min離心，取出貧血小板血漿(PPP)。用PPP將透光度調(diào)到100，然后以PRP調(diào)零，加攪拌棒、加生理鹽水或脈絡(luò)寧凍干粉(0.1g、0.2g、0.4g/ml)及陽(yáng)性對(duì)照藥香丹注射液(0.05ml/ml)和脈絡(luò)寧注射液(0.02ml/ml)，37℃溫育。將PRP移至測(cè)定孔，加入ADP(終濃度為35μmol/L)，觀察5min最大聚集程度，儀器為TYXN-91型智能血小板聚集儀。計(jì)算血小板聚集百分率(Plateletaggregation，PAG))與抑制聚集百分率。由下表7可見，脈絡(luò)寧凍干粉對(duì)ADP誘導(dǎo)的家兔血小板聚集有明顯的抑制作用，隨著劑量的增大抑制作用逐漸增強(qiáng)，即其對(duì)ADP誘導(dǎo)的家兔血小板聚集的抑制作用有明顯的劑量依賴性。表7對(duì)ADP誘導(dǎo)的體外家兔血小板聚集的影響(n＝10)與緩沖液對(duì)照組比較，*為P＜0.05，**為P＜0.012.3.3對(duì)大鼠動(dòng)-靜脈旁路血栓形成的影響SD大鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只，10％水合氯醛3.5ml/kg腹腔注射(ip)麻醉固定，分別從舌下靜脈給予脈絡(luò)寧凍干粉5.0g/kg、10.0g/kg、20.0g/kg，藥香丹注射液2.6ml/kg和脈絡(luò)寧注射液1.95ml/kg組；對(duì)照組給予等容積的生理鹽水。于給藥后20min，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈和左側(cè)頸外靜脈。在聚乙烯管中段放入一根長(zhǎng)6cm4號(hào)絲線，用肝素生理鹽水溶液(50μl/ml)充滿聚乙烯管。當(dāng)聚乙烯管的一端插入左頸外靜脈后，另一端塑料管注入肝素(50μl/m)0.2ml抗凝，然后再將此端插入右側(cè)頸總動(dòng)脈。打開動(dòng)脈夾，讓血液從右側(cè)頸總動(dòng)脈流入管內(nèi)，返回左側(cè)頸外靜脈，開放血液15min后，中斷血流，迅速取出聚乙烯管中的血栓在分析天平上稱重，求出血栓抑制率。血栓抑制率＝[(對(duì)照組血栓濕重-給藥組血栓濕重)×100％]/對(duì)照組血栓濕重由下表8可見，脈絡(luò)寧凍干粉10.0g/kg、20.0g/kg組、香丹注射液組與模型組比較均能明顯抑制大鼠血栓形成(P＜0.05或P＜0.01)，脈絡(luò)寧注射液與5.0g/kg組有一定抑制作用，但沒有顯著差異。表8對(duì)大鼠頸總動(dòng)、靜脈搭橋形成血栓影響(n＝10)與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01結(jié)論脈絡(luò)寧凍干粉對(duì)大鼠腦栓塞具有良好的治療作用，改善腦栓塞所致大鼠的偏癱體證，縮小腦內(nèi)梗死面積，減輕腦水腫和神經(jīng)細(xì)胞的繼發(fā)性損害；有效延長(zhǎng)小鼠斷頭呼吸的時(shí)間，增加呼吸的次數(shù)；抑制血小板聚集，延長(zhǎng)凝血時(shí)間，對(duì)大鼠血栓形成具有明顯的抑制作用；表明脈絡(luò)寧凍干粉對(duì)腦中風(fēng)具有明顯的防治作用。穩(wěn)定性試驗(yàn)1.方法三批脈絡(luò)寧凍干粉樣品(批號(hào)分別為030515、030521、030526)以臨床試驗(yàn)用包裝(在包裝材料質(zhì)地與結(jié)構(gòu)上相當(dāng)于上市藥品的包裝)室溫放置，連續(xù)考察12個(gè)月，觀察其變異情況，取其平均值。