專利名稱：使腫瘤細胞致死的人α－乳清蛋白(HAMLET)在治療病毒感染中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒感染的治療方法，并涉及生物活性復(fù)合物在制備用于治療病毒感染的藥物中的用途。
HAMLET(humanα-lactalbumin made lethal to tumour cells，使腫瘤細胞致死的人α-乳清蛋白)(以前稱為MAL)是一種α-乳清蛋白的活性折疊變異體，它在轉(zhuǎn)化細胞中能誘導(dǎo)細胞凋亡，但卻不損傷健康的分化細胞(M.Svensson等，(2000)Proc Natl Acad Sci USA，97，4221-6)。已經(jīng)知道，HAMLET能與腫瘤細胞表面結(jié)合，易位到細胞質(zhì)并聚集在細胞核內(nèi)，在此引起DNA斷裂(M.Svensson等，(2000)Proc NatlAcad Sci USA，97，4221-6)。這類生物活性復(fù)合物得自乳汁，尤其是人乳，可用作抗細菌藥物，參見例如EP-0776214。
迄今為止，有關(guān)HAMLET的研究報道已經(jīng)表明，轉(zhuǎn)化細胞在體外對HAMLET敏感，這表明它可用于癌癥治療(參見例如C.Svanborg等，Advances in Cancer Research.United States，25 2003，88，1-29)。也發(fā)現(xiàn)它具有抗菌效果，具體地講，當(dāng)進行體外試驗時，它能抑制肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)和流感嗜血桿菌(H.influenzae)附著到人呼吸道上皮細胞(WO96/04929)。相反，某些病毒(例如某些類型的腺病毒)看來卻增加某些細菌的體外粘附力(A.Hakansson等，Infection andImmunity，(1994)第62卷，72707-2714)。
本申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了，HAMLET和這類復(fù)合物當(dāng)用于治療病毒感染時，獲得了預(yù)料不到的良好結(jié)果。
根據(jù)本發(fā)明，提供選自HAMLET或其生物活性修飾物或它們的生物活性片段的α-乳清蛋白生物活性復(fù)合物在制備用于治療病毒感染的藥物中的用途。
看來，HAMLET或其生物活性修飾物的作用是靶向特定細胞類型，這其中除了包括以前已經(jīng)報道過的腫瘤細胞之外，還包括已經(jīng)感染病毒的細胞。
因此，這些復(fù)合物可用于治療病毒感染。如果及時治療的話，在病毒有機會復(fù)制之前，HAMLET就已導(dǎo)致含有病毒(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒)的細胞死亡。結(jié)果限制了病毒的擴散。
各種各樣的病毒都可采用這種方式進行治療，包括人類病毒和獸醫(yī)病毒。這些病毒列表如下。
1.腺病毒科(Adenoviridae)，包括哺乳動物腺病毒屬(Mastadenovirus)，模式種人腺病毒2型(human adenovirus 2)；禽腺病毒屬(Aviadenovirus)，模式種禽腺病毒1型(fowl adenovirus 1)和非洲豬熱病樣病毒(African swine fever-like viruses)。
2.沙粒病毒科(Arenaviridae)，包括沙粒病毒屬(Arenaviruses)，模式種淋巴細胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitisvirus)；動脈炎病毒屬(Arterivirus)，模式種馬動脈炎病毒(equinearteritis virus)。
3.星狀病毒科(Astroviridae)，包括星狀病毒屬(Astrovirus)，模式種人星狀病毒1型(human astrovirus 1)。
4.雙節(jié)段雙鏈RNA病毒科(Birnaviridae)，包括水生動物雙節(jié)段雙鏈RNA病毒屬(Aquabirnavirus)，模式種傳染性胰腺壞死病毒(infectious pancreatic necrosis virus)；禽雙節(jié)段雙鏈RNA病毒屬(Avibirnavirus)，模式種傳染性法氏囊病病毒(infectious bursal diseasevirus)。
