專利名稱：陰道保健產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及維生素E和各種植物激素在增加陰道上皮細胞的生長、更新(renewal)和粘液的產(chǎn)生并改善雌性生殖道健康中的用途。
背景技術(shù)：
因為雌激素水平在絕經(jīng)期間下降，所以雌激素依賴性組織開始退化并出現(xiàn)雌激素缺乏的特有現(xiàn)象。在絕經(jīng)期，宮頸粘液水平下降，陰道粘膜退化。隨著年齡增加，陰道縮短，皺褶消失，彈性喪失。陰道分泌不足。當給予雌激素時，這些效應(yīng)中的某些方面可逆轉(zhuǎn)宮頸可分泌更多粘液，陰道粘膜可更新失去的各層。然而，這些癥狀通常不會完全消失，這部分是因為所提供的用于激素替代的雌激素的數(shù)量低于正常月經(jīng)周期間的循環(huán)雌激素水平。
約40％的絕經(jīng)后婦女會經(jīng)歷萎縮性陰道炎或陰道干燥。在陰道萎縮期間，陰道上皮的厚度、水合作用(hydration)、皺褶(皺襞)和血流都會減少。萎縮性陰道炎的原因包括局部和全身雌激素含量下降以及環(huán)境因素，例如化學治療、抗組胺藥、吸煙、過量運動和使用會陰產(chǎn)品(即沖洗器、除臭劑和香水)。雌激素或激素替代療法(HRT)能有效減輕陰道干燥。然而，可能的危險副作用包括乳癌、子宮內(nèi)膜癌、血栓、惡心、胸部觸痛和頭痛的發(fā)病率較高。
非處方(over-the-counter)市售產(chǎn)品包括潤滑劑(例如Astroglide和KY Lubricating Jelly)以及保濕劑(例如Replens和KY Long LastingMoisturizer)。這些產(chǎn)品在其組合物中大部分是水，僅能暫時緩解癥狀(1-2天)，但其實并不能對陰道組織提供長期益處。
因此，陰道干燥和陰道粘膜退化是個問題，特別是在絕經(jīng)后。刺激宮頸粘液的產(chǎn)生，可有助于緩解陰道干燥，也可以增強外源給予雌激素的作用，以緩解陰道干燥。而且也需要用于防止陰道粘膜退化的組合物和方法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供非激素療法，所述療法用于治療某些生殖和陰道方面的問題，包括萎縮性陰道炎。一般而言，這些療法具有最小副作用，刺激天然的和非激素的作用機制，促進陰道細胞生長和更新，增加粘液分泌，刺激基因表達，用新組織替代衰老組織并保持或恢復健康的組織功能。
因此，本發(fā)明涉及多種用于治療或預防雌性哺乳動物的陰道和/或生殖方面問題的組合物和方法。所述組合物包括有效量的包含維生素E和/或植物激素例如茉莉酮酸或赤霉酸的組合物。本發(fā)明的組合物也可包括類視黃醇或類胡蘿卜素(例如維生素A)和/或一種或多種核苷酸或核苷。一般而言，這些組合物可通過局部或陰道內(nèi)給予。本發(fā)明的組合物和方法尤其能夠在雌性哺乳動物體內(nèi)增加陰道細胞生長、刺激陰道細胞各層的更新(renewal)或周轉(zhuǎn)(turnover)和/或緩解或減輕陰道干燥。本發(fā)明的組合物和方法也可刺激膠原蛋白和纖連蛋白的產(chǎn)生。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種增加陰道或?qū)m頸上皮細胞生長的方法，所述方法包括給予雌性哺乳動物有效量的維生素E和/或植物激素例如茉莉酮酸或赤霉酸。本發(fā)明的組合物也可包含類視黃醇或類胡蘿卜素(例如維生素A)和/或一種或多種核苷酸或核苷。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種增加陰道或?qū)m頸上皮細胞的粘蛋白(例如粘蛋白-4)表達的方法，所述方法包括給予雌性哺乳動物具有有效量的維生素E和/或植物激素例如茉莉酮酸或赤霉酸的組合物。本發(fā)明的組合物也可包括類視黃醇或類胡蘿卜素(例如維生素A)和/或一種或多種核苷酸或核苷。
在另一個實施方案中，所述方法包括增加陰道或?qū)m頸上皮細胞的P2Y2受體或雌激素受體或血管內(nèi)皮生長因子的表達的方法，所述方法包括給予雌性哺乳動物具有有效量的維生素E和/或植物激素例如茉莉酮酸或赤霉酸的組合物。本發(fā)明的組合物也可包含類視黃醇或類胡蘿卜素(例如維生素A)和/或一種或多種核苷酸或核苷。
這類方法可促進哺乳動物的退化陰道粘膜的更新，預防或治療陰道干燥，或者維持或增強哺乳動物陰道粘液的正常保護功能。一般而言，維生素E、植物激素(例如茉莉酮酸或赤霉酸)和其它化合物都可經(jīng)由陰道內(nèi)給予。
附圖簡述
圖1說明1μM維生素E在24小時內(nèi)增加粘蛋白-4表達。經(jīng)溴化乙錠染色的2.0％瓊脂糖凝膠顯示出分離的β-肌動蛋白(350bp陽性對照)和粘蛋白-4(800bp)的PCR產(chǎn)物。第1道含有DNA標記。第2-5道含有PCR產(chǎn)物，分別使用宮頸cDNA、胎盤cDNA、ME-180 cDNA(未處理)和ME-180 cDNA(1μM維生素E)作為模板。
圖2A-2C說明在2天時間內(nèi)，三個濃度的反-視黃酸(○)、9-順-視黃酸(□)和13-順-視黃酸(◇)對ME-180細胞生長的影響。作為陰性對照，也圖示了不含視黃酸的培養(yǎng)基(×)對細胞生長的影響。圖2A圖示了在2天時間內(nèi)，10μM反-視黃酸(○)、9-順-視黃酸(□)和13-順-視黃酸(◇)對ME-1 80細胞生長的影響。圖2B圖示了在2天時間內(nèi)，1μM反-視黃酸(○)、9-順-視黃酸(□)和13-順-視黃酸(◇)對ME-180細胞生長的影響。圖2C圖示了在2天時間內(nèi)，100nM反-視黃酸(○)、9-順-視黃酸(□)和13-順-視黃酸(◇)對ME-180細胞生長的影響。Y軸是ME-180細胞數(shù)。
圖3提供一幅照片，顯示經(jīng)溴化乙錠染色的PCR產(chǎn)物的2％瓊脂糖凝膠，采用來自ME-180宮頸上皮細胞mRNA的cDNA作為模板。用兩組引物產(chǎn)生第2-11道的產(chǎn)物P2Y2-特異性引物(上面的條帶，650bp，第2-11道)和β-肌動蛋白-特異性引物(下面的條帶，300bp)。第1道和第12道是DNA大小標記。肉眼可見P2Y2產(chǎn)物在第2、3和7道，其中模板cDNA分別來自宮頸細胞(第2道)、不含維生素A的ME-180細胞(第3道)和不含維生素A或血清的ME-180細胞(第7道)。將100nM維生素A加入到ME-180細胞中，在血清存在下(第4-6道)和在血清不存在下(第8-11道)，引起P2Y2表達的增加。
圖4提供一幅照片，顯示經(jīng)溴化乙錠染色的PCR產(chǎn)物的2％瓊脂糖凝膠，使用來自ME-180宮頸上皮細胞cDNA作為模板。第1道提供DNA大小標記。用兩組引物產(chǎn)生第2-10道的PCR產(chǎn)物ER-α-特異性引物(上面的條帶)和β-肌動蛋白-特異性引物(下面的條帶)。在第2道，模板是來自在血清存在下培養(yǎng)的ME-180細胞的cDNA。在第3道和第7道，模板是來自血清不存在時培養(yǎng)的ME-180細胞的cDNA。在第4-6道，模板是來自無血清培養(yǎng)、且用100nM維生素A分別處理4小時、8小時和l6小時的ME-180細胞的cDNA。將100nM維生素A加入到ME-180細胞中，導致ER-α表達增加。
圖5提供一幅照片，顯示經(jīng)溴化乙錠染色的PCR產(chǎn)物的2％瓊脂糖凝膠，使用來自不同細胞類型的RNA作為模板。第1道和第7道提供DNA大小標記。用兩組引物產(chǎn)生第2-6道的PCR產(chǎn)物血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)特異性引物(上面的條帶)和β-肌動蛋白-特異性引物(下面的條帶)。第2道和第6道提供來自未處理ME-180細胞的cDNA的PCR產(chǎn)物。第3-5道提供來自用100nM維生素A分別處理4小時、8小時和16小時的ME-180細胞cDNA的PCR產(chǎn)物。
圖6提供一幅照片，顯示經(jīng)溴化乙錠染色的PCR產(chǎn)物的2％瓊脂糖凝膠，使用來自不同細胞類型的RNA作為模板。圖6中凝膠的第1道含有DNA大小標記，尤其是大小標記的100bp梯標記(最亮條帶是600bp)。第2道含有RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物，用來自宮頸RNA的模板cDNA和粘蛋白-4引物(800bp產(chǎn)物)以及β-肌動蛋白引物(300bp產(chǎn)物)。第3道含有類似PCR反應(yīng)產(chǎn)物，用來自ME-180細胞的模板cDNA。第4含有類似PCR反應(yīng)產(chǎn)物，用來自經(jīng)100nM維生素A處理24小時的ME-180細胞的模板cDNA。
圖7圖示與未接受茉莉酮酸或赤霉酸的人類志愿者(對照)進行比較，茉莉酮酸和赤霉酸對健康人類志愿者的細胞更新時間的影響。如圖所示，在未接受茉莉酮酸或赤霉酸的人類志愿者體內(nèi)，細胞更新較緩慢。茉莉酮酸使人皮膚細胞更新所需時間增加了約28％，而赤霉酸使細胞更新時間增加了約20％。
圖8圖示經(jīng)血細胞計數(shù)器測定的茉莉酮酸對細胞生長隨時間的影響。未接受茉莉酮酸的對照細胞(○)具有最小的細胞生長。接受1μg/ml茉莉酮酸(▲)、10μg/ml茉莉酮酸(×)和100μg/ml茉莉酮酸(◆)的細胞以劑量依賴方式表現(xiàn)出增加的細胞生長。
圖9圖示經(jīng)直接細胞計數(shù)法測定的茉莉酮酸對細胞生長隨時間的影響。未接受茉莉酮酸的對照細胞(○)的細胞生長最少。接受1μg/ml茉莉酮酸(■)、10μg/ml茉莉酮酸(◆)和100μg/ml茉莉酮酸(×)的細胞以劑量依賴方式表現(xiàn)出增加的細胞生長。這些數(shù)據(jù)表明，植物激素例如茉莉酮酸可以增加表皮細胞的細胞生長，因此可用于治療陰道萎縮。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供用于在雌性哺乳動物生殖系統(tǒng)內(nèi)增加粘液分泌并刺激細胞生長和表皮層更新的組合物和方法。本發(fā)明的組合物包含維生素E和/或植物激素，例如茉莉酮酸或赤霉酸。給予這類組合物可以增加雌性生殖系統(tǒng)的粘液產(chǎn)生、刺激細胞生長、促進陰道和宮頸細胞的更新。因此，本發(fā)明的組合物可以促進新細胞替代老細胞，因而更新雌性生殖道內(nèi)襯。
本發(fā)明利用價廉易得的活性化合物，所述化合物有效增強陰道和宮頸組織更新自身并產(chǎn)生水分的天然能力。因此，本發(fā)明的方法和組合物避免了強烈的化學品和非天然物質(zhì)，而這些物質(zhì)對使用者的健康和生殖的影響是未知的。
本發(fā)明的方法可從質(zhì)量及數(shù)量上改善生殖器分泌，修復和置換衰老組織并影響生殖細胞、上皮細胞和粘膜細胞內(nèi)的基因表達。其表達受到本發(fā)明方法影響的基因包括粘蛋白基因。
