專利名稱：治療肌肉萎縮的寡核苷酸藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療肌肉萎縮或增強肌肉生長的寡核苷酸，本發(fā)明還涉及含此寡核苷酸的組合物以及用途。
背景技術(shù)：
增強肌肉生長是臨床上和農(nóng)牧業(yè)中需要解決的課題。
肌肉萎縮及相關(guān)的肌體異常包括肌營養(yǎng)不良、脊髓損傷、神經(jīng)變性疾病、肌缺乏、惡病質(zhì)、肌萎縮和糖尿病。這些疾病的通常癥狀是肌肉減少并伴隨著肌無力，嚴重的將導致殘廢和死亡。
在農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)中，例如在食用動物的飼養(yǎng)，人們總是希望能增加肌肉的比例成分。
但目前尚無有效的治療肌肉萎縮或增強肌肉生長的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一類有效的治療肌肉萎縮或增強肌肉生長的藥物或方法。
盡管引起肌肉萎縮的起源是多因素的，但通常是由多種不同基因表達異常所造成。很顯然，通過對在此類疾病中異常表達基因的調(diào)節(jié)，可以達到治療的目的。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)某些寡核苷酸具有治療肌肉萎縮或增強肌肉生長的作用。
所述寡核苷酸的特征是(1)含有7～75個核苷酸；(2)含有通過非手性5′到3′磷酸核苷間鍵連接的7～75個鄰接的核糖基團；(3)互補于與肌肉萎縮病相關(guān)靶基因的5′端非翻譯區(qū)、翻譯起始區(qū)、3′端非翻譯區(qū)和翻譯終止區(qū)；(4)具有75℃～115℃的熔解溫度(Tm，1毫摩爾濃度)當本發(fā)明所述寡核苷酸用作治療肌肉萎縮或增強肌肉生長時，可使用一種，也可使用二種或更多種。當使用二種寡核苷酸時，這二種寡核苷酸將各自與相同或不同的肌肉萎縮病相關(guān)基因的一段區(qū)域互補。
當使用二種寡核苷酸時，第一種寡核苷酸與某一組基因中的第一個基因的5′非翻譯區(qū)、翻譯起始位點、3′非翻譯區(qū)或翻譯終止位點的區(qū)域互補，第二種寡核苷酸與同一組或另一組基因中的第二個基因的5′非翻譯區(qū)、翻譯起始位點、3′非翻譯區(qū)或翻譯終止位點的區(qū)域互補。
優(yōu)選地，上述寡核苷酸由10～26個核苷酸組成，具有40℃～85℃的熔解溫度(Tm，1微微摩爾濃度)。
所述寡核苷酸還可經(jīng)化學修飾，成為在糖基2′位上帶有取代基團的修飾性寡核苷酸，也具有較好的治療肌肉萎縮或增強肌肉生長的作用，這些基團包括氧、甲氧基、丙氧基、甲氧-乙氧基、氟、氯、溴、碘。
在一些實例中，修飾性寡核苷酸在3′端或5′帶有保護基團。
所述修飾的寡核苷酸還可以是3′末端封閉和/或5′末端封閉的。
本發(fā)明所述的寡核苷酸包括核糖寡核苷酸和脫氧核糖寡核苷酸。所述修飾的寡核苷酸的序列選自SEQ ID NO1-SEQ ID NO191。
本發(fā)明所述的寡核苷酸是反義寡核苷酸，包括靶向人基因的反義寡核苷酸、靶向動物基因的反義寡核苷酸、針對人肌生長抑制素的代表性反義寡核苷酸。代表性的反義寡核苷酸的序列見表3、表4和表5。
本發(fā)明所述的寡核苷酸還可以是可調(diào)節(jié)肌生長抑制素和其受體表達的干擾RNA(RNAi)。這些干擾RNA為21～25核苷酸組成的雙鏈RNA，在每條鏈的3′端有2個突出的核苷酸；雙鏈的G+C含量為30～52％；在正義鏈上的15至19位置上為A/U配對；無分子內(nèi)重復序列。
本發(fā)明所述的寡核苷酸還可以是核酶。