5.布尼亞病毒科(Bunyaviridae)，向括布尼亞病毒屬(Bunyavirus)，模式種布尼安維拉病毒(Bunyamwera virus)；漢坦病毒屬(Hantavirus)，模式種漢坦病毒(Hantaan virus)；內(nèi)羅畢病毒屬(Nairovirus)，模式種內(nèi)羅畢綿羊病病毒(Nairobi sheep disease virus)；白蛉熱病毒屬(Phlebovirus)，模式種白蛉熱西西里病毒(sandfly feverSicilian virus)。
6.杯狀病毒科(Caliciviridae)，包括杯狀病毒屬(Calicivirus)，模式種豬小泡疹病毒(vesicular exanthema of swine virus)。
7.圓環(huán)病毒科(Circoviridae)，包括圓環(huán)病毒屬(Circovirus)，模式種雞貧血病毒(chicken anemia virus)。
8.冠狀病毒科(Coronaviridae)，包括冠狀病毒屬(Coronavirus)，模式種禽類傳染性支氣管炎病毒(avian infectious bronchitis virus)；環(huán)狀病毒屬(Torovirus)，模式種伯爾尼病毒(Berne virus)；丁型病毒屬(Deltavirus)，模式種丁型肝炎病毒(hepatitis delta virus)。
9.目單分子負鏈RNA病毒目(Mononegavirales)，包括絲狀病毒科(Filoviridae)，包括絲狀病毒屬(Filovirus)，模式種馬爾堡病毒(Marburg virus)。
10.黃病毒科(Flaviviridae)，包括黃病毒屬(Flavivirus)，模式種黃熱病病毒(yellow fever virus)；蟲媒病毒屬(Pestivirus)，模式種牛腹瀉病毒(diarrhea virus)和“丙型肝炎樣病毒”屬(Genus“Hepatitis C-like viruses”)，模式種丙型肝炎病毒(hepatitis C virus)。
11.嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)，包括正嗜肝病毒屬(Orthohepadnavirus)，模式種乙型肝炎病毒(hepatitis B virus)；禽嗜肝DNA病毒屬(Avihepadnavirus)，模式種鴨乙型肝炎病毒(duckhepatitis B virus)。
12.皰疹病毒科(Herpesviridae)，包括皰疹病毒亞科皰疹病毒甲亞科(Alphaherpesvirinae)，例如單純皰疹病毒屬(Simplexvirus)，模式種人皰疹病毒1型(human herpesvirus 1)；水痘病毒屬(Varicellovirus)，模式種人皰疹病毒3型(human herpesvirus 3)；皰疹病毒乙亞科(Betaherpesvirinae)，包括巨細胞病毒屬(Cytomegalovirus)，模式種人皰疹病毒5型(human herpesvirus 5)；鼠巨細胞病毒屬(Muromegalovirus)，模式種小鼠巨細胞病毒1型(Mouse cytomegalovirus 1)；玫瑰疹病毒屬(Roseolovirus)，模式種人皰疹病毒6型(human herpesvirus 6)；皰疹病毒丙亞科(Gammaherpesvirinae)，包括淋巴濾泡病毒屬(Lymphocryptovirus)，模式種人皰疹病毒4型(human herpesvirus 4)；蛛猴皰疹病毒屬(Rhadinovirus)，模式種蛛猴皰疹病毒2型(ateline herpesvirus 2)。
13.虹彩病毒科(Iridoviridae)，包括蛙病毒屬(Ranavirus)，模式種蛙病毒3型(frog virus 3)；淋巴囊腫病毒屬(Lymphocystivirus)，模式種flounder virus；“金魚病毒樣病毒”屬(Genus“Goldfish virus-likeviruses”)，模式種金魚病毒1型(goldfish virus 1)。