粘蛋白是指高分子量的糖蛋白家族，由粘膜組織的杯狀和非杯狀上皮細胞分泌或表達。粘蛋白可形成粘液，粘液是一種具有特定結(jié)構(gòu)和功能的高度水合的凝膠。不同物種的粘蛋白具有類似的功能特征，尤其是粘蛋白的蛋白質(zhì)骨架。已經(jīng)鑒定出了9種不同的粘蛋白基因(MUCl、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC6、MUC7和MUC8)。粘蛋白是含有50-80％糖的糖蛋白。它們是具有蛋白質(zhì)骨架的又大又長的分子(分子量105-107道爾頓)，蛋白質(zhì)骨架上連接有呈瓶刷構(gòu)型的寡糖。寡糖側(cè)鏈即瓶刷在其組成上可以是高度可變的，這表明該分子的更基本的功能源自蛋白質(zhì)核心。這些分子可通過二硫橋交聯(lián)，構(gòu)成分子量非常高的凝膠。不同組織可產(chǎn)生不同種類的粘蛋白。
根據(jù)本發(fā)明，維生素E可以增加粘蛋白的表達，因此使雌性哺乳動物生殖道分泌增加并形成粘液。
本發(fā)明所提供的對粘液分泌的影響包括但不限于粘蛋白(例如硫粘蛋白和/或唾液粘蛋白)的數(shù)量和種類、粘度變化、氫離子阻滯、疏水性、磷脂含量變化、糖基化和硫酸化、大分子組裝、表面張力、粘著性、運動性質(zhì)、彈性模量、拉伸性能、剛性系數(shù)(rigidity factor)、反沖系數(shù)(recoil factor)、粘液成絲現(xiàn)象、精子穿入性能、稠度、多孔性、蕨樣變(ferning)等。
本發(fā)明的方法可改變局部生殖系統(tǒng)的組成并刺激分泌，包括陰道、宮頸、子宮、輸卵管、前庭大腺(Bartholin gland)或前庭腺的組成和尿道分泌。本發(fā)明的方法和組合物可影響生殖系統(tǒng)內(nèi)粘液基因的功能，所述基因包括但不限于在宮頸、子宮和前庭大腺以及具有粘液分泌細胞的生殖系統(tǒng)其它部分內(nèi)控制粘液產(chǎn)生的基因。下生殖道(例如陰道)的鱗狀上皮和宮頸上皮細胞可以用本發(fā)明的方法處理。以下方法包括在內(nèi)影響或改變粘液基因的分泌效果、粘液分泌細胞、以及影響所有上述生殖系統(tǒng)各腺體的分泌特性和細胞表面粘蛋白的細胞的方法。
粘液可以按其化學、物理和生物學性質(zhì)來定義。粘液的流變學即流動性能包括粘液的粘度、流速、剪切指數(shù)、粘液成絲現(xiàn)象或延伸性，這些都是因為增加了粘彈性和蕨樣變(結(jié)晶)參數(shù)所致。陰道分泌物的水合作用、粘度、數(shù)量或其它性能的變化或刺激，可影響大量病癥和障礙，包括但不限于避孕、不育、絕經(jīng)、交媾困難(dyspareunia)、感染和其它相關(guān)及無關(guān)病癥。這些器官的功能和解剖學描述可參見以下文獻Novak′s Gynecology，12.sup.th edition，Berek，Adashi和Hillard編著，Williams和Wilkins，Baltimore，Md.，1996。
本發(fā)明的方法和組合物也可以增加雌性生殖道內(nèi)襯細胞(例如陰道細胞和宮頸細胞)的生長。這樣的細胞生長增加可快速發(fā)生，或者僅在治療數(shù)日后就可發(fā)生。例如，僅在治療2-3天后，大量新形成的細胞幾乎是未治療個體細胞的2-3倍或4-5倍。隨著治療進程，大量新形成的細胞還可進一步增加。例如，與未治療個體相比，接受治療的個體可具有約2倍至約20倍數(shù)量的新形成的年幼細胞。與未治療個體相比，其它個體可具有約2倍至約10倍數(shù)量的新形成的年幼細胞。這類增加的細胞生長可修復和置換衰老細胞和組織，更新雌性生殖道內(nèi)襯，提供更大彈性并改善參與生殖組織的健康。
因此，本發(fā)明具有至少兩個一般性用途。首先，本發(fā)明可以增加粘液數(shù)量和/或生殖器官分泌物的含水量，以改善雌性生殖系統(tǒng)的健康并且增加其潤滑度。其次，本發(fā)明可通過例如刺激細胞生長、基因表達和粘液分泌，用于更新衰老組織并增強這些組織的健康和彈性。
維生素E至少有8種天然存在的化合物具有維生素E活性。每種維生素E化合物都是6-苯并二氫吡喃醇衍生物。參見ULLMANN′SENCYCLOPEDIA OF INDUSTRIAL CHEMISTRY，第A27卷，VitaminE，第4章478-488(VCH Verlagsgesellschaft，1996)。生育酚類化合物(化合物Ia-d)具有飽和側(cè)鏈，而生育三烯酚(tocotrienol)類化合物(化合物IIa-d)具有不飽和側(cè)鏈。生育酚類化合物包括下式I的化合物 其中R1、R2和R3都獨立地為氫(H)、甲基(CH3)或羥基(OH)。α-生育酚化合物(Ia)是式I化合物，其中R1、R2和R3都為甲基。β-生育酚化合物(Ib)是式I化合物，其中R1和R3為甲基，R2為氫。γ-生育酚化合物(Ic)是式I化合物，其中R1為氫，而R2和R3為甲基。δ-生育酚化合物(Id)是式I化合物，其中R1和R2為氫，而R3為甲基。
生育三烯酚類化合物包括下式II的化合物 其中R1、R2和R3都獨立地為氫(H)、甲基(CH3)或羥基(OH)。α-生育三烯酚化合物(IIa)是式II化合物，其中R1、R2和R3都為甲基。β-生育三烯酚化合物(IIb)是式II化合物，其中R1和R3為甲基，R2為氫。γ-生育三烯酚化合物(IIc)是式II化合物，其中R1為氫，而R2和R為甲基。δ-生育三烯酚化合物(IId)是式II化合物，其中R1和R2為氫，而R3為甲基。
在本發(fā)明之內(nèi)，維生素E被認為包括具有維生素E活性的所有上述生育酚和生育三烯酚。
當本發(fā)明組合物中含有維生素E化合物時，維生素E化合物的用量占本發(fā)明組合物的約0.0001％至約50％、或約0.001％至約20％、或約0.001％至約10％、或約0.01％至約5％、或約0.05％至約2％。根據(jù)本發(fā)明，原位濃度范圍為約10-5M至約10-7M的活性赤霉酸對于增加上皮細胞增殖和粘蛋白-4表達來說是有效的。
赤霉酸赤霉酸包括一類化合物，也稱為赤霉素。赤霉素是影響植物生命周期的各種各樣過程的植物激素，這些過程包括種子萌發(fā)、抽莖、開花誘導、花藥發(fā)育和種子與果皮生長。赤霉素是四環(huán)雙萜類酸，可從真菌和高等植物中分離，具有下式(III)結(jié)構(gòu)的內(nèi)赤霉素烷(ent-gibberellane)環(huán)系 赤霉素首次是由日本研究人員于1930年自真菌藤倉赤霉(Gibberella fujikuroi，F(xiàn)usarium moniliforme)中分離獲得的。赤霉素是次生代謝物，已經(jīng)知道它們也存在于其它真菌、某些蕨類和許多裸子植物及被子植物中。在121種已知的赤霉素中，已經(jīng)鑒定出96種僅存于高等植物中，12種僅存于赤霉屬(Gibberella)中，12種在這兩者中都同時存在。在赤霉屬中觀察到許多不同的赤霉素可存在于個別被子植物中。
主要存在兩類赤霉素具有20個碳原子的C20-赤霉素(以下結(jié)構(gòu)IV)，以及第20個碳原子因代謝而失去的C19-赤霉素(以下結(jié)構(gòu)V)。在幾乎所有C19-赤霉素中，碳-19的羧酸與碳-10鍵合，產(chǎn)生內(nèi)酯橋。
內(nèi)赤霉素烷環(huán)系可含有許多結(jié)構(gòu)修飾，由此得到大量已知的赤霉素。具有已鑒定結(jié)構(gòu)的天然存在的赤霉素被稱為“A號”(MacMillan等(1968)Nature 217170-171)。目前，來自植物和真菌的126種天然存在的赤霉素是已知的。有關(guān)赤霉素的最新結(jié)構(gòu)信息可在以下網(wǎng)站查找到plant-hormones.bbsrc.ac.uk/gibberellin_information2.htm。
赤霉素的結(jié)構(gòu)變化有多種方式。碳-20可以不同氧化態(tài)存在，例如甲基(-CH3)、羥甲基(-CH2OH)、醛基(-CHO)或羧基(-COOH)。內(nèi)赤霉素烷骨架(尤其是C19-赤霉素骨架)也可含有其它官能團。羥基(-OH)經(jīng)常插入到環(huán)系中；也可發(fā)生環(huán)氧基(＞O)和酮基(＝O)官能團的插入，雖然不那么常見。取代基的位置和/或立體化學可影響分子的生化及生理特性。認為位于環(huán)平面之上的取代基是呈β構(gòu)型；它們與環(huán)的連接用實線拉伸的三角形來表示。認為位于環(huán)平面之下的取代基是呈α構(gòu)型；它們與環(huán)的連接用虛線拉伸的三角形來表示。取代基與環(huán)系平面的連接用直線表示。
赤霉素可以綴合物(conjugate)的形式存在，例如與己糖或戊糖分子(例如葡萄糖)構(gòu)成的綴合物。醚鍵或酯鍵可將這樣的葡萄糖分子與赤霉素連接在一起。這樣的連接可使植物體內(nèi)的赤霉素活性暫時或永久性失活。
不同赤霉素的生物活性不同，植物體內(nèi)各種赤霉素可以是活性赤霉素的前體、生物合成中間體或失活產(chǎn)物。三種結(jié)構(gòu)特征通常與赤霉素生物活性相關(guān)3-羥基、7-羧基和內(nèi)酯環(huán)。一般而言，可以認為，具有內(nèi)赤霉素烷環(huán)系、但缺乏這些結(jié)構(gòu)特征中的一個或多個結(jié)構(gòu)特征的化合物是赤霉素前體、中間體或衍生物。
本發(fā)明的組合物和方法通常使用活性形式的赤霉酸、赤霉酸前體、赤霉酸中間體或赤霉酸衍生物，例如具有上述式IV和式V相關(guān)結(jié)構(gòu)的那些形式。具有所述結(jié)構(gòu)的赤霉素在不同位置上可具有多種取代基，包括羥基(-OH)、羧基(-COOH)、醚基(-O)、甲基(-CH3)、亞甲基(＝CH2)、內(nèi)酯(-CO-O-)環(huán)、羥基亞甲基(-CH2-OH)、甲?；?CHO)和相關(guān)取代基。所用的赤霉素在其環(huán)結(jié)構(gòu)的不同位置上也可具有雙鍵。
在某些實施方案中，赤霉酸可具有式VI、VIa或VIb中的任一個。
具有式VI的赤霉素通常稱為赤霉素A3。
具有式VIa的赤霉素通常稱為赤霉素A4。
具有式VIb的赤霉素通常稱為赤霉素A7。
當本發(fā)明組合物中含有赤霉酸或其衍生物時，赤霉酸或其衍生物的用量占本發(fā)明組合物的約0.001％至約50％、或約0.01％至約20％、或約0.01％至約10％、或約0.05％至約5％、或約0.05％至約2％。根據(jù)本發(fā)明，原位濃度為約10-4M至約10-6M的活性赤霉酸對于增加表皮細胞增殖來說是有效的。具有約0.5％赤霉酸的組合物表現(xiàn)出能促進皮膚周轉(zhuǎn)。
茉莉酮酸化合物本發(fā)明所用的茉莉酮酸化合物包括茉莉酮酸和本領(lǐng)域技術(shù)人員可用的茉莉酮酸衍生物。所述化合物包括茉莉酮酸、茉莉酮酸甲酯及其異構(gòu)體。在本發(fā)明中所用的茉莉酮酸和茉莉酮酸衍生物也包括茉莉酮酸、二氫茉莉酮酸、羥基茉莉酮酸和二氫-羥基茉莉酮酸的合成及天然立體異構(gòu)體?？捎糜诒景l(fā)明的茉莉酮酸衍生物的其它實例包括具有式VII、VIII、IX或X中的任一個的化合物。
其中R4為烷基；R5為COOR或-(CH2)n-OX，其中n為1-20的整數(shù)；R為H或烷基；和X為H或1-6個糖殘基(例如己糖或戊糖)。
