專利名稱::益生素制品的制作方法專利說明益生素制品發(fā)明領域本發(fā)明涉及用作益生素(prebiotic)營養(yǎng)添加劑的阿糖基木聚糖制品以及通過在膳食中添加所述添加劑來改善人類腸胃道健康的方法。在優(yōu)選的實施方案中,所述阿糖基木聚糖制品衍生自天然來源,如植物材料,更優(yōu)選來自谷物。
背景技術:
:本發(fā)明涉及具有給定的非淀粉多糖(NSP)的食物腸胃健康狀況、更具體地說是腸道微生物群的有益效果。NSP包括具有不同物理化學性質的化合物。阿糖基木聚糖是一類重要的谷類NSP,它也稱作戊聚糖,它由連接O-2和/或O-3α-L-阿拉伯呋喃糖基單元的β-1,4-連接的D-吡喃木糖基單元的主鏈組成。在一種典型的阿糖基木聚糖中,會出現(xiàn)未取代的、一取代和二取代的木糖殘基(參見圖1)。阿糖基木聚糖是水可提取的或水不可提取的。后者在堿性條件下或使用酶的情況下會部分溶解并與大量水結合。水可提取的阿糖基木聚糖具有形成不尋常的粘度的趨勢。通常,視來源和提取方法的不同,其分子量會非常高(最高達800,000道爾頓)。盡管它們僅是次要成分,但它們對于谷類在生物技術工藝過程中的功能如制造小麥淀粉、意大利面和啤酒、面包制造和其它食品應用來說是重要的。衍生自阿糖基木聚糖或木聚糖(未取代的β-1,4-連接的D-吡喃木糖基單元的聚合物)的一些類型的寡糖已經(jīng)顯示出益生素特性。益生素是不被上胃腸道的酶消化但被大腸中某些類型的腸道細菌選擇性發(fā)酵的化合物,通常是非糖苷寡糖(Gibson和Roberfroid,1995;Roberfroid,1988;VanLoo,2004)。飲食中存在益生素能改變腸道菌群的組成,通常表現(xiàn)為乳酸菌和雙歧桿菌增加。腸道微生物的這種改變能提高總體健康狀況、減少內(nèi)臟感染、增加腸短鏈脂肪酸水平、更好地吸收礦物質以及抑制結腸癌的發(fā)生(VanLoo,2004)。以聚合度(DP)為2-3的寡糖(木二糖(xylobiose)和木三糖(xylotriose))為主的木寡糖(xylo-oligosaccharide)(XOS,由β-1,4-連接的D-吡喃木糖基單元構成的寡糖)制品已顯示可顯著提高大鼠糞便和盲腸(EP0265970B1;Campbell等,1997;Hsu等,2004)以及人結腸(Okazaki等,1990)內(nèi)雙歧桿菌的水平。這種富含木二糖的XOS制品還能抑制大鼠中化學物質誘導的結腸癌變的早期癥狀(Hsu等,2004)及提高鈣的吸收(Toyoda等,1993)。主要由DP為3-5的阿糖基木寡糖(AXOS)(阿糖基木二糖、阿糖基木三糖、阿糖基木四糖(xylotetraose)和二阿糖基木四糖)構成的制品也顯示可提高大鼠和小鼠腸道中雙歧桿菌的水平(Yamada等,1993)。嚴重限制現(xiàn)有XOS制品商業(yè)潛力的一個主要缺點是相比其它寡糖而言現(xiàn)有XOS制品價格過高,這說明目前的制造方法不夠經(jīng)濟。已經(jīng)描述過的制造主要由DP為2-3的XOS構成的益生素制品的方法包括,用NaClO溶液和高度濃縮的KOH溶液從植物基產(chǎn)品(硬木、玉米棒、棉籽皮、小麥麩皮或釀過酒的谷物)化學提取木聚糖,然后用木聚糖內(nèi)切酶酶解提取的木聚糖(EP0265970B1)。一種類似的用來制造AXOS益生素制品(DP為3-5的AXOS制品)的方法包括用濃堿溶液化學提取阿糖基木聚糖,然后除去鹽,用木聚糖內(nèi)切酶酶解,然后在碳柱上層析(Yamada等,1993)。這些方法的主要缺點是,化學提取木聚糖或阿糖基木聚糖對環(huán)境不利,并且需要通過大量透析或超濾這樣的花費巨大的過程除去化學物質,然后才能進行酶解。制造XOS或AXOS的另一種方法涉及熱水自動水解硬木或釀過酒的谷物。在這種方法中,植物材料的懸浮液在專用反應器中150-190℃下加熱20-60分鐘(EP0265970Bl;Kabel等,2002;Carvalheiro等,2004)。這種方法的缺點在于,由于反應溫度高,因此會產(chǎn)生食品中不受歡迎的副產(chǎn)物,如糠醛、羥甲基糠醛和乙酰丙酸(Carvalheiro等,2004)?,F(xiàn)有XOS和AXOS益生素制品的平均聚合度為2(EP0265970B1)或4(Yamada等,1993)。當用于食品時這些制品有一些缺點。首先,這些制品富含木糖,木糖的甜度約為蔗糖的60%(Suntory,木寡糖說明書和產(chǎn)品單,2001)。一些用途可能需要甜味,但其它用途需要更加中性的味道。平均聚合度低的木寡糖的甜度為蔗糖的40%(Suntory,木寡糖說明書和產(chǎn)品單,2001)。其次,平均聚合度低的制品的能量水平無法滿足低卡路里食品成分的要求。為計算木寡糖的能量值,認為每克木糖的可代謝能量值為4卡路里,每克木二糖和木三糖為2卡路里,每克DP>4的木糖基-阿糖基-寡糖為0卡路里(Suntory,木寡糖說明書和產(chǎn)品單,2001)。發(fā)明概述本發(fā)明涉及能有益調(diào)節(jié)人體腸道菌群的含有阿糖基木聚糖的營養(yǎng)添加劑。此外,提供了一些含有這種添加劑的食品和飲品以及制備所述添加劑的方法。發(fā)明詳述圖1阿糖基木聚糖的結構元素。A未取代的β-D-吡喃木糖基殘基;B在O-2位上被α-L-阿拉伯呋喃糖基部分取代的β-D-吡喃木糖基殘基;C在O-3位上被α-L-阿拉伯呋喃糖基部分取代的β-D-吡喃木糖基殘基;D在O-2和O-3位上被α-L-阿拉伯呋喃糖基部分取代的β-D-吡喃木糖基殘基。結構C顯示了阿魏酸與α-L-阿拉伯呋喃糖基殘基的O-5位連接的情況。圖2不同AXOS制品的HPSEC分子量分布。柱為ShodexSB-806HQ(300×8mm,Showa,DenkoK.K.,東京,日本)。分子量為78.8×104、40.4×104、21.2×104、11.2×104、4.73×104、2.28×104、1.18×104、0.59×104Da的支鏈淀粉標準品和葡萄糖(180Da)的洗脫體積從左到右用“x”符號指出。圖3在100℃和pH2、3、7和11下培育不同時間后AXOS-15-0.27(A)、Xylooligo-95P(B)和果寡糖(fructo-oligosaccharide)(C)的組成單糖的降解百分比。圖4在100℃和pH2、3和7下培育不同時間后AXOS-15-0.27(A)、Xylooligo-95P(B)和果寡糖(C)的水解百分比。圖5在100℃和pH2、3和7下培育不同時間后AXOS-15-0.27中木糖鍵(A)和阿拉伯糖鍵(B)的水解百分比。圖6AXOS-15-0.27、Xylooligo-95P和蔗糖的甜度。曲線顯示了評定員(n=20)給出的累積甜味百分比與化合物濃度(克/升)的繪圖。圖7將木聚糖內(nèi)切酶處理刮漿淀粉(或稱刮漿,squeegee)WU-AX制得的AXOS超濾后獲得的寡糖組分的HPSEC分子量分布。所用膜的MMCO為5kDa(圖A)、10kDa(圖B)和30kDa(圖C)。柱為ShodexSB-802.5HQ(300×8mm,Showa,DenkoK.K.,東京,日本)。分子量標記為分子量為11.2×104、4.73×104、2.28×104、1.18×104和0.59×104Da的Shodex標準P-82支鏈淀粉,分子量為810(DP6)、678(DP5)、546(DP4)、414(DP3)和282Da(DP2)的木寡糖標準品,分子量為180Da的葡萄糖,它們各自的洗脫體積從左到右用“x”符號指出。圖8將木聚糖內(nèi)切酶處理刮漿淀粉WU-AX制得的AXOS依次通過MMCO為10kDa和30kDa的膜超濾后獲得的寡糖組分的HPSEC分子量分布。分析的組分是10kDa膜的保留物通過30kDaMMCO后的保留物(RET10kDa+30kDa)、10kDa膜的保留物通過30kDaMMCO后的通過物(PER10kDa+30kDa)、或是通過10kDa膜的通過物(PER10kDa)。柱為ShodexSB-802.5HQ(300×8mm,Showa,DenkoK.K.,東京,日本)。分子量標記為分子量為11.2×104、4.73×104、2.28×104、1.18×104和0.59×104Da的Shodex標準P-82支鏈淀粉,分子量為810(DP6)、678(DP5)、546(DP4)、414(DP3)和282Da(DP2)的木寡糖標準品,分子量為180Da的葡萄糖,它們各自的洗脫體積從左到右用“x”符號指出。圖9在雞飼料中添加AXOS-7-0.34、AXOS-122-0.66或Xylooligo-95P對雞盲腸中微生物群的影響。試驗開始后分別在第1和2周通過腸桿菌科和雙歧桿菌科平板計數(shù)確定盲腸微生物群的組成。柱表示測量平均值,誤差棒表示標準差。根據(jù)Tukey檢驗可知,在給定的時間點上用不同字母表示的值相互之間顯著不同(p<0.05)。圖10在雞飼料中添加0.1%或0.25%AXOS-15-0.27、0.25%或1%果寡糖(FOS)或者木聚糖內(nèi)切酶14天后對雞盲腸中雙歧桿菌數(shù)目的影響。通過定量PCR測定雙歧桿菌屬的細菌。根據(jù)最小顯著性差異檢驗(leastsignificancedifferencetest)可知,用不同字母表示的值相互之間顯著不同(p<0.05;n=3)。柱表示測量平均值,誤差棒表示標準差。圖11在大鼠飲食中添加0.25%AXOS-8-0.27、AXOS-15-0.27、AXOS-16-0.78或AXOS-122-0.66喂養(yǎng)13天后對大鼠糞便中乙酸(上圖)、丙酸(中圖)和丁酸(下圖)水平的影響。根據(jù)最小顯著性差異檢驗可知,用不同字母表示的值相互之間顯著不同(p<0.05;n=4)。柱表示測量平均值,誤差棒表示標準差。圖12在大鼠飲食中添加4%AXOS-15-0.27或Xylooligo-95P喂養(yǎng)14天后對大鼠近側結腸內(nèi)乙酸(A)、末端結腸內(nèi)乙酸(B)、末端結腸內(nèi)丙酸(C)和末端結腸內(nèi)丁酸(D)水平的影響。柱表示測量平均值,誤差棒表示標準差。圖13在大鼠飲食中添加4%AXOS-15-0.27或Xylooligo-95P喂養(yǎng)14天后對盲腸內(nèi)雙歧桿菌水平的影響。通過定量PCR測定雙歧桿菌屬的細菌。根據(jù)最小顯著性差異檢驗可知,用不同字母表示的值相互之間顯著不同(p<0.05;n=4)。柱表示測量平均值,誤差棒表示標準差。圖1414天內(nèi)攝入4.88克/天AXOS-15-0.27或4.81克/天WPC對健康人類志愿者糞便內(nèi)雙歧桿菌數(shù)目的影響。通過定量PCR測定雙歧桿菌屬的細菌。柱表示測量平均值,誤差棒表示標準差。根據(jù)Wilcoxon符號秩檢驗可知,用星號表示的柱與基礎水平顯著不同(p<0.05;n=5)。