本發(fā)明所述的寡核苷酸還可以是可調(diào)節(jié)肌生長抑制素和其受體表達的脫氧核酶。該脫氧核酶含序列為GGCTAGCTAACGA的催化功能區(qū)，可特異性地切割存在于肌生長抑制素和其受體基因mRNA中的嘌呤和嘧啶之間連接鍵。脫氧核酶與靶基因mRNA的結(jié)合是通過兩個存在于切割位點5′端和3′端的互補序列與mRNA雜交完成。
用本發(fā)明所述的寡核苷酸作為活性物質(zhì)可以制備多種治療肌肉萎縮或增強肌肉生長的藥物組合物，適用于動物和人。所述的動物包括哺乳動物，如人、馬、牛等和非哺乳動物，如雞等。所述藥物組合物中可以含有各種藥學上可接受的賦形劑、輔劑。所述藥物組合物中，可以含有一種或幾種所述寡核苷酸。比如，可含二種、三種、四種、五種或五種以上的修飾性寡核苷酸。
在有些實例中，本發(fā)明提供一種含二種或二種以上調(diào)節(jié)肌生長抑制素和其受體基因表達的寡核苷酸，其中至少有一個寡核苷酸的靶基因是肌生長抑制素基因，至少有一個寡核苷酸的靶基因不是肌生長抑制素基因。
在另一些實例中，藥物組合物可含有一種或多種從一組反義寡核苷酸、干擾RNA、核酶或脫氧核酶所選出的物質(zhì)。
本發(fā)明所指的非肌生長抑制素基因包括但不限于Activin A受體IIB，Tollo⊥dmetalloproteinase，NF-kappaB，TNF-alpha，MuRF1，Caspase-3，Atrogin-1，RAS，P38MAPK，MKK3，MKK6，JNK，c-myc，c-jun，ASK-1，TAK-1 Smad，Cyclin-dependent Kinase inhibitorp21，Gadd45，IL-6和PIF(見表1和表2)。在有些實例中，藥物組合物所含的反義寡核苷酸可從表3、4、5中靶向肌生長抑制素基因的寡核苷酸中選出，所含的靶向非肌生長抑制素基因的寡核苷酸可從表3和4中選出。
本發(fā)明還提供了在肌生長抑制素基因表達的細胞內(nèi)，用本發(fā)明的寡核苷酸調(diào)節(jié)肌生長抑制素表達的方法。在另一些實例中，這些調(diào)節(jié)肌生長抑制素表達的分子可以是反義寡核苷酸、干擾RNA、核酶、脫氧核酶。
本發(fā)明還提供了肌生長抑制素基因和非肌生長抑制素基因表達的細胞內(nèi)，用本發(fā)明的反義寡核苷酸、干擾RNA、核酶或脫氧核酶，混合使用調(diào)節(jié)靶基因的表達。
本發(fā)明的寡核苷酸，即包括上述反義寡核苷酸、干擾RNA、核酶、脫氧核酶，可用于治療人肌肉萎縮病，也可用于食用性動物飼養(yǎng)中增加肌肉的比例與重量。
上述反義寡核苷酸、干擾RNA、核酶、脫氧核酶在藥物組合物中可以使用一種，也可以幾種同時混合使用。
本發(fā)明提供的寡核苷酸對于動物或人的給藥劑量為每公斤體重0.01～100mg。
發(fā)明的詳細描述本發(fā)明涉及可用于調(diào)節(jié)與肌萎縮或疾病相關(guān)基因的表達的寡核苷酸及其藥物組合物，以及用此寡核苷酸促進動物肌肉生長的方法。因此，發(fā)明所提供的藥物既可用于治療肌萎縮、異常脂肪積累等疾病，又可用于增強動物肌肉生長，例如畜牧動物。
本發(fā)明的藥物組合物，方法是利用基因調(diào)控寡核苷酸來調(diào)節(jié)靶基因表達，這些基因調(diào)控寡核苷酸(或稱為調(diào)控分子)包括反義寡核苷酸、干擾RNA(RNAi)、核酶、脫氧核酶。調(diào)控的方式可以是用一種調(diào)控分子去控制一種涉及肌肉生長發(fā)育的基因，例如，肌生長抑制素基因。調(diào)控還可以采用多種組合的方式，例如，采用不同類型調(diào)控分子的組合；針對同一基因，但不同位點的多種調(diào)節(jié)分子組合；針對不同基因的多種調(diào)節(jié)分子組合及上述各種組合方式形成的新的組合。
本發(fā)明的修飾性寡核苷酸具有特定的結(jié)構(gòu)和物理化學特性，例如，末端保護，質(zhì)子化處理，抗酸性，抗核酸酶，含非手性磷酸酯鍵，修飾性核糖和脫氧核糖取代基。