14.目單分子負鏈RNA病毒目(Mononegavirales)，包括絲狀病毒科(Filoviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、彈狀病毒科(Rhabdoviridae)。
15.正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，包括甲型流感病毒屬(Influenzavirus A)、乙型流感病毒屬(Influenzavirus B)，模式種甲型流感病毒(influenza A virus)；丙型流感病毒屬(Influenzavirus C)，模式種丙型流感病毒(influenza C virus)；“托高土樣病毒”屬(Genus“Thogoto-Like viruses”)，模式種托高土病毒(Thogoto virus)。
16.乳多空病毒科(Papovaviridae)，包括多瘤病毒屬(Polyomavirus)，模式種鼠多瘤病毒(murine polyomavirus)；乳頭瘤病毒屬(Papillomavirus)，模式種棉尾兔乳頭瘤病毒(cottontail rabbitpapillomavirus)(Shope)。
17.目單分子負鏈RNA病毒目(Mononegavirales)，包括副粘病毒科(Paramyxoviridae)及副粘病毒亞科(Paramyxovirinae)，包括副粘病毒屬(Paramyxovirus)，模式種人副流感病毒1型(humanparainfluenxa virus 1)；麻疹病毒屬(Morbillivirus)，模式種麻疹病毒(measles virus)；腮腺炎病毒屬(Rubulavirus)，模式種腮腺炎病毒(mumps virus)，以及肺病毒亞科(Pneumovirinae)，包括肺病毒屬(Pneumovirus)，模式種人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytialvirus)。
18.細小DNA病毒科(Parvoviridae)，包括細小DNA病毒亞科(Parvovirinae)，包括細小DNA病毒屬(Parvovirus)，模式種小鼠細小病毒(mice minute virus)；紅病毒屬(Erythrovirus)，模式種B19病毒(B19 virus)；依賴病毒屬(Dependovirus)，模式種腺伴隨病毒2型(adeno-associated virus 2)。
19.小RNA病毒科(Picornaviridae)，包括腸道病毒屬(Enterovirus)，模式種脊髓灰質(zhì)炎病毒1型(poliovirus 1)；鼻病毒屬(Rhinovirus)，模式種人鼻病毒1A型(human rhinovirus 1A)；肝病毒屬(Hepatovirus)，模式種甲型肝炎病毒(hepatitis A virus)；心臟病毒屬(Cardiovirus)，模式種腦心肌炎病毒(encephalomyocarditisvirus)；和口蹄疫病毒屬(Aphthovirus)，模式種口蹄疫病毒O型(foot-and-mouth disease virus 0)。
20.痘病毒科(Poxviridae)，包括脊椎動物痘病毒亞科(Chordopoxvirinae)，包括正痘病毒屬(Orthopoxvirus)，模式種痘苗病毒(vaccinia virus)；副痘病毒屬(Parapoxvirus)，模式種口瘡病毒(orfvirus)；禽痘病毒屬(Avipoxvirus)，模式種雞痘病毒(fowlpox virus)；山羊痘病毒屬(Capripoxvirus)，模式種羊痘病毒(sheeppox virus)；野兔痘病毒屬(Leporipoxvirus)，模式種粘液瘤病毒(myxoma virus)；豬痘病毒屬(Suipoxvirus)，模式種豬痘病毒(swinepox virus)；軟疣痘病毒屬(Molluscipoxvirus)，模式種接觸傳染性軟疣病毒(Molluscumcontagiosum virus)；和亞塔痘病毒屬(Yatapoxvirus)，模式種亞巴猴腫瘤病毒(Yaba monkey tumor virus)。