圖15攝入一次AXOS-15-0.27(0.24、0.73、2.21或4.88g)對尿(A)和糞便(B)中氮排泄及對口-盲腸通過時間(C)的影響。氮排泄表示為攝入試驗膳食后0-48小時和0-72小時內(nèi)分別收集的尿或糞便樣品中回收的所給予15N-標記的氮的百分比???盲腸通過時間表示為0-72小時內(nèi)收集的糞便樣品中所給予的3H-標記的PEG的百分比。柱表示測量平均值,誤差棒表示標準差。根據(jù)Wilcoxon符號秩檢驗可知,用一個星號或兩個星號表示的柱與對照處理顯著不同,分別為p<0.05(n=9)和p<0.01(n=9)。圖16攝入一次AXOS-15-0.27(0.24、0.73、2.21或4.88g)對尿中對甲酚(A)和苯酚(B)排泄的影響。對甲酚和苯酚排泄表示為攝入試驗膳食后0-24小時內(nèi)收集的尿樣中回收的對甲酚和苯酚總量(毫克)。柱表示測量平均值,誤差棒表示標準差。根據(jù)Wilcoxon符號秩檢驗可知,用一個星號或兩個星號表示的柱與對照處理顯著不同,分別為p<0.05(n=9)和p<0.01(n=9)。描述已經(jīng)描述了在飼料或食品中添加特定阿糖基木聚糖制品的益生素效應。更具體地說,現(xiàn)有技術提供了平均聚合度(DP)低于4的木糖基-阿糖基-寡糖和含有天然形成的長鏈阿糖基木聚糖的阿糖基木聚糖制品產(chǎn)雙歧桿菌(bifidogenic)效應的例子。市售的木糖基-阿糖基-寡糖制品是在劇烈且不受控的解聚條件下制得的,這導致存在相對高水平具有甜味的木糖和短的木寡糖。這些制品的甜味使它們不能用于特定食品。此外,DP低于4的木糖基-阿糖基-寡糖分子具有代謝能,這使得它們無法用于低卡路里食品。天然形成的阿糖基木聚糖的理化性質如高粘性和高保水性使它們不適合廣泛用于食品。天然阿糖基木聚糖的部分解聚改善了它們的理化性質,已經(jīng)描述了含有平均DP約為58的阿糖基木聚糖分子的制品。然而,只在相對較高劑量時證實了這些部分解聚的阿糖基木聚糖在人類中的益生素作用(每天>6克;Grasten等,2003)。本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn),即含有平均DP在5和50之間的阿糖基木聚糖的阿糖基木聚糖制品當給予人類和作為人類模型的試驗動物時是有效的益生素。此外,這種制品沒有含天然阿糖基木聚糖或短鏈木糖基-阿糖基-寡糖的制品的理化或感官缺點。還發(fā)現(xiàn),在人類、大鼠和雞中,本發(fā)明的阿糖基木聚糖制品的產(chǎn)雙歧桿菌效應強于含平均DP為58或更高的部分解聚的阿糖基木聚糖的制品。此外,發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的阿糖基木聚糖制品主要在結腸末端發(fā)揮其益生素作用,而短鏈木寡糖在結腸近側部分活性更強。這一發(fā)現(xiàn)非常重要,因為看上去末端結腸內(nèi)的菌群組成與結腸疾病更具體是結腸癌之間有一定關系。除了益生素效應,使用本發(fā)明的阿糖基木聚糖制品還有其它有益效果,如減少尿氮排泄同時增加糞便氮排泄,以及減少尿中甲酚和苯酚的排泄。因此,在本發(fā)明的第一個方面,提供了一種用作食品添加劑或作為營養(yǎng)補充品基礎的阿糖基木聚糖制品。這種阿糖基木聚糖制品的特征在于,所述制品中所含阿糖基木聚糖分子的平均DP在5和50之間。在優(yōu)選的實施方案中,所述阿糖基木聚糖制品含有至少15%所述阿糖基木聚糖分子。在更優(yōu)選的實施方案中,該制品含有30%以上所述阿糖基木聚糖,例如60%以上。在更優(yōu)選的實施方案中,本發(fā)明制品中所含阿糖基木聚糖的平均DP在7和40之間,更優(yōu)選在7和20之間。通過高效尺寸排阻色譜(HPSEC)測得,本發(fā)明制品中所含阿糖基木聚糖的90%的DP優(yōu)選在2和650之間,更優(yōu)選在2和130之間。在優(yōu)選的實施方案中,本發(fā)明的阿糖基木聚糖制品獲自天然來源,如植物材料,更優(yōu)選來自谷物。它們可以是所述天然阿糖基木聚糖的選擇組分,或者可通過所述天然阿糖基木聚糖降解或發(fā)酵獲得,或者它們可以是通過化學、酶和/或物理方法制得的結構類似物。在優(yōu)選的實施方案中,所述阿糖基木聚糖制品衍生自面筋-淀粉分離過程的側流(side-stream),如WPC(Pfeifer&Langen)。在另一優(yōu)選實施方案中,所述阿糖基木聚糖制品衍生自谷物麩皮。以每份0.25克的劑量通過食物給予本發(fā)明的阿糖基木聚糖制品時觀察到了益生素效應。因此,在本發(fā)明的第二個方面,提供了一種含有本發(fā)明阿糖基木聚糖制品的食品或飲品。在優(yōu)選的實施方案中,所述食品或飲品每份含有0.1-5克本發(fā)明的阿糖基木聚糖制品。在更優(yōu)選的實施方案中,所述食品或飲品每份含有0.25-5克本發(fā)明的阿糖基木聚糖制品。在更優(yōu)選的實施方案中,所述食品或飲品每份含有1-3克本發(fā)明的阿糖基木聚糖制品。在另一優(yōu)選實施方案中,所述食品或飲品每份含有0.1-5克平均DP在5和50之間的阿糖基木聚糖。在更優(yōu)選的實施方案中,所述食品或飲品每份含有0.25-5克平均DP在5和50之間的阿糖基木聚糖。在更優(yōu)選的實施方案中,所述食品或飲品每份含有1-3克平均DP在5和50之間的阿糖基木聚糖。如上所述,本發(fā)明的阿糖基木聚糖制品特別適合作為低卡路里食品的有益添加劑。在一具體實施方案中,所述食品是乳制品,如酸奶或新鮮奶酪。優(yōu)選地,每100克所述乳制品(一份為125克)含有0.25-5克,更優(yōu)選1-3克,平均DP在5和50之間的阿糖基木聚糖。所述乳制品任選含有能夠發(fā)酵阿糖基木聚糖的雙歧桿菌屬或乳酸菌屬的活細菌。在另一具體實施方案中,本發(fā)明的飲料也稱為非酒精功能性軟飲料。優(yōu)選地,每100毫升這種功能性軟飲料含有0.25-5克,更優(yōu)選1-3克,平均DP在5和50之間的阿糖基木聚糖。或者,所述功能性軟飲料在250毫升中含有所需量的這種阿糖基木聚糖。在一具體實施方案中,所述功能性軟飲料含有能夠發(fā)酵阿糖基木聚糖的雙歧桿菌屬或乳酸菌屬的活細菌。通常,含有谷物或谷物衍生的材料作為組分的食品含有阿糖基木聚糖。然而,這些食品中所含的阿糖基木聚糖要么是DP超過6000的長鏈天然阿糖基木聚糖,要么是DP為至少200-300的部分解聚的阿糖基木聚糖。因此,使所述食品富含本發(fā)明的阿糖基木聚糖還提高了它們的營養(yǎng)價值。優(yōu)選地,這種富集是在含谷物食品的制造過程中添加給定量本發(fā)明的阿糖基木聚糖制品實現(xiàn)的。顯然,這種富集導致含谷物食品除了含有DP為200或更高的阿糖基木聚糖外,還含有DP低于200的阿糖基木聚糖群體(以平均DP在5和50之間為特征)。精通本領域的技術人員將了解,可在這些食品的制造過程中在適當條件下采用木聚糖分解酶(xylanoliticenzyme)至少部分實現(xiàn)使含谷物食品富含所述DP低于200的阿糖基木聚糖群體。在一具體實施方案中,所述食品是烘烤制品,如面包。優(yōu)選地,每100克所述面包富含0.25-5克,更優(yōu)選1-3克,平均DP在5和50之間的阿糖基木聚糖。在另一實施方案中,所述食品是油酥皮(pastry)制品,如蛋糕。優(yōu)選地,每100克所述油酥皮制品富含0.25-5克,更優(yōu)選1-3克,平均DP在5和50之間的阿糖基木聚糖。再在另一實施方案中,所述食品是意大利面制品。優(yōu)選地,每80克所述意大利面制品富含0.25-5克,更優(yōu)選1-3克,平均DP在5和50之間的阿糖基木聚糖。再在另一實施方案中,所述食品是早餐谷物。優(yōu)選地,每30克所述早餐谷物富含0.25-5克,更優(yōu)選1-3克,平均DP在5和50之間的阿糖基木聚糖。再在另一實施方案中,所述食品是餅干,例如干早餐餅干。優(yōu)選地,每125克所述餅干富含0.25-5克,更優(yōu)選-3克,平均DP在5和50之間的阿糖基木聚糖。本發(fā)明的阿糖基木聚糖制品也可有益地加入其它食品,例如但不限于,絞肉制品、巧克力、曲奇、面包棒和甜點如布丁。在本發(fā)明的第三個方面,提供了一種含有本發(fā)明的阿糖基木聚糖制品的食品補充品。在優(yōu)選的實施方案中,所述食品補充品是膠囊、藥片、粉末等。在更優(yōu)選的實施方案中,所述食品補充品被制成每日給予0.1-5克,更優(yōu)選0.25-5克,例如1-3克平均DP在5和50之間的阿糖基木聚糖。在本發(fā)明的第五個方面,提供了一種制造本發(fā)明的阿糖基木聚糖制品的方法。該方法的第一個實施方案包括以下步驟i.通過使富含阿糖基木聚糖的材料如麩皮、小麥面粉或小麥刮漿淀粉脫淀粉化(destarchification)和脫蛋白質化(deproteinisation)從富含阿糖基木聚糖的材料分離水不可提取的阿糖基木聚糖組分,優(yōu)選分別采用淀粉分解酶和蛋白水解酶;ii.用一種或多種木聚糖分解酶解聚水不可提取的阿糖基木聚糖組分。該方法的第二個實施方案包括以下步驟i.獲得部分解聚的水可提取的含阿糖基木聚糖的制品,如獲自淀粉-面筋分離過程測流的制品;ii.需要的話從所述含阿糖基木聚糖的制品除去淀粉和蛋白質,優(yōu)選分別采用淀粉分解酶和蛋白水解酶;iii.用一種或多種木聚糖分解酶解聚所述制品中所含的阿糖基木聚糖。在一具體實施方案中,用木聚糖分解酶處理之后將所述制品超濾以降低所述制品中單糖和DP為4或更低的寡糖的含量。在本發(fā)明的最后一個方面,提供了一種分析含谷物食品中DP小于200的阿糖基木聚糖群體的濃度和平均DP的方法。所述方法包括以下步驟i.研磨含谷物食品的樣品,優(yōu)選在干燥或凍干所述樣品之后進行研磨;ii.用蒸餾水提取研磨過的樣品;iii.在適當條件下用淀粉分解酶處理提取物,以將所有淀粉轉化成葡萄糖,例如在淀粉葡萄糖苷酶處理之后進行淀粉酶處理;iv.除去(iii)所得樣品中的葡萄糖,例如用酵母代謝葡萄糖;v.確定(iv)所得樣品中所含阿糖基木聚糖的分子量分布,優(yōu)選采用高效液相色譜(HPLC);vi.計算DP<200的阿糖基木聚糖組分的相對量和平均DP,例如通過分析HPLC曲線下的面積。下面將參照下述實施方案來進一步描述本發(fā)明。示例性實施方案實施例實施例1制備平均DP>4的XOS/AXOS材料和方法Xylooligo-95P。主要由木二糖、木三糖和木四糖構成的市售木寡糖制品Xylooligo-95P獲自SuntoryLtd.(東京,日本)。從小麥麩皮制備水不可提取的阿糖基木聚糖。為制備麩皮中水不可提取的阿糖基木聚糖(WU-AX),將市售小麥麩皮(MenebaMeelBV,鹿特丹,荷蘭)用作原料。