一般而言，這些茉莉酮酸化合物中所用的烷基具有約1-20個碳原子，盡管在某些實施方案中可使用低級烷基，例如約1-8個碳原子的烷基。也可使用具有更少碳原子數(shù)的烷基，例如1-6個或1-3個碳原子的烷基。
在某些實施方案中，本發(fā)明的組合物中使用茉莉酮酸。茉莉酮酸是式VII的化合物，其中R4為C2H5，R5為COOH。
本發(fā)明所用的另一個茉莉酮酸化合物是下式VIII的化合物。
其中R4為烷基；R5為COOR或-(CH2)n-OX，其中n為1-20的整數(shù)；R為H或烷基；和X為H或1-6個糖殘基(例如己糖或戊糖)。
在某些實施方案中，本發(fā)明的組合物中使用二氫茉莉酮酸。二氫茉莉酮酸是式VIII的化合物，其中R4為C2H5，R5為COOH。
本發(fā)明所用的另一個茉莉酮酸化合物是下式IX的化合物 其中R4為烷基；R5為COOR或-(CH2)n-OX，其中n為1-20的整數(shù)；R為H或烷基；X為H或1-6個糖殘基(例如己糖或戊糖)；和Y為H、烷基或1-6個糖殘基(例如己糖或戊糖)。
在某些實施方案中，本發(fā)明的組合物中使用羥基茉莉酮酸。羥基茉莉酮酸是式IX的化合物，其中R4為C2H5，R5為COOH。
本發(fā)明所用的另一個茉莉酮酸化合物是下式X的化合物。
其中R4為烷基；R5為COOR或-(CH2)n-OX，其中n為1-20的整數(shù)；R為H或烷基；X為H或1-6個糖殘基(例如己糖或戊糖)；和Y為H、烷基或1-6個糖殘基(例如己糖或戊糖)。
在某些實施方案中，本發(fā)明的組合物中使用二氫-羥基茉莉酮酸。二氫-羥基茉莉酮酸是式X的化合物，其中R4為C2H5，R5為COOH。
當本發(fā)明組合物中含有茉莉酮酸或茉莉酮酸衍生物時，茉莉酮酸或茉莉酮酸衍生物的用量占本發(fā)明組合物的約0.001％至約50％、或約0.01％至約20％、或約0.01％至約10％、或約0.05％至約5％、或約0.05％至約2％。根據(jù)本發(fā)明，原位濃度范圍為約10-4M至約10-6M的茉莉酮酸對于增加表皮組織的細胞增殖來說是有效的。如本文所述，約0.025％的茉莉酮酸溶液對促進皮膚周轉(zhuǎn)和更新來說是有效的。
其它成分在另一個實施方案中，本發(fā)明的組合物和方法包括給予雌性哺乳動物有效量的類視黃醇或類胡蘿卜素和/或一種或多種核苷酸或核苷。這些組合物和方法可以增加陰道或?qū)m頸上皮細胞中的P2Y2受體或雌激素受體或血管內(nèi)皮生長因子的表達。
在某些實施方案中，本發(fā)明的組合物可包含一種或多種類視黃醇或類胡蘿卜素。IUPAC-IUB Joint Commission on BiochemicalNomenclature規(guī)定“類視黃醇是一類由4個類異戊二烯單位頭尾相連而組成的化合物”。所有類視黃醇在形式上都由含5個碳-碳雙鍵和非環(huán)狀部分末端官能團的單環(huán)母體化合物衍生而成。類視黃醇的基本結(jié)構(gòu)可再細分為三部分，分別稱為極性末端、綴合側(cè)鏈(conjugatedside chain)和環(huán)己烯基環(huán)。大多數(shù)常見的天然類視黃醇的基本結(jié)構(gòu)都稱為視黃醇、視黃醛和視黃酸。然而，本發(fā)明的類視黃醇不僅僅局限于視黃醇、視黃醛和視黃酸。而且，本發(fā)明的類視黃醇和類胡蘿卜素也包括落入下式XIA或XIB范圍內(nèi)的化合物 其中Z為CH或N；R為H或1-6個碳的烷基；m為0-5的整數(shù)；n為0-2的整數(shù)；r為0-2的整數(shù)；L為-(C＝Z)-NH-或-NH-(C＝Z)-，其中Z為O或S；Q為苯基、萘基、吡啶基、噻吩基、呋喃基、噠嗪基、嘧啶基、吡嗪基、噻唑基、唑基、咪唑基或吡唑基(pyrrazolyl)，其中所述苯基、萘基、吡啶基、噻吩基、呋喃基、噠嗪基、嘧啶基、吡嗪基、噻唑基、唑基、咪唑基或吡唑基(pyrrazolyl)可被一個或兩個R1基團取代；W為F、Br、Cl、I、C1-6烷基、氟-取代的C1-6烷基、NO2、N3、OH、OCH2OCH3、OC1-10烷基、四唑、CN、SO2C1-6-烷基、SO2C1-6-氟-取代的烷基、SO-C1-6烷基、CO-C1-6烷基、COOR8、苯基，苯基本身又可被不是苯基或取代苯基的W基團取代，前提條件是當X為CH且r為0時，則n不為0，至少一個W基團不為烷基；A為(CH2)q(其中q為0-5)、3-6個碳的低級支鏈烷基、3-6個碳的環(huán)烷基、2-6個碳和1-2個雙鍵的烯基、2-6個碳和1-2個三鍵的炔基；和B為COOH或其藥學上可接受的鹽、COOR8、CONR9R10、CH2OH、CH2OR11、CH2OCOR11、CHO、CH(OR12)2、CHOR13O、COR7、CR7(OR12)2、CR7OR13O，其中R7為含有1-5個碳的烷基、含有1-5個碳的環(huán)烷基或含有1-5個碳的烯基，R8為1-10個碳的烷基或三甲基甲硅烷基烷基(其中烷基具有1-10個碳)或5-10個碳的環(huán)烷基，或者R8為苯基或低級烷基苯基，R9和R10獨立地為氫、1-10個碳的烷基或5-10個碳的環(huán)烷基或苯基或低級烷基苯基，R11為低級烷基、環(huán)烷基、低級烷基取代的環(huán)烷基、苯基或低級烷基苯基，R12為低級烷基，R13為2-5個碳的二價烷基。
在某些實施方案中，類視黃醇或類胡蘿卜素是下式XII所限定的化合物 其中R20、R21和R22各自獨立地為C1-6烷基、氟-取代的C1-6烷基、羥基-取代的C1-6烷基、CH2OH、CH2OR11、CH2OCOR11、CHO、CH(OR12)2、CHOR13O、COR7、CR7(OR12)2或CR7OR13O。
術(shù)語烷基是指并包括被認為是直鏈烷基、支鏈烷基和環(huán)烷基的任何及所有基團。術(shù)語烯基是指并包括具有一個或多個不飽和位的直鏈烯基、支鏈烯基和環(huán)烯基。同樣，術(shù)語炔基是指并包括具有一個或多個三鍵的直鏈炔基和支鏈炔基。
低級烷基是指1-6個碳的烷基以及3-6個碳的低級支鏈烷基和環(huán)烷基。低級烯基同樣定義為2-6個碳的直鏈低級烯基，以及3-6個碳的支鏈低級烯基和環(huán)低級烯基。低級炔基也同樣定義為2-6個碳的直鏈低級炔基，以及4-6個碳的支鏈低級炔基。
可以按照美國專利6,437,129和美國專利6,437,003所述，制備式XIA、XIB和XII的化合物，所述文獻通過引用全部結(jié)合到本文中。
可以制備任何本發(fā)明化合物的藥學上可接受的鹽，所述化合物具有能形成所述鹽的官能團，例如酸或胺官能團。藥學上可接受的鹽是保留母體化合物活性的任何鹽，并且對于接受所述鹽的患者來說在給藥前后都沒有任何毒性或不想要的作用。藥學上可接受的鹽可衍生自有機堿或無機堿。鹽可以是一價離子或多價離子。特別重要的是鈉、鉀、鈣和鎂等無機離子。有機鹽可以用胺來制備，特別是銨鹽，例如一烷基胺、二烷基胺、三烷基胺或乙醇胺。也可用咖啡因、三羥甲基氨基甲烷和類似分子形成鹽。當所含有的氮具有足夠堿性而能形成酸加成鹽時，可以用任何無機酸或有機酸或烷化劑(例如甲基碘)來形成所述鹽。優(yōu)選的鹽是用無機酸所形成的鹽，所述無機酸例如鹽酸、硫酸或磷酸。也可使用任何簡單有機酸，例如一元酸、二元酸或三元酸。
某些本發(fā)明的化合物可具有反式異構(gòu)體和順式異構(gòu)體。另外，本發(fā)明的化合物可含有一個或多個手性中心，因此可以對映體形式和非對映體形式存在。本發(fā)明的范圍內(nèi)包括所有這些異構(gòu)體，以及順反異構(gòu)體的混合物、非對映體混合物和對映體的外消旋混合物(旋光異構(gòu)體)。
本發(fā)明的組合物可包含一種或多種核苷或核苷酸。這類核苷酸或核苷可包括例如dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、ATP、GTP、CTP、TTP、UTP，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員可用的所述核苷酸或核苷的任何衍生物。
在某些實施方案中，核苷酸或核苷是下式XIII所限定的化合物 其中X1、X2和X3各自獨立地為O-或S-。在某些實施方案中，X2和X3都為O-；R31為O、亞氨基、亞甲基或二鹵代亞甲基(例如二氯亞甲基、二氟亞甲基)。在某些實施方案中，R31為氧或二氟亞甲基。
R32為H或Br。在某些實施方案中，R32為H。式XIII化合物的實例是尿苷5′-三磷酸(UTP)和尿苷5′-O-(3-硫代三磷酸)(UTPγS)。
在其它實施方案中，核苷酸或核苷是下式XIV所限定的化合物 其中V是尿嘧啶或腺嘌呤。
在本發(fā)明的另一些實施方案中，核苷酸或核苷是下式XV所限定的化合物
其中X1、X2、X3和R31如上定義；當R35不存在且N-1和C-6之間有雙鍵時，R33和R34為H(腺嘌呤)，或者當R35為O且N-1和C-6之間有雙鍵時，R33和R34為H(腺嘌呤1-氧化物)，或者R33、R34和R35結(jié)合在一起為-CH＝CH-，從N-6至N-1構(gòu)成環(huán)，其中在N-6和C-6之間具有雙鍵(1，N6-亞乙烯基腺嘌呤)。
在本發(fā)明的又一些實施方案中，核苷酸或核苷是下式XVI所限定的化合物
其中X1、X2、X3和R31如上定義；當R38不存在且N-3和C-4之間有雙鍵時，R36和R37為H(胞嘧啶)，或者R36、R37和R38結(jié)合在一起為-CH＝CH-，并且從N-3至與R36和R37連接的氮構(gòu)成環(huán)(3，N4-亞乙烯基胞嘧啶)。
因此，本發(fā)明的組合物可含有式XIII、XIV、XV或XVI化合物中的一個或多個化合物，其數(shù)量足以有效刺激雌性陰道或生殖道的粘液分泌。
上式XIII化合物的說明性化合物包括(a)尿苷5′-三磷酸(UTP)；(b)尿苷5′-O-(3-硫代三磷酸)(UTPγS)；和(c)5-溴-尿苷5′-三磷酸(5-BrUTP)。這些化合物是已知的，或者可按已知方法或本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的修改方法來制備。一般參見N.Cusack和S.Hourani，Annals N.Y.Acad.Sci.603，172-81(標題″Biological Actions ofExtracellular ATP″)。例如，可以按照Kenner等，J.Chem.Soc.1954，2288；或者Hall和Khorana，J.Am.Chem.Soc.76，5056(1954)所述方法制備UTP。參見Merck Index，Monograph No.9795(第11版，1989)?？梢园凑誖.S.Goody和F.Eckstein，J.Am.Chem.Soc.93，6252(1971)所述方法制備UTPγS。
式XIV化合物的說明性化合物包括P1，P4-二(腺苷-5′)四磷酸或P1，P4-二(尿苷-5′)四磷酸?？梢园凑找阎椒ɑ蚱湫薷姆椒▉碇苽溥@些化合物，所述方法參見P.Zamecnik等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，838-42(1981)；K.Ng和L.E.Orgel，Nucleic Acids Res.15(8)，3572-80(1987)?？梢园凑誄.Vallejo等，Biochem.Biophys.Acta 438，304-09(1976)所述的類似方法，制備P1，P4-二(尿苷-5′)四磷酸。