21.呼腸孤病毒科(Reoviridae)，包括正呼腸孤病毒屬(Orthoreovirus)，模式種呼腸孤病毒3型(reovirus 3)；環(huán)狀病毒屬(Orbivrus)，模式種藍舌病毒1型(bluetongue virus 1)；輪狀病毒屬(Rotavirus)，模式種猿猴輪狀病毒SA11(simian rotavirus SA11)；Coltivirus屬，模式種科羅拉多蜱傳熱病毒(Colorado tick fever virus)；和水生動物呼腸孤病毒屬(Aquareovirus)，模式種金體美洲鳊魚病毒(golden shiner virus)。
22.逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)，包括“哺乳動物B型逆轉(zhuǎn)錄病毒”屬(Genus“mammalian type B retroviruses”)，模式種小鼠乳腺瘤病毒(mouse mammary tumor virus)；“哺乳動物C型逆轉(zhuǎn)錄病毒”(Genus“mammalian type C retroviruses”)，模式種鼠白血病病毒(murineleukemia virus)；“禽C型逆轉(zhuǎn)錄病毒”屬(Genus“avian type Cretroviruses”)，模式種禽白血病病毒(avian leukosis virus)；“D型逆轉(zhuǎn)錄病毒”屬(Genus“type D retroviruses”)，模式種Mason-Pfizer猴病毒(Mason-Pfizer monkey virus)；“blv-htlv逆轉(zhuǎn)錄病毒”屬(Genus“blv-htlv retroviruses”)，模式種牛白血病病毒(bovine leukemia virus)；慢病毒屬(Lentivirus)，模式種人免疫缺陷病毒1型(humanimmunodeficiency virus 1)；和泡沫病毒屬(Spumavirus)，模式種人泡沫病毒(human spumavirus)。
23.目單分子負鏈RNA病毒目(Mononegavirales)，包括彈狀病毒科(Rhabdoviridae)，包括水泡性病毒屬(Vesiculovirus)，模式種水泡性口膜炎印地安那病毒(vesicular stomatitis Indiana virus)；狂犬病病毒屬(Lyssavirus)，模式種狂犬病病毒(rabies virus)；和暫時熱病毒屬(Ephemerovirus)，模式種牛暫時熱病毒(bovine ephemeral fevervirus)。
24.衛(wèi)星病毒(Satellites)，包括dsDNA衛(wèi)星病毒(dsDNA Satellites)和ssRNA衛(wèi)星病毒(ssRNA Satellites)。
25.披膜病毒科(Togaviridae)，包括甲病毒屬(Alphavirus)，模式種辛德比斯病毒(Sindbis virus)；和風(fēng)疹病毒屬(Rubivirus)，模式種風(fēng)疹病毒(rubella virus)。
用所述生物復(fù)合物治療的具體病毒包括呼吸道病毒、胃腸道病毒、免疫缺陷病毒(例如人免疫缺陷病毒(HIV))和腦病毒(例如病毒性腦膜炎病毒)或其它內(nèi)臟器官病毒。
在性質(zhì)(例如pH等)方面，粘膜表面的情況相當(dāng)獨特。然而，本發(fā)明的復(fù)合物在這樣的條件下仍能保持活性。尤其在以下部位中都存在有粘膜表面鼻道、口腔、咽喉、食道、肺、胃、結(jié)腸、陰道和膀胱。尤其可以用本發(fā)明治療的粘膜表面包括咽喉、肺、結(jié)腸和膀胱表面。本發(fā)明尤其適用于治療影響這些部位的病毒，例如HSV。
可按本發(fā)明治療的具體的呼吸道病毒包括腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒、鼻病毒、冠狀病毒。
本文所用的術(shù)語“HAMLET”是指α-乳清蛋白的生物活性復(fù)合物，所述蛋白是按下述方法獲得的按照例如EP-A-0776214所述，使乳汁的酪蛋白部分在pH4.6沉淀出來，通過離子交換層析和凝膠層析進行分離；或者按照WO99/26979所述，在來自人乳酪蛋白的輔因子(以C18:1脂肪酸為特征)存在下，對α-乳清蛋白進行離子交換層析。
α-乳清蛋白可得自不同來源的哺乳動物，包括人、牛、綿羊和山羊的乳汁，但是優(yōu)選人乳或牛乳，最優(yōu)選人乳。也可使用該蛋白的重組形式。