按照Maes等(2004)描述的方法通過酶處理部分除去麩皮中的非阿糖基木聚糖。小麥麩皮與水(1∶7w/v)的懸浮液先用耐熱α-淀粉酶(Termamyl120LS,Novozymes,Bagsvaerd,丹麥;1μl/g小麥麩皮)在90℃處理90分鐘以水解淀粉。冷卻至50℃后用濃HCl將懸浮液的pH調(diào)至6.0并將懸浮液與蛋白酶(Neutrase0.8L,Novozymes,Bagsvaerd,丹麥;150μl/g小麥麩皮)一起在50℃培育24小時以水解剩余蛋白質。之后將懸浮液煮沸,過濾并丟棄濾液。殘余物被稱為“麩皮WU-AX”,用水洗滌并空氣干燥。從小麥面粉或小麥刮漿淀粉(squeegeestarch)制備水不可提取的阿糖基木聚糖。采用標準方法(McRitchie,1985)可將小麥面粉分成4種不同組分A-淀粉(初淀粉(primestarch))、B-淀粉(刮漿淀粉或尾粉(tailing))、面筋和水溶性組分。WU-AX集中在刮漿淀粉組分中。通過酶處理從刮漿淀粉組分中部分除去非阿糖基木聚糖材料。首先,將刮漿淀粉與水的懸浮液(1∶6w/v)用耐熱α-淀粉酶(Termamyl120LS,Novozymes,Bagsvaerd,丹麥,30μl/g刮漿淀粉)在90℃處理60分鐘,用淀粉葡萄糖苷酶(Megazyme,Bray,愛爾蘭,20μl/g刮漿淀粉)在60℃處理16小時以水解淀粉。煮沸30分鐘并離心,然后將殘余物與蛋白酶(Neutrase0.8L,Novozymes,Bagsvaerd,丹麥;20μl/g刮漿淀粉)一起在50℃培育20小時以水解剩余蛋白質。之后再次將懸浮液煮沸(30分鐘),過濾并丟棄濾液。殘余物被稱為“面粉WU-AX”,用水、乙醇(95%v/v)洗滌并空氣干燥。除了可從小麥淀粉提取WU-AX,也可從小麥刮漿淀粉中直接分離WU-AX。此時將市售的工業(yè)上淀粉-面筋分離過程的測流產(chǎn)品Meritena233(Tate&LyIe,Aalst,比利時)用作原料。然后,將Meritena233與水的懸浮液(1∶5w/v)用耐熱α-淀粉酶(Termamyl120LS,Novozymes,Bagsvaerd,丹麥,30μl/gMeritena233)在90℃處理60分鐘,用淀粉葡萄糖苷酶(Megazyme,Bray,愛爾蘭,20μl/gMeritena233)在60℃處理16小時以水解淀粉。煮沸30分鐘并離心,然后將殘余物與蛋白酶(Neutrase0.8L,Novozymes,Bagsvaerd,丹麥;20μl/gMeritena233)一起在50℃培育20小時以水解剩余蛋白質。之后再次將懸浮液煮沸(30分鐘),過濾并丟棄濾液。殘余物被稱為“刮漿淀粉WU-AX”,用水、乙醇(95%v/v)洗滌并空氣干燥。小麥戊聚糖濃縮物(WPC)。小麥戊聚糖濃縮物(WPC,Pfeifer&Langen,Dormagen,德國)衍生自小麥面粉,Courtin和Delcour(1998)已經(jīng)詳細描述了其化學組成。WPC富含水可提取的阿糖基木聚糖(約43%)和蛋白質(約30%)。其余部分主要由阿糖基半乳聚糖肽(約14%)和較少量的聚合葡萄糖(6%)構成。制備avDP為122、A/X比為0.66的AXOS(AXOS-122-0.66)。制備AXOS-122-0.66的原料為市售小麥戊聚糖濃縮物(WPC,Pfeifer&Langen,Dormagen,德國)。將WPC溶于去離子水(1∶10w/v)并加入二氧化硅的水懸液(20%w/v)直至二氧化硅/蛋白質比例為7∶1。用0.1MHCl將混合物的pH調(diào)至4.8以使蛋白質最大程度地吸附到二氧化硅上。將懸浮液攪拌30分鐘后通過布氏漏斗過濾。丟棄含有二氧化硅/蛋白質的殘余物,濾液用乙醇沉淀。邊連續(xù)攪拌邊加入乙醇(95%v/v),直到最終濃度達到65%(v/v),之后再攪拌30分鐘,靜置(24小時,4℃)并過濾,所得殘余物用溶劑干燥(乙醇、丙酮和二乙醚)并空氣干燥。將所得物質均質并通過250μm篩篩分。制備avDP為16、A/X比為0.78的AXOS(AXOS-16-0.78)。從市售小麥戊聚糖濃縮物(WPC,Pfeifer&Langen,Dormagen,德國)制備AXOS-16-0.78。如制備AXOS-122-0.66所述用二氧化硅處理WPC以除去蛋白質?;厥盏臑V液再與棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)的木聚糖內(nèi)切酶XAA(Shearzyme500L,Novozymes,Bagsvaerd,丹麥)一起在30℃培育24小時,每克小麥戊聚糖濃縮物使用29單位酶。通過煮沸(30分鐘)將酶滅活,之后將所得溶液冷卻并乙醇沉淀。邊連續(xù)攪拌邊加入乙醇(95%v/v),直到最終濃度達到80%(v/v),之后再攪拌30分鐘,靜置(24小時,4℃)并過濾,將所得殘余物溶于去離子水并再次乙醇沉淀。邊連續(xù)攪拌邊加入乙醇(95%v/v),直到最終濃度達到65%(v/v),之后再攪拌30分鐘,靜置(24小時,4℃)并過濾,除去沉淀的物質。將余下的上清旋轉蒸發(fā)、除去乙醇、溶于去離子水并凍干。將所得物質均質并通過250μm篩篩分。制備avDP為7、A/X比為0.34的AXOS(AXOS-7-0.34)。制備AXOS-7-0.34的原料是如上述分離的麩皮WU-AX。隨后將麩皮WU-AX與木聚糖內(nèi)切酶XBS(GrindamylH640,Danisco,丹麥)一起在30℃培育24小時,每克干燥的分離的麩皮WU-AX使用80單位酶。過濾后,通過煮沸(30分鐘)將酶滅活,之后將濾液凍干,將所得物質均質并通過250μm篩篩分。制備avDP為15、A/X比為0.27的AXOS(AXOS-15-0.27)。市售小麥麩皮(DosscheMills&Bakery,Deinze,比利時)被用作制備AXOS-15-0.27的原料。小麥麩皮與水(1∶7w/v)的懸浮液先用耐熱α-淀粉酶(Termamyl120LS,Novozymes,Bagsvaerd,丹麥;1μl/g小麥麩皮)在90℃處理90分鐘以水解淀粉。冷卻至50℃后用濃HCl將懸浮液的pH調(diào)至6.0并將懸浮液與蛋白酶(Neutrase0.8L,Novozymes,Bagsvaerd,丹麥;40μl/g小麥麩皮)一起在50℃培育4小時以水解剩余蛋白質。之后將懸浮液煮沸20分鐘,過濾并丟棄濾液。殘余物用水洗滌并重懸于去離子水(1∶14w/v)。邊連續(xù)攪拌邊將懸浮液與木聚糖內(nèi)切酶XBS(GrindamylH640,Danisco,丹麥)一起在50℃培育10小時,每克去淀粉和去蛋白質的小麥麩皮使用1.4單位酶,然后加入第二次劑量木聚糖內(nèi)切酶XBS再在50℃培育10小時,每克去淀粉和去蛋白質的小麥麩皮使用1.1單位酶。通過煮沸(30分鐘)將酶滅活,將溶液濃縮直到降膜蒸發(fā)器中留下20%干物質,最后在噴霧干燥器中干燥。制備avDP為8、A/X比為0.27的AXOS(AXOS-8-0.27)。AXOS-8-0.27是將AXOS-15-0.27與來自棘孢曲霉的木聚糖內(nèi)切酶XAA(Shearzyme500L,Novozymes,Bagsvaerd,丹麥)的溶液(1∶10w/v)在30℃培育1小時制備的,每克AXOS-15-0.27使用125單位酶。通過煮沸(30分鐘)將酶滅活,之后將溶液凍干,將所得物質均質并通過250μm篩篩分。制備avDP為39、A/X比為0.22的AXOS(AXOS-39-0.22)。AXOS-39-0.22是從如上所述分離自Meritena233B-淀粉的小麥刮漿淀粉WU-AX制備的。將平均A/X比為0.63的刮漿淀粉WU-AX以3克/升懸浮于25mM乙酸鈉緩沖液(pH4.7),邊連續(xù)攪拌邊與木聚糖內(nèi)切酶XBS(GrindamylH640,Danisco,丹麥)一起在30℃下培育2小時,每克刮漿淀粉WU-AX使用3.3單位酶。離心(10,000g,15分鐘,18℃)后將上清液煮沸30分鐘以將酶滅活,并用上述乙酸鈉緩沖液(最初體積的1/4)洗滌殘余物。將洗下來的水滅活(30分鐘,100℃)并與上清液合并。過濾后將所得溶液凍干以得到avDPGC為262、A/X比為0.50的AXOS。將酶溶解的物質再溶于去離子水(1∶20w/v)并加入HCl(1M)將溶液的pH調(diào)至2.8。將溶液在90℃培育24小時以除去大部分α-1,2-和α-1,3-連接的阿拉伯糖取代基,相比AXOS的β-1,4-連接的木糖亞基這兩種取代基更易被酸水解。冷卻至室溫后加入1MNaOH中和溶液并離心(10,000g,20分鐘,18℃)。邊連續(xù)攪拌邊在所得上清液中加入乙醇(95%v/v),直到最終乙醇濃度達到80%(v/v)。將混合物再攪拌30分鐘并于4℃過夜。通過離心(10,000g,20分鐘,4℃)除去沉淀的AXOS化合物,將其溶于去離子水,凍干,將所得物質均質并通過250μm篩篩分。制備avDP為31、A/X比為0.21的AXOS(AXOS-13-0.21)。AXOS-13-0.21是將AXOS-39-0.22(3克/升)與來自棘孢曲霉的木聚糖內(nèi)切酶XAA(Shearzyme500L,Novozymes,Bagsvaerd,丹麥)的溶液30℃培育2小時制備的,每克AXOS-39-0.22使用27.7單位酶。通過煮沸(30分鐘)將酶滅活,之后將溶液凍干,將所得物質均質并通過250μm篩篩分。分離制品的定性。用不同技術來定性寡糖制品。通過Courtin等(2000)所述的氣液色譜分析確定總糖和還原端(reducingend)糖含量。樣品的阿糖基木聚糖(AX)含量表示為0.88×(%阿拉伯糖+%木糖)??蓪⒛咎呛桶⒗堑目偭砍赃€原端木糖的量以計算通過氣液色譜法確定的AXOS的平均聚合度(avDPGC)。通過AOAC官方方法(1995)的改進方法--Dumas燃燒法來確定樣品的蛋白質含量(N×5.7)。采用裝配有ED-40電化學檢測器、GP-50梯度泵和AS-3500自動取樣器的DionexDX-500色譜系統(tǒng)(Sunnyvale,CA,USA),通過高效陰離子交換色譜和脈沖電流檢測(HPAEC-PAD)分析制品的組成寡糖。將樣品(10mg)溶于純的去離子水(2ml,電阻率為18mΩ-cm),過濾并注入(25μl)與CarbopacPA-100陰離子交換柱(4×250mm)相連的CarbopacPA-100保護柱(4×25mm)。洗脫(1.0毫升/分鐘)采用30分鐘100mMNaOH中從0到250mM乙酸鈉的線性梯度,然后是15分鐘100mMNaOH中從250到400mM乙酸鈉的線性梯度。梯度洗脫之后柱用100mMNaOH洗脫5分鐘。用采用以下電位和時限設置的脈沖電流檢測模式的ED-40檢測器監(jiān)測洗脫E1,+0,05V(t1=400ms);E2,+0,75V(t2=200ms);E3,-0,15V(t3=400ms)。