專利名稱:一種抑制腫瘤血管新生的方法
技術領域:
本發(fā)明屬于腫瘤防治技術領域。
背景技術:
血管新生是腫瘤惡性生長和發(fā)生轉移的基礎。腫瘤的持續(xù)生長和侵襲轉移有賴于充足的微血管生成和血液供應,當腫瘤體直徑超過1-2mm時,營養(yǎng)的吸收和代謝廢物的排出就會受到限制,從而影響腫瘤的進一步生長,實體瘤只有具備了血管生成表型后才能惡性生長和發(fā)生成功的轉移。
水通道(water channel),又稱水孔蛋白(Aquaporin,AQP),是近年來發(fā)現(xiàn)的一族具有同源性的內在膜蛋白,是存在于哺乳動物和植物細胞膜上轉運水的特異孔道,目前已從哺乳動物組織中鑒定出10種水通道。在血管內皮細胞上AQP1蛋白的表達豐富。已有的研究表明大多數(shù)腫瘤都顯示出很高的血管通透性和高間質液壓[Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1998;954607],Sevick等報道鼠乳腺腫瘤的血管具有高濾過系數(shù)[Cancer Res.1991;511352]。提示腫瘤血管水代謝亢進,是腫瘤血管旺盛生長的物質基礎之一。
血管生長抑制劑作為抗癌藥,目前正在廣泛地研究,但最好的策略是抑制血管內皮細胞,而不是阻斷腫瘤細胞產生某種血管生長因子,因為腫瘤細胞還會釋放其它的血管生長因子而產生耐藥。若以血管內皮細胞做為治療的靶標,就不會產生耐藥作用[Annu Rev Med.1998;49407]。
目前,國內外尚未通過阻斷內皮細胞的水代謝通路——水孔蛋白而抑制內皮細胞生長以達到控制腫瘤的研究報道。
發(fā)明內容
本發(fā)明需要解決的問題是從內皮細胞跨膜水轉運系統(tǒng)的角度研制一種治療腫瘤及新生血管性疾病的新方法。
本發(fā)明的技術方案為1.建立C57BL/6小鼠Lewis肺癌自發(fā)性肺轉移動物模型,觀察水孔蛋白抑制劑acetazolamide對腫瘤生長和轉移的影響;2.采用Western blot和免疫組化的方法,觀察水通道蛋白AQP1的分布及表達量的變化;3.采用體內雞胚尿囊膜(chorioallantotic membrane,CAM)新生血管實驗和體外人臍靜脈內皮細胞(ECV304)增殖實驗,觀察水孔蛋白抑制劑對體內外血管生成的作用。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比,其有益效果是水孔蛋白抑制劑acetazolamide可顯著抑制AQP1的蛋白表達,用藥后腫瘤組織內小血管數(shù)目明顯減少(附圖1);能有效抑制血管內皮細胞的生長(附圖3)及雞胚尿囊膜(CAM)血管新生(附圖2);抑制腫瘤的生長和轉移,肺轉移抑制率為83.9%。表明水孔蛋白抑制劑在腫瘤及新生血管性疾病的治療中有潛在的應用前景,是很有前途的抗腫瘤藥,為攻克癌癥提供了新的方法。且以腫瘤血管內皮細胞膜水孔蛋白進行靶向性治療,無毒副作用。而目前常規(guī)的細胞毒類抗癌藥物,毒性大,給患者帶來很大痛苦。
四
圖1.AQP1在腫瘤組織中主要分布于毛細血管、毛細血管后小靜脈的內皮細胞,acetazolamide可顯著抑制AQP1的蛋白表達,治療后腫瘤組織內小血管數(shù)目明顯減少。A和C對照組;B和Dacetazolamide治療組。