本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)動物和人細胞內(nèi)基因表達的方法和使用本發(fā)明的藥物組合物治療肌肉萎縮病的方法。所述肌肉萎縮病包括肌營養(yǎng)不良、脊髓損傷、神經(jīng)變性疾病、厭食癥、肌缺乏、惡質(zhì)病、肌萎縮、二型糖尿病、X 綜合癥等。在正常動物中應用本發(fā)明藥物組合物可增加肌肉的重量和比例。
本發(fā)明提供的修飾性寡核苷酸的作用是調(diào)節(jié)其靶基因的表達。這種調(diào)節(jié)既可以是抑制，也可以是促進，或者發(fā)生其他變化，例如，形成改變的基因產(chǎn)物。抑制是指與野生型相比，該基因表達降低了1％～99％。促進是指與野生型相比，該基因表達增加了1％～99％。
本發(fā)明的藥物組合物中含有一種或多種能夠調(diào)節(jié)與肌萎縮或肌生長相關(guān)基因的寡核苷酸。這些寡核苷酸包括反義寡核苷酸、干擾RNA、核酶、脫氧核酶。寡核苷酸的靶位點可以是某一基因的一個或多個區(qū)域，也可以是多個基因的一個以上的位點，例如肌生長抑制素、肌生長抑制素受體和肌生長抑制素轉(zhuǎn)錄因子基因。
本發(fā)明的藥物組合物和應用方法適用于任何與肌萎縮有關(guān)的基因，改變或調(diào)節(jié)這些基因的表達可以對肌萎縮或肌生長產(chǎn)生治療效果或有益的生物學效應。盡管在肌肉的生長和保持過程中，一些主要基因起著重要的作用，但在大多數(shù)情況下，疾病往往涉及多個信號傳導途徑及每個途徑中的多個基因。因此，本發(fā)明不僅提供了針對單一基因(例如，肌生長抑制素)的藥物，而且還提供了針對多個基因或單一基因的不同區(qū)域的藥物組合，或以上兩種藥物的組合。
在表1和表2中列出了代表性靶基因，這些基因可用于設(shè)計基因調(diào)節(jié)藥物。
A 調(diào)節(jié)基因表達的藥物任何以核酸為基礎(chǔ)的制劑均可用于本發(fā)明的藥物，其中包括反義寡核苷酸、核酶、干擾RNA和脫氧核酶。這些技術(shù)方法的共同點是通過Watson-Crick堿基配對原理，與其靶基因mRNA結(jié)合。因此，本發(fā)明涉及在嚴格條件下，多核苷酸與相關(guān)基因序列之間的雜交。這里所指的嚴格條件是一定程度的錯配可導致雜交體核酸無法形成。多核苷酸指的是可用于抑制肌萎縮相關(guān)基因表達的分子，其也可作為探針和引物，用于診斷和實驗室研究。
寡核苷酸指的是含核苷酸(核糖核酸，脫氧核糖核酸或兩者)的分子，這些核苷酸通過5′與3′端或5′與2′端連接，所用的核苷酸可以是天然的，也可以是化學合成的類似物，這些類似物可與天然核酸形成配對。例如，氮雜(Aza)和脫氮雜(deaza)嘧啶類似物，氮雜(aza)和脫氮雜(deaza)嘌呤，及其它雜環(huán)堿基類似物。這些堿基類似物包括在嘧啶或嘌呤中的一個或多個碳氮原子由氧、硫、硒、磷等取代。
以下分別詳述本發(fā)明的寡核苷酸所包括的反義寡核苷酸、干擾RNA、核酶和脫氧核酶。
1.反義寡核苷酸反義寡核苷酸是化學合成的短DNA或RNA，其可通過堿基配對與靶mRNA結(jié)合，從而阻斷mRNA的翻譯或通過激活RNAseH降解mRNA。反義寡核苷酸的作用可通過抑制RNA的拼接、翻譯和細胞核與細胞質(zhì)之間的輸送過程。作用機理受寡核苷酸的母體結(jié)構(gòu)改變的影響。反義寡核苷酸可以互補于整個基因序列，也可以互補于靶基因的一部分。
因此，本發(fā)明所述的一個反義寡核苷酸的長度可以是5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，60，70，80，90，100或多于100個核苷酸。優(yōu)選用長度為7～75個核苷酸。反義寡核苷酸優(yōu)選長度為10～26個核苷酸。