上式XV化合物的說明性化合物包括(a)腺苷5′-三磷酸(ATP)和(b)1，N6-亞乙烯基腺苷5′-三磷酸。上式XIV化合物的說明性化合物包括(a)胞苷5′-三磷酸和(b)3，N4-亞乙烯基胞苷5′-三磷酸?？砂匆阎椒ɑ虮绢I(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的修改方法，制備這些化合物。例如，可按以下文獻及其中的參考文獻所述的標準方法，進行核苷的磷酸化D.Hoard和D.Ott，J.Am.Chem.Soc.87，1785-1788(1965)；M.Yoshikawa等，Tetrahedron Lett.5065-68(1967)和M.Yoshikawa等，Bull.Chem.Soc.(Jpn)42，3505-08(1969)；J.Moffatt和H.Khorana，J.Am.Chem.Soc.83，649-59(1961)；B.Fischer等，J.Me d.Chem.36，3937-46(1993)?？砂粗T如以下文獻中所述的已知方法制備胞苷和腺苷的亞乙烯基衍生物N.Kotchetkov等，Tetrahedron Lett.1993(1971)；J.Barrio等，Biochem.Biophys.Res.Commun.46，597(1972)；J.Secrist等，Biochemistry 11，3499(1972)；J.Bierndt等，Nucleic AcidsRes.5，789(1978)；K.Koyasuga-Mikado等，Chem.Pharm.Bull.(Tokyo)28，932(1980)。具有α、β和γ硫代磷酸基團的衍生物可按以下方法或其修改方法來衍生J.Ludwig和F.Eckstein，J.Org.Chem.54，631-35(1989)；F.Eckstein和R.Goody，Biochemistry 15，1685(1976)；R.Goody和F.Eckstein，J.Am.Chem.Soc.93，6252(1971)。
可按G.Blackburn等，J.Chem.Soc.Perkin Trahs.1，1119-25(1984)中所述的類似方法，制備R1為CCl2和CF2的式XIII、XV或XVI化合物。可按T.Myers等，J.Am.Chem.Soc.85，3292-95(1963)所述的類似方法，制備R1為CH2的式I、II、III化合物。
另外，UTP、ATP、CTP、P1，P4-二(腺苷-5′)四磷酸、3，N4-亞乙烯基胞苷三磷酸、1，N6-亞乙烯基腺嘌呤5′-三磷酸、腺苷1-氧化物5′-三磷酸、ATPγS、ATPβS、ATPαS、AMPPCH2-P、AMPPNHP、N4-亞乙烯基胞苷和1，N6-亞乙烯基腺苷都是市售的，例如來自SigmaChemical Company，PO Box 14508，St.Louis，Mo.63178。
使用方法本發(fā)明涉及多種治療或預防雌性哺乳動物陰道和/或生殖問題的方法。這些方法包括給予雌性哺乳動物有效量的維生素E和/或植物激素例如赤霉酸或茉莉酮酸。一般而言，給藥是經(jīng)局部或陰道內(nèi)給予。
對雌性哺乳動物陰道和/或生殖問題進行的治療，包括調(diào)節(jié)粘液水平，以增加或減少雌性哺乳動物的生育力，或者緩解或減輕雌性哺乳動物的陰道干燥。因此，治療可包括緩解或減少雌性哺乳動物的不止一個陰道和/或生殖問題。
在一個實施方案中，所述方法增加陰道或?qū)m頸表皮細胞的生長。在另一個實施方案中，所述方法包括增加粘蛋白基因的表達，所述粘蛋白基因例如粘蛋白-1基因、粘蛋白-2基因、粘蛋白-3A基因、粘蛋白-3B基因、粘蛋白-4基因、粘蛋白-5B基因、粘蛋白-5AC基因、粘蛋白-6基因、粘蛋白-7基因、粘蛋白-11基因、粘蛋白-13基因、粘蛋白-15基因、粘蛋白-17基因、粘蛋白-19基因、粘蛋白-20基因和類似的粘蛋白基因。所述方法可預防或治療哺乳動物的陰道干燥，或者維持或增強哺乳動物陰道粘液的正常保護功能。
本文所用的術(shù)語“哺乳動物”是指動物，通常是指溫血動物。哺乳動物包括家牛(cattle)、野牛(buffalo)、綿羊、山羊、豬、馬、狗、貓、大鼠、兔、小鼠和人。也包括其它牲畜、馴養(yǎng)動物和捕獲動物。
治療包括給予有效量的維生素E和/或植物激素。維生素E、赤霉酸和/或茉莉酮酸可作為組合物給予，所述組合物還含有其它成分，例如，一種或多種核苷酸或核苷、其它維生素(例如類視黃醇或類胡蘿卜素例如維生素A)、蘆薈(aloe vera)等。一般而言，含有維生素E、赤霉酸或茉莉酮酸以及還含或不含其它成分的組合物是經(jīng)陰道內(nèi)給予的。
組合物給予本發(fā)明的組合物，以改善雌性生殖系統(tǒng)的健康，刺激潤滑液(粘液)的分泌，促進細胞生長，治療陰道粘膜退化并更新雌性生殖系統(tǒng)。
為了達到所需效果，可以以單劑量或分次劑量給予組合物，例如，至少約0.001μg/kg至約100-200mg/kg，約0.01μg/kg至約30-50mg/kg，約0.1μg/kg至約10-20mg/kg或約1.0μg/kg至約1.0mg/kg至約10mg/kg體重的一種或多種類視黃醇或類胡蘿卜素或核苷酸或核苷，盡管其它劑量也可提供有益結(jié)果。給藥量將隨以下因素的不同而異包括但不限于疾病、哺乳動物體重、身體狀況、健康狀況、年齡，以及是想要達到防止生育還是想達到治療陰道干燥的目的。臨床醫(yī)師用動物模型或本領(lǐng)域可用的其它試驗系統(tǒng)，就可容易地確定這些因素。
給予本發(fā)明的治療劑，可以是單劑量、多劑量，以連續(xù)或間歇方式，這取決于例如受體的生理狀況，給藥目的是為了治療還是預防，以及熟練醫(yī)師已知的其它因素?？梢栽陬A先選定的一段時間內(nèi)基本連續(xù)給予本發(fā)明的組合物，或者可以以一系列間隔劑量給藥。通?？紤]局部給藥。
將活性成分按合適濃度混合，制備本發(fā)明組合物?？梢匀芜x添加本領(lǐng)域技術(shù)人員所選定的其它活性劑或鈍化劑。包括在單位劑量中的給定活性劑的絕對重量可以在寬范圍內(nèi)變動。例如，可以給予約0.001μg至約50mg、或約0.01μg至約10mg、或約0.1μg至約1mg的至少一種維生素E、赤霉酸或茉莉酮酸，或者多種維生素E化合物或赤霉酸化合物或茉莉酮酸化合物。或者，單位劑量可以在以下范圍內(nèi)變動約0.001μg至約1000μg，約0.01μg至約750μg，約0.1μg至約1mg，約1.0μg至約750μg，約2.5μg至約600μg，約5.0μg至約500μg，或約7.5μg至約400μg。
本發(fā)明組合物的日用量同樣也可變動。所述日用量的范圍為例如約0.001mg/天至約50mg/天，約0.01mg/天至約25mg/天，約0.1mg/天至約12mg/天，約0.1mg/天至約8mg/天，約0.1mg/天至約4mg/天和約0.1mg/天至約2mg/天的一種或多種維生素E、赤霉酸或茉莉酮酸化合物。
組合物中的維生素E、赤霉酸或茉莉酮酸濃度也可變動。例如，濃度范圍為約0.1μM至約1000μM，或約0.5μM至約500μM，或約1μM至約300μM，或約5μM至約200μM，或約10μM至約100μM。
因此，可以通過各種途徑，給予一種或多種包含本發(fā)明治療用組合物的合適單位劑型，所述途徑包括口服、胃腸外(包括皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)和腹膜內(nèi))、直腸、皮膚、經(jīng)皮、胸內(nèi)、肺內(nèi)、陰道內(nèi)和鼻內(nèi)(呼吸)途徑。治療用組合物也可配制成緩釋劑型(例如采用微囊法，參見WO 94/07529和美國專利第4,962,091)。如果合適的話，可以以分離的單位劑型形式便利地提供制劑，并且可以通過制藥領(lǐng)域眾所周知的任何方法來制備。這類方法可包括以下步驟將治療劑與液體載體、固體基質(zhì)、半固體載體、微細固體載體或其組合混合在一起，然后在必要時將產(chǎn)物引入想要的給藥系統(tǒng)或者成型中。
當制備本發(fā)明治療用組合物供陰道內(nèi)給藥用時，通常將它們與藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑混合在一起，制成藥物制劑或單位劑型。對于陰道內(nèi)給藥，可以溶液劑、混懸劑、乳劑、粉劑、顆粒制劑形式提供組合物，或者使組合物存在于天然或合成聚合物或樹脂中。也可以快速注射劑(bolus)或貼劑的形式提供活性組合物。陰道內(nèi)給予的本發(fā)明治療用組合物，也可配制成供緩釋之用，例如可以將組合物包衣、微囊化或用其它方法放入緩釋給藥裝置中。這類制劑中所含的總活性成分占制劑重量的0.1-99.9％。
“藥學上可接受的”是指與制劑的其它成分相容且對其受體無毒的載體、稀釋劑、賦形劑和/或鹽。
可以通過本領(lǐng)域已知方法，使用眾所周知的易得成分，制備含本發(fā)明治療用組合物的藥物制劑。例如，組合物可與常用賦形劑、稀釋劑或載體配制在一起，制成片劑、膠囊劑、溶液劑、混懸劑、粉劑、氣霧劑等。適于這類制劑的賦形劑、稀釋劑和載體的實例包括緩沖劑、以及填充劑和增量劑，例如淀粉、纖維素、糖、甘露醇和硅衍生物。也可包括粘合劑，例如羧甲基纖維素、羥甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素及其它纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮?？砂ū駝?例如甘油)、崩解劑(例如碳酸鈣和碳酸氫鈉)。也可包括延遲溶解的試劑，例如石蠟。也可包括吸收加速劑(例如季銨化合物)?？砂ū砻婊钚詣?例如鯨蠟醇和單硬脂酸甘油酯)?？商砑游捷d體，例如高嶺土和皂土。也可包括潤滑劑(例如滑石粉、硬脂酸鈣和硬脂酸鎂)和固體聚乙烯醇。也可添加防腐劑。本發(fā)明的組合物也可含有增稠劑，例如纖維素和/或纖維素衍生物。它們也可含有樹膠，例如黃原膠、瓜爾膠或carbo膠或阿拉伯膠，或者聚乙二醇、有機皂土和蒙脫土等。本發(fā)明的組合物也可含有其它維生素，例如維生素A、維生素B、維生素C或維生素D。在一個實施方案中，本發(fā)明的組合物也可含有蘆薈。
本發(fā)明治療用組合物也可制備成乳劑、混懸劑、含水或無水溶液劑或分散體，或者可以呈乳劑或混懸劑或軟膏劑的形式，便于陰道內(nèi)給藥?；钚越M合物和其它成分可制成分散在油性或水性溶媒中的混懸劑、溶液劑或乳劑，并且可含有配方劑(formulatory agent)，例如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?；蛘?，活性組合物和其它成分可以呈粉針劑形式，這是通過無菌固體的無菌分離或者通過由溶液凍干而制得的，這類粉針劑在臨用前用合適溶媒(例如無菌、無熱源水)來配制。