阿拉伯糖(A)、木糖(X1)、木二糖(X2)和DP為3-6的XOS(X3-X6)被用作參考。高效尺寸排阻色譜(HPSEC)在裝配有自動進樣器的HPLC系統(tǒng)(KontronInstruments,325泵系統(tǒng),Kontron,米蘭,意大利)上進行。將所有制品溶于0.3%氯化鈉(1.5ml)、過濾并注入(20μl)與ShodexSB-806HQHPSEC柱(300×8mm,分離范圍1×102-20×106Da)相連的ShodexSB-800P保護柱(Showa,DenkoK.K.,東京,日本,50×6mm)。用0.3%氯化鈉(0.5毫升/分鐘;30℃)洗脫并用折射率檢測器(VDSOptilab,柏林,德國)監(jiān)測。分子量標記為分子量為78.8×104、40.4×104、21.2×104、11.2×104、4.73×104、2.28×104、1.18×104和0.59×104Da的Shodex標準P-82支鏈淀粉和分子量為180Da的葡萄糖。寡糖的平均聚合度(avDP)通過高效尺寸排阻色譜確定(avDPHPSEC),用MMHPSEC/132來計算。確定木聚糖分解酶(xylanolyticenzyme)的活性。木聚糖分解酶的活性采用xylazyme(Megazyme,Bray,愛爾蘭)作為不溶性底物按照制造商的測定方法進行比色測定。1單位定義為在測試條件下使590nm的消光改變1.0所需的酶的量。結果和討論如材料和方法中所述,從小麥麩皮、小麥面粉或小麥刮漿淀粉制備不同類型的AXOS。不同制品的阿糖基木聚糖含量、平均取代度(阿拉伯糖與木糖的比值)和平均聚合度的性質示于表1,其中將它們與已知具有益生素特性的市售XOS制品Xylooligo-95P(Campbell等,1997;Hsu等,2004)的相應值進行了比較。根據(jù)表1及下文中使用的術語,AXOS制品表示為AXOS-x-y,其中x是通過氣液色譜法確定的平均聚合度,y是阿拉伯糖與木糖的比值。不同制品的平均聚合度為7-122(Xylooligo-95P為2),取代度為0.21-0.78(Xylooligo-95P為0.09)。衍生自小麥麩皮的制品(AXOS-7-0.34、AXOS-15-0.27、AXOS-8-0.27)的取代度低于衍生自小麥面粉的制品(AXOS-122-0.66、AXOS-16-0.78)。我們還顯示,用酸處理可降低AXOS化合物的取代度。實際上,AXOS-39-0.22是通過包括酸處理在內(nèi)的不同步驟(見材料和方法)從刮漿淀粉WU-AX制備的,這使平均取代度從刮漿淀粉WU-AX的0.63降至AXOS-39-0.22的0.22。圖2顯示了通過HPSEC確定的不同AXOS制品的分子量分布。所有AXOS制品都是多分散的,并由具有位于通過氣液色譜法確定的avDP附近的峰的分子實體構成。表1提供了不同AXOS制品中通過HPSEC洗脫分布確定的包含90%寡糖的聚合度范圍。實施例2XOS/AXOS制品的理化和感官特性材料和方法寡糖制品。按實施例1材料和方法中的描述獲得Xylooligo-95P、AXOS-15-0.27、AXOS-39-0.22和AXOS-13-0.21。果寡糖(FOS)制品是市售產(chǎn)品Raftilose(Orafti,Tienen,比利時)。首先將用于感官分析的AXOS-15-0.27溶于水(1∶25w/v)并用活性碳處理以除去制造過程中造成的可能的臭味。將AXOS-15-0.27和活性碳(0.75g/gAXOS-15-0.27)的懸浮液在18℃攪拌1小時,傾析后通過離心(10000g,30分鐘,18℃)除去活性碳。穩(wěn)定性測量。對寡糖制品水可提取的部分進行穩(wěn)定性測量,該部分是用以下方法制得的將制品懸浮于去離子水(1∶10w/v),然后振蕩(2小時,18℃)、離心(10,000g,20分鐘,18℃)和過濾。凍干濾液,然后將水可提取的樣品溶于pH值為2、3、7和11的通用緩沖液以得到寡糖濃度為0.15%(w/v)的溶液。通用緩沖液從用水(1.0升)配制的含6.0克檸檬酸、3.9克磷酸二氫鉀、1.8克硼酸和5.8克二乙巴比妥酸構成的儲液制備(Britton和Welford,1937)。用2.0MHCl或2.0MNaOH將一份(20ml)該儲液調(diào)至所需pH。各寡糖溶液在沸水中保持不同時間(0、5、10、15、20、30和60分鐘)。之后將溶液冷卻,并通過實施例1材料和方法中描述的氣液色譜法測量總的單糖和還原端糖的量。用公式(1)計算FOS的降解百分比,Xylooligo-95P和AXOS-15-0.27的降解百分比用公式(2)計算。FOS以及Xylooligo-95P和AXOS-15-0.27的水解百分比分別用公式(3)和(4)計算。AXOS-15-0.27中水解的木糖和阿拉伯糖鍵的百分比分別用公式(5)和(6)計算。感官分析。在一次最多容納10名志愿者的安靜會議室內(nèi)進行感官分析。對象被要求在會議開始前禁止飲食和飲水至少1小時。首先使對象熟悉過程,然后讓他們品嘗用純的去離子水(電阻率18mΩ-cm)制備的具有不同濃度Xylooligo-95P、AXOS-15-0.27、蔗糖(參考甜味刺激)、氯化鈉(參考咸味刺激)和抗壞血酸(參考酸味刺激)的編號樣品。各化合物的最高濃度溶液編號為8,最低濃度編號為1(表2)。要求對象按照濃度增加的順序連續(xù)品嘗一種化合物的所有濃度范圍,但各個對象品嘗不同化合物的次序是隨機的。品嘗化合物的濃度系列之前先用純的去離子水(電阻率為18mΩ-cm)漱口兩次,然后用一次性針筒在對象口中放入5毫升各測試溶液,含漱5秒鐘再咽下。要求參與者指出可識別出化合物甜味、咸味或酸味的最低濃度(個體識別閾)。平均味道識別閾定義為一半對象正確識別特定化合物味道的濃度,它是用總共20人的個體識別閾數(shù)據(jù)計算的。粘度測量。對獲自寡糖制品水可提取部分進行粘度測量,該部分用以下方法獲得將制品懸浮于水(1∶10w/v)中,然后振蕩(2小時,18℃)、離心(10,000g,20分鐘,18℃)和過濾。凍干濾液,然后按照Vinkx等(1991)的方法用Ostwald型粘度計(毛細管粘度計,SchottGerate,型號50904)在30℃測量5.0%(w/v)溶液的粘度。溶液粘度測量一式三份進行,表示為將各寡糖溶液的流動時間除以相同試驗條件下去離子水的流動時間得到的相比去離子水的相對值(ηrel)。計算出比粘度(ηsp=ηrel-1)之后,用公式(7)所示的Morris方程(Morris,1984)確定表觀固有粘度([ηapp],dl/g),式中,c(單位為mg/ml)為寡糖濃度,假設只有寡糖會影響溶液的粘度性質。每次分析后,粘度計用去離子水沖洗兩次、用95%乙醇沖洗兩次、用丙酮沖洗一次并用二乙醚沖洗一次,隨后用壓縮空氣干燥。結果和討論將AXOS-15-0.27的pH穩(wěn)定性與已知益生素果寡糖(FOS,市售產(chǎn)品Raftilose)和木寡糖(XOS,市售產(chǎn)品Xylooligo-95P)的pH穩(wěn)定性比較。不同寡糖在不同pH值(pH2、3、7和11)于100℃下保持不同時間。通過測量組成單糖含量的降低確定降解百分比,通過測量還原性組成單糖含量的升高確定水解百分比。如圖3所示,在低或中性pH(pH2、3或7)時沒有寡糖發(fā)生實質性降解。另一方面,在堿性pH(pH11)下觀察到所有三種測試寡糖都發(fā)生降解。這種效應對于Xylooligo-95P明顯,60分鐘后其有73%降解。堿性條件下最穩(wěn)定的寡糖是AXOS-15-0.27(圖3)。堿性pH下觀察到的降解稱為堿剝離(alkalipeeling),這是一種在升高的溫度(60-100℃)下發(fā)生的、從寡糖還原端開始的一種反應(Whistler和BeMiller,1958;Santori等,2003)。在三種測試寡糖中,顯然FOS在低pH下對水解最敏感(圖4)。在pH2和3時,58%和53%的FOS在60分鐘后被水解。Xylooligo-95P和AXOS-15-0.27在pH2時顯示出相同的水解水平。然而,在pH3時AXOS-15-0.27比Xylooligo-95P更加穩(wěn)定,只有2%的AXOS-15-0.27水解,而有6%的Xylooligo-95P水解(圖4)。在低pH下對AXOS-15-0.27水解的進一步研究顯示,相比木糖鍵而言,阿拉伯糖鍵更易于發(fā)生酸性水解。實際上,將AXOS-15-0.27在pH2、100℃下培育60分鐘會使所有阿拉伯糖鍵的54%水解,而在相同條件下只有4%的木糖鍵水解(圖5)。據(jù)報道,低DP木寡糖如Xylooligo-95P能品嘗出甜味,其甜度約為蔗糖的40%(Suntory,木寡糖說明書和產(chǎn)品單,2001)。至今還不知道具有較高聚合度的阿糖基木寡糖的味道特性。我們采用由20人構成的鑒味組來確定AXOS-15-0.27和Xylooligo-95P的味道識別閾。測試樣品還包括蔗糖、氯化鈉和抗壞血酸,它們分別作為甜味、咸味和酸味的代表。要求對象指出對于各測試化合物一系列濃度所識別出的化合物甜味、咸味或酸味的濃度。只有15%的鑒味組成員認為AXOS-15-0.27在最高測試濃度(71.5克/升)時有甜味,沒有人指出咸味或酸味。蔗糖和Xylooligo-95P的平均甜味識別閾分別為7和24克/升,而AXOS-15-0.27的該值高于71.5克/升。因此,AXOS-15-0.27的甜度比蔗糖低10倍以上,比Xylooligo-95P低3倍以上,而Xylooligo-95P本身的甜度比蔗糖低約3倍。測定AXOS-15-27、AXOS-39-0.22和AXOS-13-0.21的粘度,并與果寡糖(FOS,市售產(chǎn)品Raftilose)和木寡糖(XOS,市售產(chǎn)品Xylooligo-95P)進行了比較。如表3所示,這些不同的AXOS制品具有較高表觀固有粘度,比FOS和Xylooligo-95P高3-10倍。實施例3通過超濾分級AXOS制品材料和方法AXOS的制備。如實施例1材料和方法所述制備刮漿淀粉WU-AX。將刮漿淀粉WU-AX以3克/升懸浮于乙酸鈉緩沖液(25mM,pH4.7),并與來自棘孢曲霉的木聚糖內(nèi)切酶XAA(Shearzyme500L,Novozymes,Bagsvaerd,丹麥)一起在30℃下培育4小時,每克刮漿淀粉WU-AX使用18.4單位酶。通過煮沸30分鐘將酶滅活,之后過濾懸浮液,AXOS回收于濾液中。通過超濾分離AXOS。在終端‘HP4750攪拌室’超濾裝置(SterlitechCorporation,Kent,USA)中對AXOS進行分級。所用超濾膜的截斷分子量(MMCO)為5kDa(P005F,Celgard,Wiesbaden,德國)、10kDa(PES-10,SynderFiltration,Vacaville,CA,USA)或30kDa(PES-030H,Celgard)。