典型的設(shè)計反義寡核苷酸的方法包括(1)選擇一個與靶區(qū)域鄰近或重迭的寡核苷酸，(2)測定與靶基因結(jié)合的Gibbs自由能水平，(3)分析雜交熔解溫度(Tm)，(4)進行序列庫分析，以確定其靶位點所處區(qū)域，例如，5′端非翻譯區(qū)、翻譯起始區(qū)、3′端非翻譯區(qū)和翻譯終止區(qū)。優(yōu)選的反義寡核苷酸一般鄰近于翻譯起始區(qū)或至少有一個核苷酸與翻譯起始點重迭。在有些實例中這種重迭不少于三個核苷酸。
基于RNA的二級和高級結(jié)構(gòu)特征，反義RNA或DNA的設(shè)計，一般可選在5′端區(qū)域。在有些情況下，可選在3′端區(qū)域，或在RNA拼接點周圍。
本發(fā)明的反義寡核苷酸可通過Gibbs自由能分析來確定其與靶RNA的結(jié)合強度。這一分析可通過計算機程序進行，常用的程序可在ftp//rna.chem.rochester.edu網(wǎng)站找到，并可參考Matthews等(J.Mol.Biol，1999，288，911-940和RNA，1999，5，1458-1469)。寡核苷酸與靶RNA雜交分子的Gibbs自由能一般≤-20kcal(37℃)，優(yōu)選為≤-25kcal。對于一個10-14個單位的寡核苷酸，其自由能為≤-15kcal；15-17單位的寡核苷酸的雜交自由能為≤-20kcal；18-20單位的寡核苷酸的雜交自由能為≤-25kcal；21-23單位的寡核苷酸的雜交自由能為≤-30kcal；24-26個單位的寡核苷酸的雜交自由能為≤-35kcal。
因此，本發(fā)明所提供的寡核苷酸長度為7～75個核苷酸，優(yōu)選長度為10～26個核苷酸，熔解溫度(Tm)約為75℃～115℃(1毫摩爾濃度)，優(yōu)選熔解溫度40℃～85℃(1微微摩爾濃度)?；パa于靶基因的5′端非翻譯區(qū)、翻譯起始區(qū)或終止區(qū)；靶基因可以是表1和表2中的任選基因，或其它基因，其表達的調(diào)節(jié)可對肌萎縮相關(guān)的病癥產(chǎn)生治療效果。，為了有效地在體內(nèi)應用寡核苷酸，對其進行化學修飾可顯著地增加寡核苷酸抗酸和抗酶降解的穩(wěn)定性，例如，2′-O-甲基、2′-O-烯丙基、交接式核酸(Locked nucleic acids，LNA)和肽鏈核酸(peptide nucleic acids，PNA)。
反義寡核苷酸可利用在本技術(shù)領(lǐng)域熟知的方法通過化學合成或酶連接的方式進行制備。另外，反義寡核苷酸還可以利用表達載體在生物體內(nèi)產(chǎn)生。盡管在表3，4，5中所例舉的反義寡核苷酸均為脫氧核糖核酸組成，其也可以是核糖核酸，例如，用尿嘧啶取代胸腺嘧啶，用核糖基代替脫氧核糖基。因此，本發(fā)明的寡核苷酸可以完全由脫氧核糖核酸組成，也可以完全由核糖核酸組合，或由脫氧核糖核酸和核糖核酸混合組成。
本發(fā)明所提供的反義寡核苷酸可以是完全同源于表3，4，5中所列舉的序列，但也可以與所列序列具有百分之60，70，80，90，95或99的同源性。這種序列同源性分析可采用在本技術(shù)領(lǐng)域熟知的方法進行測定，例如，F(xiàn)asta程序(Oxford Molecular Grouplnc)，BLAST(WWW.ncbi.nlm.nih.gov)(Atschul等，1997，Nucleic Acids Res，25，3389-3402)。程序的分析參數(shù)均采用程序推薦設(shè)制。
本發(fā)明的反義寡核苷酸的G∶C成份一般為大于35％，優(yōu)選的比例為大于40％，最佳比例為大于45％。