2.結(jié)果結(jié)果見表9。表9三批樣品穩(wěn)定性研究結(jié)果下面通過具體實(shí)施例來解釋本發(fā)明，旨在進(jìn)一步說明本發(fā)明，不以任何形式對(duì)本發(fā)明構(gòu)成限制。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1提取物的制備及含量測(cè)定提取物的制備取2500g石斛、5000g玄參、7500g牛膝、5000g金銀花粉碎成粗粉，用60％乙醇以250ml/min速度滲漉提取，收集8倍生藥量的滲漉液，低溫減壓回收乙醇，減壓濃縮至50℃下相對(duì)密度為1.10的浸膏，離心去除不溶性雜質(zhì)，加8倍量水，充分?jǐn)嚢?，靜置過夜，過濾，濾液減壓濃縮至50℃下相對(duì)密度為1.05的浸膏，過濾，去除沉淀，調(diào)節(jié)pH值至3～4，等體積乙酸乙酯萃取8次，合并萃取液，回收乙酸乙酯，60℃真空干燥得提取物365g。含量測(cè)定照《中國(guó)藥典》2000年版一部高效液相色譜法(中國(guó)藥典2000年版一部附錄VID)測(cè)定。供試品溶液制備精密稱取提取物0.1g，加甲醇超聲溶解兩次，濾過，濾液轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，補(bǔ)充甲醇至刻度作為供試品溶液。綠原酸含量測(cè)定色譜條件DiamonsilC18，5μm，250×4.6mm；流動(dòng)相∶乙腈-0.1％H3PO4水溶液(11∶89)；柱溫30C；流速1ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)327nm。理論板數(shù)按綠原酸對(duì)照品峰計(jì)大于3000。綠原酸對(duì)照品溶液的配制精確稱取綠原酸對(duì)照品4.56mg，加甲醇定容到100ml，精密吸取1ml至10ml容量瓶中，甲醇稀釋至刻度即得。測(cè)定法分別精密取對(duì)照品與供試品溶液各10ul注入高效液相色譜儀測(cè)定，提取物中綠原酸含量為15.2％。肉桂酸含量測(cè)定色譜條件DiamonsilC18，5μm，250×4.6mm；流動(dòng)相∶乙腈-0.1％H3PO4水溶液(28∶72)；柱溫30℃；流速1ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)276nm。，理論板數(shù)按肉桂酸對(duì)照品峰計(jì)大于3000。肉桂酸對(duì)照品溶液的配制精密稱取肉桂酸對(duì)照品4.49mg，用甲醇定容到50ml，精密吸取1ml至10ml容量瓶中，甲醇稀釋至刻度即得。測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10ul注入高效液相色譜儀依法測(cè)定，提取物中肉桂酸的含量為0.05％。濱蒿內(nèi)酯含量測(cè)定色譜條件DiamonsilC18，5μm，250×4.6mm(迪馬公司產(chǎn))；流動(dòng)相∶乙腈-水(30∶70)；柱溫30℃；流速1ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)290nm。理論板數(shù)按濱蒿內(nèi)酯對(duì)照品峰計(jì)大于3000。