通過置于室中央的攪拌速度為700rpm的涂有Teflon的磁力攪拌棒使膜表面的濃差極化最小化。壓力源是壓縮氮氣氣缸。通過壓力調(diào)節(jié)器控制壓力,所有過濾試驗在4巴恒壓下室溫進行。在終端超濾室(dead-endultrafiltrationcell)中加入300毫升待分級的溶液,當收集到總體積約200毫升的滲透液時停止超濾。分離制品的表征。見實施例1的材料和方法。如實施例1材料和方法的描述進行高效尺寸排阻色譜(HPSEC),但采用ShodexSB-802.5HQHPSEC柱(Showa,DenkoK.K.,東京,日本,300×8mm,分離范圍1×102-1×104Da)。分子量標記為分子量為11.2×104、4.73×104、2.28×104、1.18×104和0.59×104Da的Shodex標準P-82支鏈淀粉(2.0mg/ml),分子量為810(DP6)、678(DP5)、546(DP4)、414(DP3)和282Da(DP2)的木寡糖標準品,以及分子量為180Da的葡萄糖。結果和討論AXOS制品中有甜味且可代謝的低分子量寡糖的存在對于特定的用途如作為食品成分是不希望的,但是對于其它應用需要使用主要由低分子量寡糖構成的有甜味的AXOS制品。因此,開發(fā)能將AXOS制品分級從而將DP為2-3的AXOS/XOS與具有較高DP的AXOS分離的方法是有用的。以前總是通過用不同濃度的醇溶液沉淀將阿糖基木聚糖分級(Courtin和Delcour,1998)。然而,在工業(yè)規(guī)模采用醇沉淀在技術和經(jīng)濟上都不令人滿意。因此研究了通過超濾進一步分級用酶法制造的AXOS的可行性。一個例子是,用截斷分子量(MMCO)為5kDa、10kDa或30kDa的膜對通過將刮漿淀粉WU-AX與XAA(18.4U/g)一起在30℃培育4小時制備的AXOS進行超濾。當使用5kDa膜時,通過部分(PER5kDa)的HPSEC分布(圖7a)主要顯示大小與木二糖(DP2)和木三糖(DP3)相當?shù)墓烟?。保留部?RET5kDa)含有AXOS儲液中86%的可溶性阿糖基木聚糖(表4),與超濾前的AXOS制品有基本相同的分子量分布,但DP2和DP3的寡糖的量降低了約一半(圖7a)。由于高分子量組分的存在導致通過物的流量減少,因而RET5kDa部分中的低DP寡糖沒有被全部除去。用10kDa膜超濾可在通過部分中回收到34%阿糖基木聚糖組分,通過部分中保留了65%(表4)。通過部分(PER10kDa)主要含有DP2-6的寡糖。保留部分(RET10kDa)含有低水平尺寸較小的DP2-4的寡糖,主要由分子量從700到>110,000Da(DP5到DP>850)的寡糖構成(圖7b)。與PER10kDa部分相比,用30kDa膜得到的通過物(PER30kDa)具有較高含量1000-10,000Da的寡糖。相應的,30kDa膜的保留部分(RET30kDa)相比RET10kDa具有較低含量1000-10,000Da的寡糖,但奇怪的是,RET30kDa中DP2和DP3寡糖的含量高于RET10kDa。從表4可以清楚看出,超濾能影響所得AXOS部分的A/X比。通過部分(PER5kDa、PER10kDa和PER30kDa)富含A/X比相對較低的寡糖,而保留部分(RET5kDa、RET10kDa和RET30kDa)所含組分的A/X比較高。為評價通過超濾進一步分級AXOS的可能性,采用MMCO為30KDa的膜對RET10kDa部分進行第二次超濾。RET10kDa部分通過MMCO為30kDa的膜超濾后得到的通過部分(PER10kDa+30kDa)和保留部分(RET10kDa+30kDa)以及PER10kDa部分的HPSEC分布示于圖8。RET10kDa+30kDa部分主要含有高分子量組分(>20,000Da),這種組分在ShodexSB-802.5HQ柱上以空體積出現(xiàn)。PER10kDa+30kDa部分代表AXOS儲液中約25%的阿糖基木聚糖(表5),主要由分子量為700-10,000Da(DP5-75)的中等大小的寡糖構成(圖8)。這些結果說明,宜用MMCO為10kDa的膜進行超濾,這樣可使AXOS制品有高含量DP2-6的寡糖(超濾的通過物),或有高含量DP>4和低含量DP2-4的寡糖(超濾的保留物)。連續(xù)超濾宜使10kDa膜的保留物通過30kDa膜,這樣可得到富含DP5-75的AXOS的AXOS部分。實施例4AXOS制品對雞腸的影響材料和方法寡糖制品。見實施例1的材料和方法。通過平板計數(shù)進行微生物分析。將雞盲腸內(nèi)容物稱重,以1∶10稀釋于無菌蛋白胨生理鹽水(PPSS;0.1%細菌用蛋白胨,0.85%NaCl),在兜包(stomacher)中均質,再根據(jù)10倍稀釋方案稀釋于PPSS。然后用傾注平皿技術將適量稀釋液平鋪于VioletRedBileBlucose瓊脂(VRBG;OxoidCM0485B,Basingstoke,英國)以進行腸桿菌計數(shù),和平鋪于通過添加冰醋酸(1ml/l)和莫匹羅星(100mg/l)改進的Wilkins-Chalgren厭氧菌瓊脂(OxoidCM619)以進行雙歧桿菌計數(shù)。后一種改進提高了Wilkins-Chalgren瓊脂對雙歧桿菌的選擇性,改進的Wilkins-Chalgren瓊脂特別適用于一步測定雞盲腸中的雙歧桿菌數(shù)(Rada等,1999;Rada和Petr,2000)。于37℃有氧培養(yǎng)腸桿菌1天后對菌落進行計數(shù),于37℃厭氧培養(yǎng)(在帶有Oxoid不產(chǎn)氣菌系統(tǒng)AN0025A的厭氧罐中進行)雙歧桿菌4天后對菌落進行計數(shù)。用每克盲腸內(nèi)容物的數(shù)目表示。在制備樣品時需注意以下幾點以使雙歧桿菌最小程度暴露于氧氣(i)在樣品制備開始時才從盲腸取出盲腸內(nèi)容物;(ii)稀釋液和瓊脂在使用前才經(jīng)高壓滅菌或煮沸以除去溶解氧;(iii)雙歧桿菌計數(shù)平板從樣品制備開始時在厭氧氣氛下放置2小時。通過定量PCR進行微生物分析。按VandeWiele等(2004)的描述提取以1∶5稀釋于PPSS的盲腸樣品的DNA。使用添加有SYBRGreenPCRCoreReagents的緩沖液按照供應商(PEAppliedBiosystems,Nieuwerkerka/dIjssel,荷蘭)的描述在25μl反應混合物中進行擴增,擴增在具有光學帽(opticalcap)的MicroAmpOptical96孔反應平板(PEAppliedBiosystems)中進行。正向和反向引物分別為BIF164f和BIF163r(Satokari等,2001),以1μM的濃度使用以檢測雙歧桿菌屬細菌16S核糖體RNA基因的拷貝。PCR溫度程序如下50℃2分鐘,95℃10分鐘,然后40輪94℃1分鐘、62℃1分鐘和60℃1分鐘循環(huán)。模板DNA在一式三份反應混合物中擴增,并用ABIPrismSDS7000設備(PEAppliedBiosystems)監(jiān)測。基于從短雙歧桿菌(Bifidobacteriumbreve)(LMG11042株)培養(yǎng)物提取的DNA的四種不同稀釋液一式四份反應的實時PCR擴增建立標準曲線。將試驗樣品的實時PCR數(shù)據(jù)對標準曲線繪圖,并用具有最高DNA濃度的試驗樣品的DNA濃度除以各試驗樣品DNA濃度得到的因子校正DNA提取物的效率。統(tǒng)計分析。用Analyse-it軟件(版本1.71)通過1-因子方差分析以95%置信水平分析不同膳食對動物體重、飼料攝入或腸道微生物組成的影響。當對膳食因子觀察到統(tǒng)計學顯著效應時,通過最小顯著差(LSD)檢驗或通過Tukey檢驗以95%置信水平分析膳食間的差異。結果和討論測試了添加不同(阿糖基)木聚糖衍生制品對雞下部腸道微生物組成的影響。在第一個試驗中,從商業(yè)孵化場(Avibel,Tielt,比利時)購買了64只1天大的公雞(Ross公雞),分別養(yǎng)在4個圈中(每圈16只雞)。每個圈中有飲水盆和1米長的飼料容器。雞剛來時圈的溫度穩(wěn)定在35℃,然后每2天降低1℃。對動物保持23小時光照、1小時黑暗的光周期。飼料(每圈1份飼料)和飲水隨意給予。試驗期為14天。測試以下試驗飼料·對照飼料·對照飼料+0.25%AXOS-7-0.34制品(0.17%純AX)·對照飼料+0.25%AXOS-122-0.66制品(0.18%純AX)·對照飼料+0.25%Xylooligo-95P(0.22%純AX)括號中的濃度是根據(jù)其AX含量計算的校正純度。對照飼料由市售幼畜飼料(Krix0,HendrixUTD,Boxmeer,荷蘭)構成,其中含有木聚糖酶和葡聚糖酶的混合物(Roxazyme)作為添加劑。第7天時稱重所有動物,每組隨機選擇8只動物斷頭處死。之后解剖動物以收集盲腸。將盲腸排空,每種處理收集兩組內(nèi)容物(每次4根盲腸)。當其余動物14天大時重復該過程,但每種處理收集3組內(nèi)容物(各為3、3和2只動物)。未觀察到AXOS-7-0.34組動物的平均體重相比對照組有顯著變化。AXOS-122-0.66和Xylooligo-95P組動物的體重在7天后相比對照組顯著降低,但在14天后又上升,與對照的差異變得不顯著。在AXOS-122-0.66組中,7天后體重相對較低可能是由于該組中的雞在孵化時體重明顯較輕。對雞盲腸微生物群的分析顯示,飼養(yǎng)7天和14天后都有較高腸桿菌水平(約108-109/克盲腸內(nèi)容物),對任何處理都未觀察到顯著差異。7天后,所有處理組的雙歧桿菌水平都較低(約102-103/克盲腸內(nèi)容物)(圖9),但Xylooligo-95P組的動物除外,其雙歧桿菌水平要高得多(約108/克盲腸內(nèi)容物)。14天后,對照組盲腸中雙歧桿菌數(shù)仍舊較低。相反,AXOS-7-0.34組盲腸內(nèi)容物中觀察到的雙歧桿菌數(shù)目明顯升高(約為105倍)。Xylooligo-95P組的雙歧桿菌水平在7天后略低,但在14天后仍舊明顯高于對照組。在AXOS-122-0.66組中,14天后盲腸內(nèi)容物中雙歧桿菌的數(shù)目適度升高,但這種升高相比對照組不顯著。在對雞進行的第二個試驗中,從商業(yè)孵化場(Avibel,Tielt,比利時)購買了54只1天大的公雞(Ross公雞),分別養(yǎng)在6個圈中(每圈9只雞)。圈的條件如第一個試驗所述(見上文)。試驗期為14天。測試以下試驗飼料·對照飼料·對照飼料+0.141%AXOS-15-0.27制品(0.1%純AX)·對照飼料+0.352%AXOS-15-0.27制品(0.25%純AX)·對照飼料+0.263%FOS制品(0.25%純FOS)·對照飼料+1.053%FOS制品(1%純FOS)·對照飼料+0.01%木聚糖酶制品括號中的濃度是根據(jù)其AX或FOS含量計算的校正純度。