圖2.acetazolamide對雞胚尿囊膜血管生成的影響。A對照組,Bacetazolamide用藥組(×4)。
圖3.acetazolamide對處于指數(shù)生長期的內皮細胞ECV304增殖的作用(MTT法)*p<0.05,**p<0.01,C對照組;Aacetazolamide用藥組。
五具體實施例方式
1.實驗動物C57BL/6小鼠,雌性,體重18-20g,由北京大學醫(yī)學部實驗動物中心提供。Lewis肺癌瘤種購自中國醫(yī)學科學院藥物研究所。
2.藥品與試劑Acetazolamide、丙烯酰胺(Acrylamide,Acry)、亞甲雙丙烯酰胺(N,N-Methylene-bis-Acrylamide,Bis)購自Sigma公司;過硫酸胺(Ammoniumpersulfate,AP)、十二烷基磺酸鈉(Sodium dodecyl sulfate,SDS)、TEMED購自Bio-RAD公司;堿性磷酸酶標記的羊抗兔IgG購自Bio-RAD公司;兔抗人AQP1抗血清由美國加州大學醫(yī)學院舊金山分校Verkman教授惠贈;顯色劑BCIP和NBT為Clontech公司產品;免疫組化試劑盒為美國Zymed公司產品;其余試劑均為國產分析純。
3.動物腫瘤模型的建立和實驗分組
從荷瘤小鼠上剝離Lewis肺癌的皮下移植瘤,去除包膜及壞死組織,按腫瘤(g)∶生理鹽水(ml)為1∶3比例,冰上研磨成勻漿,給每只C57BL/6小鼠腋窩皮下接種腫瘤勻漿0.2ml,接種后第5-6天皮下移植瘤生長可觸及,隨機分組。所有小鼠均飼以自制高蛋白固體飼料及瓶裝飲用水。于21天頸椎脫臼處死動物,解剖顯微鏡下記錄肺轉移灶數(shù)后,立即將雙肺組織分裝,投入液氮,后轉移至-70℃冰箱保存待用.
Acetazolamide(水孔蛋白1抑制劑)分高中低三個劑量80、40、20mg·kg-1,將Acetazolamide混懸于0.5%羧甲基纖維素鈉,對照組用相同溶媒,4.荷瘤肺組織蛋白質提取1從-70℃冰箱取出肺組織標本,1g肺組織加入預冷的勻漿分離緩沖液,用Teflon-glass勻漿器冰上進行勻漿。
2 4℃離心,800g,25分鐘,取上清。
3 4℃離心,16000g,1.5小時,取上清。
5.Western Blot1取50μg/泳道蛋白質樣品,加入5×上樣緩沖液,于60℃孵育10min,上樣進行SDS-PAGE電泳(恒壓150V,1h).
2電泳結束后,將蛋白質電轉移至PVDF膜(恒流150mA,2h).
3將PVDF膜置于含5%脫脂奶粉的1×TBS中室穩(wěn)封閉30min.
4用TBS-Tween20(1×TBS+0.05%Tween20)洗3次×5min.
5加入1∶1000的兔抗人AQP1抗血清,4℃孵育過夜.
6TBS-Tween20洗3次×5min.
7加堿性磷酸酶標記的羊抗兔IgG 1∶3000,室溫孵育2h.
8TBS-Tween20洗3次×5min,用BCIP/NBT系統(tǒng)顯色.
9在PVDF膜上的Western Blot信號,經凝膠成像分析系統(tǒng)掃描后,用測光密度軟件進行定量分析.