這些制劑可含有本領(lǐng)域眾所周知的藥學上可接受的載體、溶媒和輔料。除了水之外，還可以使用例如一種或多種選自以下的生理上可接受的有機溶劑來配制溶液劑丙酮、乙醇、異丙醇、乙二醇醚(例如以商品名“Dowanol”銷售的產(chǎn)品)、聚乙二醇和聚氧乙烯、短鏈酸的C1-C4烷基酯、乳酸乙酯或乳酸異丙酯、脂肪酸甘油三酯(例如以商品名“Miglyol”銷售的產(chǎn)品)、豆蔻酸異丙酯、動物油、礦物油和植物油以及聚硅氧烷等。
必要時，可以添加以下輔料抗氧化劑、表面活性劑、其它防腐劑、成膜劑、角質(zhì)軟化劑或粉刺藥、香料、矯味劑和著色劑?？梢蕴砑涌寡趸瘎?，例如叔丁基對苯二酚、丁羥茴醚、丁羥甲苯和α-生育酚及其衍生物。
此外，組合物也很適于配制成緩釋劑型等。可以這樣配制制劑，使得它們在一段時間內(nèi)在雌性生殖系統(tǒng)中釋放活性組合物。例如，可以用以下聚合物來制備包衣、包膜和保護性基質(zhì)聚交酯-羥乙酸酯、脂質(zhì)體、微型乳劑、微粒、納米?；蛳灐?br>
對于陰道內(nèi)給藥，可以將治療劑配制成本領(lǐng)域已知的制劑，供陰道部位直接使用。主要適于陰道使用的形式是例如乳膏劑、乳劑、凝膠劑、分散劑或微型乳劑、稠度不等的洗劑、浸漬墊(impregnatedpad)、軟膏劑、氣溶膠制劑(例如噴霧劑或泡沫劑)、乳膏劑、洗劑、貼劑、膠凍劑、噴霧劑和氣霧劑?；蛘撸M合物可配制成粘合聚合物的組成部分，例如聚丙烯酸酯或丙烯酸酯/乙酸乙烯酯共聚物。
軟膏劑和乳膏劑可用例如水性或油性基質(zhì)來配制，并添加合適的增稠劑和/或膠凝劑。洗劑可用例如水性或油性基質(zhì)配制，并且通常還含有一種或多種以下的賦形劑乳化劑、穩(wěn)定劑、分散劑、懸浮劑、增稠劑或著色劑。可用加壓包裝方便地噴出液體噴霧劑，例如通過特殊形狀的封口。也可通過例如美國專利第4,140,122號、第4,383,529號或第4,051,842號所公開的離子電滲療法，給予活性組合物。本發(fā)明治療劑在陰道制劑中的重量百分比將取決于各種因素，但通常范圍為制劑總重量的0.01％-95％(重量)，通常為0.1-85％(重量)。
本發(fā)明的藥物制劑可包括作為任選成分的藥學上可接受的載體、稀釋劑、增溶劑或乳化劑以及本領(lǐng)域可用的鹽形式。這類物質(zhì)的實例包括生理鹽水溶液，例如生理緩沖鹽溶液和水。用于本發(fā)明藥物制劑的載體和/或稀釋劑的具體的非限制性實例包括水和生理上可接受的緩沖鹽溶液，例如磷酸緩沖鹽溶液，pH約4.5至約5.5。
此外，活性成分也可與例如以下的其它治療藥聯(lián)用抗微生物藥、鎮(zhèn)痛藥、消炎藥、維生素(例如維生素A、B、C或D)、蘆薈等，無論是用于所述病癥還是其它病癥。
本發(fā)明還涉及用于控制生殖和/或陰道干燥的包裝藥物組合物，例如藥盒或其它容器。藥盒或容器中裝有治療有效量的控制生殖和/或陰道干燥的藥物組合物以及用于控制生殖和/或陰道干燥的藥物組合物的使用說明書。藥物組合物包括本發(fā)明的組合物，其用量是控制陰道干燥的治療有效量。
另外，本發(fā)明提供陰道插入劑(insert)，所述插入劑可以控制方式釋放維生素E、赤霉酸或茉莉酮酸。這類陰道插入劑可以是生物可降解的或者是生物不可降解的。陰道插入劑以合適速率提供持續(xù)釋放的活性成分，以達到粘液分泌、基因表達和細胞增殖的所需水平。
在某些實施方案中，活性成分可以用油性基質(zhì)或軟膏來配制，以制成陰道插入劑。這類制劑包含活性成分和烴基半固體，其含有溶解的和/或懸浮的抑菌劑/防腐劑和緩沖系。在這些基質(zhì)中的礦脂成分可以是粘度范圍從礦物油至固體石蠟的任何石蠟，所述礦物油中使用了摻合的異丁烯、膠態(tài)二氧化硅或硬脂酸鹽。這類體系的實例是白凡士林和黃凡士林?？梢酝ㄟ^熔融，將高熔點蠟摻入到液體礦物油中，或者通過在高溫下將聚乙烯摻入到礦物油中，來制備這類基質(zhì)。聚硅氧烷(也稱為硅酮)適用于這些基質(zhì)，通常粘度范圍在約0.5-10.sup.6厘沲。與聚硅氧烷連接的有機實體優(yōu)選為各自具有1-8個碳的低分子量烴部分(例如低級烷基、低級烯基、苯基和烷基取代的苯基)以及苯基(低級)烷基(例如芐基)。在這一部分中，每個低級烷基或烯基優(yōu)選具有1-3個碳(1和3也包括在內(nèi))，例如在二甲基硅氧烷聚合物中。
吸收基質(zhì)可以與這樣的油性體系一起使用。除了活性成分外，還可使用能夠乳化大量水的其它成分?？梢灾瞥捎桶?w/o)乳劑，其中外相是油性的?？梢詫⒎栏瘎?抑菌劑(例如對羥基苯甲酸酯、緩沖系等)摻入到這些基質(zhì)中，作為與活性成分混合在一起的乳化水溶液?？杀憷厥褂貌煌砑觿┳鳛槿榛瘎?，這些乳化劑包括但不限于膽固醇、羊毛脂(其含有膽固醇和膽固醇酯和其它乳化劑)、羊毛脂衍生物、蜂蠟、脂肪醇、羊毛蠟醇、低HLB(疏水物/疏油物平衡)乳化劑，以及各種離子型和非離子型表面活性劑，單獨使用或聯(lián)合使用。
油包水(W/O)乳劑基質(zhì)可用于本發(fā)明的陰道插入劑。這些制劑可以擴充包括液體或乳膏在內(nèi)的通用吸收基質(zhì)?？梢酝ㄟ^制備活性成分與油相成分、抑菌劑/防腐劑和溶解或懸浮于其中的緩沖鹽的混合物，再向其中加入水，形成油包水乳液，從而制得這些制劑。
水包油(O/W)乳劑基質(zhì)也可用于本發(fā)明的陰道插入劑。這些體系是半固體乳劑、微型乳劑或泡沫乳劑體系，其中含有甲硝唑。通常這樣的體系具有“乳白色”外觀。通常，內(nèi)部油相占組合物重量百分比的范圍為約10％至約40％的油，而外相可含有80％以上的水。油相可含有但不限于長鏈醇(鯨蠟醇、硬脂醇)、長鏈酯(肉豆蔻酸酯、棕櫚酸酯、硬脂酸酯)、長鏈酸(棕櫚酸、硬脂酸)、植物油、動物油和各種蠟。這些可以用陰離子型、陽離子型、非離子型或兩性表面活性劑制備而成，或者尤其是用非離子型表面活性劑的組合制備而成。以下實例是這些體系的示例，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會知道，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對具體成分進行替換和增加或刪除。
含有活性成分的陰道插入劑和栓劑可以是例如油性組合物(在體溫下可融化)，或者是基于聚乙二醇的組合物(溶解于陰道液體內(nèi))。栓劑的基它基質(zhì)是甘油和甘油明膠。
活性成分也可用由膠凝劑制備的緩沖凝膠配制成陰道插入劑。這些膠凝劑的某些實例是纖維素制品、陽離子型聚合物、聚氧化烯和羧基乙烯聚合物。用于本發(fā)明制劑的纖維素制品包括例如甲基纖維素、羧甲基纖維素、羥乙基纖維素和羥丙基纖維素。用于本發(fā)明制劑的陽離子型聚合物包括“Polyquaternium-10”，這是一種由羥乙基纖維素與三甲基銨-取代的環(huán)氧化物等反應(yīng)而生成的聚合季銨鹽。用于本發(fā)明制劑的聚氧化烯包括羊毛脂及其衍生物的聚氧乙烯-聚氧丙烯酯。用于本發(fā)明制劑的羧基乙烯聚合物包括交聯(lián)丙烯酸聚合物，例如B.F.Goodrich Co.，Akron，Ohio的市售產(chǎn)品，商品名是CARBOPOLTM。
陰道插入劑可包括聚合物混合物或包衣，其可在延長的時間周期內(nèi)、以恒定速率釋放活性劑。在某些實施方案中，陰道插入劑包括水溶性發(fā)泡劑，例如聚乙二醇(PEG)，它可與水不溶性聚合物混合，延長插入劑的持久性并延長釋放活性成分。該水溶性發(fā)泡劑可以是聚乙二醇、聚丙二醇、糖(乳糖、蔗糖、葡萄糖等)的混合物或聚合物、鹽、泊洛沙姆、聚乙烯醇和其它水溶性食品級和其它賦形劑。
當PEG用作發(fā)泡劑時，PEG的分子量范圍為約200至約20,000，或者約400至約8,000。例如，使用分子量約540至約8,000的PEG。在另一個實施方案中，PEG分子量為約1,000至約8,000或更高。對本發(fā)明制劑進行包衣的PEG的分子量取決于PEG形成不粘結(jié)、有足夠強度并產(chǎn)生適當孔徑的包衣膜的能力，以便在所需時間周期內(nèi)、在體外和體內(nèi)控制釋放活性成分。
用于本發(fā)明制劑的發(fā)泡劑的用量能有效調(diào)節(jié)生物活性化合物以所需速率釋放。優(yōu)選發(fā)泡劑的有效量能長期釋放活性劑，因而增加持續(xù)釋放藥物植入物的使用壽命。有效量的發(fā)泡劑取決于所需速率和釋放周期，以及在包衣工藝中形成連續(xù)微孔膜的能力。為了能在更長時間周期中進行釋放，使用具有更高分子量的PEG。例如當PEG8000的使用濃度為10-50％、優(yōu)選20-45％和最優(yōu)選30-45％時，可在超過100天的時間周期內(nèi)進行釋放。本文中的PEG濃度表示為每干基的％重量，并且表示干燥后包衣膜中的PEG濃度。同樣，包衣膜的厚度為5-50μm，優(yōu)選10-30μm，最優(yōu)選15-25μm。
根據(jù)實施例所述的體外和體內(nèi)研究，活性劑的溶出率和摻入到包衣膜中的發(fā)泡劑用量之間具有良好相關(guān)性。根據(jù)所需釋放長度，PEG濃度范圍可以按需進行調(diào)節(jié)。例如，可以根據(jù)活性劑在120小時時間點的體外溶出率，簡單地預測包衣插入劑的體內(nèi)持續(xù)周期。
本發(fā)明的陰道插入劑也可包含水不溶性聚合物。這類聚合物的實例是乙基纖維素、丙烯酸樹脂、甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯的共聚物、聚乳酸、PLGA、聚氨酯、聚乙烯乙酸乙烯酯共聚物、聚苯乙烯-丁二烯共聚物和硅橡膠或其混合物。例如，可以使用商標名為AquacoatECD 30和Eudragit RS 30和NE 30D(Rhom Tech，Inc.的注冊商標)的聚合物。
適用于本發(fā)明的聚合物是在與發(fā)泡劑的噴霧干燥工藝中能夠形成連續(xù)包衣膜的聚合物。在植入過程中，控制由此類聚合物制成的膜的速率是非常穩(wěn)定的。該膜應(yīng)具有足夠強度，以抵抗磨損和內(nèi)部滲透壓，并具有穩(wěn)定性，在植入期間不會膨脹或發(fā)生水合作用。
在一個實施方案中，對本發(fā)明制劑進行包衣，用于將含有活性成分并壓制成固體、生物可降解的插入劑的小丸包裹起來，然后給藥，以刺激粘液分泌、基因表達和/或細胞增殖。
下面的非限制性實例用于進一步說明本發(fā)明。
實施例1維生素E增加陰道細胞生長和粘液分泌該實施例表明，在萎縮性陰道炎模型中，維生素E可以增加人宮頸上皮細胞生長并且增加粘蛋白-4的表達。
材料與方法細胞培養(yǎng)。在37℃/5％CO2中，人宮頸上皮細胞(ME-180，ATCC)用含10％熱滅活胎牛血清(Invitrogen)的McCoy氏5A培養(yǎng)基(Invitrogen)進行增殖。維生素E購自ICN Biomedicals。用無水乙醇配制維生素E貯液。
從ME-180細胞中提取RNA。按每T75瓶2×105細胞(15ml總體積)的濃度接種ME-180細胞，讓該細胞增殖4天。第4天更換培養(yǎng)基。向ME-180細胞中加入15ml含有或不含10％FBS的McCoy氏5A培養(yǎng)基(含0或1μM維生素E)，一式兩份。將ME-180細胞與這些溶液一起孵育24小時。棄去培養(yǎng)基，將1500μl裂解緩沖液加入到瓶內(nèi)。用細胞刮刀將細胞從瓶壁刮下。按照制造商的說明書，使用Ambion RNAqueous試劑盒，分離RNA。將沉淀的RNA重懸于經(jīng)DEPC處理過的水(含1μl RNA酶抑制劑)中。
