專利名稱：用于治療口腔疾病的類黃酮組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體而言涉及包含兩類特殊的靶向于類花生酸(eicosanoid)和細胞因子途徑的化合物——無取代B環(huán)類黃酮以及黃烷的混合物的新型組合物，其用于預防及治療口腔、牙齒及牙齦的疾病和病癥。具體而言，所述口腔、牙齒及牙齦的疾病和病癥包括但不限于牙周病，例如牙齦炎、牙周炎、牙髓炎，由移植假牙(physical implantation of oral dentures)、創(chuàng)傷、損傷、夜磨牙癥、腫瘤及其它退行性過程所引起的牙周病癥；白垢、菌膜、牙斑、牙結(jié)石和牙垢。應(yīng)用本文所述的組合物還可以提供以下好處維持最佳的唾液生成和pH、最小化細菌生長、減少菌膜以及牙斑的形成、抑制牙齒脫鈣和齲齒(蛀蝕)、促進礦質(zhì)補充、形成健康的牙齦、潔白牙齒、保持健康口腔衛(wèi)生及減少口腔惡臭(口臭)。
背景技術(shù)：
牙周病是某些或全部牙齒支持結(jié)構(gòu)(齒齦、牙骨質(zhì)、牙周韌帶、牙槽骨及其它牙齒周圍組織)的炎癥和感染相結(jié)合的一類疾病。牙齦炎(牙齦)和牙周炎(牙齦和骨)是牙周病的兩種主要形式。根據(jù)國家牙齒和顱面研究所(National Institute of Dental and Craniofacial Research)發(fā)布的全國口腔信息(National Oral Information)，估計80％的美國成年人目前都患有某種形式的牙周病。當在一顆或多顆清潔牙齒上形成菌膜時開始生成牙周病。菌膜吸引需氧革蘭氏陽性菌(大多為放線菌和鏈球菌)，它們附著于牙齒上形成菌斑。菌斑一天天加厚，潛在的細菌耗盡氧氣且移動性的(motile)厭氧桿菌和螺旋體開始寄生于齒齦下部區(qū)域。由厭氧菌釋放的內(nèi)毒素引起炎癥反應(yīng)、牙齦組織損傷及甚至骨流失。牙周病經(jīng)歷個四個主要階段，其特點如下所示。牙周病的破壞性影響超過了牙齒衛(wèi)生和健康的范圍，因為某些感染人群的肝、腎及大腦中發(fā)現(xiàn)了牙周病引起的微觀損傷。
牙周病的四階段