已經(jīng)知道，其它試劑、尤其是脂質(zhì)(例如油酸)可用于將人α-乳清蛋白轉(zhuǎn)化成HAMLET。具體地講，先前已報道，油酸(C18:1:9順式)是產(chǎn)生HAMLET所需要的(M.Svensson等，(2000)Proc Natl Acad SciUSA，97，4221-6)。最近發(fā)現(xiàn)，其它脂肪酸也可以類似方式作為輔因子。將α-乳清蛋白轉(zhuǎn)化成HAMLET的最佳輔因子是C18:1脂肪酸，在9位或11位具有順式構(gòu)象的雙鍵。
α-乳清蛋白是一種14.2kDa的球狀蛋白，帶有4個α-螺旋(殘基1-34，86-123)和反平行β-折疊(殘基38-82)，由4個二硫鍵(61-77；73-91；28-111和6-120)連接在一起(K.R.Acharya等，(1991)J Mol Biol，221，571-81)。α-乳清蛋白的天然構(gòu)象是由高親和性Ca2+結(jié)合位點限定，與Asp82、Asp87和Asp88的側(cè)鏈羧基、Lys79和Asp84的羰基氧和2個水分子配位(K.R.Acharya等，(1991)J Mol Biol，221，571-81)。當(dāng)暴露在低pH時，或者在螯合劑存在下，在HAMLET中發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)采用所謂的apo-構(gòu)象，釋放強結(jié)合的Ca2+離子(D.A.Dolgikh等，(1981)FEBS Lett，136，311-5；K.Kuwajima，(1996)Faseb J，10，102-09)。
為了形成生物活性復(fù)合物，α-乳清蛋白通常需要構(gòu)象變化或折疊變化并需要脂質(zhì)輔因子的存在。從α-乳清蛋白上除去鈣離子，會適當(dāng)影響構(gòu)象變化。在一個優(yōu)選的實施方案中，采用沒有功能性鈣結(jié)合位點的α-乳清蛋白變異體，適當(dāng)?shù)睾喕嗽撨^程。
含有所述變異體的生物活性復(fù)合物包括在本文所用的術(shù)語HAMLET的“修飾物”之內(nèi)。然而，申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，一旦形成了復(fù)合物，功能性鈣結(jié)合位點的存在和/或鈣的存在，就不會影響復(fù)合物的穩(wěn)定性或生物活性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，生物活性復(fù)合物保留對鈣的親和力，同時也不喪失活性。因此，本發(fā)明的復(fù)合物還可包含鈣離子。
因此，具體地講，本發(fā)明使用生物活性復(fù)合物，所述復(fù)合物包括α-乳清蛋白、或呈apo折疊狀態(tài)的α-乳清蛋白變異體、或它們的任何片段以及使復(fù)合物穩(wěn)定保持生物活性形式的輔因子，前提條件是α-乳清蛋白或其變異體的任何片段包括對應(yīng)于在α和β結(jié)構(gòu)域之間形成界面的α-乳清蛋白區(qū)的區(qū)域。
合適的輔因子是順式C18:1:9脂肪酸或順式C18:1:11脂肪酸或具有類似構(gòu)型的不同脂肪酸。
在一個特別簡便的實施方案中，用于本發(fā)明的生物活性復(fù)合物包括(i)順式C18:1:9脂肪酸或順式C18:1:11脂肪酸或具有類似構(gòu)型的不同脂肪酸；和(ii)已除去鈣離子的α-乳清蛋白，或者已釋放鈣離子或沒有功能性鈣結(jié)合位點的α-乳清蛋白變異體；或它們的任何片段，前提條件是任何片段都包含對應(yīng)于在α和β結(jié)構(gòu)域之間形成界面的α-乳清蛋白區(qū)的區(qū)域。
本文所用的術(shù)語“變異體”是指與基礎(chǔ)蛋白(basic protein)同源的多肽或蛋白質(zhì)，它們適宜是人α-乳清蛋白或牛α-乳清蛋白，但是它們所來源的堿基序列不同，所述序列中一個或多個氨基酸被其它氨基酸取代。氨基酸取代可被認為是“保守的”，其中一個氨基酸被具有大致相似特性的不同氨基酸取代。非保守取代則是氨基酸被不同類型的氨基酸取代。一般而言，少數(shù)非保守取代可能不會改變多肽的生物活性。合適的變異體可具有至少60％的同一性，優(yōu)選至少70％、甚至更優(yōu)選80％或85％、特別優(yōu)選90％、95％或98％或更高同一性。