濱蒿內(nèi)酯對(duì)照品溶液的配制精密稱取濱蒿內(nèi)酯對(duì)照品2.79mg，加甲醇定容到100ml即得。測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10ul注入高效液相色譜儀依法測(cè)定，提取物中濱蒿內(nèi)酯的含量為0.05％。實(shí)施例2提取物的制備取5000g石斛、5000g玄參、5000g牛膝、5000g金銀花粉碎成粗粉，用70％乙醇以300ml/min速度滲漉提取，收集10倍生藥量的滲漉液，低溫減壓回收乙醇，減壓濃縮至50℃下相對(duì)密度為1.15的浸膏，離心去除不溶性雜質(zhì)，加8倍量水，充分?jǐn)嚢瑁o置過夜，過濾，濾液減壓濃縮至50℃下相對(duì)密度為1.15的浸膏，過濾，去除沉淀，調(diào)節(jié)pH值至5～6，等體積乙酸乙酯萃取8次，合并萃取液，回收乙酸乙酯，50℃真空干燥得提取物320g。以實(shí)施例1的測(cè)定方法測(cè)定，其中綠原酸含量為11.3％，肉桂酸含量為0.10％，濱蒿內(nèi)酯含量為0.06％。實(shí)施例3提取物的制備取8000g石斛、2000g玄參、4000g牛膝、6000g金銀花粉碎成粗粉，用80乙醇以200ml/min速度滲漉提取，收集12倍生藥量的滲漉液，低溫減壓回收乙醇，減壓濃縮至50℃下相對(duì)密度為1.20的浸膏，離心去除不溶性雜質(zhì)，加8倍量水，充分?jǐn)嚢瑁o置過夜，過濾，濾液減壓濃縮至50℃下相對(duì)密度為1.15的浸膏，過濾，去除沉淀，調(diào)節(jié)pH值至1～2，等體積乙酸乙酯萃取10次，合并萃取液，回收乙酸乙酯，50℃真空干燥得提取物352g。以實(shí)施例1的測(cè)定方法測(cè)定，其中綠原酸含量為9.8％，肉桂酸含量為0.11％，濱蒿內(nèi)酯含量為0.06％。實(shí)施例4提取物的制備取2500g石斛、6000g玄參、5500g牛膝、6000g金銀花粉碎成粗粉，用90％乙醇以200ml/min速度滲漉提取，收集12倍生藥量的滲漉液，低溫減壓回收乙醇，減壓濃縮至50℃下相對(duì)密度為1.20的浸膏，離心去除不溶性雜質(zhì)，加8倍量水，充分?jǐn)嚢?，靜置過夜，過濾，濾液減壓濃縮至50℃下相對(duì)密度為1.20的浸膏，過濾，去除沉淀，調(diào)節(jié)pH值至3～4，等體積乙酸乙酯萃取6次，合并萃取液，回收乙酸乙酯，50℃真空干燥得提取物343g。以實(shí)施例1的測(cè)定方法測(cè)定，其中綠原酸含量為16.6％，肉桂酸含量為0.15％，濱蒿內(nèi)酯含量為0.07％。實(shí)施例5提取物的制備取5000g石斛、5000g玄參、5000g牛膝、5000g金銀花粉碎成粗粉，用70％乙醇以100ml/min速度滲漉提取，收集12倍生藥量的滲漉液，低溫減壓回收乙醇，減壓濃縮至50℃下相對(duì)密度為1.20的浸膏，離心去除不溶性雜質(zhì)，加6倍量水，充分?jǐn)嚢?，靜置過夜，過濾，濾液減壓濃縮至50℃下相對(duì)密度為1.20的浸膏，過濾，去除沉淀，調(diào)節(jié)pH值至1～2，等體積乙酸乙酯萃取6次，合并萃取液，回收乙酸乙酯，60℃真空干燥得提取物345g。以實(shí)施例1的測(cè)定方法測(cè)定，其中綠原酸含量為18.1％，肉桂酸含量為0.08％，濱蒿內(nèi)酯含量為0.12％。