FOS制品是市售產(chǎn)品Raftilose(Orafti,Tienen,比利時)。木聚糖酶制品為市售產(chǎn)品Belfeed(Beldem,Groot-Bijgaarden,比利時)。對照飼料的組成見表6。第14天時稱重所有動物并斷頭處死。之后解剖動物以收集盲腸,每3只屬于相同處理組的動物的盲腸內(nèi)容物被收集在一起。集中在一起的盲腸樣品中雙歧桿菌的數(shù)目通過定量PCR測定。用各種膳食試驗兩周后,未觀察到不同處理之間體重有顯著差異。就2周后雞盲腸中雙歧桿菌數(shù)而言,只有用含0.25%AXOS-15-0.27的膳食喂養(yǎng)的雞與對照處理顯著不同(圖10)。用0.25%AXOS-15-0.27飼養(yǎng)的雞的雙歧桿菌數(shù)比用對照膳食飼養(yǎng)的雞高22倍。注意,出于比較的目的,該試驗包括了已知的益生素-果寡糖(FOS),但即便以高于AXOS-15-0.27有效劑量4倍的劑量使用也未使雞盲腸中的雙歧桿菌數(shù)升高。這說明AXOS-15-0.27是異常有效的產(chǎn)雙歧桿菌化合物。已知雙歧桿菌與動物和人類健康積極相關,并且是許多益生素的組成成分。除了直接攝入微生物制品,人們對于在腸胃道內(nèi)選擇性富集這些菌群以促進或維持動物和人的良好健康狀態(tài),包括抑制結腸直腸癌的興趣越來越高(VanLoo等,2004)。雞的飼養(yǎng)實驗結果說明,所有含阿糖基木聚糖的飼料都能刺激雙歧桿菌在雞盲腸中的存在。具有高聚合度的AXOS制品AXOS-122-0.66只使雞盲腸中的雙歧桿菌菌群非顯著地適度上升。另一方面,具有低至中等聚合度的制品Xylooligo-95P、AXOS-7-0.34和AXOS-15-0.27使雙歧桿菌顯著的升高,且沒有使動物體重降低。在7天后就已經(jīng)能看到對Xylooligo-95P的反應,而AXOS-7-0.34和AXOS-15-0.27在14天后才造成產(chǎn)雙歧桿菌反應。這說明,相比具有較高平均聚合度和較高平均取代度的AXOS-7-0.34和AXOS-15-0.27制品,Xylooligo-95P更快被雙歧桿菌發(fā)酵。對用于人類和其它腸道較長的動物的益生素而言,需要它們被所選有益菌慢發(fā)酵。被腸細菌慢發(fā)酵增加了通過結腸近側部分后未被完全消耗的益生素的量,因此可作為結腸末端部分中適當細菌的發(fā)酵底物。在人類中,結腸末端和直腸部分的癌癥發(fā)病率加在一起要高于結腸近側部分的癌癥發(fā)病率(http://www.state.ni.us/health/cancer/cr/subsites.htm),因此,益生素能刺激末端結腸和直腸的有益微生物群是重要的。實施例5AXOS制品對大鼠腸的影響材料和方法XOS/AXOS制品。見實施例1的材料和方法。通過定量PCR進行微生物分析。將實施例4的材料和方法。短鏈脂肪酸分析。用5倍體積的水/磷酸/甲酸(98/1.8/0.2,v/v/v)提取腸樣品并通過離心澄清(22,000g,10分鐘)。短鏈脂肪酸(SCFA)通過氣液色譜法(Shimadzu,GC14A)在用ChromosorbW(meshsize60/30;Supelco,Bellefonte,USA)填裝的柱子上分析,并通過火焰離子化檢測?;诓煌嵋阎獫舛鹊臉藴势酚嬎鉙CFA濃度。己酸被用作內(nèi)標。統(tǒng)計分析。用Analyse-it軟件(版本1.71)通過1-因子方差分析以95%置信水平分析不同膳食對動物體重、飼料攝入、SCFA或腸道微生物組成的影響。當對膳食因子觀察到統(tǒng)計學顯著效應時,通過最小顯著差(LSD)檢驗以95%置信水平分析膳食間的差異。結果和討論在大鼠的第一個試驗中,從ElevageJanvier(LeGenest-St-lsle,法國)購買了40只6周齡的雄性大鼠(Wistar),將它們關在以不銹鋼絲作為底的籠子中(每個籠子2只大鼠),籠子放在環(huán)境控制室(22℃)中,14-10小時光-暗循環(huán)。大鼠可以自由接觸水和‘基礎人膳食’丸7天?!A人膳食’的組成見表7。適應7天基礎人膳食之后,將大鼠隨機分配到5個不同處理組之一(每組8只大鼠),各組可自由接觸由以下膳食之一制成的丸子(10毫米)13天·基礎人膳食·基礎人膳食+0.70%AXOS-122-0.66制品(0.5%純AX)·基礎人膳食+0.69%AXOS-16-0.78制品(0.5%純AX)·基礎人膳食+0.73%AXOS-15-0.27制品(0.5%純AX)·基礎人膳食+0.72%AXOS-8-0.27制品(0.5%純AX)括號中的濃度是根據(jù)其AX含量計算的校正純度。在含有AXOS的膳食中,基礎人膳食中的淀粉被適量AXOS替代。每周三次對動物進行稱重和測量飼料攝入。處理13天后,將所有動物稱重并用過量戊巴比妥實施安樂死。之后解剖動物以收集糞便。收集的糞便是從末端結腸到肛門的糞球。每2只屬于相同處理組的動物的糞便被收集在一起并分析其SCFA含量。處理期間的飼料攝入為18.9-27.7克/天,平均為22.7克/天。處理開始時大鼠的初始體重平均為262.0克,處理13天后最終體重平均為375.3克。未觀察到體重或飼料攝入在不同處理組之間有顯著差異。由于腸SCFA水平升高是攝入益生素造成的微生物菌群改變的標志(VanLoo,2004),我們測量了不同處理組糞便的SCFA含量。如圖11所示,用AXOS-8-0.27、AXOS-15-0.27和AXOS-16-0.78飼養(yǎng)的大鼠糞便的丙酸水平顯著高于對照組或AXOS-122-0.66組。AXOS-8-0.27、AXOS-15-0.27和AXOS-16-0.78組糞便中的乙酸和丁酸水平也有上升趨勢。SCFA如乙酸、丙酸和丁酸是由于腸道厭氧環(huán)境中的細菌呼吸吸收電子(electronsink)產(chǎn)生的。已知益生素能增加下腸胃道中SFCA的水平。高SCFA水平是需要的,因為它們能降低腸內(nèi)容物的pH,從而限制潛在致病性腐敗細菌生長。降低腸道pH還能增加礦物質鈣和鎂的溶解度和生物利用度(Teitelbaum和Walker,2002)。短鏈脂肪酸,尤其是丁酸,還能刺激結腸上皮細胞,從而提高上皮細胞的吸收力(Topping和Clifton,2001)。未觀察到用AXOS-15-0.27或AXOS-16-0.78(這兩種制品有幾乎相同的平均聚合物但A/X比不同)處理的大鼠之間有顯著差異的事實說明,取代度對AXOS刺激結腸內(nèi)細菌發(fā)酵的能力沒有大的影響。另一方面,當比較AXOS-16-0.78和AXOS-122-0.66的功效時,這兩種制品有幾乎相同的取代度但有不同聚合度,顯然具有高聚合度的AXOS制品如AXOS-122-0.66相比具有較低平均聚合度的制品是不太有效的益生素。因此,平均聚合度低于120的AXOS制品是優(yōu)選的益生素化合物。為提高末端結腸和直腸中AXOS的利用度而需要慢發(fā)酵時,優(yōu)選平均聚合度大于4的AXOS制品。在對大鼠進行的第二個試驗中,從ElevageJanvier(LeGenest-St-lsle,法國)購買了24只6周齡的雄性大鼠(Wistar),將它們關在以不銹鋼絲作為底的籠子中(每個籠子2只大鼠),籠子放在環(huán)境控制室(22℃)中,14-10小時光-暗循環(huán)。大鼠可以自由接觸水和‘基礎人膳食’丸(10mm)6天?!A人膳食’的組成見表7。用基礎人膳食飼養(yǎng)6天后,將大鼠隨機分配到3個不同處理組之一(每組8只大鼠),各組可自由接觸由以下膳食之一制成的丸子(10毫米)·基礎人膳食·基礎人膳食+5.87%AXOS-15-0.27制品(4%純AX)·基礎人膳食+5.26%Xylooligo-95P(4%純AX)括號中的濃度是根據(jù)其AX含量計算的校正純度。在含有AXOS-15-0.27或Xylooligo-95P的膳食中,基礎人膳食中的淀粉被適量AXOS替代。每周三次對動物進行稱重和測量飼料攝入。處理14天后,將所有動物稱重并用過量戊巴比妥實施安樂死,解剖動物以收集近側結腸、盲腸和末端結腸。每2只屬于相同處理組的動物的盲腸內(nèi)容物被收集在一起并通過定量PCR分析雙歧桿菌量。每2只屬于相同處理組的動物的近側結腸和末端結腸內(nèi)容物被收集在一起并分析SCFA含量。近側結腸中的SCFA水平遠低于末端結腸,且在近側結腸樣品中只有乙酸高出檢測閾。因此,只能獲得近側結腸的乙酸數(shù)據(jù)和末端結腸中乙酸、丙酸和丁酸的數(shù)據(jù)。在95%概率水平時沒有處理能顯著影響SCFA水平。然而可以看出數(shù)據(jù)中有明顯的趨勢。如圖12所示,AXOS-15-0.27和Xylooligo-95P組乙酸和丁酸水平高于對照組,但丙酸沒有。對末端結腸中丁酸的影響最顯著,相比對照組,AXOS-15-0.27組上升了58%,Xylooligo-95P組上升了34%。相比Xylooligo-95P,AXOS-15-0.27對末端結腸中所有SCFA都有較強影響。有趣的是,Xylooligo-95P使近側結腸中乙酸增加最多,而AXOS-15-0.27使末端結腸中乙酸升高最多。相比接受對照膳食的大鼠,用AXOS-15-0.27或Xylooligo-95P喂養(yǎng)的大鼠盲腸中雙歧桿菌的量顯著升高。在AXOS-15-0.27組中觀察到最高盲腸雙歧桿菌增加(比對照組升高1.08log單位或12倍,圖13)。這些結果說明,AXOS-15-0.27是比Xylooligo-95P更有效的益生素。這些數(shù)據(jù)還說明,相比Xylooligo-95P,AXOS-15-0.27被更慢發(fā)酵,這是由于Xylooligo-95P在近側結腸產(chǎn)生較強SCFA效果,而AXOS-15-0.27在末端結腸產(chǎn)生較強效果。在實施例5所述的對雞進行的試驗中也觀察到AXOS-15-0.27比Xylooligo-95P更慢的發(fā)酵。AXOS-15-0.27的慢發(fā)酵特性是需要的,因為這能使更多的益生素到達末端結腸,它們可在這里發(fā)揮其有益的假設的癌發(fā)生抑制作用。實施例6AXOS制品對人腸的影響材料和方法AXOS-15-0.27和WPC制品。見實施例1的材料和方法。通過定量PCR進行微生物分析。見實施例4的材料和方法。對象。沒有志愿者有腸胃病或代謝疾病或外科手術史。對象在研究開始前至少3個月內(nèi)未接受會影響消化道通過性或腸道菌群的抗生素或任何其它藥物治療。試驗期間沒有女性懷孕。未強迫志愿者采用標準膳食。但要求他們維持常規(guī)進食模式直到研究期結束,并要求他們避免過量攝入發(fā)酵乳制品和含有大量可發(fā)酵碳水化合物的食品。