當(dāng)為了確定同一性程度而對氨基酸序列進行比較時，可以使用例如BESTFIT和GAP(都來自Wisconsin Genetics Computer Group(GCG)軟件包)等程序。例如，BESTFIT比較兩個序列并產(chǎn)生最相似區(qū)段的最佳比對。GAP能通過在各序列中合適地插入空位，而比對序列的全長并找到最佳比對。在本發(fā)明的內(nèi)容中，當(dāng)討論序列同一性時，適宜通過序列的全長比對而進行比較。
術(shù)語“其片段”是指給定氨基酸序列的任何部分，所述部分可形成具有與包括完整α-乳清蛋白氨基酸序列的復(fù)合物類似活性的復(fù)合物。片段可包括不止一個來自全長蛋白質(zhì)并連接在一起的部分。各部分適宜包括來自基礎(chǔ)序列(basic sequence)的至少5個、優(yōu)選至少10個連續(xù)氨基酸。合適的片段將是缺失突變體，其長度適宜包含至少20個氨基酸，更優(yōu)選至少100個氨基酸。它們包含來自蛋白質(zhì)或它們的組合的小區(qū)域。
在人α-乳清蛋白中，在α和β結(jié)構(gòu)域之間形成界面的區(qū)域限定在結(jié)構(gòu)中的氨基酸34-38和82-86。因此，合適片段包括這些區(qū)域，優(yōu)選來自天然蛋白質(zhì)的氨基酸34-86的整個區(qū)。
在一個具體的優(yōu)選實施方案中，生物活性復(fù)合物包括α-乳清蛋白變異體，其中鈣結(jié)合位點已被修飾，使得對鈣的親和力降低，或者不再具有功能。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在牛α-乳清蛋白中，鈣結(jié)合位點是與殘基K79、D82、D84、D87和D88配位。因此在非牛α-乳清蛋白中，對該位點或其等同位點的修飾(例如去除一個或多個酸性殘基)可以使該位點對鈣的親和力降低，或者完全消除該功能，這類突變體是本發(fā)明的優(yōu)選方面。
牛α-乳清蛋白的Ca2+-結(jié)合位點是由310螺旋和α-螺旋組成，兩個螺旋之間具有短轉(zhuǎn)角區(qū)(Acharya K.R.等，(1991)J Mol Biol 221，571-581)。它鄰接兩個二硫橋，使分子的這一部分相當(dāng)剛硬。與Ca2+配位的7個氧基團中有5個是由Asp82、87和88的側(cè)鏈羧基或Lys79和Asp84的羰基氧貢獻出來的。兩個水分子提供余下的兩個氧(Acharya K.R.等，(1991)J Mol Biol 221，57l-581)。
先前已經(jīng)知道，通過定點誘變將87位天冬氨酸變成丙氨酸(D87A)，能鈍化強鈣結(jié)合位點(Anderson P.J.等，(1997)Biochemistry 36，11648-11654)，突變蛋白可采用apo構(gòu)象。
因此，在一個具體實施方案中，在牛α-乳清蛋白的蛋白質(zhì)序列中87位氨基酸的天冬氨酸殘基，突變成非酸性殘基，尤其是非極性或不帶電荷的極性側(cè)鏈。
非極性側(cè)鏈包括丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸或半胱氨酸。尤其優(yōu)選的實例是丙氨酸。不帶電荷的極性側(cè)鏈包括天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸。
為了使突變蛋白的結(jié)構(gòu)變形最小化，D87也已被天冬酰胺(N)取代(Permyakov S.E.等，(2001)Proteins Eng 14，785-789)，其缺乏非補償?shù)聂然撾姾?，但具有相同的?cè)鏈體積和幾何結(jié)構(gòu)。已經(jīng)知道，突變蛋白(D87N)以低親和力結(jié)合鈣(K-Ca2×105M-1)(Permyakov S.E.等，(2001)Proteins Eng 14，785-789)。在另一個本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，這樣的突變體構(gòu)成生物活性復(fù)合物的要素。