因牙周疾病引起的炎癥主要與兩種生物體系有關(guān)類花生酸系統(tǒng)和細胞因子系統(tǒng)。花生四烯酸(AA)從細胞膜中的釋放與代謝通過幾種不同途徑導致生成促炎(pro-inflammatory)代謝物。兩種最重要的發(fā)炎途徑都是由脂氧合酶(LOX)和環(huán)氧合酶(COX)酶介導的。這些平行通道分別導致白三烯和前列腺素的生成，它們在炎癥反應(yīng)的引發(fā)和發(fā)展中扮演重要角色。這些血管活性化合物為化學吸引素，其促進發(fā)炎細胞浸潤入牙齦組織并使可能導致骨流失的炎癥反應(yīng)延長。因此，負責生成這些炎癥介質(zhì)的酶成為開發(fā)用于預防和治療與口腔、牙齒和牙齦有關(guān)的疾病和病癥的治療性藥物的目標。
當網(wǎng)絡(luò)局部激活時細胞因子系統(tǒng)在體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中是十分強大的力量，并且細胞因子以表面結(jié)合或可擴散的形式在鄰近發(fā)揮作用。但是，當細胞因子持續(xù)和/或全身產(chǎn)生時它就會產(chǎn)生炎癥、感染、自身免疫和惡性疾病的跡象、癥狀及病理。TNF-α是由巨噬細胞、中性粒細胞、成纖維細胞、角質(zhì)形成細胞、NK細胞T和B細胞及腫瘤細胞產(chǎn)生的一種強力多效的細胞因子。IL-1β與TNF-α一同在炎癥反應(yīng)中起核心作用。將拮抗劑如IL-1ra(IL-1受體拮抗劑)、IL-1受體的可溶性片段、或TNF-α的單克隆抗體以及TNF的可溶性受體給藥都會在炎癥動物模型中阻斷多種不同的急性或慢性反應(yīng)。核因子κB(NFκB)是一種控制白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)及其它多種蛋白質(zhì)的基因表達的轉(zhuǎn)錄因子。其中某些拮抗劑開始作為抗炎劑應(yīng)用于諸如敗血病、牙周疾病及類風濕性關(guān)節(jié)炎的疾病中(Dinarello(2004)CurrOpin Pharmacol.4378-385)。研究發(fā)現(xiàn)抗TNF-α抗體不僅顯著緩解類風濕性關(guān)節(jié)炎，而且減輕炎性腸病克羅恩氏病(Maini和Feldmann.(2002)Arthritis Res.4 Suppl2S22-8)。
牙周韌帶(PDL)細胞具有成骨細胞樣特征并可分化成牙骨發(fā)生細胞或者成骨細胞譜系的細胞。這些細胞對于保持牙周組織的完整和再生非常重要(Somerman等，(1990)Arch Oral Bio.35241-477；Pitaru等，(1994)J Periodontal Res.2981-94)。由細菌建群引發(fā)的牙周組織慢性感染會誘導促炎細胞因子的合成，這些細胞因子潛在地影響PDL細胞的表型和功能。這些細胞因子不僅在感染部位激活和招募免疫細胞(Le和Vilcek(1987)J.Immunol.1393330；Kunkel等，(1994)Ann，N.Y.Acad.Sci.730134)，而且促使支持骨和韌帶連接流失(Pitaru等，(1994)JPeriodontal Res.2981-94)。例如，TNF-α經(jīng)證實可以調(diào)節(jié)PDL細胞的成骨細胞樣表型和功能(Agarwal等，(1998)Infect.Immun.66932-937)。此外，TNF-α和IL-1β通過下調(diào)堿性磷酸酶(Kuroki等，(1994)Rheumatology33224)及調(diào)節(jié)膠原蛋白、膠原酶、蛋白聚糖及前列腺素的合成(Agarwal等，(1998)Infect.Immn.66932-937)而改變成骨細胞的表型特征。
在分離的PDL細胞中，IL-1β誘導表型改變(Agarwal等，(1998)Infect.Immun.66932-937)。源于健康牙周組織的PDL細胞不識別細菌脂多糖(LPS)也不對LPS反應(yīng)而產(chǎn)生促炎細胞因子。在經(jīng)IL-1β處理后，PDL細胞失去其成骨細胞樣特征而呈現(xiàn)對LPS反應(yīng)的一種新型表型。因此，IL-1β是PDL細胞功能的重要調(diào)節(jié)因子，并引導這些細胞在感染過程中積極參與免疫反應(yīng)。IL-1β刺激骨再吸收并抑制骨形成(Stashenko等，(1987)J Bone Miner Res.2559-65；Nguyen等，(1991)LymphokineCytokine Res.1015-21；Tatakis(1993)J Periodontol(1991)64416-31)。除此之外，IL-1β對TNF-α的骨再吸收作用有協(xié)同作用(Bertolini等，(1986)Nature319516-18；van der Pluijm等，(1991)Endocrinology1291596)。IL-1β在牙周炎病理進程中另一重要作用是誘導生成間質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)(Havemose-poulsen和Holmstrup(1997)Crit.Rev.Oral.Biol.Med8217)。IL-1β引起齒齦成纖維細胞和PDL細胞中原膠原酶(procollagenase)的水平增加(Meikle等，(1989)J Periodontal Res.24207-13；Lark等，(1990)Connect Tissue Res.2549-65；Tewari等，(1994)Arch Oral Biol.39 657-64)。此外，IL-1β刺激齒齦成纖維細胞中的纖溶酶原激活劑產(chǎn)生纖溶酶，這是若干間質(zhì)金屬蛋白酶的激活劑(Mochan等，(1998)J Periodontal Res.2328-32)。此外，Stashenko及合作者報道了牙齦組織中IL-1β的水平與新近的(recent)附著喪失成正相關(guān)(Stashenko等，(1991)J Clin Periodontol18548-54)。
TNF-α是免疫和炎癥反應(yīng)中另一種重要介質(zhì)，并以可測得的量存在于活躍的牙周炎癥反應(yīng)區(qū)域(Rossomando等，(1990)Arch Oral Biol.35431-34；Stashenko等，(1991)J Ciln periodontol18548-54)。TNF-α改變PDL細胞的成骨細胞特性(Quintero等，(1995)J.Dent.Res.741802)。這通過其對LPS反應(yīng)而表達其它促炎反應(yīng)細胞因子如IL-1β、IL-6、和IL-8的能力而得到證實。TNF-α誘導成纖維細胞分泌膠原酶、軟骨和骨組織再吸收，還與牙周炎中牙周組織的損傷有關(guān)(Elias等，(1987)J.Immunol.1383812；Meikle等，(1989)J.Periodontal Res.24207-13；Chaudhary等，(1992)Endocrinology1302528)。在靜止巨噬細胞中，TNF-α誘導合成IL-1β和前列腺素E2。TNF-α還激活破骨細胞并因此誘導骨再吸收。TNF-α和IL-1β的骨再吸收作用有協(xié)同作用(van der Pluijm等，(1991)Endocrinology1291596；Bertolini等，(1986)Nature319516-8；Johnson等，(1989)Endocrinology 1241424)。
經(jīng)證實在牙周炎癥損傷中，多種細胞如T細胞、巨噬細胞、內(nèi)皮細胞和成纖維細胞提高了IL-6在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平的表達(Kono等，(1991)J.Immunol.1461812；Matsuki等，(1992)Immunology7642-47；Fujihashi等，(1993)Am.J.Pathol.142.1239；Yamazaki等，(1994)J OralPathol Med.23347-53)。由于IL-6在人類B細胞反應(yīng)中特別重要，人們推測在牙周炎損傷中觀察到的B細胞/漿細胞膨脹可能是因疾患處IL-6生成增加所導致(Fujihashi等，(1993)J Periodontol64400-406)。此外，IL-6在骨轉(zhuǎn)換的局部調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用(Lowik等，(1989)BiochemBiophys Res.Commun.1621546-52；Ishimi等，(1990)J.Immunol.1453297；Kurihara等，(1990)J.Immunol.1444226)，而且似乎在雌激素缺乏引起的骨丟失中必不可少(Horowitz(1993)J Bone Miner Res.81163-71)。體外研究也表明用IL-6和可溶性IL-6受體同時處理小鼠的成骨細胞和骨髓細胞顯著誘導破骨細胞的形成(Tamura等，(1993)PNAS9011924)。而且，還提示IL-6可能通過刺激破骨細胞形成及破骨細胞再吸收活化從而作為自分泌和/或旁分泌因子在骨再吸收的病理狀態(tài)發(fā)揮作用(Ohsaki等，(1992)Endocrinology1312229)。這些發(fā)現(xiàn)提示在牙周炎的牙周組織損傷的病理過程中涉及IL-6。
環(huán)氧合酶(COX)的抑制是大多數(shù)非甾體抗炎藥(NSAID)的作用機制。存在兩種不同的同種型COX酶(COX-1和COX-2)，它們共有大約60％的序列同源性，但表達模式以及功能不同。COX-1是與生理學重要的前列腺素的生成相聯(lián)系的組成型酶，它協(xié)助調(diào)節(jié)正常生理功能如血小板凝集、保護胃中細胞功能以及維持正常腎功能(Dannhardt和Kiefer(2001)Eur.J.Med.Chem.36109-26)。第二種同種型COX-2是可被促炎細胞因子如白細胞介素-1β(IL-1β)和其他生長因子誘導的酶的形式。(Herschmann(1994)Cancer Metastasis Rev.134241-56；Xie等，(1992)Drugs Dev.Res.25249-265)。該同種型催化從花生四烯酸(AA)生成前列腺素E2(PGE2)。COX的抑制是常規(guī)NSAID具有抗炎活性的原因。
對COX和LOX表現(xiàn)出雙重特異性的抑制劑將具有抑制花生四烯酸代謝的多重途徑的明顯好處。這種抑制劑可通過抑制其生成而阻斷前列腺素(PG)以及多重白三烯(LT)的炎性作用。其包括也公知作為過敏反應(yīng)(anaphalaxis)慢反應(yīng)物質(zhì)的PGE2、LTB4、LTD4以及LTE4的血管舒張、血管通透性和趨化性作用。其中，LTB4具有最有效的趨化性以及化學增活作用(chemokinetic effect)(Moore(1985)，ProstanoidsPharmacological，Physiological and Clinical Relevance，CambridgeUniversity Press，N.Y.，pp.229-230)。
由于COX抑制劑的作用機制與大多數(shù)常規(guī)的NSAID重疊，因此COX抑制劑被用于治療許多相同癥狀包括發(fā)炎在其中起關(guān)鍵作用的短期癥狀和慢性疾病中與發(fā)炎有關(guān)的疼痛和腫脹。然而，大多數(shù)已知的NSAID由于其溶解度和生物利用度低而不適于牙周疾病。
目前治療牙周疾病的方法限制以控制感染為首要目的(Genco等，(1990)Contenporary Periodontics，The C.V. Mosby Company，St.Louis，pp.361-370)。常用的抗菌劑及抗牙斑劑包括氯己定、三氯生、氟化亞錫、李斯特靈(Listerine)、過氧化氫、十六烷基氯化吡啶鎓和血根堿生物堿。抗菌漱口劑、抗菌片、抗生素凝膠/微球及酶抑制劑-多西環(huán)素的處方藥是治療和控制牙周疾病的優(yōu)選的非機械/物理方法。申請人未發(fā)現(xiàn)有任何報道以無取代B環(huán)類黃酮以及黃烷的組合作為靶向于類花生酸和細胞因子途徑的主要生物活性成分的用于治療口腔疾病和病癥的制劑。
類黃酮或生物類黃酮為廣泛分布的天然產(chǎn)物，據(jù)報道其具有抗菌、抗炎、抗過敏、抗誘變、抗病毒、抗腫瘤、抗血栓形成(anti-thrombic)及血管舒張活性。這組化合物共有的結(jié)構(gòu)單元包括兩個位于3-碳環(huán)兩側(cè)的苯環(huán)，如下結(jié)構(gòu)通式所示 連接至該總?cè)h(huán)結(jié)構(gòu)的羥基、糖、氧及甲基的各種組合產(chǎn)生多種類型的類黃酮，包括黃烷醇、黃酮、黃烷-3-醇(兒茶素)、花色苷和異黃酮。
無取代B環(huán)黃酮及黃酮醇是一類特殊的類黃酮，其芳香B環(huán)上無取代基(下文稱作無取代B環(huán)類黃酮)，由如下通式所示 其中R1、R2、R3、R4和R5獨立地選自以下組中-H、-OH、-SH、-OR、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、-NR3+X-，單個糖或者多個糖組合的糖苷，其中所述糖苷是通過碳、氧、氮或硫連接到7-羥基色酮上，并且其中所述單個糖或多個糖的組合包括但不限于戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖以及它們的化學衍生物；
其中R是具有1-10個碳原子的烷基；以及X選自藥物學可接受的抗衡陰離子組中，其包括但不限于羥基、氯離子、碘離子、氟離子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、碳酸根等。
無取代B環(huán)類黃酮相對稀少。在9,396種合成或自天然來源分離的類黃酮中，已知僅有231種無取代B環(huán)類黃酮(The Combined ChemicalDictionary，Chapman&Hall/CRC，Version 51 June 2001)。據(jù)報道無取代B環(huán)類黃酮具有各種生物活性。通常，基于類黃酮的可用性隨機測試其生物活性。偶爾地，特定生物活性強調(diào)需要B環(huán)上的取代，如與p-糖蛋白高親和力結(jié)合(Boumendjel等(2001)Bioorg.Med.Chem.Lett.11(1)75-77)、強心作用(Itoigawa等(1999)J.Ethnopharmacol.65(3)267-272)、抗亞油酸過氧化氫誘導的毒性的對內(nèi)皮細胞的保護作用(Kaneko和Baba(1999)Biosci Biotechnol.Biochem 63(2)323-328)、COX-1抑制活性(Wang(2000)Phytomedicine 715-19)以及前列腺素內(nèi)過氧化物合酶(Kalkbrenner等(1992)Pharmacology 44(1)1-12)需要B環(huán)上被取代。僅有為數(shù)不多的出版物提到無取代B環(huán)類黃酮中未取代的B環(huán)的重要性。一個實例為抑制NADPH醌受體氧化還原酶的2-苯基黃酮作為潛在的抗凝血劑的應(yīng)用(Chen等(2001)Biochem.Pharmacol.61(11)1417-1427)。
各種無取代B環(huán)類黃酮抗炎活性的作用機制存在爭議。無取代B環(huán)類黃酮、柯因(Liang等(2001)FEBS Lett.496(1)12-18)、漢黃芩素(Chi等(2001)Biochem.Pharmacol.611195-1203)以及halangin(Raso等(2001)Life Sci.68(8)921-931)的抗炎活性通過過氧化物酶體增生物活化受體γ(PPARγ)的活化以及對脫粒和AA釋放的影響從而與誘導型環(huán)氧合酶和一氧化氮合酶的抑制有關(guān)。(Tordera等(1994)Z.Naturforsch[C]49235-240)。據(jù)報道，木蝴蝶素、黃芩黃素(baicalein)和漢黃芩素抑制12-脂氧合酶活性而不影響環(huán)氧合酶(You等(1999)Arch.Pharm.Res.22(1)18-24)。新近據(jù)報道，漢黃芩素、黃芩苷和黃芩黃素的抗炎活性通過由一氧化氮抑制劑和脂多糖誘導的誘導型一氧化氮合酶和cox-2基因表達的抑制而產(chǎn)生(Chen等(2001)Biochem.Pharmacol.61(11)1417-1427)。還有報道顯示木蝴蝶素通過抑制NFκB的活化起作用(Chen等(2001)Biochem.Pharmacol.61(11)1417-1427)。最后，有報道顯示漢黃芩素抑制巨噬細胞中誘導型PGE2的生成(Wakabayashi和Yasui(2000)Eur.J.Pharmacol.406(3)477-481)。
中國藥用植物黃芩含有大量的無取代B環(huán)類黃酮，包括黃芩黃素、黃芩苷、漢黃芩素和baicalenoside。傳統(tǒng)上，該植物用于治療許多病癥，包括清熱、瀉火、濕溫和暑熱??；高燒引起的煩渴；癰、潰瘍和其他化膿的皮膚感染；上呼吸道感染如急性扁桃體炎、咽喉炎和猩紅熱；病毒性肝炎；腎炎；盆腔炎(pelvitis)；痢疾；嘔血和鼻出血。該植物傳統(tǒng)上還用于預防流產(chǎn)(見Encyclopedia of Chinese Traditional Medicine，上海科技出版社，上海，中國，1998)。臨床上，黃芩現(xiàn)用于治療病癥如小兒肺炎、小兒細菌性腹瀉、病毒性肝炎、急性膽囊炎、高血壓、由傷口和外科手術(shù)引起的局部急性發(fā)炎、支氣管哮喘和上呼吸道感染(Encyclopediaof Chinese Traditional Medicine，上?？萍汲霭嫔?，上海，中國，1998)。黃芩根治療支氣管哮喘的藥理學功效據(jù)報道與無取代B環(huán)類黃酮的存在以及其抑制作用有關(guān)，它們可以抑制嗜酸性細胞的與嗜酸性細胞趨化因子相關(guān)的補充(Nakajima等(2001)Planta Med.67(2)132-135)。
迄今為止，許多天然存在的無取代B環(huán)類黃酮得以商品化用于各種用途。例如，黃芩提取物的脂質(zhì)體劑型用于護膚(美國專利No.5,643,598；5,443,983)。由于對致癌基因具有抑制作用，黃芩苷被用于預防癌癥(美國專利No.6,290,995)。黃芩苷和其他化合物被用作抗病毒、抗菌和免疫調(diào)節(jié)劑(美國專利No.6,083,921和WO 98/42363)并作為天然的抗氧化劑(WO 98/49256和波蘭專利公開No.9,849,256)。含萜類的類黃酮制劑曾被用作表面結(jié)合葡糖基轉(zhuǎn)移酶的抑制劑用于治療和抑制齲齒(US#20040057908)。日本專利No.63027435描述了黃芩黃素的提取及富集，日本專利No.61050921描述了黃芩苷的純化。
于2002年3月1日提交的序列號為10/091,362的名為“Identificationof Free-B-Ring Flavonoids as Potent COX-2 Inhibitors”以及于2003年7月22日提交的序列號為10/427,746的名為“Formulation of a Mixture ofFree-B-Ring Flavonoids and Flavans as a Therapeutic Agent”的美國專利申請都公開了通過向有此需要的主體給藥含有無取代B環(huán)類黃酮的組合物或含有無取代B環(huán)類黃酮混合物的組合物來抑制環(huán)氧合酶COX-2的方法。這是首篇將無取代B環(huán)類黃酮與COX-2抑制活性相聯(lián)系的報導。該申請于此全文并入作為參考。
黃烷包括以下結(jié)構(gòu)通式所表示的化合物 其中R1、R2、R3、R4和R5獨立地選自以下組中-H、-OH、-SH、-OCH3、-SCH3、-OR、-SR、-NH2、-NRH、-NR2、-NR3+X-，所述取代基的酯，包括但不限于沒食子酸酯、乙酸酯、肉桂酰和羥基肉桂酰酯、三羥基苯甲酰酯和咖啡酰酯、以及它們的化學衍生物，單個糖或者多個糖組合的糖苷，其中所述糖苷是通過碳、氧、氮或硫連接到7-羥基色酮上，并且其中所述單個糖或者多個糖的組合包括但不限于戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖以及它們的化學衍生物以及其他聚合的黃烷；其中R是具有1-10個碳原子的烷基；以及X選自藥物學可接受的抗衡陰離子，包括但不限于羥基、氯離子、碘離子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟離子、碳酸根等。
兒茶素是一種黃烷，主要發(fā)現(xiàn)于綠茶中，其具有下列結(jié)構(gòu) 兒茶素既單獨起作用又可與其他在茶中發(fā)現(xiàn)的類黃酮一同起作用，并且其既具有抗病毒又具有抗氧化活性。據(jù)證實，兒茶素對病毒性肝炎的治療有效。其還顯示可預防對心臟、腎、肺、脾的氧化損傷，并可抑制胃癌細胞的生長。
兒茶素與其異構(gòu)體表兒茶素抑制前列腺素內(nèi)過氧化物合酶，IC50值為40μM。(Kalkbrenner等(1992)Pharmacol.441-12)。可從商業(yè)途徑得到的純(+)-兒茶素抑制COX-1的IC50值視試驗條件而定，約為183到279μM，對COX-2不具有選擇性(Noreen等(1998)J.Nat.Prod.611-7)。綠茶兒茶素當補充加入至Sprague Dawley雄性大鼠的膳食中時，降低了血小板PLA2的活性水平并顯著減少了血小板環(huán)氧合酶水平(Yang等(1999)J.Nutr.Sci.Vitaminol.45337-346)。兒茶素和表兒茶素據(jù)報道可微弱抑制cox-2基因在人結(jié)腸癌DLD-1細胞中的轉(zhuǎn)錄(IC50＝415.3μM)。(Mutoh等(2000)Jpn.J.Cancer Res.91686-691)。來自紅酒的(+)-兒茶素的神經(jīng)保護能力源自兒茶素的抗氧化性能，而不是其對細胞內(nèi)酶類如環(huán)氧合酶、脂氧合酶或一氧化氮合酶的抑制作用(Bastianetto等(2000)Br.J.Pharmacol.131711-720)。由綠茶和紅茶中純化而得的兒茶素衍生物如表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯(EGCG)、表沒食子兒茶素(EGC)、表兒茶素-3-沒食子酸酯(ECG)和茶黃素顯示可抑制人結(jié)腸粘膜和結(jié)腸腫瘤組織中AA的環(huán)氧合酶和脂氧合酶依賴性代謝(Hong等(2001)Biochem.Pharmacol.621175-1183)以及誘導型(induce)cox-2表達和PGE2生成(Park等(2001)Biochem.Biophys.Res.Commun.286721-725)。
金合歡是豆科樹木和灌木屬。金合歡屬包括多于1000種屬于豆科及含羞草亞科的物種。金合歡分布于全世界如中、南美洲、非洲、亞洲部分地區(qū)以及具有最多特有品種的澳洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)。迄今為止，約從各種金合歡品種中分離出330種化合物。類黃酮為從金合歡中分離出的主要類型的化合物。已鑒定有大約180種不同的類黃酮，其中111種為黃烷。萜類是從金合歡屬物種中分離出的第二大類化合物，已鑒定出48種化合物。從金合歡中分離出的其他類型化合物包括生物堿(28)、氨基酸/肽(20)、鞣質(zhì)(16)、糖類(15)、含氧雜環(huán)(15)和脂肪族化合物(10)(Buckingham，The Combined Chemical Dictionary，Chapman&Hall CRC，52版，Dec.2001)。
所有金合歡品種中具有中等到高濃度的酚類化合物，特別是黃烷(Abdulrazak等(2000)Journal of Animal Sciences.13935-940)。在歷史上，金合歡屬的大多數(shù)植物和提取物被用作收斂藥治療胃腸道紊亂、腹瀉、消化不良以及止血。(Vautrin(1996)Universite Bourgogne(France)European abstract 58-01C177；Saleem等(1998)Hamdard Midicus.4163-67)。金合歡樹皮提取物在日本被授予的專利為作為增白劑外部應(yīng)用(Abe，JP 10025238)、作為葡糖基轉(zhuǎn)移酶抑制劑的牙科應(yīng)用(Abe，JP07242555)、作為蛋白質(zhì)合成抑制劑(Fukai，JP 07165598)、作為活性氧清除劑用于外部皮膚制劑(Honda，JP 07017847，Bindra美國專利No.6,1266,950)、以及作為透明質(zhì)酸酶抑制劑用于預防炎癥、花粉熱和咳嗽(Ogura，JP 07010768)。
鉤藤屬包括34個種，其中許多熟知為藥用植物。鉤藤屬植物被不同的民族用于治療創(chuàng)傷、和潰瘍、發(fā)燒、頭痛、胃腸疾病和微生物/真菌感染。鉤藤屬植物包含大量的兒茶素和其他黃酮。鉤藤屬已報道的其它成分包括生物堿、萜類、喹喏酸苷、香豆素、和黃酮類化合物。兒茶鉤藤(Uncaria gambir)是馬來西亞、新加坡、印度和東南亞國家常見的物種。兒茶素是兒茶鉤藤整株的主要成分。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明包括可同時既有效地抑制類花生酸系統(tǒng)又有效地抑制細胞因子系統(tǒng)的用于預防和治療與口腔、牙齒和牙齦有關(guān)的疾病和病癥的方法。該同時雙重調(diào)節(jié)類花生酸系統(tǒng)及細胞因子系統(tǒng)的方法包括向有此需要的主體全身或局部給藥包含合成和/或從單一植物或多種植物分離的無取代B環(huán)類黃酮和黃烷的混合物的組合物。本文將該組合物稱作UP676。該方法的功效和安全性用純化酶在不同細胞系、多種動物模型并且最終于人體臨床試驗中得以證實。組合物中的無取代B環(huán)類黃酮與黃烷的比例范圍可為99.9∶0.1無取代B環(huán)類黃酮比黃烷到0.1∶99.9無取代B環(huán)類黃酮比黃烷。在本發(fā)明的特定具體實施方案中，無取代B環(huán)類黃酮與黃烷的比例選自以下組中約90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80和10∶90。在本發(fā)明一個優(yōu)選的具體實施方案中，組合物中無取代B環(huán)類黃酮與黃烷的比例為約80∶20。在優(yōu)選的具體實施方案中無取代B環(huán)類黃酮從一種或多種黃芩屬植物中分離，黃烷從一種或多種金合歡屬或鉤藤屬植物中分離。
本發(fā)明還包括用于預防和治療口腔、牙齒和牙齦的疾病和病癥的方法。這種用于預防和治療口腔、牙齒和牙齦的所述疾病和病癥的方法包括向有此需要的主體全身或局部給藥有效量的包含合成和/或從單一植物或多種植物分離的無取代B環(huán)類黃酮和黃烷的混合物以及藥物學可接受的載體的組合物。組合物中的無取代B環(huán)類黃酮與黃烷的比例范圍可為99.9∶0.1無取代B環(huán)類黃酮比黃烷到0.1∶99.9無取代B環(huán)類黃酮比黃烷。在本發(fā)明的特定具體實施方案中，無取代B環(huán)類黃酮與黃烷的比例選自以下組中約90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80和10∶90。在本發(fā)明一個優(yōu)選的具體實施方案中，組合物中無取代B環(huán)類黃酮與黃烷的比例為約80∶20。在優(yōu)選的具體實施方案中無取代B環(huán)類黃酮從一種或多種黃芩屬植物中分離，黃烷從一種或多種金合歡屬或鉤藤屬植物中分離。
此處所述無取代B環(huán)類黃酮也指可根據(jù)以下的發(fā)明應(yīng)用的無取代B環(huán)黃酮和黃酮醇，包括以下結(jié)構(gòu)通式所示的化合物 其中R1、R2、R3、R4和R5獨立地選自以下組中-H、-OH、-SH、-OR、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、-NR3+X-，單個糖或者多個糖組合的糖苷，其中所述糖苷是通過碳、氧、氮或硫連接到7-羥基色酮上，并且其中所述單個糖或多個糖的組合包括但不限于戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖以及它們的化學衍生物；其中R是具有1-10個碳原子的烷基；以及X選自藥物學可接受的抗衡陰離子，其包括但不限于羥基、氯離子、碘離子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟離子以及碳酸根等。
本發(fā)明的無取代B環(huán)類黃酮可由合成方法獲得，或從下列各科植物中提取，包括但不限于番荔枝科(Annonaceae)、Asteraceae、紫葳科(Bignoniaceae)、使君子科(Combretaceae)、菊科(Compositae)、大戟科(Euphorbiaceae)、唇形科(Labiatae)、樟科(Lauranceae)、豆科(Leguminosae)、?？?Moraceae)、松科(Pinaceae)、鳳尾蕨科(Pteridaceae)、中國蕨科(Sinopteridaceae)、榆科(Ulmaceae)和姜科(Zingiberacea)。該無取代B環(huán)類黃酮可由下列高等植物屬提取、濃縮和純化，包括但不限于假鷹爪屬(Desmos)、Achyrocline、木蝴蝶屬(Oroxylum)、Buchenavia、香青屬(Anaphalis)、山芫荽屬(Cotula)、鼠麴草屬(Gnaphalium)、蠟菊屬(Helichrysum)、矢車菊屬(Centaurea)、澤蘭屬(Eupatorium)、Baccharis、烏柏屬(Sapium)、黃芩屬(Scutellaria)、Molsa、羽萼木屬(Colebrookea)、水蘇屬(Stachys)、牛至屬(Origanum)、新塔花屬(Ziziphora)、山胡椒屬(Lindera)、黃肉楠屬(Actinodaphne)、金合歡屬(Acacia)、魚藤屬(Derris)、甘草屬(Glycyrrhiza)、雞血藤屬(Millettia)、水黃皮屬(Pongamia)、灰毛豆屬(Tephrosia)、木波羅屬(Artocarpus)、榕屬(Ficus)、粉葉蕨屬(Pityrogramma)、隱囊蕨屬(Notholaena)、松屬(Pinus)、榆屬(Ulmus)和山姜屬(Alpinia)。
可根據(jù)以下發(fā)明應(yīng)用的黃烷包括以下的結(jié)構(gòu)通式所示的化合物
其中R1、R2、R3、R4和R5獨立地選自以下組中-H、-OH、-SH、-OCH3、-SCH3、-OR、-SR、-NH2、-NRH、-NR2、-NR3+X-，所述取代基的酯，包括但不限于沒食子酸酯、乙酸酯、肉桂酰和羥基肉桂酰酯、三羥基苯甲酰酯和咖啡酰酯、以及它們的化學衍生物，單個糖或者多個糖組合的糖苷，其中所述糖苷是通過碳、氧、氮或硫連接到7-羥基色酮上，并且所述單個糖或者多個糖的組合包括但不限于戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖以及它們的化學衍生物以及其他聚合的黃烷；其中R是具有1-10個碳原子的烷基；以及X選自藥物學可接受的抗衡陰離子，其包括但不限于羥基、氯離子、碘離子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟離子以及碳酸根等。
本發(fā)明的黃烷可由選自金合歡屬或鉤藤屬的一種或多種植物中獲得。在一個優(yōu)選的具體實施方案中，該植物選自以下組中兒茶(Acaciacatechu)、Acacia concinna、金合歡(Acacia farnesiana)、阿拉伯膠樹(Acacia Senegal)、Acacia speciosa、阿拉伯金合歡(Acacia arabica)、A.caesia、蛇藤(A.pennata)、藤金合歡(A.sinuata)、黑荊樹(A.mearnsii)、A.picnantha、白粉金合歡(A.dealbata)、大葉相思(A.auriculiformis)、A.holoserecia和馬占相思(A.mangium)，以及兒茶鉤藤(Uncaria gambir)、恒春鉤藤(Uncaria lanosa)、毛鉤藤(Uncaria hirsute)、Uncaria africana、Uncaria elliptica、Uncaria orientalis、Uncaria attenuate、Uncaria acida、北越鉤藤(Uncaria homomalla)、白鉤藤(Uncaria sessilifructus)、Uncariasterrophylla、Uncaria bernaysii、華鉤藤(Uncaria sinensis)、Uncariacallophylla、鉤藤(Uncaria rhychophylla)、Uncaria tomentosa、Uncarialongiflora、毛鉤藤(Uncaria hirsute)、Uncaria cordata和Uncariaborneensis。
在一個具體實施方案中，本發(fā)明包括預防及治療許多與口腔、牙齦和牙齒有關(guān)的疾病和病癥的方法，所述疾病和病癥包括但不限于牙周(牙齦)疾病如牙齦炎、侵襲性牙周炎、慢性牙周炎、根尖周炎、系統(tǒng)疾病所表現(xiàn)的牙周炎、以及壞死性牙周疾病，其中所述牙周疾病的起因包括但不限于慢性細菌感染、斑塊堆積(plaque accumulation)、吸煙或咀嚼煙草、遺傳易感性(genetically susceptibility)、懷孕或青春期、壓力、藥物、以及糖尿病、營養(yǎng)不良和其他系統(tǒng)疾病所引起。
在另一個具體實施方案中，本發(fā)明包括用于預防和治療敏感性牙齦和牙齒、后遺癥、牙髓炎，因移植假牙、創(chuàng)傷、損傷、夜磨牙癥和其他在口腔、齒齦或舌頭上的小傷口引起的刺激、疼痛以及炎癥，牙斑和結(jié)石、牙脫鈣、蛋白酶解和齲齒(蛀蝕)的方法。
本發(fā)明還包括含有本發(fā)明治療劑的治療組合物。除了用于預防和治療上述口腔、牙和齒齦的疾病和病癥以外，本文所述的治療組合物還可用于維持最佳唾液生成、唾液pH值、最小化細菌生長、減少牙斑酸的生成、抑制礦物質(zhì)流失、促進礦質(zhì)補充、減少齲齒的患病率、形成健康牙齦、潔白牙齒、維持健康的口腔衛(wèi)生并減少口腔惡臭(口臭)。
本發(fā)明的預防和治療方法包括向有此需要的主體全身或局部給藥治療有效量的從單一或多種來源分離的無取代B環(huán)類黃酮和黃烷的制劑。根據(jù)用于獲得該化合物的方法，所述單一和/或多種無取代B環(huán)類黃酮及黃烷的混合物的純度包括但不限于0.01％到100％。在一個優(yōu)選的具體實施方案中，含有無取代B環(huán)類黃酮和黃烷的混合物的劑量通常是選自基于組合物總重量的0.001％到100％范圍中的有效、無毒的量。本領(lǐng)域技術(shù)人員采用常規(guī)的臨床試驗即可決定用于治療特定疾病的最佳劑量。
本發(fā)明包括采用酶促及體內(nèi)模型對無取代B環(huán)類黃酮和黃烷的不同組合物進行評價以優(yōu)化組合物并獲得期望的生理活性。該組合物的有效性和安全性通過人類臨床試驗得以證實。本發(fā)明的組合物可通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的任何方法給藥。給藥方式包括但不限于腸內(nèi)(口服)給藥、非胃腸道(靜脈內(nèi)、皮下和肌內(nèi))給藥和局部施用。在一個具體實施方案中，本發(fā)明的治療方法包括向有此需要的主體局部給藥治療有效量的合成和/或從單一植物或多種植物分離的無取代B環(huán)類黃酮和黃烷的混合物。局部給藥方法包括但不限于牙膏、凝膠、軟膏、漱口水、口香糖、酊劑、飲料以及其他已知的藥物劑型。
至今為止，本發(fā)明的申請人尚未發(fā)現(xiàn)任何關(guān)于包含無取代B環(huán)類黃酮和黃烷的組合的制劑作為治療與口腔、牙齒和牙齦有關(guān)的疾病和病癥的主要生物活性成分的報道。無取代B環(huán)類黃酮的一個芳香環(huán)上不含取代基對這些化合物有效用于口腔護理起著非常重要的作用。不像許多其他的抗炎藥物和天然存在的化合物，無取代B環(huán)類黃酮如黃芩苷在分子的一側(cè)存在低極性的芳香環(huán)并在另一側(cè)存在高極性的葡糖苷酸和兩個羥基。這種結(jié)構(gòu)安排使得這些化合物容易滲入并保持在牙齦組織。用于產(chǎn)生本文稱之為UP676的組合物的無取代B環(huán)類黃酮與黃烷的組合為對類花生酸系統(tǒng)和細胞因子系統(tǒng)兩者的協(xié)同和強效的調(diào)節(jié)劑，其有助于控制牙周組織炎癥，包括牙周疾病所有四個階段的炎癥。此外，由于生物利用度的原因，即生物活性化合物滲入上皮細胞膜的速率和百分比以及生物活性化合物在牙周組織的局部濃度，這兩種不同類型的化合物(高極性的黃烷vs.低極性的無取代B環(huán)類黃酮)的組合能夠由生物活性的黃烷提供快速、就地(on-site)的緩解疼痛和急性炎癥作用并由生物活性的無取代B環(huán)類黃酮提供對牙周組織的慢性炎癥的持久的調(diào)節(jié)作用。最后，在一個優(yōu)選的含顯著量的無取代B環(huán)類黃酮(80重量％)與相對低濃度的黃烷(20重量％)的具體實施方案中，更有效的抗氧化劑黃烷將既作為對抗無取代B環(huán)類黃酮氧化降解的天然保存劑(preservative)，又中和并緩沖該組合物從而允許在最佳pH和電離條件下傳遞主要的活性化合物——無取代B環(huán)類黃酮。。
應(yīng)理解，前述總體描述及下述詳細描述都僅是舉例說明和解釋，而并非是對所要求保護的本發(fā)明的限制。