實(shí)施例6提取物的制備取3500g石斛、4000g玄參、6500g牛膝、6000g金銀花粉碎成粗粉，用80％乙醇以250ml/min速度滲漉提取，收集16倍生藥量的滲漉液，低溫減壓回收乙醇，減壓濃縮至50℃下相對(duì)密度為1.30的浸膏，離心去除不溶性雜質(zhì)，加6倍量水，充分?jǐn)嚢瑁o置過夜，過濾，濾液減壓濃縮至50℃下相對(duì)密度為1.20的浸膏，過濾，去除沉淀，調(diào)節(jié)pH值至1～2，等體積乙酸乙酯萃取8次，合并萃取液，回收乙酸乙酯，50℃真空干燥得提取物367g。以實(shí)施例1的測(cè)定方法測(cè)定，其中綠原酸含量為15.3％，肉桂酸含量為0.10％，濱蒿內(nèi)酯含量為0.08％。實(shí)施例7提取物的制備取4500g石斛、5500g玄參、8000g牛膝、2000g金銀花粉碎成粗粉，用55％乙醇以200ml/min速度滲漉提取，收集14倍生藥量的滲漉液，低溫減壓回收乙醇，減壓濃縮至50℃下相對(duì)密度為1.35的浸膏，離心去除不溶性雜質(zhì)，加4倍量水，充分?jǐn)嚢?，靜置過夜，過濾，濾液減壓濃縮至50℃下相對(duì)密度為1.20的浸膏，過濾，去除沉淀，調(diào)節(jié)pH值至1～2，等體積乙酸乙酯萃取6次，合并萃取液，回收乙酸乙酯，70℃真空干燥得提取物333g。以實(shí)施例1的測(cè)定方法測(cè)定，其中綠原酸含量為17.8％，肉桂酸含量為0.07％，濱蒿內(nèi)酯含量為0.06％。實(shí)施例8提取物的制備取4000g石斛、8000g玄參、3000g牛膝、5000g金銀花粉碎成粗粉，用60％乙醇以200ml/min速度滲漉提取，收集12倍生藥量的滲漉液，低溫減壓回收乙醇，減壓濃縮至50℃下相對(duì)密度為1.35的浸膏，離心去除不溶性雜質(zhì)，加8倍量水，充分?jǐn)嚢瑁o置過夜，過濾，濾液減壓濃縮至50℃下相對(duì)密度為1.05的浸膏，過濾，去除沉淀，調(diào)節(jié)pH值至1～2，等體積乙酸乙酯萃取4次，合并萃取液，回收乙酸乙酯，60℃真空干燥得提取物365g。以實(shí)施例1的測(cè)定方法測(cè)定，其中綠原酸含量為14.4％，肉桂酸含量為0.09％，濱蒿內(nèi)酯含量為0.07％。實(shí)施例9提取物的制備取3000g石斛、6000g玄參、6000g牛膝、5000g金銀花粉碎成粗粉，用70％乙醇以300ml/min速度滲漉提取，收集12倍生藥量的滲漉液，低溫減壓回收乙醇，減壓濃縮至50℃下相對(duì)密度為1.20的浸膏，離心去除不溶性雜質(zhì)，加8倍量水，充分?jǐn)嚢?，靜置過夜，過濾，濾液減壓濃縮至50℃下相對(duì)密度為1.15的浸膏，過濾，去除沉淀，調(diào)節(jié)pH值至1～2，等體積乙酸乙酯萃取8次，合并萃取液，回收乙酸乙酯，50℃真空干燥得提取物338g。以實(shí)施例1的測(cè)定方法測(cè)定，其中綠原酸含量為12.4％，肉桂酸含量為0.08％，濱蒿內(nèi)酯含量為0.06％。實(shí)施例10提取物的制備取3000g石斛、8000g玄參、4500g牛膝、4500g金銀花粉碎成粗粉，用70％乙醇以150ml/min速度滲漉提取，收集16倍生藥量的滲漉液，低溫減壓回收乙醇，減壓濃縮至50℃下相對(duì)密度為1.25的浸膏，離心去除不溶性雜質(zhì)，加8倍量水，充分?jǐn)嚢?，靜置過夜，過濾，濾液減壓濃縮至50℃下相對(duì)密度為1.05的浸膏，過濾，去除沉淀，調(diào)節(jié)pH值至1～2，等體積乙酸乙酯萃取6次，合并萃取液，回收乙酸乙酯，50℃真空干燥得提取物355g。以實(shí)施例1的測(cè)定方法測(cè)定，其中綠原酸含量為10.4％，肉桂酸含量為0.05％，濱蒿內(nèi)酯含量為0.05％。