因此，用于本發(fā)明復(fù)合物的特別優(yōu)選的變異體是α-乳清蛋白D87A變異體和D87N變異體，或包含該突變的片段。牛蛋白和人蛋白分子的該區(qū)是不同的，因為在牛α-乳清蛋白中3個堿性氨基酸中有一個(R70)變成S70，因而消除了一個配位側(cè)鏈。因此，優(yōu)選當(dāng)牛α-乳清蛋白用于本發(fā)明的復(fù)合物時，采用S70R突變體。
在不同物種的α-乳清蛋白中，Ca2+結(jié)合位點是100％保守的(Acharya K.R.等，(1991)J Mol Biol 221，571-581)，說明該功能對蛋白質(zhì)的重要性。它由5個不同氨基酸和2個水分子配位。D87以及D88的側(cè)鏈羧基最初減少了鈣離子進入陽離子結(jié)合區(qū)，并形成穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)的內(nèi)部氫鍵(Anderson P.J.等，(1997)Biochemistry 36，11648-11654)。已經(jīng)知道，D87或D88的缺乏會削弱Ca2+的結(jié)合，并使分子穩(wěn)定在部分未折疊狀態(tài)中(Anderson P.J.等，(1997)Biochemistry 36，11648-11654)。
此外，也可使用在牛α-乳清蛋白鈣結(jié)合位點中具有兩個不同點突變的突變蛋白。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，87位的天冬氨酸被丙氨酸取代(D87A)完全消除了鈣的結(jié)合并破壞蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)。天冬氨酸被天冬酰胺取代，蛋白質(zhì)(D87N)仍能結(jié)合鈣，但親和力較低，并顯示出喪失三級結(jié)構(gòu)，雖然不象D87A突變體那樣明顯(Permyakov S.E.等，(2001)Proteins Eng 14，785-789)。突變蛋白在堆積體積(packingvolume)上表現(xiàn)出最小變化，因為兩個氨基酸都具有相同的平均體積1253，天冬酰胺的羧基側(cè)鏈允許蛋白質(zhì)與鈣配位，但效果較差(Permyakov S.E.等，(2001)Proteins Eng 14，785-789)。兩個突變蛋白在生理溫度下、在apo構(gòu)象中是穩(wěn)定的，但是盡管有該構(gòu)象變化，它們?nèi)允菬o生物活性的。結(jié)果證明，僅有apo構(gòu)象的構(gòu)象變化并不足以誘導(dǎo)生物活性。
α-乳清蛋白的結(jié)構(gòu)是本領(lǐng)域已知的，本文所用殘基的準(zhǔn)確氨基酸編號可以根據(jù)以下文獻所述的結(jié)構(gòu)而確定例如Anderson等，出處同上；Permyakov等，出處同上。
按照本發(fā)明制備的藥物適宜是藥物組合物，其形式適于局部給予受病毒感染的特定部位。
例如，對于呼吸道感染而言，該組合物可適于吸入或吹入給予?？诜M合物可用于治療胃腸道病毒感染，尤其是胃部感染。治療其它粘膜表面的病毒感染，例如陰道或結(jié)腸，可用局部制劑(例如栓劑)進行治療。
局部溶液劑或乳膏劑適宜含有用于蛋白質(zhì)復(fù)合物的乳化劑以及稀釋劑，或者乳膏基質(zhì)可以更適用于粘膜表面的其它病毒感染。所述制劑可直接施用于粘膜表面。
另外，所述局部組合物可用于治療皮膚病毒感染。
在另一個實例中，組合物的形式適于滴注到膀胱內(nèi)，以治療膀胱病毒。
累及內(nèi)臟器官的其它病毒感染可通過輸注到受累部位而進行治療。所述部位可以包括腦、肝、腎、前列腺和卵巢。同樣，免疫缺陷病毒可通過將復(fù)合物輸注到負責(zé)免疫系統(tǒng)的器官(例如淋巴腺和骨髓)而進行治療。
復(fù)合物適于用對流增強給藥(CED)來輸注。
組合物可包含公知的藥學(xué)上可接受的載體、填充劑和/或賦形劑(expedient)。
例如，滴注或輸注到膀胱或其它內(nèi)臟器官的組合物包括活性劑用無菌水或鹽水制成的溶液劑。
本發(fā)明的活性劑將會攻擊受病毒感染的細胞，使它們死亡(可能是通過細胞凋亡)，但卻不損傷健康細胞。結(jié)果阻止了病毒擴散。
活性化合物的日用量可以變化，這取決于正常臨床實踐中的患者、待治療病毒的性質(zhì)等。通常采用每天給予200mg/劑至1g/劑的生物活性復(fù)合物，每周期至少3天，優(yōu)選至少5天。