圖1所示為從黃芩分離的標準化的無取代B環(huán)類黃酮(HPLC分析含83％黃芩苷)對COX-1和COX-2的抑制曲線。測定提取物對重組綿羊COX-1(◆)和綿羊COX-2(■)的過氧化物酶活性的抑制作用。數(shù)據(jù)顯示為百分抑制率對抑制劑濃度(μg/mL)作圖。對COX-1的IC50計算為0.24μg/mL/酶單位而對COX-2的IC50為0.48μg/mL/酶單位。
圖2所示為從黃芩分離的純化成分黃芩苷對COX-1和COX-2的抑制曲線。測定該化合物對重組綿羊COX-1(◆)和綿羊COX-2(■)的過氧化物酶活性的抑制作用。數(shù)據(jù)顯示為百分抑制率對抑制劑濃度(μg/mL)作圖。對COX-1的IC50確定為0.44μg/mL/酶單位而對COX-2的IC50為0.28μg/mL/酶單位。
圖3所示為從黃芩分離的純化成分黃芩黃素對COX-1和COX-2的抑制曲線。測定該化合物對重組綿羊COX-1(◆)和綿羊COX-2(■)的過氧化物酶活性的抑制作用。數(shù)據(jù)顯示為百分抑制率對抑制劑濃度(μg/mL)作圖。對COX-1的IC50確定為0.18μg/mL/酶單位而對COX-2的IC50為0.28μg/mL/酶單位。
圖4所示為從兒茶(A.catechu)分離的含50％總黃烷的標準化黃烷提取物對COX-1和COX-2的抑制曲線。測定該提取物對重組綿羊COX-1(◆)和綿羊COX-2(■)的過氧化物酶活性的抑制作用。數(shù)據(jù)顯示為百分抑制率對抑制劑濃度(μg/mL)作圖。對COX-1的IC50計算為0.17μg/mL/酶單位而對COX-2的IC50計算為0.41μg/mL/酶單位。
圖5所示為包含大于90％的從兒茶分離的黃烷的組合物對COX-1和COX-2的抑制曲線。測定該提取物對重組綿羊COX-1(◆)和綿羊COX-2(■)的過氧化物酶活性的抑制作用。數(shù)據(jù)顯示為百分抑制率對抑制劑濃度(μg/mL)作圖。對COX-1的IC50計算為0.11μg/mL/酶單位而對COX-2的IC50計算為0.42μg/mL/酶單位。
圖6所示為從黃芩根分離的無取代B環(huán)類黃酮提取物和從兒茶樹皮分離的黃烷提取物以80∶20的比例結(jié)合制成的制劑對COX-1和COX-2的抑制曲線。測定下文稱之為UP676的該組合物對重組綿羊COX-1(◆)和綿羊COX-2(■)的過氧化物酶活性的抑制作用。數(shù)據(jù)顯示為百分抑制率對抑制劑濃度(μg/mL)作圖。對COX-1的IC50為2μg/mL/酶單位而對COX-2的IC50為4μg/mL/酶單位。
圖7所示為從黃芩根分離的無取代B環(huán)類黃酮提取物和從兒茶樹皮分離的黃烷提取物以約50∶50的比例結(jié)合制成的制劑對COX-1和COX-2的抑制曲線。測定該組合物對重組綿羊COX-1(◆)和綿羊COX-2(■)的過氧化物酶活性的抑制作用。數(shù)據(jù)顯示為百分抑制率對抑制劑濃度(μg/mL)作圖。對COX-1的IC50計算為0.38μg/mL/酶單位而對COX-2的IC50確定為0.84μg/mL/酶單位。
圖8所示為從黃芩根分離的無取代B環(huán)類黃酮提取物和從兒茶樹皮分離的黃烷提取物以約20∶80的比例結(jié)合制成的制劑對COX-1和COX-2的抑制曲線。測定該組合物對重組綿羊COX-1(◆)和綿羊COX-2(■)的過氧化物酶活性的抑制作用。數(shù)據(jù)顯示為百分抑制率對抑制劑濃度(μg/mL)作圖。該組合物對COX-1的IC50為0.18μg/mL/酶單位而對COX-2的IC50為0.41μg/mL/酶單位。
圖9所示為從兒茶分離的黃烷提取物對5-LO的抑制曲線。如實施例4所示，測定該組合物對重組馬鈴薯5-脂氧合酶活性(◆)的抑制作用。數(shù)據(jù)顯示為在無抑制劑測試下的百分抑制率。對5-LO的IC50為1.38μg/mL/酶單位。
圖10所示為在實施例9所述條件下進行的包含80∶20比例的從黃芩根分離的無取代B環(huán)類黃酮和從兒茶樹皮分離的黃烷的混合物的典型制劑的高壓液相色譜分析(HPLC)的色譜圖。
圖11所示為如實施例10所示在THP-1或HT-29細胞(ATCC)經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附法測定(ELISA)中增加UP676的濃度對于LPS誘導新合成的白三烯B4(LTB4)量的影響(◆)。UP676是通過將從黃芩根中分離的無取代B環(huán)類黃酮以及從兒茶樹皮中分離的黃烷的標準提取物以80∶20的比例相結(jié)合而制成。UP676制劑的活性以對誘導LTB4合成的抑制％來表示。
圖12所示為如實施例10中所示，將由ELISA測定的于未誘導的細胞中以3μg/mL UP676處理后殘留在HT-29細胞中的LTB4水平同以3μg/mL布洛芬的處理結(jié)果的對比。結(jié)果證實該UP676制劑在處理兩天后在HT-29細胞中抑制80％的LTB4生成。
圖13圖示了如實施例12所示的用于衡量對炎癥的抑制作用的耳腫脹數(shù)據(jù)。通過從黃芩根中分離的無取代B環(huán)類黃酮及從兒茶的樹皮中分離的黃烷的標準提取物以80∶20的比例混合而制成UP676，并與不經(jīng)處理的小鼠和經(jīng)喂飼法給予吲哚美辛(1.5mg/kg)的小鼠進行比較。數(shù)據(jù)顯示為未處理組與處理組中每只小鼠耳垂的微米測量的差異。
圖14所示為如實施例13所示的經(jīng)UV照射之后不同處理組間無毛小鼠(hairless mouse)皮膚紅斑分值隨時間的變化圖。B-1、A-1、B-2和A-2組小鼠在照射之前(B-1、B-2組)或者照射之后(A-1、A-2)用UP676處理。UP676是通過從黃芩根中分離的無取代B環(huán)類黃酮及從兒茶的樹皮中分離的黃烷的標準提取物以80∶20的比例混合制成。參照圖14，可以看出與對照組及標準治療劑Sooth-a-Caine相比在照射前及照射后局部施用UP676均使紅斑分值顯著降低。
圖15所示為在實施例15所述條件下純兒茶素在不同水溶液中在第1、3、6、8及13天時的濃度變化圖。
圖16所示為多種可防止純兒茶素在pH為7.5的水溶液中降解和顏色發(fā)生變化的化學保存劑。
圖17所示為10個健康受試者(n＝10，6位女性，4位男性)口服給予單劑量300mg UP676后，無取代B環(huán)類黃酮對時間的平均血清濃度。平均Cmax為0.93μg/ml(％RSD＝84.9)，平均Tmax約為5.8小時(％RSD＝43.4)。
具體實施例方式
此處所使用的各種術(shù)語涉及本發(fā)明的多個方面。提供以下定義以幫助闡明對本發(fā)明各成分的說明。
應(yīng)注意此處所用術(shù)語“a”或“an”實體是指一個或多個該實體；例如aflavonoid指一種或多種類黃酮。同樣地，術(shù)語“a”或“an”、“一個或多個”和“至少一個”在此處可互相替換。
此處所用的“無取代B環(huán)類黃酮”為一類特殊的類黃酮，如下列結(jié)構(gòu)通式所示，其芳香B環(huán)無取代基 其中R1、R2、R3、R4和R5獨立地選自以下組中-H、-OH、-SH、-OR、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、-NR3+X-，單個糖或者多個糖組合的糖苷，其中所述糖苷是通過碳、氧、氮或硫連接到7-羥基色酮上，并且其中所述單個糖或多個糖的組合包括但不限于戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖以及它們的化學衍生物；其中R是具有1-10個碳原子的烷基；以及X選自藥物學可接受的抗衡陰離子，其包括但不限于羥基、氯離子、碘離子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟離子以及碳酸根等。
本文所述的“黃烷”為一類特殊的類黃酮，其通常可由下列結(jié)構(gòu)通式代表 其中R1、R2、R3、R4和R5獨立地選自以下組中-H、-OH、-SH、-OCH3、-SCH3、-OR、-SR、-NH2、-NRH、-NR2、-NR3+X-，所述取代基的酯，包括但不限于沒食子酸酯、乙酸酯、肉桂酰和羥基肉桂酰酯、三羥基苯甲酰酯和咖啡酰酯、以及它們的化學衍生物，單個糖或者多個糖組合的糖苷，其中所述糖苷是通過碳、氧、氮或硫連接到7-羥基色酮上，并且其中所述單個糖或者多個糖的組合包括但不限于戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖以及它們的化學衍生物以及其他聚合的黃烷；其中R是具有1-10個碳原子的烷基；以及X選自藥物學可接受的抗衡陰離子，其包括但不限于羥基、氯離子、碘離子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟離子、碳酸根等。
本文所用“治療的”包括治療和/或預防。當使用時，治療是針對人類以及其他動物。
“藥物學或治療有效的劑量或量”指足以引發(fā)所需生物學結(jié)果的劑量水平。該結(jié)果可以是病征、癥狀或疾病的起因的緩解或任何其他所需的生物學系統(tǒng)的改變。精確劑量根據(jù)各種因素而不同，包括但不限于對象的年齡及尺寸、疾病及所實施的治療。
“安慰劑”指由非活性物質(zhì)替代足以引發(fā)所需的可緩解病征、癥狀或疾病的起因的生物學結(jié)果的藥物學或治療有效的劑量或量。
“主體”或“患者”本文所述的組合物所要給藥的活著的對象，其為人或動物。因此，本文所述的發(fā)明可以用于獸醫(yī)以及人類應(yīng)用，并且術(shù)語“患者”或“主體”不應(yīng)該以限制性的方法來理解。就獸醫(yī)應(yīng)用而言，考慮到動物體重，其劑量范圍可以按下文所述來確定。
此處所用的“藥物學可接受的載體”是指任何不干擾活性成分生物活性的有效性并對其所給藥的主體無毒的載體?！八幬飳W可接受的載體”的實例包括但不限于任何標準藥物載體如鹽水溶液即林格溶液、緩沖鹽溶液、水、葡萄糖溶液、血清白蛋白，以及其它用于片劑和膠囊劑型的賦形劑和保存劑。
“基因表達”是指基因轉(zhuǎn)錄至mRNA。
“蛋白表達”是指將mRNA翻譯成蛋白質(zhì)。
此處所用的“RT-qPCR”是指將mRNA分子逆轉(zhuǎn)錄(RT)為cDNA分子，之后使用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)并與熒光報道基團(fluorescentreporter)相結(jié)合對基因表達的水平加以定量評價的方法。
注意本申請全文中提供各種引用。各個引用分別具體地全文并入此處作為參考。
本發(fā)明提供用有機溶劑和含水溶劑提取含有無取代B環(huán)類黃酮的植物，包括黃芩屬的三個種和木蝴蝶(Oroxulum indicum)以及含有黃烷的植物，包括兒茶和鉤藤(Uncaria)屬的三個種的方法(實施例1，表1)。測定該粗提物的環(huán)氧合酶抑制活性(實施例2，表2和3)。如實施例3和4以及表4所示，純化的無取代B環(huán)類黃酮和黃烷分別對環(huán)氧合酶(COX)和脂氧合酶(LOX)顯示抑制活性。該提取物的分析和定量方法如實施例5和6所示，并且從植物來源制備標準化的無取代B環(huán)類黃酮和黃烷的方法在實施例7和8中提供。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，該標準化的無取代B環(huán)類黃酮提取物包含如實施例1、2、5和8中所定義的具有1-99重量％純度的總無取代B環(huán)類黃酮活性化合物。黃芩苷是源自黃芩屬的提取物中的主要活性成分，它占總無取代B環(huán)類黃酮的大約50-90重量％。在一個優(yōu)選的具體實施方案(實施例9)，源自黃芩屬的該標準化提取物包含＞82％的總無取代B環(huán)類黃酮，其中以無取代B環(huán)類黃酮的重量計主要成分是黃芩苷(見表11)。
在一個具體實施方案中，該標準化的黃烷提取物包含如實施例1、4、6和7中所定義的具有1-99重量％純度的總黃烷活性化合物。兒茶素是源自兒茶和兒茶鉤藤的提取物中的主要活性成分，它占總黃烷的大約30-95重量％。在一個優(yōu)選的具體實施方案(實施例9)中，該源自兒茶的標準化黃烷提取物含＞80％的兒茶素。
在一個具體實施方案中，UF676是通過以99∶1至1∶99的比例混合上述兩種提取物或者合成化合物來制備。如實施例9和表11所定義，無取代B環(huán)類黃酮與黃烷的優(yōu)選重量比為80∶20。
無取代B環(huán)類黃酮在UP676中的濃度可以是從大約1％到99％，而黃烷在UP676中的濃度可以是從大約99％到1％。在本發(fā)明一個優(yōu)選的具體實施方案中，如實施例9和表11所示，總無取代B環(huán)類黃酮在UP676中的濃度大約為75％，其中黃芩苷含量占UP676總重量的大約60％；而總黃烷在UP676中的濃度大約為10％，其中兒茶素含量占大約9.9％。在這一具體實施方案中，總活性成分(無取代B環(huán)類黃酮加黃烷)在UP676中占總重量的＞85％。
本發(fā)明包括可同時既有效地抑制類花生酸途徑又有效地抑制細胞因子途徑的方法，其可用于預防和治療牙周疾病和牙齦病癥。該雙重調(diào)節(jié)類花生酸及細胞因子途徑的方法包括向有此需要的主體全身或局部給藥包含合成和/或從單一植物或多種植物分離的無取代B環(huán)類黃酮和黃烷的混合物的組合物。本文將該組合物稱作UP676。該方法的功效用純化酶在不同細胞系、多種動物模型并且最終于人體臨床試驗中得以證實。組合物中的無取代B環(huán)類黃酮與黃烷的比例范圍可為99.9∶0.1無取代B環(huán)類黃酮比黃烷到0.1∶99.9無取代B環(huán)類黃酮比黃烷。在本發(fā)明的特定具體實施方案中，無取代B環(huán)類黃酮與黃烷的比例選自以下組中約90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80和10∶90。在本發(fā)明優(yōu)選的具體實施方案中，組合物中無取代B環(huán)類黃酮與黃烷的比例為80∶20。在優(yōu)選的具體實施方案中，無取代B環(huán)類黃酮從一種或多種黃芩屬植物中分離，黃烷從一種或多種金合歡屬植物中分離。
本發(fā)明還包括同時既有效地抑制環(huán)氧合酶(COX)活性又有效地抑制脂氧合酶(LOX)活性的方法。該同時抑制環(huán)氧合酶活性(COX)及脂氧合酶(LOX)活性的方法包括向有此需要的主體全身或局部給藥有效量的包含合成和/或從一種或多種植物分離的無取代B環(huán)類黃酮和黃烷的混合物以及藥物學可接受載體的組合物。組合物中的無取代B環(huán)類黃酮與黃烷的比例范圍可為99.9∶0.1無取代B環(huán)類黃酮比黃烷到0.1∶99.9無取代B環(huán)類黃酮比黃烷。在本發(fā)明的具體實施方案中，無取代B環(huán)類黃酮與黃烷的比例選自以下組中約90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80和10∶90。在本發(fā)明優(yōu)選的具體實施方案中，組合物中無取代B環(huán)類黃酮與黃烷的比例為80∶20。在優(yōu)選的具體實施方案中，無取代B環(huán)類黃酮從一種或多種黃芩屬植物中分離，黃烷從一種或多種金合歡屬植物中分離。
本發(fā)明中還包括一種同時降低IL-1β、TNFα和IL-6以及與炎癥相關(guān)的其它蛋白質(zhì)的方法，用來預防和治療與口腔、牙齦及牙齒相關(guān)的疾病或癥狀。盡管不受理論所限，可以相信降低這些蛋白質(zhì)的機理是由于本發(fā)明組合物下調(diào)它們的基因表達所造成的。促炎細胞因子，尤其是IL-1β、TNFα和IL-6在牙周組織慢性感染中發(fā)揮重要作用。促炎細胞因子的誘導合成影響PDL細胞的表型和功能。這些細胞因子不僅在感染部位激活和募集免疫細胞，而且導致支持骨及韌帶連接流失。同時抑制促炎細胞因子，尤其是IL-1β、TNFα和IL-6的基因表達的方法包括向有此需要的主體全身或局部給藥包含合成和/或從一種或多種植物分離的無取代B環(huán)類黃酮和黃烷的混合物的組合物。本文將該組合物稱作UP676。組合物中的無取代B環(huán)類黃酮與黃烷的比例范圍可為99.9∶0.1無取代B環(huán)類黃酮比黃烷到0.1∶99.9無取代B環(huán)類黃酮比黃烷。在本發(fā)明的具體實施方案中，無取代B環(huán)類黃酮與黃烷的比例選自以下組中約90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80和10∶90。在本發(fā)明優(yōu)選的具體實施方案中，組合物中無取代B環(huán)類黃酮與黃烷的比例為20∶80。在另一優(yōu)選具體實施方案中，無取代B環(huán)類黃酮是從一種或多種黃芩屬植物中分離，黃烷從一種或多種金合歡屬植物中分離。
在一個具體實施方案中，本發(fā)明包括一種預防及治療許多與口腔、牙齦和牙齒有關(guān)的疾病和病癥的方法，該疾病和病癥包括但不限于牙周(齒齦)疾病如牙齦炎、侵襲性牙周炎、慢性牙周炎、根尖周炎、系統(tǒng)疾病所表現(xiàn)的牙周炎、以及壞死性牙周疾病，其中所述牙周疾病的起因包括但不限于慢性細菌感染、斑塊堆積、吸煙或咀嚼煙草、遺傳易感性、懷孕或青春期、壓力、藥物、以及糖尿病、營養(yǎng)不良和其他系統(tǒng)疾病所引起。
在另一具體實施方案中，本發(fā)明包括一種用于預防和治療敏感性牙齦和牙齒、后遺癥、牙髓炎，由移植假牙或其它材料所引起的刺激和疼痛的方法，促進傷口愈合、減少由創(chuàng)傷、損傷、夜磨牙癥及其它在口腔、牙齦或舌頭上的小損傷所引起的疼痛和炎癥的方法。在另一具體實施方案中，本發(fā)明包括預防和治療牙斑、牙垢、牙齒脫鈣、蛋白水解和齲齒(蛀蝕)的方法。
本發(fā)明還包括含有本發(fā)明的治療劑的治療組合物。除了用于預防和和治療上述口腔、牙和齒齦的疾病和病癥以外，本文所述的治療組合物還可用于維持最佳唾液生成、唾液pH值、最小化細菌生長、減少牙斑酸的生成、抑制礦物質(zhì)流失、促進礦質(zhì)補充、減少齲齒的患病率、形成健康牙齦、潔白牙齒、維持健康的口腔衛(wèi)生并減少口腔惡臭(口臭)。
可以根據(jù)本發(fā)明方法應(yīng)用的無取代B環(huán)類黃酮包括上述結(jié)構(gòu)通式所示的化合物。本發(fā)明的無取代B環(huán)類黃酮可由合成方法獲得，或從下列各科植物中提取，包括但不限于番荔枝科、Asteraceae、紫葳科、使君子科、菊科、大戟科、唇形科、樟科、豆科、?？啤⑺煽?、鳳尾蕨科、中國蕨科、榆科和姜科。該無取代B環(huán)類黃酮可由如下高等植物屬提取、濃縮并純化，包括但不限于假鷹爪屬、Achyrocline、木蝴蝶屬、Buchenavia、香青屬、山芫荽屬、鼠麴草屬、蠟菊屬、矢車菊屬、澤蘭屬、Baccharis、烏柏屬、黃芩屬、Molsa、羽萼木屬、水蘇屬、牛至屬、新塔花屬、山胡椒屬、黃肉楠屬、金合歡屬、魚藤屬、甘草屬、雞血藤屬、水黃皮屬、灰毛豆屬、木波羅屬、榕屬、粉葉蕨屬、隱囊蕨屬、松屬、榆屬和山姜屬。所述類黃酮存在于植物的不同部位中，包括但不限于莖、莖皮、嫩枝、塊莖、根、根皮、嫩梢、種子、根莖、花及其他生殖器官、葉及其他氣生部分。