實(shí)施例11脈絡(luò)寧凍干粉的制備實(shí)施例1的提取物中加注射用水2000ml加熱煮沸8分鐘，自然放冷，冷藏，過濾，濾液以截留分子量為5000的超濾膜超濾，收集超濾液，濾液中加入甘露醇200g，PVP2g，補(bǔ)加注射用水至3000ml，調(diào)pH值6.5～7.0，除菌過濾，濾液分裝于西林瓶中，加塞，冷凍干燥，包裝，得凍干粉針劑1000支。實(shí)施例12脈絡(luò)寧凍干粉的制備實(shí)施例1的提取物中加注射用水2000ml加熱煮沸10分鐘，自然放冷，冷藏，過濾，濾液以截留分子量為6000的超濾膜超濾，收集超濾液，濾液中加入甘露醇280g，PVP3g，補(bǔ)加注射用水至3000ml，調(diào)pH值6.5～7.0，除菌過濾，濾液分裝于西林瓶中，加塞，冷凍干燥，包裝，得凍干粉針劑1000支。實(shí)施例13脈絡(luò)寧凍干粉的制備實(shí)施例5的提取物中加注射用水2000ml加熱煮沸10分鐘，自然放冷，冷藏，過濾，濾液以截留分子量為7000的超濾膜超濾，收集超濾液，濾液中加入甘露醇300g，乳糖30g，補(bǔ)加注射用水至3000ml，調(diào)pH值6.5～7.0，除菌過濾，濾液分裝于西林瓶中，加塞，冷凍干燥，包裝，得凍干粉針劑1000支。實(shí)施例14脈絡(luò)寧凍干粉的制備實(shí)施例6的提取物中加注射用水2000ml加熱煮沸12分鐘，自然放冷，冷藏，過濾，濾液以截留分子量為5000的超濾膜超濾，收集超濾液，濾液中加入右旋糖苷300g，PVP8g，補(bǔ)加注射用水至3000ml，調(diào)pH值6.5～7.0，除菌過濾，濾液分裝于西林瓶中，加塞，冷凍干燥，包裝，得凍干粉針劑1000支。實(shí)施例15脈絡(luò)寧凍干粉的制備實(shí)施例5的提取物中加注射用水2000ml加熱煮沸10分鐘，自然放冷，冷藏，過濾，濾液以截留分子量為5000的超濾膜超濾，收集超濾液，濾液中加入甘露醇330g，PVP6g，補(bǔ)加注射用水至3000ml，調(diào)pH值6.5～7.0，除菌過濾，濾液分裝于西林瓶中，加塞，冷凍干燥，包裝，得凍干粉針劑1000支。實(shí)施例16脈絡(luò)寧凍干粉的制備實(shí)施例8的提取物中加注射用水2000ml加熱煮沸15分鐘，自然放冷，冷藏，過濾，濾液以截留分子量為7000的超濾膜超濾，收集超濾液，濾液中加入甘露醇260g，葡萄糖50g，補(bǔ)加注射用水至3000ml，調(diào)pH值6.5～7.0，除菌過濾，濾液分裝于西林瓶中，加塞，冷凍干燥，包裝，得凍干粉針劑1000支。實(shí)施例17脈絡(luò)寧凍干粉的制備實(shí)施例2的提取物中加注射用水2000ml加熱煮沸10分鐘，自然放冷，冷藏，過濾，濾液以截留分子量為5000的超濾膜超濾，收集超濾液，濾液中加入乳糖150g，右旋糖苷150g，PVP8g，補(bǔ)加注射用水至3000ml，調(diào)pH值6.5～7.0，除菌過濾，濾液分裝于西林瓶中，加塞，冷凍干燥，包裝，得凍干粉針劑1000支。實(shí)施例18脈絡(luò)寧凍干粉的制備實(shí)施例3的提取物中加注射用水2000ml加熱煮沸12分鐘，自然放冷，冷藏，過濾，濾液以截留分子量為5500的超濾膜超濾，收集超濾液，濾液中加入右旋糖苷350g，補(bǔ)加注射用水至3000ml，調(diào)pH值6.5～7.0，除菌過濾，濾液分裝于西林瓶中，加塞，冷凍干燥，包裝，得凍干粉針劑1000支。