在本發(fā)明的另一方面，提供病毒感染的治療方法，所述方法包括給予有需要的患者選自以下的α-乳清蛋白生物活性復(fù)合物HAMLET或其生物活性修飾物或它們的生物活性片段。
具體地講，可以將復(fù)合物直接給予受病毒感染的細胞。例如，就治療粘膜表面的病毒感染而言，可以將復(fù)合物以治療有效量給予所述表面。
生物活性復(fù)合物的優(yōu)選實例如上所述。優(yōu)選以局部組合物的形式給予生物活性復(fù)合物，也同樣如上所述。
權(quán)利要求
1.一種選自使腫瘤細胞致死的人α-乳清蛋白(HAMLET)或其生物活性修飾物或它們的生物活性片段的α-乳清蛋白生物活性復(fù)合物在制備用于治療病毒感染的藥物中的用途。
2.權(quán)利要求1的用途，其中所述病毒感染是呼吸道病毒感染、胃腸道病毒感染、免疫缺陷病毒感染和腦或其它內(nèi)臟器官的病毒感染。
3.權(quán)利要求1或2的用途，其中所述生物活性復(fù)合物包括α-乳清蛋白、或呈apo折疊狀態(tài)的α-乳清蛋白變異體、或它們的任何片段以及使復(fù)合物穩(wěn)定保持生物活性形式的輔因子，前提條件是α-乳清蛋白或其變異體的任何片段包含對應(yīng)于在α和β結(jié)構(gòu)域之間形成界面的α-乳清蛋白區(qū)的區(qū)域。
4.權(quán)利要求3的用途，其中所述輔因子是順式C18:1:9脂肪酸或順式C18:1:11脂肪酸或具有類似構(gòu)型的不同脂肪酸。
5.權(quán)利要求1-4中任一項的用途，其中所述生物活性復(fù)合物包含按下述方法獲得的HAMLET使乳汁的酪蛋白部分在pH4.6沉淀出來，通過陰離子交換層析和凝膠層析進行分離；或者在來自人乳酪蛋白并以C18:1脂肪酸為特征的輔因子存在下，對α-乳清蛋白進行離子交換層析。
6.權(quán)利要求1-4中任一項的用途，其中所述α-乳清蛋白生物活性復(fù)合物包含(i)順式C18:1:9脂肪酸或順式C18:1:11脂肪酸或具有類似構(gòu)型的不同脂肪酸；和(ii)已除去鈣離子的α-乳清蛋白，或者已除去鈣離子或沒有功能性鈣結(jié)合位點的α-乳清蛋白變異體；或它們的任何片段，前提條件是任何片段都包含對應(yīng)于在α和β結(jié)構(gòu)域之間形成界面的α-乳清蛋白區(qū)的區(qū)域。
7.權(quán)利要求6的用途，其中所述生物活性復(fù)合物包括α-乳清蛋白變異體，其中所述鈣結(jié)合位點已經(jīng)被修飾，使得對鈣的親和力降低，或者不再具有功能。
8.權(quán)利要求7的用途，其中所述變異體在牛α-乳清蛋白中的一個相當(dāng)于K79、D82、D84、D87和D88的氨基酸上具有突變。
9.權(quán)利要求8的用途，其中所述修飾是在D87上，所述修飾物包括具有D87A變異體或D87N變異體的α-乳清蛋白變異體。
10.權(quán)利要求1-4中任一項的用途，其中所述生物活性復(fù)合物包含α-乳清蛋白或其變異體的片段，其中所述片段包含天然蛋白的氨基酸34-86的整個區(qū)。
11.前述權(quán)利要求中任一項的用途，其中所述α-乳清蛋白是人α-乳清蛋白或牛α-乳清蛋白或它們的變異體。
12.權(quán)利要求11的用途，其中所述α-乳清蛋白是人α-乳清蛋白。
13.權(quán)利要求11的用途，其中所述α-乳清蛋白是包含S70R突變的突變型牛α-乳清蛋白。
14.一種治療病毒感染的方法，所述方法包括給予有需要的患者選自以下的α-乳清蛋白生物活性復(fù)合物HAMLET或其生物活性修飾物或它們的生物活性片段。
15.權(quán)利要求14的方法，所述方法用于治療粘膜表面的病毒感染，并且包括給予有需要的患者的所述表面選自以下的α-乳清蛋白生物活性復(fù)合物HAMLET或其生物活性修飾物或它們的生物活性片段。
全文摘要
選自使腫瘤細胞致死的人α－乳清蛋白(HAMLET)或其生物活性修飾物或它們的生物活性片段的α－乳清蛋白生物活性復(fù)合物在制備用于治療病毒感染的藥物中的用途。
文檔編號A61P31/12GK1980688SQ200580019236
公開日2007年6月13日 申請日期2005年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月20日
發(fā)明者C·斯范博格 申請人:哈姆雷特藥品公司