Leuven大學倫理委員會批準了該試驗,并征得了所有對象的同意。標記的底物。用獲自Euriso-top(Saint-Aubin,法國)的[15N,15N]脲按照Hofmann(1931)改進的Schoorl法合成乳糖-[15N,15N]-酰脲。3H-標記的聚乙二醇(3H-PEG)獲自NewEnglandNuclearLifeScienceProducts(Boston,MA,USA)。測定尿和糞便的Ntot和15N。用與熱導體檢測器(TCD;PDZ)和穩(wěn)定同位素比質譜儀(IRMS;PDZ)相連的元素分析儀(ANCA-SL;PDZ,Cheshire,UK)測定尿和糞便的總氮含量和15N豐度。在1000℃、存在氧氣時將已知體積的尿(15μl)或已知質量的糞便(約5-7mg凍干的糞便)氧化。之后使燃燒產(chǎn)物通過600℃含有銅的第二個爐子,在這里過量的氧氣被吸收同時氮氧化物也被還原成元素氮。用TCD檢測器測量總氮含量,15N豐度通過與元素分析儀的燃燒單元相連的IRMS檢測器測量。對照校準的實驗室標準(即標準硫酸銨溶液)測量N2中15N與14N的同位素比例。如下計算回收的15N給藥量的百分比(Evenepoel等,1999)式中,過量APt測得的特定尿樣品中15N的豐度,用原子百分比(AP)表示APbas基礎尿樣品中15N的豐度(用AP表示)Ntot特定尿樣品的總氮含量對于尿樣品,將給予測試膳食后0-48小時內(nèi)的15N給藥量%累加起來,而對于糞便樣品,將給予測試膳食后0-72小時內(nèi)的15N給藥量%累加起來。對糞便樣品口-糞便通過時間個體間差異進行校正。方法是將72小時內(nèi)回收的累加15N給藥量%除以72小時內(nèi)回收的累加3H-PEG給藥量%。將3H-PEG氧化(Packard樣品氧化劑,型號307)成3H-H2O之后通過液體閃爍計數(shù)器(Tricarb液體閃爍譜儀,型號3375;PackardInstruments,DownersGrove,IL,USA)測量糞便中3H-PEG的含量。尿中酚類化合物的測定。通過氣液色譜法-質譜(GC-MS)技術測量總對甲酚含量和苯酚含量。用濃硫酸將950ml尿的pH調(diào)至pH1。該溶液在90℃熱處理30分鐘以去蛋白(deproteinise)并水解結合的酚類。冷卻至室溫后,加入50ml2,6-二甲苯酚(20mg/100ml)作為內(nèi)標。用1ml乙酸乙酯萃取酚類。乙酸乙酯層用Na2SO4干燥,取0.5ml該溶液在GC-MS(TraceGC-MS,ThermoFinnigan,SanJose,CA,USA)上分析。分析柱為30m×0.32mm內(nèi)徑,1μmAT5-MS(AlltechAssociates,Deerfield,IL,USA)。用恒定流速為1.3毫升/分鐘的GC級氦氣作為載體。爐溫程序設定為從75℃(等溫5分鐘)開始以10℃/分鐘升至160℃并以20℃/分鐘升至280℃。以電子碰撞全掃描模式從m/z59到m/z590進行質譜檢測,每秒掃描兩次。對甲酚和苯酚的結果表示為0-24小時收集物的總含量(mg)。統(tǒng)計分析。用SPSS軟件(12.0版本)進行統(tǒng)計分析。采用Wilcoxon符號秩檢驗以95%置信水平對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計評價。結果和討論對10名健康志愿者(5名男性,5名女性,年齡23-37歲)進行第一次人體試驗。將10名志愿者隨機分成2組,每組5人。第一組接受2周每天7克(4.88克)懸浮在水中的AXOS-15-0.27,而第二組每天接受11.6克(4.82克)懸浮在水中的WPC。括號中的重量值是基于AX含量和制品水分含量的校正重量。收集每名志愿者試驗開始前的那天和第15天的糞便樣品。每次收集當天排出的第一次糞便,稱重并儲存于-20℃直到通過定量PCR進行微生物分析。如圖14所示,接受14天每天4.88克AXOS-15-0.27的對象的糞便雙歧桿菌水平比基礎水平高1.55對數(shù)單位(=35倍)(p=0.043)。相反,接受每天4.82克WPC的對象的雙歧桿菌水平在2周后輕微降低,但它與基礎水平的差異不顯著(p=0.715)。這些數(shù)據(jù)說明,具有中等平均聚合度的AXOS化合物如AXOS-15-0.27(avDP=15,表1)相比具有高平均聚合度的化合物如WPC(avDP=58,表1)顯示出更強的益生素效應。已經(jīng)從對雞進行的產(chǎn)雙歧桿菌作用試驗(見實施例4)和對大鼠進行的SCFA增加試驗(見實施例5)得出了相同的結論。在第二個試驗中,評價了不同一次(once-off)劑量的AXOS-15-0.27對人結腸中NH3、對甲酚和苯酚代謝的作用。NH3、苯酚和對甲酚有毒并且是潛在的致癌代謝物,它們是由結腸中的細菌發(fā)酵蛋白質產(chǎn)生的。用乳糖-[15N,15N]-酰脲作為生物標記評價NH3代謝。口服給予時,乳糖-酰脲未經(jīng)修飾到達結腸,這是由于乳糖-酰脲中糖部分和脲之間的分子鍵阻止了人腸胃道的酶降解。當乳糖-[15N,15N]-酰脲到達結腸時,它被特定細菌降解成[15N,15N]-標記的脲。標記的脲快速水解產(chǎn)生15NH3(Wutzke等,1997)。標記的NH3與結腸中的氨混合,其結果是,15N-標記測量中觀察到的變化反應了總結腸NH3的命運。除了監(jiān)測結腸NH3代謝,還測量了尿中存在的苯酚和對甲酚,它們被作為結腸中細菌發(fā)酵蛋白質的標志?;谖墨I數(shù)據(jù)(Evenepoel等,1999),假設在生理環(huán)境下約有3-6%攝入的蛋白質未被消化。但未消化的蛋白質到達結腸時,它們被結腸菌群發(fā)酵。細菌發(fā)酵酪氨酸導致產(chǎn)生苯酚和對甲酚。這些化合物被結腸大量吸收,在粘膜和肝臟中解毒(通過結合葡糖苷酸和硫酸鹽)并最終在尿中排泄。由于苯酚和對甲酚主要由細菌代謝產(chǎn)生且不來自人體代謝,因此尿中苯酚和對甲酚的產(chǎn)量反應了結腸中細菌產(chǎn)生這些化合物的情況(Smith和Macfarlane,1996)。其結果是,益生素對結腸蛋白質發(fā)酵的任何影響將反應在苯酚和對甲酚的尿濃度中。對9名(3名男性,6名女性,年齡19-26歲)健康的志愿者進行了第二次人體試驗。各志愿者接受含有不同劑量AXOS-15-0.27的5種不同測試膳食,每次測試之間間隔1周。AXOS-15-0.27的不同日劑量為0、0.35g(0.24g)、1.05g(0.73g)、3.17g(2.21g)和7g(4.88g),括號中的重量值是基于AX含量和制品水分含量校正的AXOS重量。志愿者接受不同測試膳食的順序是隨機的。測試膳食由薄煎餅(15,8克蛋白質,11,6克脂肪和21,1克碳水化合物;255千卡)構成,其中含有75毫克穩(wěn)定同位素標記的底物乳糖-[15N,15N]-酰脲、185kBq氚-標記的聚乙二醇(3H-PEG)和適量AXOS-15-0.27。3H-PEG用作口-糞便通過時間的生物標記(Geboes等,2005)。收集尿液,在其中加入1克新霉素以防止微生物生長。攝入測試膳食之前收集基礎尿樣品。收集攝入每種測試膳食后48小時內(nèi)的尿液,分三個不同部分收集0-6小時、6-24小時和24-48小時。測量尿液體積,然后將樣品儲存于-20℃直至分析。收集攝入測試膳食后72小時內(nèi)的糞便。排泄后將糞便立即冷凍、稱重并儲存于-20℃。進一步分析之前將同一天收集的所有糞便合并并均質。取出已知重量的樣品并凍干。再次稱重干燥的物質,取等份以進行氮和放射性分析。如圖15A所示,注意到相比缺乏AXOS-15-0.27的對照膳食,攝入含AXOS-15-0.27的測試膳食后15N-標記的氮的尿排泄率始終較低。攝入對照膳食后,尿樣品中15N給藥量的44.5%被回收。攝入0.24、0.73、2.21和4.88克AXOS-15-0.27后該值分別降至40.4%(相比對照降低9%)、43.7%(相比對照降低2%)、33.1%(相比對照降低26%)和33.6%(相比對照降低25%)。對劑量為2.21和4.88克的AXOS-15-0.27來說,尿15N排泄的降低是顯著的(p<0.05)。相反,在測試膳食中添加AXOS-15-0.27能使經(jīng)糞便排泄的15N始終增加(圖15B)。在對照測試膳食組中,糞便中15N給藥量的15.1%被回收。攝入0.24、0.73、2.21和4.88克AXOS-15-0.27后該值分別升至16.4%(相比對照升高8%)、18.8%(相比對照升高24%)、25.3%(相比對照升高67%)和26.1%(相比對照升高72%)。對劑量為2.21和4.88克的AXOS-15-0.27來說,糞便15N排泄的增加是顯著的(p<0.05)。通過3H-PEG生物標記測量可知,任何測試劑量的AXOS-15-0.27對胃腸通過時間都沒有影響(圖15C)。注意到相比缺乏AXOS-15-0.27的對照膳食,攝入含AXOS-15-0.27的測試膳食后對甲酚和苯酚的尿排泄率始終較低(圖16)。攝入0.24、0.73、2.21和4.88克AXOS-15-0.27后通過尿排泄的對甲酚相比對照分別降低9%、21%、35%和41%(圖16A)。攝入0.24、0.73、2.21和4.88克AXOS-15-0.27后通過尿排泄的苯酚相比對照分別降低45%、39%、33%和45%(圖16B)。對劑量從0.24克到4.88克的所有AXOS-15-0.27來說,尿苯酚排泄的降低是顯著的(p<0.05)。因此證實AXOS-15-0.27是在極低劑量(低達每份0.24克)下有活性的人益生素。在給予已知益生素如菊粉和乳果糖的人中已經(jīng)觀察到氮尿排泄的降低和糞便氮排泄的相應升高(DePreter等,2004;Geboes等,2005)。由于氨能縮短結腸上皮細胞的壽命、增加它們轉變和使它們更加易于化學癌變,因此需要刺激通過糞便排泄氨(Visek,1978)。結腸腔中的氨主要來自未消化蛋白質的細菌發(fā)酵(Smith&Macfarlane,1996;Fooks等,1999)。慢發(fā)酵益生素碳水化合物,如具有中等聚合度的AXOS,能刺激存在于結腸內(nèi)的糖解細菌和細菌的糖解途徑。因此,這種化合物能抑制結腸中的蛋白水解發(fā)酵和刺激依賴碳水化合物作為主要碳源和能源的細菌重新利用氨作為氮源。同時,需要降低蛋白質發(fā)酵代謝物甲酚和苯酚的尿排泄,因為這些酚類化合物與腸癌有關(Bone等,1976)。已經(jīng)觀察到益生素乳果糖能降低酚類化合物的尿排泄(DePreter等,2004)。假設甲酚和苯酚的排泄降低是通過在益生素的刺激下提高結腸中糖解細菌的活性從而提高酪氨酸或蛋白質腐化代謝產(chǎn)物的利用率造成的。