RNA的反轉(zhuǎn)錄。在80℃，將約7μl RNA與3μl引物一起保溫10分鐘，然后立即放在冰上。配制含有4μl DEPC水、4μl 5x反應(yīng)緩沖液、1μl dNTP、1μl RNA酶抑制劑和1μl反轉(zhuǎn)錄酶的混合母液(mastermix)，進行反應(yīng)。將10μl混合母液加入到RNA/引物溶液中，在42℃放置2小時。在70℃，將所得cDNA與3.5μl NaOH溶液一起保溫10分鐘，水解殘余RNA。加入5μl 0.5M Tris/EDTA以中和溶液。為了沉淀cDNA，加入125μl 3M NH4OAc、5μl直鏈聚丙烯酰胺和700μl無水乙醇。將溶液渦旋混合，在-20℃放置過夜。將樣品以14000rpm在4℃離心30分鐘。除去乙醇，將樣品干燥10分鐘。將cDNA重懸于10-12μl PCR級的水中。
聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)。用Advantage 2 PCR試劑盒(Ambion)配制混合母液，用于PCR反應(yīng)，其中含有37-38μl PCR級的水、5μl10xPCR緩沖液、1μldNTP、1μlβ-肌動蛋白引物(10μM，任選對照)和2μl試驗引物(10μM，P2Y2或粘蛋白-4(MUC-4))。加入2毫升cDNA和1mlDNA聚合酶。循環(huán)條件如下95℃5分鐘；25-30次循環(huán)(95℃30秒，65℃1分鐘，68℃3分鐘)；68℃5分鐘。
使用的PCR引物如下P2Y2-特異性引物(產(chǎn)生PCR產(chǎn)物為650bp)
編碼鏈5′-TGTCTTCGCCCTCTGCTTCC-3′(SEQ ID NQ1)非編碼鏈5′-GTCAGGCCAGGGGTGTCATT-3′(SEQ ID NO2)β-肌動蛋白-特異性引物(PCR產(chǎn)物為300bp)編碼鏈5′-AGTCGGTTGGAGCGAGCATC-3′(SEQ ID NO3)非編碼鏈5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′(SEQ ID NO4)粘蛋白-4(MUC-4)特異性引物(PCR產(chǎn)物為800bp)編碼鏈5′-AGCCCAGGACTGTGGTCTGC-3′(SEQ ID NO5)非編碼鏈5′-GCTCACGTTCAGGGCTGTCA-3′(SEQ ID NO6)結(jié)果將ME-180細胞與不同濃度的維生素E一起孵育3天。在10μM維生素E中，ME-180細胞生長受到抑制(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，這可能是因為培養(yǎng)基中存在較高濃度乙醇(用作維生素E的溶劑)所致。用同樣含量的乙醇(沒有維生素E)的陰性對照也顯示出ME-180細胞未生長。在1μM維生素E中，與相應(yīng)陰性對照相比，ME-180細胞生長增加。在100nM維生素E中，與陰性對照相比，細胞生長不受影響。因此，用濃度為1μM維生素E來測定24小時內(nèi)RNA表達的變化。
在胎牛血清存在或不存在時，將ME-180細胞用0或1μM維生素E處理。本發(fā)明人的先期結(jié)果表明，在血清存在下，RNA表達很少有變化。然而，當去除血清時，ME-180細胞生長放緩，這是在陰道萎縮中觀察到的結(jié)果。因此，在沒有血清時維持ME-180細胞，可用作萎縮性陰道炎模型。
當用維生素E處理24小時后，從ME-180細胞中分離出RNA。用反轉(zhuǎn)錄，將RNA轉(zhuǎn)化成cDNA，用作PCR反應(yīng)的模板。在血清存在下，不出所料，觀察到P2Y2或粘蛋白-4的表達沒有顯著變化(數(shù)據(jù)未顯示)。
在沒有血清時，用維生素E處理24小時后，ME-180細胞中粘蛋白-4的表達顯著增加(圖1)。在沒有血清時，用維生素E處理24小時，導致在24個時間點，在P2Y2表達、DTR表達或VEGF表達上沒有觀察到差異(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，先前用維生素A的實驗表明，在沒有血清時約24小時后，ME-180細胞開始表達P2Y2。因此，可能在24小時孵育期間或之后發(fā)生變化，該變化在該實驗中沒有檢出。
這些數(shù)據(jù)表明，在萎縮性陰道炎模型中，維生素E能夠增加人宮頸上皮細胞生長以及增加粘蛋白-4的表達。因此，維生素E可用于治療萎縮性陰道炎。
實施例2維生素A影響宮頸細胞生長和基因表達對ME-180宮頸細胞與幾種濃度的維生素A衍生物之間的相互作用進行了研究，以確定維生素A衍生物是否會影響ME-180細胞生長和基因表達。
ME-180細胞的細胞增殖。將ME-180細胞與維生素A衍生物一起孵育至多3天。每天對ME-180細胞進行計數(shù)。這些實驗的結(jié)果見圖2和圖3。
當使用極低濃度的維生素A時，幾乎沒有觀察到對細胞生長的影響。例如，濃度為0.0nM(陰性對照)、1nM、10nM和100nM反-視黃酸、9-順-視黃酸或13-順-視黃酸對細胞生長幾乎沒有影響。然而，暴露給反-視黃酸的細胞看來比起暴露給其它試劑的細胞或無試劑的細胞(未暴露，陰性對照細胞)來說，生長稍微快一點。
因此，進行了另一個實驗，使用視黃酸的濃度范圍為100nM-10μM。如圖2所示，用1μM或10μM反-視黃酸處理后，比不用視黃酸(陰性對照)處理后，存在更多細胞。這些數(shù)據(jù)表明，在培養(yǎng)中，反-視黃酸增加了ME-180細胞生長。相比之下，用13-順-視黃酸處理的細胞以及陰性對照細胞均不生長，表明13-順-視黃酸在微摩爾濃度時對ME-180細胞有毒性。
用聚合酶鏈式反座和ME-180 cDNA的表達測定。ME-180細胞用1μM或10nM反-視黃酸(維生素A)處理24小時后，分離RNA。沉淀后，通過如上所述的反轉(zhuǎn)錄，將所得RNA作為DNA合成模板。再采用PCR技術(shù)，擴增新合成DNA，測定P2Y2受體基因轉(zhuǎn)錄的大致水平(約600bp PCR產(chǎn)物)?！肮芗一颉奔幢３趾愣ū磉_水平的基因也通過PCR進行擴增，用于比較。用P2Y2測定的管家基因是β-肌動蛋白(～300bp產(chǎn)物)。
如圖3所示，加入對照β-肌動蛋白引物，導致合成約300bp cDNA產(chǎn)物，該產(chǎn)物在所有樣品中大致等量存在。該結(jié)果說明，大致等量的模板RNA存在于所有樣品中。然而，也如圖3所示，P2Y2產(chǎn)物僅在第2、3和7道中可見，其中PCR模板是宮頸cDNA對照，ME-180細胞(沒有維生素A)和ME-180細胞(分別沒有維生素A或血清)。因此，在沒有維生素A時，ME-180細胞中幾乎不存在P2Y2mRNA。
然而，一旦將100nM維生素A加入到ME-180細胞中，就觀察到在培養(yǎng)基中存在血清(圖3，第4-6道)和沒有血清(圖3，第8-11道)的條件下，P2Y2表達都會增加。這些數(shù)據(jù)表明，低濃度維生素A可用于治療萎縮性陰道炎。
也測定了在血清不存在時暴露給維生素A的細胞樣品中也可影響萎縮性陰道炎的其它基因的表達。采用設(shè)計用于擴增雌激素受體α(ER-α)基因的引物，用來自經(jīng)受血清饑餓的細胞的RNA進行PCR。在對照(圖4，第2道)中可以觀察到ER-α產(chǎn)物(650bp)，其中模板是來自無血清條件下培養(yǎng)的ME-180細胞的cDNA。在不含血清或維生素A的樣品中，未檢出表明ER-α基因表達的cDNA片段(第3道和第7道，圖4)。然而，在暴露給100nM維生素A(但沒有血清)達4小時、8小時和16小時的樣品中，表達了ER-α基因(分別為第4-6道)。這些數(shù)據(jù)表明，在無血清條件下培養(yǎng)的宮頸上皮細胞中，維生素A可誘導ER-α的表達。在生殖道上皮細胞上雌激素受體數(shù)量增加，可以增加受體被雌激素活化的概率。
此外，用100nM維生素A處理ME-180細胞也增加了血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達，VEGF是參與血管形成的重要因子。如圖5所示，在用100nM維生素A處理的ME-180細胞中，檢測到約700bp的VEGF特征性產(chǎn)物。
這些實驗表明，維生素A(反-視黃酸)無毒性，可用于增加罹患萎縮性陰道炎的婦女的天然陰道水分。微摩爾濃度的維生素A就可增加宮頸細胞生長，這有助于強化陰道組織。維生素A的存在增加了宮頸上皮細胞的雌激素受體α、血管內(nèi)皮生長因子和P2Y2受體基因的表達。這類表達上的增加，可有助于治療萎縮性陰道炎癥狀。
實施例3維生素A增加粘蛋白-4的表達材料與方法如上所述，從經(jīng)0nM或100nM維生素A(沒有血清)處理的ME-180宮頸細胞中分離RNA。將RNA反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，采用PCR技術(shù)(如上所述)，測定維生素A對粘蛋白-4(MUC-4)表達的影響。
結(jié)果如圖6所示，加入對照β-肌動蛋白引物，導致合成300bp的DNA產(chǎn)物，該產(chǎn)物在所有樣品中大致等量存在。該結(jié)果表明，大致等量的模板RNA存在于所有樣品中。然而，也如圖6所示，MUC-4產(chǎn)物(800bp)存在于宮頸cDNA對照(第2道)中。在沒有維生素A的ME-180細胞(圖6，第3道)中，MUC-4產(chǎn)物不存在。然而，一旦將100nM維生素A加入到ME-180細胞中，就觀察到在處理4小時或8小時后(圖6，分別是第4道和第5道)可檢出MUC-4的表達。用100nM維生素A處理16小時后(圖6，第6道)，MUC-4表達下降，但仍可檢出。這些數(shù)據(jù)表明，低濃度維生素A可增加MUC-4的表達，因此可用于治療萎縮性陰道炎。
實施例4對角質(zhì)化細胞生長的刺激該實施例提供的數(shù)據(jù)表明茉莉酮酸和赤霉酸對人皮膚角質(zhì)化細胞的細胞增殖效果。
材料與方法將來自Clonetics(Walkersville，MD，正常人表皮角質(zhì)化細胞，新生兒，目錄號cc-2503)的人皮膚角質(zhì)化細胞細胞系，暴露給茉莉酮酸和赤霉酸(來自Sigma Chemical Co.)，測定對角質(zhì)化細胞增殖的影響。所用的赤霉酸結(jié)構(gòu)如下(赤霉素A3)。
在96孔測定系統(tǒng)中，用角質(zhì)化細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(KBM，Clonetics，目錄號CC-3103)作為對照，測定這些人皮膚角質(zhì)化細胞對試驗化合物的增殖反應(yīng)。所有化合物都測試三個濃度1×10-4M、1×10-5M和1×10-6M。將細胞接種在96孔板上，濃度為2×103細胞/100μlKBM。將板在37℃/增濕5％CO2氣氛中孵育24小時。孵育后，將100μl 1×10-4M、1×10-5M或1×10-6M茉莉酮酸和赤霉酸溶液分別加入到5個孔中。另外，將100μl溶媒KBM加入到5個孔中，作為對照。將板在37℃/增濕5％CO2氣氛中孵育48小時。孵育后，將20μlCell Titer 96Aqueous One Solution(Promega，Madison，WI)加入到所有的孔中。輕輕旋轉(zhuǎn)板，放回培養(yǎng)箱達3小時。在490nm處讀取各孔的分光光度吸收值。