于2002年3月1日遞交的名為“Identification of Free-B-RingFlavonoids as Potent COX-2 Inhibitors”的第10/091,362號美國專利申請以及于2003年8月27日遞交的名為“Identification of Free-B-Ring Flavonoidsas Potent COX-2 Inhibitors”的第10/469,275號美國專利申請公開了分離和純化無取代B環(huán)類黃酮的方法，這兩篇文獻的全文都被并入此處作為參考。
根據(jù)本發(fā)明方法可以應(yīng)用的黃烷包括上述結(jié)構(gòu)通式所示的化合物。本發(fā)明的黃烷可從選自金合歡或鉤藤屬的一種或者多種植物中提取。在一個優(yōu)選的具體實施方案中，所述植物選自以下組中兒茶、A.concinna、金合歡、阿拉伯膠樹、A.speciosa、阿拉伯金合歡、A.caesia、蛇藤、藤金合歡、黑荊樹、A.picnantha、白粉金合歡、大葉相思、A.holoserecia和馬占相思；或者兒茶鉤藤、恒春鉤藤、毛鉤藤、Uncaria africana、Uncariaellitica、Uncaria orientalis、Uncaria attenuate、Uncaria acida、北越鉤藤、白鉤藤、Uncaria sterrophylla、Uncaria bernaysii、華鉤藤、Uncariacallophylla、鉤藤、Uncaria tomentosa、Uncaria longiflora、毛鉤藤、Uncariacordata、和Uncaria borneensis。所述黃烷存在于植物的不同部位中，包括但不限于莖、莖皮、干、主干皮、嫩枝、塊莖、根、根皮、嫩梢、種子、根莖、花及其他生殖器官、葉及其他氣生部分。
于2002年3月22日遞交的名為“Isolation of a Dual Cox-2 and5-Lipoxygenase Inhibitor from Acacia”的第10/104,477號美國專利申請公開了黃烷的分離和純化方法，其全文并入此處作為參考。
本發(fā)明采用若干體內(nèi)炎癥和毒性研究及體外生化、細胞和基因表達篩選相結(jié)合的策略鑒定能特異性地抑制COX和LOX酶活性、影響mRNA基因表達以及減輕炎癥的活性植物提取物。本文用于鑒定能特異性地抑制COX和LOX的活性植物提取物的方法記載于實施例1和2中，還記載于2002年3月1日提交的序列號為10/091,362的、名為“Identification of Free-B-Ring Flavonoids as Potent Cox-2 Inhibitors”以及2002年3月22日遞交的名為“Isolation of a Dual Cox-2 and 5-LipoxygenaseInhibitor from Acacia”的第10/104,477號美國專利申請，以及于2003年4月30日提交的名為“Formulation With Dual Cox-2 And 5-LipoxygenaseInhibitory Activity”的第10/427,746號美國專利申請中，其分別全文并入此處作為參考。
本發(fā)明的組合物的各種應(yīng)用記載于2004年2月24日提交的序列號為10/785,704的名為“Inhibition of Carbohydrate Induced Obesity with aDefined Plant Extract”美國專利申請、2004年4月2日遞交的名為“Formulation of Dual COX-2 and 5-Lipoxygenase Inhibitors for mammalSkin Care”的第10/817,330號美國專利申請、2004年9月1日提交的名為“Formulation With Dual COX-2 and 5-Lipoxygenase Inhibitory Activityfor Use in the Prevention and Treatment of Cognitive Decline andAge-Relatd Memory Impairment”的第10/932,517號美國專利申請、以及于2004年8月27日提交的序列號為60/605,110的名為“Therapeutic Agentfor the Down-Regulation of Multiple Cytokine Genes”的美國專利申請中，這些申請各自全文并入此處作為參考。
用于測定COX抑制的生化試驗取決于在血紅素和花生四烯酸存在下的蛋白質(zhì)過氧化物酶活性。實施例3所述的該項研究表明從黃芩中分離的純化的無取代B環(huán)類黃酮、黃芩苷和黃芩黃素和從兒茶中分離的黃烷提取物以及含有高濃度的無取代B環(huán)類黃酮和黃烷的各個單獨的標準化提取物抑制COX活性(圖1-5)。此外，按照實施例9所示制備的具有不同比例的各種單獨的標準化提取物(即，80∶20、50∶50和20∶80無取代B環(huán)類黃酮黃烷)的組合物在體外都能高度有效地抑制COX活性(圖6-8)。
本文還清楚地證實無取代B環(huán)類黃酮和黃烷的組合能更加平衡地調(diào)節(jié)COX-1和COX-2酶。例如，對COX-1比對COX-2更有效150倍的COX-1選擇性抑制劑阿司匹林會導致胃腸道副作用。相反，對COX-2酶比對COX-1酶更有效50-200倍的COX-2抑制劑萬絡(luò)(vioxx)、西樂葆(celebrex)和Bextra不會導致如此嚴重的胃腸道損傷，然而，這些COX-2選擇性藥物增加心血管危險。另一方面，無取代B環(huán)類黃酮和黃烷的制劑在黃芩苷較強的COX-2活性和兒茶素較強的COX-1活性之間達到平衡。在UP676制劑中兒茶素對COX-1酶的中等選擇性(2.3倍)起到降低選擇性COX-2抑制劑導致的心血管危險的作用。
還很重要的是上述引用的目前可用的藥物和天然制劑—UP676的作用機理完全不同。阿司匹林、萬絡(luò)、西樂葆和Bextra都是通過共價鍵與COX酶不可逆地結(jié)合，以形成緊密結(jié)合的酶-抑制劑復合物。如此強大的相互作用完全改變了酶的活性位點及側(cè)袋(side pocket)而損傷酶(Walker Mc.，Kurumbal RG.，等.(2001)Biochem.357709-718)。另一方面，在UP676中的類黃酮由于具有抗氧化性而通過較弱及可逆的結(jié)合抑制COX酶。在此相互作用的過程中，COX酶的結(jié)構(gòu)和功能沒有發(fā)生不可逆的改變，這導致UP676具有更好的耐受性和安全性。
如實施例4所述，采用脂氧合酶體外篩選試驗來評價從兒茶中分離的黃烷提取物對LOX活性的抑制。結(jié)果如圖9所示。通過向無取代B環(huán)類黃酮中加入黃烷，UP676也可抑制5-LOX的活性。對5-LOX的抑制作用導致吞噬性(phagocytic)白三烯的積累減少，其與慢性炎癥的癥狀有直接關(guān)系，并且可以減少潛在的胃腸道副作用。這種效力在實施例10和圖11、12中得以證實。簡而言之，如實施例10所述，使用UP676樣品進行目標為抑制LOX途徑中花生四烯酸分解產(chǎn)生的化合物即LTB4的細胞試驗。UP676對LTB4的抑制作用如圖12所示。根據(jù)此圖所示結(jié)果，明顯可見無取代B環(huán)類黃酮與黃烷的組合對減少細胞白三烯生成提供了額外的好處。目前，這種減少細胞白三烯生成的作用優(yōu)于傳統(tǒng)的非甾體抗炎藥如布洛芬。
實施例11表明UP676可有效地抑制人體細胞中包括IL-1β、TNFα和IL-6的一組促炎細胞因子的基因表達。本實驗是采用脂多糖(LPS)刺激的人外周血單細胞(PBMC)而進行，這是一種完善的炎癥細胞模型。當細胞與不同濃度(0、10、30、和100μg/mL)的UP676共同溫育時，促炎細胞因子的基因表達受到劑量依賴性的抑制。(表12)。
促炎細胞因子特別是IL-1β、TNFα和IL-6在牙周組織慢性感染中發(fā)揮重要作用。它們不僅在感染部位激活和募集免疫細胞，而且誘導支持骨及韌帶連接流失。已確定病變的牙周組織中這些細胞因子基因的mRNA水平升高且促炎細胞因子的合成影響PDL細胞的表型和功能。由于UP676在mRNA水平同時強烈抑制包括IL-1β、TNFα和IL-6的促炎細胞因子，因此它為治療牙周疾病提供了有效的方法。
如實施例12所述，通過將皮膚刺激物如AA施用于小鼠耳部或踝關(guān)節(jié)(以模仿牙周組織對細菌感染和牙斑的生物反應(yīng))并測量用UP676處理的小鼠腫脹降低的情況驗證體內(nèi)效力。結(jié)果如圖13所示。根據(jù)該圖可見，以50mg/kg到200mg/kg的劑量口服給藥UP676顯著地降低了由局部刺激所引起的小鼠耳腫脹。
如實施例13和圖14所述，局部施用UP676的效力是利用另一動物模型通過其預防和治療UV誘導的皮膚紅斑的作用得以進一步證實。在實施例13所述的研究中，將混合比例為無取代B環(huán)類黃酮黃烷為80∶20的UP676溶于水中，并在暴露于UV前和暴露后分別使用兩種濃度局部施用于無毛小鼠皮膚處。與對照組和經(jīng)Sooth-A Cain處理組顯示出嚴重而擴大的紅斑對比，來自經(jīng)UP676處理的四組無毛小鼠的紅斑得分，無論施用時間是UV暴露之前還是之后，在兩種濃度下均顯示出形成紅斑的紅色程度較低，皮膚面積較小。該研究表明UP676可滲入無毛小鼠皮膚以降低炎癥反應(yīng)。盡管不受理論所限，可以相信這一結(jié)果是通過同時抑制類花生酸和細胞因子途徑實現(xiàn)的。
實施例14(表13)描述了采用藥理學、皮膚病學及美容學適用的賦形劑制備UP676乳劑的通法。為了舉例說明，該實施例提供了制備0.5重量％UP676局部用乳劑的詳細過程。本發(fā)明的組合物還可以配制成藥物組合物，其包括其它成分如從藥物學和/或美容學可接受的賦形劑、佐劑、調(diào)味劑和/或載體。例如，本發(fā)明的組合物可以在所要治療的主體對其耐受的賦形劑中配制。賦形劑是用作藥物的稀釋劑或載體的惰性物質(zhì)。所述賦形劑的例子包括但不局限于水、醇(乙醇或乙二醇、丙二醇)、緩沖液、鹽水、水化二氧化硅、葡萄糖溶液、羧甲基纖維素(cellulose gum)、山梨醇、甘露醇、保存劑和其它水性生理平衡鹽溶液。該治療組合物還可以含有少量添加劑，例如提高等滲性和化學穩(wěn)定性的物質(zhì)。如實施例17所述，所述保存劑包括但不限于BHA、BHT、檸檬酸二銨(DAC)、丁羥甲苯、乙二胺四乙酸(EDTA)、H2O2、沒食子酸丙酯(PG)、葡萄糖酸鈉(SG)、硫酸氫鈉/焦亞硫酸鈉(SBS)、月桂基硫酸鈉、氯化亞錫、氟化亞錫、苯甲酸鈉、苯甲酸。非水載體如不揮發(fā)油、芝麻油、油酸乙酯或甘油三酸酯都可以使用。其它可用的劑型包括含有增粘劑如羧甲基纖維素鈉、山梨醇、黃原膠、甲基纖維素或葡聚糖的混懸劑。緩沖液的實例包括磷酸鹽緩沖液、碳酸氫鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液、組氨酸、檸檬酸鹽和甘氨酸或其混合物，而保存劑的實例包括但不限于硫柳汞、間-或鄰-甲酚、福爾馬林和芐醇。標準制劑可以是液體或凝膠或糊劑或固體，它們可以作為混懸液或溶液制成適當?shù)男问接糜诮o藥。
在一個具體實施方案中，該組合物制備成為控釋劑型，它可以將本發(fā)明的組合物緩慢地釋放于主體內(nèi)。本文所使用的控釋劑型包括控釋載體中的本發(fā)明組合物。適合的控釋載體為本領(lǐng)域中的技術(shù)人員所知。優(yōu)選的控釋制劑是可生物降解的(即可生物侵蝕的)。
實施例15舉例說明了兒茶素在不同pH和保存劑的溶液中的穩(wěn)定性。兒茶素含有四個酚羥基，這使得這個化合物具有較強的酸性并對氧化應(yīng)激敏感。兒茶素氧自由基吸收容量極高(ORAC為20,000)，說明其具有抗氧化性。如圖15所述，基于純兒茶素在不同條件如pH、H2O2和金屬離子的存在下的應(yīng)激實驗，確定兒茶素在中性條件并且在4℃和40℃時穩(wěn)定而在堿性條件下或暴露于金屬離子如Fe3+中不穩(wěn)定。甚至在弱堿條件下(pH＝7.5)兒茶素也會分解。但是，它能夠保存于多種保存劑中，包括但不局限于氯化亞錫(SnCl2)、硫酸氫鈉/焦亞硫酸鈉(SBS)和圖16中所列的其它保存劑。
在優(yōu)選的具體實施方案中，將此兩類化合物相組合的另外一個優(yōu)點在于，含有大量的無取代B環(huán)類黃酮(80重量％)與相對低濃度的黃烷(20重量％)的制劑中，更有效的抗氧化劑黃烷起抗氧化降解的天然保存劑的作用，并在制劑中作為中和劑和緩沖劑用于在最適pH和電離條件下傳遞主要活性成分——無取代B環(huán)類黃酮。
實施例16舉例說明了在人體口服給藥之后UP676中的活性成分的生物利用度。結(jié)果如圖17所示。根據(jù)圖17，該分析中看到的寬的誤差柱(error bar)是由于實驗對象之間的個體差異造成的。性別和體重的差異與Cmax和Tmax或吸收和清除所觀察到的差異不相關(guān)?？梢郧宄淖C實UP676中的無取代B環(huán)類黃酮可以滲入表皮細胞。但是，無取代B環(huán)類黃酮在人體液如血清中并不是以苷元如黃芩黃素的形式存在，而是以如黃芩苷或硫酸黃芩黃素的結(jié)合結(jié)構(gòu)存在。為了定量血清中無取代B環(huán)類黃酮的總濃度，利用兩種酶將所有結(jié)合化合物水解從而釋放苷元——黃芩黃素，然后利用HPLC對其進行定量測定。
表14顯示每個對象所觀察到的最大黃芩黃素濃度(Cmax，μg/mL)和觀察到的時間(Tmax，小時)。該數(shù)據(jù)顯示，大多數(shù)對象在給予首劑量后的4到8小時之間達到最大濃度。平均Cmax為0.93μg/mL(％RSD＝84.9)，平均Tmax大約為5.8小時(％RSD＝43.4)。根據(jù)該數(shù)據(jù)，可以計算出吸收和清除的平均時間，并對整個研究組做圖(圖17)。如圖6所示，由于UP676對COX酶抑制作用的IC50在0.2-0.4μg/mL之間，因此UP676在口服給藥兩個小時后達到有效濃度。但是在口服給藥后大約10小時，血清中無取代B環(huán)類黃酮的濃度將保持治療水平之上。為了補償無取代B環(huán)類黃酮不能快速生物利用的問題，兒茶素型黃烷制劑提供了有益的補充。關(guān)于兒茶素、槲皮素和表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯生物利用度的研究(Kao等，(2000)Endocrinology141(3)980-987；Koga和Meydani(2001)Am.J.Clin.Nutr.73941-948；Lee等，(2002)CancerEpidemiol.Biomarker Prevention111025-1032)表明兒茶素的Cmax和Tmax迅速出現(xiàn)(大約45分鐘)而半衰期據(jù)報道為2小時。因此，通過無取代B環(huán)類黃酮與黃烷的結(jié)合，滲透快的兒茶素在口服給藥后0.5小時達到有效血清濃度。當兒茶素濃度下降時，第二種活性成分無取代B環(huán)類黃酮達到生物活性濃度并將維持至口服給藥后12個小時?？偠灾琔P676制劑設(shè)計成既具有由黃烷如兒茶素導致的快速就地減輕牙周疼痛及抗炎作用，又具有由無取代B環(huán)類黃酮如黃芩苷導致的持久效果。這種協(xié)同和互補作用還可以通過制劑的局部傳遞來實現(xiàn)。
實施例17闡明了對人體皮膚局部施用UP676的安全性。對如實施例9和14所述配制的UP676對人體皮膚潛在的刺激性和接觸致敏的誘導進行評價。分別有總數(shù)為97和101個受試者完成了以0.5％和1.5％U676乳膏進行誘導和刺激。實驗結(jié)果表明UP676乳膏在0.5％和1.5％濃度下產(chǎn)生的刺激很小并且不引發(fā)誘導接觸致敏的跡象。
總之，本發(fā)明的組合物可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的任何方法給藥。給藥方法包括但不限于腸內(nèi)(口服)給藥、非胃腸道(靜脈內(nèi)、皮下和肌內(nèi))給藥和局部施用。本發(fā)明的治療方法包括向有此需要的患者體內(nèi)(internally)或局部給藥治療有效量的合成和/或自一種或多種植物分離的無取代B環(huán)類黃酮和黃烷的混合物。在一個具體實施方案中，該組合物是經(jīng)局部給藥。本發(fā)明的治療劑可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的任何適宜局部給藥治療組合物的方式局部給藥，所述給藥方式包括但不限于作為糊劑、軟膏劑、凝膠劑、洗劑或漱口液或膏基，或作為乳劑、貼片、敷料或面膜、不粘的紗布、繃帶、藥簽、或抹布(cloth wipe)。這種局部施用可以使用任何已知的局部給藥的標準方法比如用牙刷刷、涂敷在牙線上、或用藥簽施用或用液體或凝膠劑清洗來局部地給藥于任何疾患部位。根據(jù)給藥方法不同，治療組合物可以各種單位劑量形式給藥。對于特殊的傳遞方法，本發(fā)明的治療組合物可以在本發(fā)明的賦形劑中配制。本發(fā)明的治療試劑可以對任何主體，優(yōu)選為哺乳動物，更優(yōu)選為人類給藥。具體給藥方法將取決于所治療的病癥。
在一個具體實施方案中，適宜的軟膏包含的所需濃度的無取代B環(huán)類黃酮和黃烷的混合物是有效、無毒的量，其通常選自局部制劑總重量的0.001％到100％、牙膏的0.05％到5％(優(yōu)選為0.1％到0.5％)、漱口液的0.01％到5％(優(yōu)選為0.2％到1％)、乳劑、凝膠或乳膏的0.1％到25％(優(yōu)選為0.5％到5％)的范圍內(nèi)。
不管給藥方式如何，具體劑量均根據(jù)主體的大致體重來計算。確定上述每種制劑用于治療的適宜劑量所必需的進一步的精細計算通常是由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員常規(guī)地完成的，并在他們通常進行的任務(wù)范圍內(nèi)，而無需過多的實驗，特別是在根據(jù)本文公開的劑量信息和試驗的情況下。這些劑量可以通過應(yīng)用已建立的與適當?shù)膭┝糠磻?yīng)數(shù)據(jù)聯(lián)合應(yīng)用的用于確定劑量的試驗來確定。
應(yīng)注意的是，此處公開的發(fā)明可以用于獸醫(yī)以及人類應(yīng)用，并且術(shù)語“主體”不應(yīng)被限制性地解釋。就獸醫(yī)應(yīng)用而言，考慮到動物體重，其劑量范圍可如上所述確定。
下列實施例僅供舉例說明目的而并非意圖限制本發(fā)明的范圍。
實施例實施例1由金合歡和黃芩屬植物制備有機及水提物。
將源于兒茶樹皮、直萼黃芩根、黃芩根或美黃芩(Scutellarialateriflora)整株及各種木蝴蝶及鉤藤屬的植物原料磨成粒徑不大于2mm。然后將干燥的磨碎的植物原料(60g)轉(zhuǎn)移至錐形瓶中并加入甲醇二氯甲烷(1∶1)(600mL)。混合物振搖一小時，過濾并用甲醇二氯甲烷(1∶1)(600mL)再次提取生物質(zhì)。合并有機提取物且真空蒸發(fā)得到有機提取物(見下表1)。經(jīng)有機提取后，將生物質(zhì)風干并用超純水(600mL)提取一次。水溶液經(jīng)過濾和凍干得到水提物(見下表1)。
表1.各種植物中有機及水提物的產(chǎn)率