6.免疫組化動物模型同第一部分,于21天頸椎脫臼處死動物,立即取出肺及皮下瘤組織,投入固定液(1%苦味酸75ml,甲醛25ml,冰醋酸5ml)中固定24h,組織經70%、80%、90%、95、及100%梯度酒精脫水后,常規(guī)石蠟包埋(浸蠟時溫度不得超過60℃)。切片厚度為5μm。常規(guī)免疫組化方法7.雞胚尿囊膜(CAM)新生血管實驗(一)操作步驟1.受精卵孵育第6天,用75%醫(yī)用消毒酒精消毒蛋殼表面,用砂輪在蛋殼表面,胚頭下方約0.5cm處劃刻出0.5cm×1.5cm的凹痕,為開窗的位置。
2.用解剖針在雞蛋氣室表面扎一小洞,制備假氣室用。
3.在開窗凹痕處滴少量生理鹽水,用尖鑷輕揭凹痕處蛋皮,輕輕撕掉內殼膜,此時該處CAM下陷,形成假氣室(區(qū)別于蛋自身的氣室)。
4.用透明膠帶紙封貼假氣室,放回孵箱中,平衡穩(wěn)定24小時。
5.24小時后,即孵育第7天,輕輕撕開透明膠帶紙,放置藥膜,再封好。
6.繼續(xù)孵育3天,撕開透明膠帶紙,觀察并拍照。
7.由觀察窗加入固定液甲醇∶丙酮=1∶1(V/V)固定15分鐘,去掉雞胚,取下CAM并與蛋皮分離,將CAM平鋪在濾紙上,長期保存并拍照。
(二)CAM血管生成的計數(shù)標準解剖鏡下計數(shù)實驗載體邊緣1mm內的血管數(shù)目,根據直徑分為大、中、小三種血管直徑>1mm,為大血管;直徑1-0.1mm為中血管;直徑<0.1mm為小血管。
8.人臍靜脈內皮細胞增殖實驗(MTT法)取指數(shù)生長期的ECV304細胞,經0.25%胰蛋白酶消化分散制備單細胞懸液,調整細胞濃度,將細胞接種至24孔Corning細胞培養(yǎng)板,初始細胞接種濃度為2×10-4,液體量2ml/孔。孵育6-12小時待細胞貼壁后,吸去培養(yǎng)液,用含有不同濃度處理因素(Acetazolamide 0,10-7M,10-6M,10-5M終濃度)的新鮮培養(yǎng)基換液1次,繼續(xù)培養(yǎng)3天。臨測細胞增殖率時,向每孔加入0.5%MTT貯液20μl。置CO2孵箱繼續(xù)培養(yǎng)4小時。此時MTT經線粒體膜琥珀酸脫氫酶轉化為formazan,鏡下可見細胞內外有大量紫紅色針狀結晶。小心吸取培養(yǎng)液,每孔加入200μl DMSO充分振蕩培養(yǎng)板15分鐘,使formazan結晶完全溶解,立即置酶標儀于570nm測光密度值OD,實驗重復3次,以OD值的大小反映活細胞的數(shù)量。
權利要求
1.一種抑制腫瘤血管新生的方法,其特征是由以下幾個步驟構成(1)、建立C57BL/6小鼠Lewis肺癌自發(fā)性肺轉移動物模型;(2)、采用Western blot和免疫組化的方法,觀察水通道蛋白AQP1在腫瘤內的分布與表達量的變化;(3)、采用體內雞胚尿囊膜新生血管實驗和體外人臍靜脈內皮細胞增殖實驗,觀察水孔蛋白抑制劑對體內外血管生成的作用。
2.根據權利要求1所述抑制腫瘤血管新生方法的水孔蛋白抑制劑在制備防治癌癥藥中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于腫瘤防治技術領域。水通道(waterchannel),又稱水孔蛋白(Aquaporin,AQP),是近年來發(fā)現(xiàn)的一族具有同源性的內在膜蛋白,是存在于哺乳動物和植物細胞膜上轉運水的特異孔道,目前已從哺乳動物組織中鑒定出10種水通道蛋白。在血管內皮細胞上AQP1蛋白的表達豐富。本發(fā)明證實AQP1對血管形成有直接的調控作用,表明阻斷血管內皮細胞膜上水孔蛋白介導的跨膜水轉運是一種抑制腫瘤血管新生的新途徑,為攻克癌癥提供了新的方法,且以腫瘤血管內皮細胞膜水孔蛋白進行靶向性治療,無毒副作用。
文檔編號A61P35/00GK1785426SQ200510095048
公開日2006年6月14日 申請日期2005年10月27日 優(yōu)先權日2005年10月27日
發(fā)明者項陽, 李學軍, 李濤 申請人:南京大學