參考資料AOAC,1995.OfficialMethodsofAnalysis(官方分析法),第16版,方法990.03.AssociationofOfficialAnalyticalChemists(公職分析化學工作者協(xié)會),WashingtonDC,USA。BeaugrandJ.,ChambatG.,WongV.W.K.,GoubetF.,RemondC,PaёsG.,BenamroucheS.,DebeireP.,O′DonohueM.,ChabbertB.(2005)ImpactandefficiencyofGH10andGH11thermostableendoxylanasesonwheatbranandalkali-extractablearabinoxylans(GH10和GH11耐熱木聚糖內(nèi)切酶對小麥麩皮和堿可提取的阿糖基木聚糖的作用和功效).Carbohydr.Res.3392529-2540Biely,P.,Vrsanska,M.,Tenkanen,M.,Kluepfel,D.(1997)JBiotechnol,57151-166BoneE,TammA和HillM(1976)Theproductionofurinaryphenolsbygutbacteriaandtheirpossibleroleinthecausationoflargebowelcancer(消化道細菌產(chǎn)生的尿酚類以及它們對引起大腸癌的可能作用).AmJClinNutr29,1448-1454。BrittonH.T.S,Welford,G.(1937)J.Chem.Soc.1848。CampbellJ.M.,F(xiàn)ahey,G.C.,Wolf,B.W.Selectedindigestibleoligosaccharidesaffectlargebowelmass,cecalandfecalshort-chainfattyacids,pHandmicorflorainrats(經(jīng)選擇的不可消化的寡糖能影響大鼠大腸、盲腸和糞便中的短鏈脂肪酸、pH和微生物菌群),1997,J.Nutr.127130-136Campbell,G.L.;Rossnagel,B.G.;Classen,H.L.;Thacker,P.A.1989.Genotypicandenvironmentaldifferencesinextractviscosityofbarleyandtheirrelationshiptoitsnutritivevalueforbroilerchickens(大麥提取物粘度的基因型和環(huán)境差異以及它們與烤雞營養(yǎng)價值的關系).AnimalFeedScienceandTechnology,226,221-230Carre,B.;Gomez,J.和Chagneau,A.M.(1995)Contributionofoligosaccharidesandpolysaccharidedigestionandexcretalossesoflacticacidandshortchainfattyacids,todietarymetabolisableenergyvalueinbroilerchickensandadultcockerels(寡糖和多糖消化及乳酸和短鏈脂肪酸的排泄損失對烤雞和成年公雞膳食可代謝能量值的貢獻).Br.Poultry.ScL,36611-629。CarvalheiroF.,Esteves,M.P.,ParajoJ.C.,Pereira,H.,Girio,F(xiàn).M.(2004)Productionofoligosaccharidesbyautohydrolysisofbrewery’sspentgrain(通過釀過酒的谷物的自動水解制造寡糖).BioresourceTechnol9193-100ChoctM.和KocherA.(2000)Non-starchcarbohydratesDigestionansitssecondaaryeffectsinmonogastrics(非淀粉糖類的消化及其對單胃的二次效應).澳大利亞營養(yǎng)協(xié)會第24屆年會的年報,F(xiàn)remantle,Perth,pp31-38。Choct,M.和Annison,G.(1992)Br.Poult.Sci.33821。Cleemput,G.,Roels,S.P.,VanOort,M.,Grobet,PJ.和Delcour,J.A.(1993)。Heterogeneityinthestructureofwater-solublearabinoxylansinEuropeanwheatfloursofvariablebread-makingquality(具有不同的制作面包質量的歐洲小麥粉中水溶性阿糖基木聚糖的結構差異).CerealChem.,70(3)324-329。CoonCN.,LeskeK.L.,AkavanichanO.和ChengT.K.(1990)Effectofoligosaccharides-freesoybeanmealontruemetabolizableenergyandfiberdigestioninadultroosters(無寡糖大豆粉對成年公雞真實可代謝能量和纖維消化的作用).PoultSci,69,787-793。Courtin,CM.和Delcour,J.A.(1998)。Physicochemicalandbread-makingpropertiesoflowmolecularweightwheat-derivedarabinoxylans(低分子量小麥衍生阿糖基木聚糖的物理化學和面包制造特性).J.Agric.FoodChem.,464066-4073。Courtin,CM.和Delcour,JA,(1998)Physico-chemicalandbreadmakingpropertiesoflowmolecularweightwheatderivedarabinoxylans(低分子量小麥衍生阿糖基木聚糖的物理化學和面包制造特性),J.Agric.FoodChem.,46,4066-4073。Courtin,CM.,VandenBroeck,H.和Delcour,JA(2000)。Determinationofreducingendsugarresiduesinoligo-andpolysaccharidebygasliquidchromatography(通過氣液色譜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述的非谷物基食品或飲品,每份含1-3克平均DP在7和40之間的阿糖基木聚糖。24.如權利要求20所述的非谷物基食品或飲品,每份含0.25-5克平均DP在7和20之間的阿糖基木聚糖。25.如權利要求20所述的非谷物基食品或飲品,每份含1-3克平均DP在7和20之間的阿糖基木聚糖。26.如權利要求18-25中任一項所述的食品,其特征在于,所述食品是肉制品。27.如權利要求18-25中任一項所述的食品,其特征在于,所述食品是乳制品。28.如權利要求18-25中任一項所述的飲品,其特征在于,所述飲品是非酒精飲料。29.如權利要求28所述的飲品,其特征在于,所述飲品是功能性軟飲料。30.如權利要求27-29中任一項所述的飲品或食品,其特征在于,所述食品含有雙歧桿菌屬或乳酸菌屬的活細菌。31.一種谷物基食品,每份所述食品含0.25-5克DP低于200的阿糖基木聚糖,其特征在于,所述阿糖基木聚糖群體的平均DP在5和50之間。32.如權利要求31所述的谷物基食品,每份所述食品含1-3克DP低于200的阿糖基木聚糖,其特征在于,所述阿糖基木聚糖群體的平均DP在5和50之間。33.如權利要求31所述的谷物基食品,每份所述食品含0.25-5克DP低于200的阿糖基木聚糖,其特征在于,所述阿糖基木聚糖群體的平均DP在7和40之間。34.如權利要求31所述的谷物基食品,每份所述食品含1-3克DP低于200的阿糖基木聚糖,其特征在于,所述阿糖基木聚糖群體的平均DP在7和40之間。35.如權利要求31所述的谷物基食品,每份所述食品含0.25-5克DP低于200的阿糖基木聚糖,其特征在于,所述阿糖基木聚糖群體的平均DP在7和20之間。36.如權利要求31所述的谷物基食品,每份所述食品含1-3克DP低于200的阿糖基木聚糖,其特征在于,所述阿糖基木聚糖群體的平均DP在7和20之間。37.如權利要求18-19或31-36中任一項所述的食品,其特征在于,所述食品是烘烤制品。38.如權利要求18-19或31-36中任一項所述的食品,其特征在于,所述食品是油酥皮制品。39.如權利要求18-19或31-36中任一項所述的食品,其特征在于,所述食品是早餐谷物。40.如權利要求18-19或31-36中任一項所述的食品,其特征在于,所述食品是餅干。41.如權利要求18-19或31-36中任一項所述的食品,其特征在于,所述食品是意大利面制品。42.如權利要求18-19或31-36中任一項所述的食品,其特征在于,所述食品是工業(yè)制備的甜點。43.如權利要求18-19或31-36中任一項所述的食品,其特征在于,所述食品是乳制品。44.如權利要求18-43中任一項所述的食品或飲品,其特征在于,所述食品或飲品是低卡路里制品。45.一種制造如權利要求1-17中任一項所述營養(yǎng)添加劑的方法,所述方法包括以下步驟i.通過使富含阿糖基木聚糖的材料如麩皮、小麥面粉或小麥刮漿脫淀粉化和脫蛋白質化從富含阿糖基木聚糖的材料分離水不可提取的阿糖基木聚糖組分,優(yōu)選分別采用淀粉分解酶和蛋白水解酶;ii.用一種或多種木聚糖分解酶解聚水不可提取的阿糖基木聚糖組分。46.一種制造如權利要求1-17中任一項所述營養(yǎng)添加劑的方法,所述方法包括以下步驟i.獲得含部分解聚的水可提取的阿糖基木聚糖的制品,如獲自淀粉-面筋分離過程測流的制品;ii.需要的話從所述含阿糖基木聚糖的制品除去淀粉和蛋白質,優(yōu)選分別采用淀粉分解酶和蛋白水解酶;iii.用一種或多種木聚糖分解酶解聚所述制品中所含的阿糖基木聚糖。47.如權利要求45或46所述的方法,其特征在于,用木聚糖分解酶處理之后將所述制品超濾以降低所述營養(yǎng)添加劑中DP為4或更低的寡糖的含量。全文摘要本發(fā)明涉及能有益調(diào)節(jié)人體腸道菌群的含有阿糖基木聚糖的營養(yǎng)添加劑。此外,提供了一些含有這種添加劑的幾種食品和飲品以及制備所述添加劑的方法。文檔編號A61P1/00GK1980579SQ20058002219公開日2007年6月13日申請日期2005年6月30日優(yōu)先權日2004年6月30日發(fā)明者J·德爾庫,C·庫爾坦,W·布魯克特,K·斯溫寧,K·韋貝肯,P·拉特格斯申請人:魯汶天主教大學研究開發(fā)部