實(shí)施例19脈絡(luò)寧凍干粉的制備實(shí)施例5的提取物中加注射用水2000ml加熱煮沸10分鐘，自然放冷，冷藏，過濾，濾液以截留分子量為6500的超濾膜超濾，收集超濾液，濾液中加入葡聚糖280g，補(bǔ)加注射用水至3000ml，調(diào)pH值6.5～7.0，除菌過濾，濾液分裝于西林瓶中，加塞，冷凍干燥，包裝，得凍干粉針劑1000支。實(shí)施例20脈絡(luò)寧凍干粉的制備實(shí)施例9的提取物中加注射用水2000ml加熱煮沸10分鐘，自然放冷，冷藏，過濾，濾液以截留分子量為5000的超濾膜超濾，收集超濾液，冷藏濾液中加入右旋糖苷280g，蔗糖10g，補(bǔ)加注射用水至3000ml，調(diào)pH值6.5～7.0，除菌過濾，濾液分裝于西林瓶中，加塞，冷凍干燥，包裝，得凍干粉針劑1000支。以上實(shí)施例并非窮舉，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以理解，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的任何同等的替代或改變，如工藝中常規(guī)參數(shù)的變化，根據(jù)需要將制劑的規(guī)格變化等均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。權(quán)利要求1.一種脈絡(luò)寧注射用粉針劑，其原料藥重量配比為石斛1～4份金銀花1～4份牛膝1～4份玄參1～4份，其特征在于，它以包括下述步驟的方法制備而成(1)取處方量的上述藥材，乙醇滲漉提取，滲漉液濃縮成浸膏，離心，加水，靜置，過濾，濾液減壓濃縮成浸膏，過濾，濾液調(diào)節(jié)pH值，乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯后干燥得提取物；(2)加水溶解提取物，冷藏，過濾，濾液超濾，收集超濾液，加入賦形劑，制成粉針劑。2.如權(quán)利要求1所述的脈絡(luò)寧注射用粉針劑，其特征在于，它以包括下述步驟的方法制備而成(1)取處方量的上述藥材粉碎，用50～90％乙醇滲漉提取，收集8～16倍生藥量的滲漉液，低溫減壓回收乙醇，減壓濃縮成浸膏，離心去除不溶性雜質(zhì)，加2～8倍量水，充分?jǐn)嚢?，靜置過夜，過濾，濾液減壓濃縮成浸膏，過濾，調(diào)節(jié)pH值至1～6，乙酸乙酯萃取2～8次，合并萃取液，回收乙酸乙酯后真空干燥得提取物；(2)在提取物中加注射用水加熱煮沸使溶解，自然放冷，冷藏，過濾，濾液超濾，收集超濾液，濾液中加入賦形劑，補(bǔ)加注射用水至處方量，調(diào)pH值，除菌過濾，濾液分裝于西林瓶中，加塞，冷凍干燥，包裝，得凍干粉針劑。3.如權(quán)利要求1所述的脈絡(luò)寧注射用粉針劑，其特征在于，它以包括下述步驟的方法制備而成(1)取處方量的上述藥材粉碎成粗粉，用50～90％乙醇以100～300ml/min速度滲漉提取，收集10.14倍生藥量的滲漉液，低溫減壓回收乙醇，減壓濃縮至50℃下相對(duì)密度為1.0～1.3的浸膏，離心去除不溶性雜質(zhì)，加4～8倍量水，充分?jǐn)嚢?，靜置過夜，過濾，濾液減壓濃縮至50℃下相對(duì)密度為1.0～1.3的浸膏，過濾，去除沉淀，調(diào)節(jié)pH值至1～4，等體積乙酸乙酯萃取4～8次，合并萃取液，回收乙酸乙酯，50.80℃真空干燥得提取物；(2)在提取物中加注射用水加熱煮沸8～15分鐘，自然放冷，冷藏，過濾，濾液以截留分子量為3000～8000的超濾膜超濾，收集超濾液，濾液中加入賦形劑，補(bǔ)加注射用水至處方量，調(diào)pH值6.5～7.0，除菌過濾，濾液分裝于西林瓶中，加塞，冷凍干燥，包裝，得凍干粉針劑。