用單因素ANOVA對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。認為P＜0.05具有顯著性，而認為P＜0.0001是極顯著，P＜0.001是非常非常顯著。
結(jié)果表1表明茉莉酮酸對人角質(zhì)化細胞的細胞增殖的影響，其中茉莉酮酸的濃度在1×10-4M(稱為JA4)、1×10-5M(稱為JA5)和1×10-6M(稱為JA6)之間變化。
表1茉莉酮酸對細胞增殖的影響
表1所示數(shù)據(jù)表明，茉莉酮酸在較低濃度時具有強烈的細胞增殖活性(P＜0.001，在10-5M和10-6M的濃度下)。在較低濃度、而非較高濃度時對細胞增殖的影響更大。
表2表明赤霉酸對人角質(zhì)化細胞的細胞增殖的影響，其中赤霉酸濃度在1×10-4M(稱為GA4)、1×10-5M(稱為GA5)和1×10-6M(稱為GA6)之間變化。
表2赤霉酸對細胞增殖的影響
表2所示數(shù)據(jù)表明，赤霉酸在所有濃度下都具有強烈的細胞增殖活性(P＜0.001，在所有濃度下)。在較低濃度、而非較高濃度時對細胞增殖的影響更大。
實施例5對產(chǎn)生膠原蛋白的刺激該實施例提供的數(shù)據(jù)表明茉莉酮酸和赤霉酸刺激膠原蛋白的產(chǎn)生。
采用由Panvera(Madison，WI)銷售的Takara Biomedicals EIA測定試劑盒(TAK MK101)，測定茉莉酮酸和赤霉酸(赤霉素A3，式V)對人皮膚成纖維細胞系(Clonetics，Walkersville，MD，正常人皮膚成纖維細胞，新生兒，目錄號CC-2509)產(chǎn)生膠原蛋白的刺激反應(yīng)。先在96孔測定系統(tǒng)中，將細胞培養(yǎng)在含有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco氏改良Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)中，這兩者都購自Sigma Chemical Co，St.Louis，MO。用無血清DMEM作為對照。所有化合物都測試三個濃度1×10-4M、1×10-5M和1×10-6M。將細胞接種在96孔板上，濃度為5×103細胞/100μl含10％胎牛血清(FBS，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)的DMEM。將板在37℃/增濕5％CO2氣氛中孵育24小時。孵育后，吸出培養(yǎng)基，各孔用100μl無血清DMEM清洗兩次。吸出最后的清洗液，將100μl 1×10-4M、1×10-5M或1×10-6M試驗化合物溶液加入到孔內(nèi)(對于每一濃度，n＝2)。另外，將100μl溶媒(無血清DMEM)加入到4個孔中，作為對照。將板在37℃/增濕5％CO2氣氛中孵育48小時。
按照推薦，對取自96孔板各孔的20μl上清液進行測定。在進行測定前，新鮮配制標準緩沖液和終止液。向各孔中加入100μl抗體-POD綴合物溶液(隨試劑盒供應(yīng))，用預先包被抗體的96孔板(隨試劑盒供應(yīng))。將20μl標準液和測定液(來自其它裝有成纖維細胞的96孔板)加入到合適的孔中。將板輕輕混合，密封，在37℃孵育3小時。
孵育后，各孔用PBS緩沖液(400μl)小心洗滌4次。洗滌后，將所有孔中的任何液體完全倒空。
向各孔中加入100μl底物溶液(過氧化氫和四甲基聯(lián)苯胺緩沖液，隨試劑盒供應(yīng))，將板孵育15分鐘。在此時，將100μl終止液(新鮮配制的1N H2SO4)按照與底物相同順序加入到各孔中。將板輕輕混合，在450nm處讀取吸收值。
用單因素ANOVA對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。認為P＜0.05具有顯著性，而認為P＜0.0001是極顯著，P＜0.001是非常非常顯著。
結(jié)果表3表明暴露給不同濃度的茉莉酮酸和赤霉酸的人成纖維細胞的膠原蛋白產(chǎn)生情況。茉莉酮酸濃度在1×10-4M(稱為JA4)、1×10-5M(稱為JA5)和1×10-6M(稱為JA6)之間變動。赤霉酸濃度在1×10-4M(稱為GA4)、1×10-5M(稱為GA5)和1×10-6M(稱為GA6)之間變動。
表3茉莉酮酸或赤霉酸對人成纖維細胞產(chǎn)生膠原蛋白的影響
表3所示數(shù)據(jù)表明，茉莉酮酸和赤霉酸都可刺激人成纖維細胞產(chǎn)生膠原蛋白。赤霉酸對膠原蛋白產(chǎn)生的影響更大，尤其是在較低濃度、而非較高濃度下。然而，茉莉酮酸在較高濃度下強烈刺激膠原蛋白的產(chǎn)生。
實施例6對產(chǎn)生纖連蛋白的刺激該實施例提供的數(shù)據(jù)表明茉莉酮酸和赤霉酸對產(chǎn)生纖連蛋白的影響。
材料與方法采用由Panvera(Madison，WI)銷售的Takara Biomedicals EIA測定試劑盒(TAK MK115)，測定茉莉酮酸和赤霉酸(赤霉素A3，式V)對人皮膚成纖維細胞系(Clonetics，Walkersville，MD，正常人皮膚成纖維細胞，新生兒，目錄號CC-2509)產(chǎn)生纖連蛋白的刺激反應(yīng)。先在96孔測定系統(tǒng)中，將細胞培養(yǎng)在含有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco氏改良Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)中，這兩者都購自Sigma Chemical Co，St.Louis，MO。用無血清DMEM作為對照。所有化合物都測試三個濃度1×10-4M、1×10-5M和1×10-6M，一式兩份。將細胞接種在96孔板上，濃度為1×104細胞/100μl含10％胎牛血清(FBS，Sigma ChemicalCo.，St.Louis，MO)的DMEM。將板在37℃/增濕5％CO2氣氛中孵育48小時。孵育后，吸出培養(yǎng)基，各孔用100μl無血清DMEM清洗兩次。吸出最后的清洗掖，將100μl 1×10-4M、1×10-5M或1×10-6M試驗化合物溶液以及100μl無血清DMEM一起加入到孔內(nèi)(對于每一濃度，n＝2)。另外，將100μl溶媒(無血清DMEM)加入到2個孔中，作為對照。將板在37℃/增濕5％CO2氣氛中孵育48小時。
按照推薦，用取自96孔板各孔的100μl上清液進行纖連蛋白測定。在進行測定前，新鮮配制標準緩沖液和終止液。用預先包被抗體的96孔板(隨試劑盒供應(yīng))轉(zhuǎn)移試驗樣品和對照。將板輕輕混合，密封，在37℃孵育1小時。除去樣品液后，洗滌所有孔，用洗滌緩沖液洗滌3次(300μl)。向各孔中加入100μl抗體-POD綴合物溶液?；旌习澹芊獠⒂?7℃孵育1小時。取出溶液，將各孔用洗滌緩沖液洗滌3次。洗滌后，將所有孔中的任何液體完全倒空。向各孔中加入100μl底物溶液(過氧化氫和四甲基聯(lián)苯胺緩沖液)，將板在室溫下孵育15分鐘。將100μl終止液(新鮮配制的lN H2SO4)按照與底物相同順序加入到各孔中。將板輕輕混合，在450nm處讀取吸收值。
用單因素ANOVA對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。認為P＜0.05具有顯著性，而認為P＜0.0001是極顯著，P＜0.001是非常非常顯著。
結(jié)果表4表明暴露給不同濃度的茉莉酮酸或赤霉酸的人成纖維細胞的纖連蛋白產(chǎn)生情況。
表4數(shù)據(jù)總結(jié)
茉莉酮酸濃度在1×10-4M(稱為JA4)、1×10-5M(稱為JA5)和1×10-6M(稱為JA6)之間變動。赤霉酸濃度在1×10-4M(稱為GA4)、1×10-5M(稱為GA5)和1×10-6M(稱為GA6)之間變動。
與對照相比，統(tǒng)計所有3種化合物在所有試驗濃度下對產(chǎn)生纖連蛋白的刺激作用。由此得知，茉莉酮酸和赤霉酸都能有效刺激人成纖維細胞產(chǎn)生纖連蛋白。
實施例7增強人皮膚的更新該實施例提供的數(shù)據(jù)表明，含有茉莉酮酸或赤霉酸的組合物可以增加健康雌性志愿者的皮膚更新速率。
角質(zhì)層更新時間是總厚度的角質(zhì)層脫落并被來自分裂表皮的新細胞置換所花費的時間。該更新時間是皮膚健康的基本指征。先前的工作已經(jīng)證明，可以使用與無活力表皮細胞緊密結(jié)合的熒光標記染料來浸漬皮膚，非侵入性地測定角質(zhì)層的更新時間。參見Jansen LH，Hojyo-Tomoko MT，Kligman AM.，Improved fluorescence stainingtechnique for estimating turnover of the human stratum corneum(改進的用于估計人角質(zhì)層更新的熒光染色技術(shù))，Br J Dermatol，90，9-12，1974；Ridge BD，Batt MD，Palmer HE，Jarrett A，The dansyl chloridetechnique for stratum comeum renewal as an indicator of changes inepidermal mitotic activity following topical treatment(角質(zhì)層更新作為局部治療后表皮有絲分裂活性變化指標的丹磺酰氯技術(shù))，Br JDermatol，118，167-74，1988；Grove GL，Kligman AM，Age-associatedchanges in human epidermal cell renewal(人表皮細胞更新中的衰老相關(guān)變化)，J Geron.，38，137-142，1983。因此，染料消失所需時間就成為角質(zhì)層更新的標志。因此我們認為，在處理和未處理位點上染料消失所需的時間差異，反映出產(chǎn)品增加表皮更新的能力。
材料與方法在43-64歲健康女性志愿者中，進行丹磺酰氯細胞更新研究。該項研究由兩周治療期組成，在這段時間內(nèi)，將產(chǎn)品每天(包括周末)兩次局部施用于試驗部位。用藥部位是指定的，約5cm×10cm，在上臂內(nèi)側(cè)。另一臂不施用產(chǎn)品，作為對照。茉莉酮酸(JA)和赤霉酸(GA，赤霉素A3，式V)兩種化合物均以0.25％的透明質(zhì)酸(0.5％水溶液)的濃度單獨進行試驗。8名女性接受茉莉酮酸，7名女性接受赤霉酸。
用標記染料消失所需時間來測定細胞更新速率。這些數(shù)據(jù)見表5。
表5經(jīng)茉莉酮酸(JA)、赤霉酸(GA)或?qū)φ仗幚淼钠つw的細胞更新時間
如表5中的數(shù)據(jù)所示，當使用0.25％茉莉酮酸(JA)或0.25％赤霉酸(GA)的組合物時，與未接受治療的對照皮膚相比，皮膚細胞更新所需時間顯著縮短。茉莉酮酸的總體細胞更新率比對照快28％，赤霉酸比對照快20％(圖7)。在任何研究志愿者中，沒有可見的任何皮膚刺激或發(fā)紅現(xiàn)象。