實施例2、來源于兒茶、各種黃芩屬植物及其它植物的植物提取物對COX-2和COX-1過氧化物酶活性的抑制如下所述，用于鑒定特異性COX-2抑制劑的生物測定指導的篩選方法設(shè)計為測定該酶的過氧化物酶活性。
過氧化物酶測定。修改檢測COX-2抑制劑的試驗用于高通量平臺(Raz)。簡而言之，將過氧化物酶緩沖液(100mM TBS，5mM EDTA，1μM血紅素，1mg腎上腺素，0.094％苯酚)中的重組綿羊COX-2(Cayman)與提取物(1∶500稀釋)一同溫育15分鐘。加入Quantablu(Pierce)底物并在25℃顯色45分鐘。用Wallac Victor 2讀板器讀取熒光。結(jié)果如表2所示。
表2顯示從三種植物包括兒茶樹皮、兩種黃芩根中獲得的包含結(jié)構(gòu)相似的無取代B環(huán)類黃酮物的有機提取物(20μg/mL)和水提物(20μg/mL)對COX-2酶的抑制。數(shù)據(jù)是以相對于重組綿羊COX-2酶和單獨底物的過氧化物酶活性的百分數(shù)來表示。有機提取物的抑制百分數(shù)范圍為30％到90％。
表2.各種不同種的植物對COX-2過氧化物酶活性的抑制