4.如權(quán)利要求1～3任一權(quán)利要求所述的脈絡(luò)寧注射用粉針劑，其特征在于，步驟(3)中所述的賦形劑選自甘露醇、PVP、葡聚糖、乳糖、右旋糖苷、蔗糖中的一種或多種。5.如權(quán)利要求1～3任一權(quán)利要求所述的脈絡(luò)寧注射用粉針劑，其特征在于，所述提取物中綠原酸含量為8～20％，肉桂酸含量為0.05～0.20％，濱蒿內(nèi)酯含量為0.05～0.15％。6.如權(quán)利要求5所述的脈絡(luò)寧注射用粉針劑，其特征在于，所述提取物中綠原酸含量為8～18％，肉桂酸含量為0.06～0.12％，濱蒿內(nèi)酯含量為0.05～0.10％。7.如權(quán)利要求6所述的脈絡(luò)寧注射用粉針劑，其特征在于，所述提取物中綠原酸含量為10～15％，肉桂酸含量為0.07～0.10％，濱蒿內(nèi)酯含量為0.05～0.08％。8.權(quán)利要求1～3任一權(quán)利要求所述的脈絡(luò)寧注射用粉針劑，其特征在于，其原料藥和賦形劑具有以下重量份配比牛膝2000～8000玄參2000～8000石斛2000～8000金銀花2000～8000甘露醇200～500PVP3～8。9.如權(quán)利要求8所述的脈絡(luò)寧注射用粉針劑，其特征在于，原料藥和賦形劑具有以下重量份配比牛膝5000玄參5000石斛5000金銀花5000甘露醇330PVP6。10.權(quán)利要求1～3任一所述的脈絡(luò)寧注射用粉針劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)取處方量的上述藥材粉碎，用50～90％乙醇滲漉提取，收集8～16倍生藥量的滲漉液，低溫減壓回收乙醇，減壓濃縮成浸膏，離心去除不溶性雜質(zhì)，加2～8倍量水，充分?jǐn)嚢?，靜置過夜，過濾，濾液減壓濃縮成浸膏，過濾，調(diào)節(jié)pH值至1～6，乙酸乙酯萃取2～8次，合并萃取液，回收乙酸乙酯后真空干燥得提取物；(2)在提取物中加注射用水加熱煮沸使溶解，自然放冷，冷藏，過濾，濾液超濾，收集超濾液，濾液中加入賦形劑，補(bǔ)加注射用水至處方量，調(diào)pH值，除菌過濾，濾液分裝于西林瓶中，加塞，冷凍干燥，包裝，得凍干粉針劑。其中，步驟(3)中所述的賦形劑選自甘露醇、PVP、葡聚糖、乳糖、右旋糖苷、蔗糖中的一種或多種。全文摘要本發(fā)明屬于中藥制藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體公開了一種脈絡(luò)寧注射制劑及其制備方法。本發(fā)明由石斛、牛膝、玄參、金銀花四種藥材按一定重量份配比提取有效成分后加入相應(yīng)輔料，經(jīng)超濾、調(diào)pH值，除菌過濾，加塞，冷凍干燥得凍干粉針劑；或滅菌后封蓋，得注射液。有效成分制備過程為四味藥材加入乙醇滲漉提取后，水沉，以乙酸乙酯純化。本發(fā)明的脈絡(luò)寧注射制劑有效成分含量高，制備工藝簡(jiǎn)潔，適合工業(yè)生產(chǎn)，且最大限度地去除了雜質(zhì)，從而保證了其安全、有效、穩(wěn)定。文檔編號(hào)A61P9/14GK101085226SQ200610014279公開日2007年12月12日申請(qǐng)日期2006年6月8日優(yōu)先權(quán)日2006年6月8日發(fā)明者葉正良,鄭永鋒,宋兆輝,白雨申請(qǐng)人:天津天士力之驕藥業(yè)有限公司