已經(jīng)報道α羥基酸類化合物(例如乙醇酸)能縮短細胞更新時間。此外，用α羥基酸進行治療，通常伴有不想要的副作用，例如皮膚刺激和發(fā)紅。本發(fā)明的組合物可滿足目前對皮膚細胞更新的抗衰老組合物的需求，所述組合物不引起不想要的副作用而且對皮膚無刺激。
實施例8茉莉酮酸增加上皮細胞生長該實施例說明茉莉酮酸能增加宮頸上皮細胞的細胞增殖。材料與方法在37℃/5％CO2中，將人宮頸上皮細胞(ME-180，ATCC)在含有10％熱滅活胎牛血清(Invitrogen)的McCoy氏5A培養(yǎng)基(Invitrogen)中培養(yǎng)增殖。將茉莉酮酸(Sigma)用ME-180培養(yǎng)基稀釋至100微克(μg)/ml、10μg/ml和1μg/ml。在較高濃度下，茉莉酮酸使培養(yǎng)基顏色變黃，表明pH對維持正常細胞生長來說過低。
將ME-180細胞接種在12個孔板上，濃度為5×104細胞/孔/2ml培養(yǎng)基。讓細胞生長1天。用胰酶消化，然后用血細胞計數(shù)器對3個孔內(nèi)的細胞進行計數(shù)，以確定在第0天時的細胞數(shù)。取出所有其它孔內(nèi)的培養(yǎng)基，更換為新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)基(2ml)中含有100μg/ml、10μg/ml或1μg/ml茉莉酮酸，一式三份。在第1天和第2天對細胞進行計數(shù)，測定茉莉酮酸對細胞生長的影響。
結(jié)果如圖8和圖9所示，孵育后2天，茉莉酮酸增加上皮細胞生長。因此，茉莉酮酸以及其它植物激素可用于治療萎縮性陰道炎。
參考文獻本文所引用的這些參考文獻和其它參考文獻都通過引用全部結(jié)合到本文中。
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本說明書引用或提及的所有專利和出版物都表明本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的水平，并且這些引用的專利或出版物分別通過引用結(jié)合到本文中，其程度與每篇參考文獻都通過引用全部結(jié)合到本文中一樣。申請人保留將來自這些引用的專利或出版物的任何和所有材料和信息結(jié)合到本說明書中的權(quán)利。
本文所述的具體方法和組合物都是優(yōu)選實施方案的代表和范例，并不得視為對本發(fā)明范圍的限制。當考慮到本說明書時，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說也會有其它目的、方面和實施方案，并且都包括在本發(fā)明的精神之內(nèi)，如同權(quán)利要求書范圍所定義的一樣。對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可以在不偏離本發(fā)明的范圍和精神的情況下，對在此公開的本發(fā)明進行不同的替換和修改。在缺乏本文未具體公開的任何要素或限制的情況下，可以適宜地實施本文說明性地描述的本發(fā)明?？梢园床煌牟襟E順序，適宜地實施本文說明性地描述的方法和步驟，并且它們不必局限于本文或權(quán)利要求書中所指定的步驟順序。本文和所附權(quán)利要求書所用的表述形式包括復數(shù)，除非上下文中另有明確說明。因此，例如，“宿主細胞”包括多個宿主細胞(例如培養(yǎng)物或群體)等。本專利決不能解釋為局限于在本文中具體公開的具體實施例或?qū)嵤┓桨富蚍椒ā１緦＠麤Q不能解釋為局限于專利商標局的任何審查員或任何其他官員或雇員所作出的任何意見陳述，除非在申請人書面答復中對這樣的意見陳述具體無條件地或無保留地明確采納。
所使用的術(shù)語和表達方式用于描述而非限制，并且在使用所述術(shù)語和表達方式時不得視為將所顯示和描述的特征或其部分的任何等同術(shù)語和表達方式排除在外，但是應(yīng)承認在要求保護的發(fā)明范圍內(nèi)可以進行各種修改。因此，可以理解，盡管用優(yōu)選實施方案和任選特征具體地公開了本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以對本文所公開的構(gòu)思進行修改和變動，并且所述修改和變動被認為是在所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本文已經(jīng)對本發(fā)明進行了廣義和一般性的描述。該一般性范圍內(nèi)的更狹義共同特征和特定特征也構(gòu)成本發(fā)明的組成部分。該一般性范圍同樣包括對從上位概念中排除任一主題的前提條件或否定限制的描述，無論所刪除的內(nèi)容是否在本文中作了具體的陳述。
其它實施方案是在所附權(quán)利要求書范圍之內(nèi)。另外，當按照馬庫什要素描述本發(fā)明的特征或方面時，本領(lǐng)域技術(shù)人員能理解，馬庫什要素中的各成員或各成員組同樣為本發(fā)明的組成部分。
序列表<110>Villanueva，Julie M.
Malik，SohailKimberly-Clark Worldwide，Inc.
<120>陰道保健產(chǎn)品<130>KC-19307<160>6<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>20<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1tgtcttcgcc ctctgcttcc20<210>2<211>20<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>2gtcaggccag gggtgtcatt20<210>3<211>20<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>3
agtcggttgg agcgagcatc 20<210>4<211>20<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>4gggcacgaag gctcatcatt 20<210>5<211>20<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>5agcccaggac tgtggtctgc 20<210>6<211>20<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>6gctcacgttc agggctgtca 20
權(quán)利要求
1.一種組合物，所述組合物包含有效量的維生素E化合物和選自赤霉酸、茉莉酮酸或其組合的植物激素以及藥學上可接受的賦形劑，并將所述組合物施用于雌性哺乳動物陰道腔內(nèi)；其中所述組合物能夠在雌性哺乳動物陰道腔內(nèi)增加上皮細胞或表皮細胞的生長、增加粘蛋白-4的表達或者促進更快速細胞更新。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物可以增加以下基因的表達粘蛋白-1基因、粘蛋白-2基因、粘蛋白-3A基因、粘蛋白-3B基因、粘蛋白-4基因、粘蛋白-5B基因、粘蛋白-5AC基因、粘蛋白-6基因、粘蛋白-7基因、粘蛋白-11基因、粘蛋白-13基因、粘蛋白-15基因、粘蛋白-17基因、粘蛋白-19基因或粘蛋白-20基因。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中所述維生素E化合物是下式I或II的化合物 其中R1、R2和R3獨立地為氫(H)、甲基(CH3)或羥基(OH)。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中赤霉酸是下式VI、VIa或VIb的化合物
5.權(quán)利要求1的組合物，其中茉莉酮酸是下式VII、VIII、IX或X的化合物 其中R4為烷基；R5為COOR或-(CH2)n-OX，其中n為1-20的整數(shù)；R為H或烷基；X為H或1-6個己糖或戊糖殘基；和Y為H、烷基或1-6個己糖或戊糖殘基。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物還包含類視黃醇或類胡蘿卜素。
7.權(quán)利要求5的組合物，其中所述類視黃醇或類胡蘿卜素是維生素A、β-胡蘿卜素、視黃醛、視黃酸或視黃醇。
8.權(quán)利要求6的組合物，其中所述組合物可以增加雌激素受體α(ER-α)、血管內(nèi)皮生長因子或P2Y2受體的表達。
9.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物還包含核苷或核苷酸。
10.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物包括洗劑、乳膏劑、凝膠劑、噴霧劑、泡沫劑或陰道插入劑。
11.一種增加雌性陰道腔內(nèi)上皮細胞或表皮細胞生長的方法，所述方法包括給予陰道腔有效量的包含載體和維生素E、赤霉酸或茉莉酮酸化合物的組合物。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述組合物還包含類視黃醇或類胡蘿卜素。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述組合物可以增加雌激素受體α(ER-α)、血管內(nèi)皮生長因子或P2Y2受體的表達。
14.權(quán)利要求11的方法，其中所述組合物還包含核苷或核苷酸。
15.一種預防或治療雌性陰道腔內(nèi)陰道干燥的方法，所述方法包括給予陰道腔有效量的包含載體和維生素E、赤霉酸或茉莉酮酸化合物的組合物。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述載體為供陰道腔用的藥學上可接受的賦形劑。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所述組合物還包含類視黃醇或類胡蘿卜素。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述組合物可以增加雌激素受體α(ER-α)、血管內(nèi)皮生長因子或P2Y2受體的表達。
19.權(quán)利要求15的方法，其中所述組合物還包含核苷或核苷酸。
20.權(quán)利要求15的方法，其中所述組合物包括洗劑、乳膏劑、凝膠劑、噴霧劑、泡沫劑或陰道插入劑。
全文摘要
本發(fā)明提供用于在雌性哺乳動物生殖道內(nèi)增加細胞生長、刺激細胞更新并促進粘液分泌的組合物和方法。
文檔編號A61P15/02GK1980650SQ200580019254
公開日2007年6月13日 申請日期2005年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月17日
發(fā)明者J·M·比利亞努埃瓦, S·馬利克 申請人:金伯利-克拉克環(huán)球有限公司