比較COX-1和COX-2同種型的相對抑制需要得到每種酶的IC50值。IC50值定義為特定抑制劑達到相對于對照而言抑制50％酶活性時的濃度。如表3所示，在這些實驗中發(fā)現(xiàn)對COX-2和COX-1酶的IC50值的范圍分別為6-50μg/mL及7-80μg/mL。比較COX-2和COX-1的IC50值證實了來源于各種植物的有機提取物對于每種酶的特異性。例如美黃芩的有機提取物對COX-2的抑制優(yōu)先于對COX-1的抑制，其IC50值分別為30和80μg/mL。盡管一些提取物顯示出優(yōu)先抑制COX-2，但其它并不如此。檢測HTP部分及從這些部分獲得的純化的化合物對于測定這些提取物和化合物真實的抑制特異性是必要的。
表3.有機提取物對于人和綿羊COX-2及COX-1的IC50值

實施例3、COX-1和COX-2過氧化物酶活件的抑制為了篩選抑制COX-1和COX-2活性的化合物，開發(fā)了一種利用對兩種酶過氧化物酶活性的抑制作用的高通量體外試驗(Needleman等.(1986)Annu Rev Biochem.5569)。簡而言之，用待測的組合物或化合物滴定固定量的COX-1和COX-2酶。試驗中包括可裂解的過氧化物生色團，以在花生四烯酸作為輔因子存在下使每種酶的過氧化物酶活性可視化。通常，試驗以96孔格式進行。將取自10mg/mL溶于100％DMSO中的儲備液的每種抑制劑在室溫條件下用以下濃度各測量三次0、0.1、1、5、10、20、50、100及500μg/mL。每孔加入150μL 100mM Tris-HCl(pH 7.5)以及10μL 22μM稀釋于三羥甲基氨基甲烷緩沖液的高鐵血色素、10μL稀釋于DMSO中的抑制劑及25個單位的COX-1或COX-2酶。將各成分在旋轉(zhuǎn)臺上混合10秒后加入20μL 2mM的N，N，N’，N’-四甲基對苯二胺二鹽酸鹽(TMPD)及20μL 1.1 mM的花生四烯酸以啟動反應(yīng)。將板振搖10秒鐘，然后在溫育5分鐘后于570nm處讀取吸光度。用抑制劑濃度對抑制％作圖，并通過沿等溫線取半數(shù)最大值點并和X軸上的濃度相交以確定IC50。實驗中將IC50對酶單位數(shù)歸一化。20μg/mL的純無取代B環(huán)類黃酮的COX-1/COX-2抑制活性總結(jié)在表4中。
表4.純化的無取代B環(huán)類黃酮對COX酶活性的抑制作用

從黃芩根中分離的標準化的無取代B環(huán)類黃酮提取物、黃芩苷及黃芩黃素的劑量反應(yīng)和IC50值分別提供在圖1、2和3中。從兒茶心材中分離的兩種標準化的黃烷提取物(分別為50％及＞90％黃烷)的劑量反應(yīng)和IC50值分別提供在圖4和圖5中。不同組分的無取代B環(huán)類黃酮和黃烷的三種制劑的劑量反應(yīng)和IC50值分別提供在圖6(80∶20混合)、圖7(50∶50混合)和圖8(20∶80混合)中。
實施例4.從兒茶分離的兒茶素對5-脂氧合酶的抑制炎癥反應(yīng)中涉及的最重要的途徑之一是由非血紅素的、含鐵的脂氧合酶(5-LO，12-LO及15-LO)所產(chǎn)生，其催化分子氧加成到脂肪酸例如AA(AA)上產(chǎn)生氫過氧化物5-、12-及15-HPETE，其然后轉(zhuǎn)化為白三烯。初步的跡象顯示源自兒茶的黃烷提取物能提供一定程度的LOX抑制，從而阻止5-HPETE的生成。采用脂氧合酶抑制劑篩選測定試劑盒(Cayman Chemical，Inc.，Cat# 760700)以評價自兒茶分離的包含＞90％黃烷的提取物是否直接在體外抑制LOX。在通過微孔過濾完成由磷酸鹽到基于三羧甲基氨基甲烷的緩沖液的緩沖液更換后，用馬鈴薯LOX代替源自大豆的通常用于試劑盒中的15-LO。該測定通過氧敏產(chǎn)色(oxygensensing chromagen)檢測氫過氧化物的生成。簡而言之，加入0.17單位/μL的馬鈴薯5-LO 90μL、1.1mM的AA 20μL、氧敏產(chǎn)色劑100μL以及10μL純化的黃烷抑制劑至最終濃度在0到500μg/mL范圍，以此一式三份進行測定。該組合物抑制5-LO的IC50經(jīng)測定為1.38μg/mL/酶單位。結(jié)果如圖9所示。
實施例5.自直萼黃芩(根)和黃芩(根)分離的活性提取物中無取代B環(huán)類黃酮的HPLC定量分析通過HPLC測定如實施例1和2所述從三種不同植物分離的五種活性提取物中的無取代B環(huán)類黃酮的存在和定量，結(jié)果如下表5所示。無取代B環(huán)類黃酮是通過HPLC在Luna C-18柱(250×4.5mm，5μm)上用1％的磷酸和乙腈從80％到20％梯度洗脫22分鐘來進行定量分析。利用紫外檢測器在245nm檢測無取代B環(huán)類黃酮并通過與黃芩苷、黃芩黃素及其它無取代B環(huán)類黃酮標準品比較保留時間來鑒別。
表5.活性植物提取物中的無取代B環(huán)類黃酮含量

實施例6.兒茶活性提取物的HPLC定量分析通過HPLC使用光電二極管陣列檢測器(HPLC/PDA)和Luna C18柱(250×4.5mm)定量分析如實施例1和2所述的自兒茶分離的有機及水提物中的黃烷。用乙腈梯度洗脫，從10％到30％乙腈洗脫20分鐘，接下來用60％乙腈洗脫5分鐘從而將黃烷自色譜柱上洗脫。結(jié)果如表6所示。根據(jù)保留時間和PDA數(shù)據(jù)以兒茶素和表兒茶素作為標準品對黃烷進行定量。這兩種主要的黃烷的保留時間分別為12.73分鐘和15.76分鐘。
表6.活性植物提取物中的兒茶素含量

實施例7.源自兒茶的標準化提取物的制備將兒茶(500mg磨碎的根)用25mL(2×25mL)下列溶劑系統(tǒng)提取兩次。(1)100％水，(2)80∶20水∶甲醇，(3)60∶40水∶甲醇，(4)40∶60水∶甲醇，(5)20∶80水∶甲醇，(6)100％甲醇，(7)80∶20甲醇∶THF，(8)60∶40甲醇∶THF。將各個分別提取的兩次提取物合并濃縮并在低真空下干燥。通過HPLC使用光電二極管陣列檢測器(HPLC/PDA)和250 mm×4.6 mm的C18柱來鑒定每種提取物中的化學成分。根據(jù)保留時間和PDA數(shù)據(jù)以兒茶素和表兒茶素作為標準品定量各化學成分。結(jié)果如表7所示。如表7所示，用80％甲醇/水溶劑提取得到的黃烷提取物具有最高濃度的黃烷成分。
表7.用于從兒茶中獲得標準化黃烷提取物的溶劑

通過從兒茶鉤藤整株中用醇/水溶劑提取生物質(zhì)得到標準化的提取物。使用相同的方法對自兒茶鉤藤中提取的標準化提取物中的黃烷含量進行定量。結(jié)果如表8所示。根據(jù)保留時間和PDA數(shù)據(jù)以兒茶素為標準品對黃烷進行定量。
使用醇/水和/或水性溶劑作為重結(jié)晶溶劑對兒茶素含量在8％-15％之間的提取物進行重結(jié)晶可得到較高純度的物質(zhì)。在重結(jié)晶之前可能有必要向提取物的熱的飽和溶液中加入活性碳或其它脫色劑以脫色。然后冷卻熱的飽和溶液結(jié)晶高純度的兒茶素。晶體然后經(jīng)過濾除去溶劑，干燥并研磨成細粉。若需要可重復重結(jié)晶以獲得所需的純度水平(60％-100％的兒茶素黃烷)。
實施例8.標準化的無取代B環(huán)類黃酮提取物自各種黃芩中的制備將直萼黃芩(500mg磨碎的根)用25mL的下列溶劑系統(tǒng)提取兩次。(1)100％水，(2)80∶20水∶甲醇，(3)60∶40水∶甲醇，(4)40∶60水∶甲醇，(5)20∶80水∶甲醇，(6)100％甲醇，(7)80∶20甲醇∶THF，(8)60∶40甲醇∶THF。提取物經(jīng)合并、濃縮并在低真空下干燥。通過HPLC使用光電二極管陣列檢測器(HPLC/PDA)和250mm×4.6mm的C18柱來鑒定各提取物中的化學成分。根據(jù)保留時間和PDA數(shù)據(jù)以黃芩黃素、黃芩苷、黃芩素及漢黃芩素為標準品定量各化學成分。結(jié)果如表9所示。
表9.源自直萼黃芩的無取代B環(huán)類黃酮提取物的定量

將黃芩(1000mg磨碎的根)用50mL的如下甲醇和水的混合物提取兩次。(1)100％水，(2)70∶30水∶甲醇，(3)50∶50水∶甲醇，(4)30∶70水∶甲醇，(5)100％甲醇。提取物經(jīng)合并、濃縮并在低真空下干燥。通過HPLC使用光電二極管陣列檢測器(HPLC/PDA)和250mm×4.6mm的C18柱來鑒定各化學成分。根據(jù)保留時間和PDA數(shù)據(jù)利用黃芩黃素、黃芩苷、黃芩素及漢黃芩素為標準品定量各提取物中的化學成分。結(jié)果如表10所示。
表10.源自黃芩的無取代B環(huán)類黃酮提取物的定量

使用醇/水作為重結(jié)晶溶劑對無取代B環(huán)類黃酮含量在8％-15％之間的提取物進行重結(jié)晶可得到較高純度的無取代B環(huán)類黃酮。在重結(jié)晶之前可能有必要向提取物的熱的飽和溶液中加入活性碳或其它脫色劑進行脫色。無取代B環(huán)類黃酮冷卻結(jié)晶。晶體經(jīng)過濾、干燥并研磨成細粉。若需要可重復重結(jié)晶以達到所需的純度水平(60％-100％的無取代B環(huán)類黃酮)。
實施例9.用源自黃芩根的標準化無取代B環(huán)類黃酮提取物和源自兒茶樹皮的標準化的黃烷提取物制備制劑用分別自金合歡和黃芩屬中分離的兩種標準化提取物與一種或多種賦形劑配制本文稱之為UP676的新型組合物。制備該組合物的一般實例如下所示。在本實施例中使用的金合歡提取物包含＞80％的總黃烷，為兒茶素和表兒茶素，而黃芩提取物包含＞80％的無取代B環(huán)類黃酮，主要是黃芩苷。該黃芩提取物中還包含其它少量的如表11所示的無取代B環(huán)類黃酮。組合物中也可以加入一種或多種賦形劑/保存劑。黃烷及無取代B環(huán)類黃酮的比例可以根據(jù)適應(yīng)癥和對抑制COX vs.LO的具體要求、皮膚滲透的要求以及對產(chǎn)品效能的要求如所要求的功效持續(xù)時間等進行調(diào)整。賦形劑的量可以根據(jù)各成分的實際活性含量進行調(diào)整。每一批獨立產(chǎn)品的混合列表必須根據(jù)產(chǎn)品規(guī)格及每批獨立的成分的QC結(jié)果來產(chǎn)生。推薦2-5％額外量的活性成分以達到產(chǎn)品規(guī)格。
將無取代B環(huán)類黃酮含量為82.8％(黃芩苷)的黃芩根提取物(38.5kg)(批號RM052302-01)；總黃烷含量為80.4％的兒茶樹皮提取物(6.9kg)(批號RM052902-01)；以及賦形劑(Candex 5.0kg)相混合制成活性無取代B環(huán)類黃酮與黃烷的重量混合比為85∶15的UP676制劑(50.4 kg)。表11提供了用實施例6和8所提供的方法測定的特定批次的UP676(批號G1702-COX-2)中的活性無取代B環(huán)類黃酮和黃烷的量。根據(jù)表11，該特定批次的UP676中含有86％總活性成分，包括75.7％的無取代B環(huán)類黃酮和10.3％的黃烷。圖10所示為典型的UP676樣品的HPLC色譜圖，其活性無取代B環(huán)類黃酮和黃烷的重量混合比例為80∶20。
表11.UP676制劑中的無取代B環(huán)類黃酮和黃烷含量

以下批UP676是使用相同的方法用源自黃芩根的標準化無取代B環(huán)類黃酮提取物和源自兒茶樹皮的標準化黃烷提取物分別以12∶88及15∶85的混合比例混合制備。
將無取代B環(huán)類黃酮含量為87.9％(為黃芩苷)的黃芩根提取物(58.0g)(批號RM021203-01)和總黃烷含量為84.9％的兒茶樹皮提取物(442.0g)(批號RM050603-01)混合制成重量混合比為12∶88的UP676(500g，批號QJ205-19)。利用實施例6和8所提供的方法，在該特定批次的UP676(批號QJ205-19)中無取代B環(huán)類黃酮含量(黃芩苷)為9.65％而黃烷含量(總兒茶素和表兒茶素)為73.2％。
將無取代B環(huán)類黃酮含量為82.9％(為黃芩苷)的黃芩根提取物(300g)(批號RM060403-01)和總黃烷含量為90.8％的兒茶樹皮提取物(1700g)(批號RM050603-01)混合制成重量混合比為15∶85的UP676組合物(2000g，批號A1904)。利用實施例6和8所提供的方法，該特定批次的UP676(批號A1904)中無取代B環(huán)類黃酮(黃芩苷)的含量為15.6％而黃烷(總兒茶素和表兒茶素)含量為75.0％。
實施例10.UP676制劑對5-LO酶抑制的劑量反應(yīng)和IC50值的測定根據(jù)實施例9所述利用源自黃芩根的標準化無取代B環(huán)類黃酮提取物和源自兒茶樹皮的標準化黃烷提取物以80∶20的混合比例混合制備UP676制劑(80∶20)。將樣品在含有THP-I或HT-29細胞、表達COX-1、COX-2和5-LOX的單核細胞系的組織培養(yǎng)物中滴定。采用用于白三烯B4的競爭性ELISA(LTB4；Neogen，Inc.，Cat#406110)評價該UP676制劑對于存在于各細胞系中的新合成的LTB4水平的影響作為評價UP676抑制5-LOX途徑的效果的方法。此試驗是在6孔板中通過每孔加入160,000-180,000個細胞來重復操作。以3、10、30和100μg/mL的濃度將UP676制劑加入THP-I培養(yǎng)物中并在37℃含5％CO2的潮濕環(huán)境中溫育過夜(～12-15小時)。結(jié)果如圖11所示，通過向THP-1培養(yǎng)物中加入濃度為3-10μg/mL之間的UP676幾乎完全抑制了LPS誘導的LTB4的新的生成。
將UP676和另一種已知的5-LOX抑制劑布洛芬以3μg/mL濃度加入到HT-29細胞中并在37℃含5％CO2的潮濕環(huán)境中溫育48小時。之后通過離心收集各經(jīng)處理的細胞系并以柔和的杜恩斯勻漿(douncehomogenization)使之破碎并溶于生理緩沖液中。如圖12所示，UP676抑制HT-29細胞中80％的新合成的LTB4產(chǎn)生。在相同時間內(nèi)布洛芬顯示LTB4量只減少20％。
實施例11.UP676在mRNA水平下調(diào)促炎細胞因子及其它與炎癥相關(guān)的蛋白質(zhì)的基因表達外周血單核細胞(PBMC)是已經(jīng)建立的用于炎癥相關(guān)疾病的細胞模型。在不含和含有不同濃度的UP676(0、10、30和100μg/mL)的存在下用10ng/mL脂多糖(LPS)刺激來自3個健康人類受試者的PBMC。將細胞在37℃、5％CO2溫育18小時，之后收獲用于RNA純化。用QiagenRNeasy試劑盒制備RNA并用ABI cDNA Archive試劑盒合成cDNA。用ABI棱鏡序列檢測器進行實時定量-PCR檢測。18S rRNA基因或親環(huán)蛋白A用作用于歸一化的內(nèi)對照。來自三個實驗的數(shù)據(jù)總結(jié)如表12所示。對于IL-1β、TNFα及IL-6基因表達的平均抑制分別為45倍、3倍和27倍。此外，在PBMC中，在用LPS刺激后18小時檢測到UP676對pparγ抑制超過10倍而對nfκb mRNA抑制為2倍。
表12.UP676在PBMC中的基因抑制作用(數(shù)字代表在用100μg/mL和0μg/mL的UP676處理的樣品之間mRNA水平倍數(shù)變化)

實施例12.用體內(nèi)小鼠耳腫脹模型評價UP676的有效性如實施例9所述，利用源自黃芩根的標準化無取代B環(huán)類黃酮提取物和源自兒茶樹皮的標準化黃烷提取物以80∶20混合比混合制備UP676制劑。為了檢驗這種組合物是否可用于體內(nèi)治療炎癥，將該組合物經(jīng)口服強飼法對4-5周齡的ICR小鼠(Harlan Labs)給藥，一天后用花生四烯酸(AA)處理小鼠耳朵。實驗組小鼠喂飼相當于50、100及200mg/kg混懸在橄欖油中的UP676的劑量，其對照組小鼠只喂飼橄欖油。第二天，將330mM溶于95％乙醇中的AA 20μL施用至每只小鼠的一只耳朵，而將乙醇施用至另一只耳朵作為對照。如圖13所示，經(jīng)UP676處理的小鼠隨著UP676劑量增加顯示出可測量的劑量反應(yīng)。根據(jù)圖13，200mg/kg的劑量與“未處理”的對照組相比腫脹降低50％。劑量為50mg/kg的UP676與劑量為50mg/kg的另一強效抗炎藥——吲哚美辛效果相當。
實施例13.UP676在預防和治療皮膚暴露于UV照射導致的損傷的有效性評價將六組無毛雌性小鼠(每組五只)(SKH-I品系，Harlan Labs)在麻醉情況下用0.626mW/cm2連續(xù)三天每天照射三分鐘來檢測UP676制劑在預防和治療皮膚暴露于UV照射導致的損傷方面的效果。如實施例9所述，將源自黃芩根的標準化無取代B環(huán)類黃酮提取物與源自兒茶樹皮標準化的黃烷提取物以80∶20混合比混合來制備UP676制劑。六個治療組如下所示組#1對照組UV照射前或后均不做處理2陽性對照組UV照射后局部施用Sooth-A-Caine(Banana Boat)處理3 UP676處理組B-1UV照射前局部施用含1mg/mL UP676的水溶液處理4 UP676處理組A-1UV照射后局部施用含1mg/mL UP676的水溶液處理5 UP676處理組B-2UV照射前局部施用含5mg/mL UP676的水溶液處理6 UP676處理組A-2UV照射后局部施用含5mg/mL UP676的水溶液處理經(jīng)三天UV照射及處理之后，對小鼠紅斑(發(fā)紅)水平用下述尺度評分0-無可見紅斑；1-輕微紅斑；2-明顯紅斑；3-嚴重紅斑；4-腫瘤形成。經(jīng)人眼對每組紅斑進行評分。結(jié)果如圖14所示。根據(jù)圖14可見對照組(1組)在第3天(暴露于UV照射之后72小時)出現(xiàn)嚴重紅斑。Sooth-A-Caine組在第3天也出現(xiàn)了最大紅斑(2組)。UP676處理組(3-6組)的紅斑從不超過2分。這些評分盡管有主觀性，但仍表明UP676對于預防和治療UV引起的皮膚紅斑均有效果。
典型的小鼠在第4天時的照片清楚地證明對照組、Sooth-A-CaineTM處理組及UP676處理組之間的不同(沒有顯示數(shù)據(jù))。與在UV暴露前和后均用UP676制劑處理的動物相比，對照組和Sooth-a-cainTM處理組顯示紅斑模式及紅色十分廣泛。在UV暴露前用5mg/mL UP676處理的動物與其它所有動物相比顯示最小量的紅斑。
實施例14.將UP676組合物制成乳膏如下列過程及表13所示將UP676(0.5重量％的UP676)(如實施例9中所述的批號A1904)制成乳膏。
室溫下將UP676(批號A 1904)溶于水且用混合器勻化直到其完全分散在溶液中(大約5分鐘)。室溫下不攪拌或攪動溶液，通過灑于溶液表面加入Ultrez-21卡波姆，且允許其完全濕潤(無可見白色區(qū)域)并沉入溶液中。輕微攪拌下將溶液加熱到40℃然后加入甘油(A部分)。然后將該混合物再攪拌5分鐘。將剩余組分(B部分)稱重并在攪拌下加熱到40℃。在40℃將剩余組分(B部分)加入到A部分中并將所得組合物充分混合直到均勻(大約5分鐘)。將該乳劑冷卻到30℃且通過攪拌棒和/或刮鏟攪拌下用中和劑滴定，將pH值調(diào)整到約5.5(5.3到5.7)。由于中和誘導的卡波姆的構(gòu)型變化使得該乳劑變得十分粘稠。乳劑最終達到乳膏適合的粘度。然后將該乳劑混合直到均勻，之后將其倒入潔凈容器內(nèi)在2℃到8℃保存一個月。
表13.0.5％UP676乳膏的成分列表

實施例15.溶液中兒茶素的穩(wěn)定性評價將純兒茶素溶于70％甲醇水溶液中，在與下列詳述的溶液混合之后至最終濃度為0.05％(w/v)。共選擇6種不同條件(不包括對照溶液)用于該45℃下的穩(wěn)定性研究。K2HPO4(0.5M)或KH2PO4(0.5M)水溶液用于制備pH值分別為5或8的緩沖溶液。將H2O2、SnCl2，、FeCl3或EDTA分別加入兒茶素溶液中直至濃度分別為0.6％H2O2、或0.05％SnCl2、或0.05％FeCl3或0.05％EDTA。將七種溶液在密封瓶子中于45℃貯存。如實施例6所示在第0、1、3、6、8、10、13、20、及28天用HPLC測定各樣品的兒茶素含量。結(jié)果如圖15所示。
將下列保存劑BHA、BHT、檸檬酸二銨(DAC)、H2O2、沒食子酸丙酯(PG)、葡萄糖酸鈉(SG)及硫酸氫鈉/焦亞硫酸鈉(SBS)加入緩沖的(pH7.5)0.05％兒茶素甲醇/水溶液中得到0.05％的濃度。將八種溶液置于密閉瓶子中于45℃貯存。如實施例6所述在第0、1、3、6、8、10、13、20、及28天測定各樣品的兒茶素含量。結(jié)果如圖16所示。
實施例16.經(jīng)口服給藥后UP676中黃芩苷生物利用度的評價該臨床研究為單中心、開放性研究，其中招募10名健康受試者參與(n＝10，6位男性，4位女性)。受試者禁食過夜并在第二天上午8:00到臨床試驗中心報告。在基線靜脈穿刺后，各受試者馬上接受300mg劑量的如實施例9所述制備的UP676。接下來在1/2、1、2、4及8小時采集血漿樣品。在第兩天的第24小時及在第七天采集額外的樣品。通過將血液收集到含有肝素的試管內(nèi)來處理每個血漿樣品。之后將血液在2,500rpm離心10分鐘。分離各管的上清液，轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)移管中并在最終收集之后測定無取代B環(huán)類黃酮水平之前于-70℃貯存用于分析。經(jīng)分析確定(i)無取代B環(huán)類黃酮吸收和清除的曲線下面積(AUC)；(ii)無取代B環(huán)類黃酮的最大血漿濃度(Cmax)；(iii)無取代B環(huán)類黃酮達到最大血漿濃度的時間(Tmax)；(iv)無取代B環(huán)類黃酮的血漿消除半衰期(T1/2)；及(v)24小時尿清除率AU24Hr。
對若干血清等分試樣的HPLC初步研究表明，由于通過葡糖醛酸化及硫酸化結(jié)合無取代B環(huán)類黃酮處于檢測限之下(＜4μg/mL)。因此，將血清用2,000u/mL的β-葡糖醛酸糖苷酶及170u/mL的硫酸酯酶消化使所有結(jié)合型無取代B環(huán)類黃酮轉(zhuǎn)變成為苷元分子黃芩黃素。之后通過HPLC用純黃芩黃素作標準品對總黃芩黃素代謝產(chǎn)物進行分析。加入抗壞血酸防止類黃酮在37℃7小時的消化過程以及之后的HPLC分析過程中氧化。
血漿經(jīng)β-葡糖醛酸糖苷酶和硫酸酯酶消化之后，用乙酸乙酯提取類黃酮，然后在進行HPLC分析前迅速用氮氣流及微熱(35℃)蒸發(fā)至干。用含有1mg/mL抗壞血酸緩沖液的甲醇四氫呋喃80∶20溶液復溶樣品。黃芩黃素的含量測定是通過反相色譜使用等度的(isocratic gradient)0.1％磷酸(v/v)(緩沖液A)和乙腈(緩沖液B)在1mL/min流速下用純黃芩黃素作標準物來校正質(zhì)量并用保留時間鑒定。用在線UV檢測器在275nm監(jiān)控洗脫物質(zhì)的檢測。
結(jié)果如圖17所示。根據(jù)圖17，黑體顯示的數(shù)據(jù)代表用來計算黃芩黃素血漿清除率的點。當對所有受試者的數(shù)據(jù)取對數(shù)作圖，這些數(shù)據(jù)代表與時間的線性函數(shù)(數(shù)據(jù)沒有顯示)。受試者間存在個體差異。表14顯示對每個受試者所觀察到的黃芩黃素濃度最大值(Cmax，μg/mL)及時間(Tmax，小時)。數(shù)據(jù)表明對于大多數(shù)受試者來說，在首次劑量后4小時到8小時間達到最大濃度。平均Cmax為0.93μg/mL(％RSD＝84.9)且平均Tmax約為5.8小時(％RSD＝43.4)。根據(jù)此數(shù)據(jù)，可計算并作圖整個研究組的吸收及清除平均值(圖17)。
表14.在各個受試者中所觀察到的黃芩黃素濃度的最大值(Cmax，μg/mL)和時間(Tmax，小時)。

實施例17.對UP676乳膏反復施用于人體皮膚引起的刺激性和誘導接觸致敏的評價使用改良的Draize Patch Test測試法在人體皮膚上對UP676進行測試(Marzulli和Maibach(1977)Contact AllergyPredictive Testing inHumans.In Advances in Modem Toxicology，Dermatotoxicology andPharmacology.Eds.Marzulli，F(xiàn).N和Maibach，H.I.4，353-372)。測試部位位于上臂或后背椎旁(paraspinal)區(qū)域。每個測試品都有誘導部位和激發(fā)部位。誘導部位包括兩個亞部位原始部位及轉(zhuǎn)移部位。將如實施例14所述制備的含有0.2mL UP676乳膏/片的貼片反復應(yīng)用于原始部位，除非發(fā)生足夠嚴重的刺激性而需要將貼片施用于轉(zhuǎn)移部位。由臨床研究所施用貼片并在約24或48/72小時后由受試者移除并棄去貼片。在誘導階段將測試品反復施用于同一皮膚部位并在4周內(nèi)共施用9片誘導貼片。在施用最后一片誘導貼片和施用激發(fā)貼片之間的間期(rest period)為10到21天。在此期間內(nèi)，無測試品或任何其他物質(zhì)施用于測試部位。在激發(fā)階段，將測試品施用于身體對側(cè)的未實驗部位并在約24或48小時后由受試者棄去。
檢測施用各貼片的皮膚反應(yīng)并在100瓦的白熾藍燈泡光源下根據(jù)指定的評分尺度評分。在強烈刺激反應(yīng)使得將測試品施用到轉(zhuǎn)移部位的情況下，對于所有先前暴露的部位直到誘導結(jié)束均記錄剩余的分數(shù)(或如果反應(yīng)持續(xù)至誘導結(jié)束后則直至消退)。記錄所有皮膚反應(yīng)。在激發(fā)階段，在施用貼片約48及72或96小時后評價皮膚反應(yīng)。關(guān)于誘導致敏(induced sensitivity)的結(jié)論主要源于激發(fā)評價。
實施例14所制備的濃度為0.5％和1.5％的兩種UP676乳膏根據(jù)上述方案進行評價。每組共招募120名受試者。97名受試者完成了0.5％UP676組的研究而101名受試者完成了1.5％UP676組的研究。沒有觀察到任何0.5％和1.5％UP676乳膏的致敏反應(yīng)。0.5％UP676在誘導過程中，16名受試者顯示偶爾發(fā)生的輕微到輕度的紅斑(評分為+和/或1)。在激發(fā)階段，4名受試者在48小時時顯現(xiàn)輕微到輕度紅斑，并在96小時時消失。1.5％UP676在誘導階段，26名受試者偶爾發(fā)生輕微到輕度紅斑(評分為+和/或1)。在激發(fā)階段，1名受試者在48小時時顯現(xiàn)輕微到輕度紅斑，并在96小時時消失。
該研究表明UP676是可以以有效濃度局部施用于人類皮膚而不引起刺激或致敏的安全成分。
權(quán)利要求
1.一種用于預防及治療口腔、牙齦和牙齒的疾病和病癥的方法，所述方法包括向有此需要的主體給藥有效量的包含至少一種無取代B環(huán)類黃酮和至少一種黃烷的混合物的藥物組合物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中在所述組合物中的無取代B環(huán)類黃酮比黃烷的比例選自99∶1無取代B環(huán)類黃酮比黃烷到1∶99無取代B環(huán)類黃酮比黃烷的范圍。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中在所述組合物中無取代B環(huán)類黃酮比黃烷的比例為約80∶20。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述無取代B環(huán)類黃酮選自具有下列結(jié)構(gòu)的化合物中 其中R1、R2、R3、R4和R5獨立地選自以下組中-H、-OH、-SH、-OR、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、-NR3+X-，單個糖或者多個糖組合的糖苷，其中所述糖苷是通過碳、氧、氮或硫連接到7-羥基色酮上，并且其中所述單個糖或多個糖的組合包括但不限于戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖以及它們的化學衍生物；其中R是具有1-10個碳原子的烷基；以及X選自藥物學可接受的抗衡陰離子，其包括羥基、氯離子、碘離子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟離子和碳酸根。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述黃烷選自具有下列結(jié)構(gòu)的化合物中 其中R1、R2、R3、R4和R5獨立地選自以下組中-H、-OH、-SH、-OCH3、-SCH3、-OR、-SR、-NH2、-NRH、-NR2、-NR3+X-，所述取代基的酯，包括但不限于沒食子酸酯、乙酸酯、肉桂酰和羥基肉桂酰酯、三羥基苯甲酰酯和咖啡酰酯、以及它們的化學衍生物，單個糖或者多個糖組合的糖苷，其中所述糖苷是通過碳、氧、氮或硫連接到7-羥基色酮上，并且其中所述單個糖或者多個糖的組合包括但不限于戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖以及它們的化學衍生物以及其他聚合的黃烷；其中R是具有1-10個碳原子的烷基；以及X選自藥物學可接受的抗衡陰離子，其包括但不限于羥基、氯離子、碘離子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟離子、碳酸根。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述無取代B環(huán)類黃酮和所述黃烷為通過有機合成或自植物中分離得到。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述無取代B環(huán)類黃酮和所述黃烷分離自選自以下組的植物部分莖、莖皮、干、主干皮、嫩枝、塊莖、根、根皮、嫩梢、種子、根莖、花及其他生殖器官、葉及其他氣生部分。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述無取代B環(huán)類黃酮分離自選自以下組的植物科中番荔枝科、Asteraceae、紫葳科、使君子科、菊科、大戟科、唇形科、樟科、豆科、?？?、松科、鳳尾蕨科、中國蕨科、榆科和姜科。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述無取代B環(huán)類黃酮分離自選自以下組的植物屬中假鷹爪屬、Achyrocline、木蝴蝶屬、Buchenavia、香青屬、山芫荽屬、鼠麴草屬、蠟菊屬、矢車菊屬、澤蘭屬、Baccharis、烏柏屬、黃芩屬、Molsa、羽萼木屬、水蘇屬、牛至屬、新塔花屬、山胡椒屬、黃肉楠屬、金合歡屬、魚藤屬、甘草屬、雞血藤屬、水黃皮屬、灰毛豆屬、木波羅屬、榕屬、粉葉蕨屬、隱囊蕨屬、松屬、榆屬和山姜屬。
10.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述黃烷分離自選自以下組的植物屬中金合歡和鉤藤。
11.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述無取代B環(huán)類黃酮分離自黃芩和木蝴蝶中的一種或多種植物，所述黃烷分離自兒茶和兒茶鉤藤中的一種或多種植物。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述組合物以0.001到200mg/kg體重的劑量給藥。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述組合物以在藥物學可接受的載體中包含大約0.001重量百分比(重量％)到40.0重量％的所述無取代B環(huán)類黃酮和黃烷的混合物的制劑給藥。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述給藥途徑選自以下組中局部、氣霧劑、栓劑、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)和靜脈內(nèi)給藥。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述給藥途徑為局部給藥。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述組合物是利用選自以下組的方式給藥牙膏、凝膠、軟膏、漱口水、口香糖、酊劑和飲料。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述藥物組合物還包括常規(guī)賦形劑和任選的佐劑、和/或載體、和/或普通或控釋載體。
18.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述口腔、牙齦和牙齒的疾病0和病癥選自由牙周疾病組成的組中，其選自牙齦炎、牙周炎、牙髓炎，由于移植假牙、創(chuàng)傷、損傷、夜磨牙癥、腫瘤及其它退行性過程所引起的牙周病癥；白垢、菌膜、牙斑、牙結(jié)石和牙垢。
19.一種對口腔、牙齒和牙齦提供健康益處的藥物組合物，其包含至少一種無取代B環(huán)類黃酮和至少一種黃烷的混合物。
20.如權(quán)利要求19所述的藥物組合物，其中在所述組合物中無取代B環(huán)類黃酮比黃烷的比例選自99∶1無取代B環(huán)類黃酮比黃烷到1∶99無取代B環(huán)類黃酮比黃烷的范圍。
21.如權(quán)利要求20所述的藥物組合物，其中在所述組合物中無取代B環(huán)類黃酮比黃烷的比例為約80∶20。
22.如權(quán)利要求19所述的藥物組合物，其中所述無取代B環(huán)類黃酮選自具有下列結(jié)構(gòu)的化合物中 其中R1、R2、R3、R4和R5獨立地選自以下組中-H、-OH、-SH、-OR、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、-NR3+X-，單個糖或者多個糖組合的糖苷，其中所述糖苷是通過碳、氧、氮或硫連接到7-羥基色酮上，并且其中所述單個糖或多個糖的組合包括但不限于戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖以及它們的化學衍生物；其中R是具有1-10個碳原子的烷基；以及X選自藥物學可接受的抗衡陰離子，其包括羥基、氯離子、碘離子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟離子和碳酸根。
23.如權(quán)利要求19所述的藥物組合物，其中所述黃烷選自具有下列結(jié)構(gòu)的化合物中 其中R1、R2、R3、R4和R5獨立地選自以下組中-H、-OH、-SH、-OCH3、-SCH3、-OR、-SR、-NH2、-NRH、-NR2、-NR3+X-，所述取代基的酯，包括但不限于沒食子酸酯、乙酸酯、肉桂酰和羥基肉桂酰酯、三羥基苯甲酰酯和咖啡酰酯、以及它們的化學衍生物，單個糖或者多個糖組合的糖苷，其中所述糖苷是通過碳、氧、氮或硫連接到7-羥基色酮上，并且所述單個糖或者多個糖的組合包括但不限于戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖以及它們的化學衍生物和其他聚合的黃烷；其中R是具有1-10個碳原子的烷基；以及X選自藥物學可接受的抗衡陰離子，其包括但不限于羥基、氯離子、碘離子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟離子、碳酸根。
24.如權(quán)利要求19所述的藥物組合物，其中所述無取代B環(huán)類黃酮和所述黃烷為通過有機合成或自植物中分離得到。
25.如權(quán)利要求24所述的藥物組合物，其中所述無取代B環(huán)類黃酮和所述黃烷分離自選自以下組的植物部分莖、莖皮、干、主干皮、嫩枝、塊莖、根、根皮、嫩梢、種子、根莖、花及其他生殖器官、葉及其他氣生部分。
26.如權(quán)利要求24所述的藥物組合物，其中所述無取代B環(huán)類黃酮分離自選自以下組的植物科中番荔枝科、Asteraceae、紫葳科、使君子科、菊科、大戟科、唇形科、樟科、豆科、桑科、松科、鳳尾蕨科、中國蕨科、榆科和姜科。
27.如權(quán)利要求24所述的藥物組合物，其中所述無取代B環(huán)類黃酮分離自選自以下組的植物屬中假鷹爪屬、Achyrocline、木蝴蝶屬、Buchenavia、香青屬、山芫荽屬、鼠麴草屬、蠟菊屬、矢車菊屬、澤蘭屬、Baccharis、烏柏屬、黃芩屬、Molsa、羽萼木屬、水蘇屬、牛至屬、新塔花屬、山胡椒屬、黃肉楠屬、金合歡屬、魚藤屬、甘草屬、雞血藤屬、水黃皮屬、灰毛豆屬、木波羅屬、榕屬、粉葉蕨屬、隱囊蕨屬、松屬、榆屬和山姜屬。
28.如權(quán)利要求24所述的藥物組合物，其中所述黃烷分離自選自以下組的植物屬中金合歡和鉤藤。
29.如權(quán)利要求24所述的藥物組合物，其中所述無取代B環(huán)類黃酮分離自黃芩和木蝴蝶中的一種或多種植物，所述黃烷分離自兒茶和兒茶鉤藤中的一種或多種植物。
30.如權(quán)利要求19所述的藥物組合物，其還包括藥物學可接受的賦型劑和任選的佐劑和載體。
31.如權(quán)利要求19所述的藥物組合物，其中所述組合物配制用于局部給藥。
32.如權(quán)利要求19所述的藥物組合物，其中所述組合物是在普通或控釋載體中配制。
33.如權(quán)利要求19所述的組合物，其中所述組合物是利用選自以下的方式配制牙膏、凝膠、軟膏、漱口水、口香糖、酊劑和飲料。
34.如權(quán)利要求19所述的組合物，其中所述對口腔、牙齒和牙齦的健康益處選自以下組中維持最佳唾液生成和pH、最小化細菌生長、減少菌膜以及斑的形成、抑制牙齒脫鈣和齲齒(蛀蝕)、促進礦質(zhì)補充、潔白牙齒、保持健康口腔衛(wèi)生及減少口腔惡臭(口臭)，所述方法包括向有此需要的主體給藥有效量的包含至少一種無取代B環(huán)類黃酮和至少一種黃烷的混合物的組合物。
35.一種為口腔、牙齒和牙齦提供健康益處的方法，其中所述健康益處選自以下組中維持最佳唾液生成和pH、最小化細菌生長、減少菌膜以及斑的形成、抑制牙齒脫鈣和齲齒(蛀蝕)、促進礦質(zhì)補充、潔白牙齒、保持健康口腔衛(wèi)生及減少口腔惡臭(口臭)，所述方法包括向有此需要的主體給藥有效量的包含至少一種無取代B環(huán)類黃酮和至少一種黃烷的混合物的組合物。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述組合物以在可接受的載體中包含大約0.001重量百分比(重量％)到40.0重量％的所述無取代B環(huán)類黃酮和黃烷的混合物的制劑給藥。
37.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述給藥途徑選自以下組中局部、氣霧劑、栓劑、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)和靜脈內(nèi)給藥。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述給藥途徑為局部給藥。
39.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述組合物是利用選自以下的方式給藥牙膏、凝膠、軟膏、漱口水、口香糖、酊劑和飲料。
40.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述組合物還包括常規(guī)賦形劑和任選的佐劑、和/或載體、和/或普通或控釋載體。
全文摘要
本發(fā)明提供一種包含兩類特殊化合物——無取代B環(huán)類黃酮以及黃烷的混合物的新型組合物，其用于預防及治療與口腔、牙齦及牙齒相關(guān)的疾病和病癥。此組合物可以同時抑制環(huán)氧合酶(COX)和脂氧合酶(LOX)的活性，并且可以在mRNA水平減少正常、老化及損傷的牙周細胞和組織中細胞因子的合成。本發(fā)明還提供了一種用于預防及治療口腔、牙齒及牙齦的疾病和病癥的方法。所述用于預防及治療口腔、牙齒及牙齦的疾病和病癥的方法包括向有此需要的主體給藥治療有效量的包含合成和/或從一種或多種植物，優(yōu)選黃芩、木蝴蝶、金合歡或鉤藤屬的植物中分離的無取代B環(huán)類黃酮和黃烷的混合物以及藥物學和/或美容學可接受載體的組合物。最后，本發(fā)明提供了一種預防及治療口腔、牙齒及牙齦的疾病和病癥的方法，所述疾病包括但不限于牙周疾病，例如牙齦炎、牙周炎、牙髓炎，由于移植假牙、創(chuàng)傷、損傷、夜磨牙癥、腫瘤及其它退行性過程所引起的牙周癥狀；白垢、菌膜、牙斑、牙結(jié)石和牙垢。應(yīng)用本文所述的組合物還可以提供以下好處維持最佳唾液生成和pH、最小化細菌生長、減少菌膜以及牙斑的形成、抑制牙齒脫鈣和齲齒(蛀蝕)、促進礦質(zhì)補充、形成健康的牙齦、潔白牙齒、保持健康口腔衛(wèi)生及減少口腔惡臭(口臭)。
文檔編號A61K8/97GK101083981SQ200580043644
公開日2007年12月5日 申請日期2005年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月19日
發(fā)明者賈琦, 趙垣 申請人:尤尼根制藥公司