2.核酶本發(fā)明所述核酶指一種可以特異性切割RNA分子的核酸，其可以是RNA，DNA，核酸類似物或RNA、DNA等的組合。核酶包括幾種不同的類型，例如，錘頭型核酶(Rossi，J等Pharmac.Ther.50245-254，1991)(Foster和Symons，Cell 4811-220；1987)(Haseloff和Gerlach，Nature 328596-600，1988)(Wallbot和Bruenning，Nature334196，1988)(Haseloff等US Pat No.5,254,678)，發(fā)卡型核酶(Hampel等，NucleicAcid Res 18299-304；US Pat No.5,254,678)，Delta肝炎病毒核酶(Perotta和Been，Biochem.3116，1992)，I組內(nèi)含子型核酶(Cech等，US Pat NO.4,987,071)和RNase P核酶(Takada等，Cell 35849，1983)。其它參考文獻包括WO 95/29241和WO 95/31551。在這幾種不同的核酶類型中，錘頭型核酶由于它的簡單性和實用性，被廣泛地應用于基因調(diào)節(jié)和可能的疾病治療中。
錘頭型核酶的靶向RNA含NUH，其中N是G、U、C、A中的任何一種，H為C、U或A。該核酶對靶向RNA的識別是通過位于催化保守序列兩側(cè)的5～15核苷酸的結(jié)合序列。核酶以及編碼核酶的DNA可以通過本技術(shù)領(lǐng)域熟知的方法進行合成(Heidenreich等，J.FASEB 70(1)90-96，1993；Sproat，Current Opin，Biotechnol 4(1)20-28，1993)。在核酶的合成過程中，可以引入不同的化學修飾，以增強核酶的穩(wěn)定性，如引入脫氧核苷酸、硫代磷酸鍵或2′-O-甲基。
因此，本發(fā)明提供了可以抑制與肌萎縮相關(guān)疾病有關(guān)基因表達的核酶，靶基因可以是表1，2中所列的任一基因或多種的組合。核酶的設(shè)計可基于錘頭型或發(fā)卡型模型，其可以是化學合成物(帶有或不帶化學修飾)，也可以是通過表達載體在生物體內(nèi)產(chǎn)生。這些調(diào)節(jié)肌萎縮或肌生長的核酶，均可作為本發(fā)明藥物組合物的成份之一。
3.干擾RNA(RNAi)RNA干擾是通過雙鏈RNA的導入細胞，從而介導所對應mRNA的降解。此技術(shù)已被證明是一種有效的抑制靶基因RNA表達的工具(Elbashir等，Nature 411494-498 2001；Tuschl等，Genes and Development，133191-3197，1999；Zamore，Cell 10125-33，2000；US pat No.6,506,539)。
RNA干擾的作用機制是通過將對應于靶基因RNA的雙鏈RNA導入細胞，在細胞內(nèi)，雙鏈RNA被消化成短的干擾RNA(siRNA)，其結(jié)合于“RNA-誘導的基因抑制復合物”(RISC)。RISC然后引導siRNA與同源的靶RNA互補結(jié)合，最終導致靶RNA的降解(Sharp等，Genes Dev 15-485-490，2001)。
本發(fā)明提供的藥物組合含針對肌萎縮有關(guān)基因的干擾RNA，以調(diào)節(jié)肌生長抑制素或其受體，或其他相關(guān)基因的表達。此干擾RNA為21-25核苷酸的雙鏈RNA，在每條鏈的3′端帶有兩個突出的核苷酸，雙鏈的G+C含量為30-52％，在正義鏈上第15～19位置上，為A/U配對，且無分子內(nèi)重復序列。按照此方法，可以制備針對人肌生長抑制素基因的干擾RNA分子。
4.脫氧核酶使用脫氧核酶是一種新型的基因抑制技術(shù)，其具有反義寡核苷酸的化學穩(wěn)定性，同時又具有核酶的催化切割RNA的功能，且其合成費用很低?；谶@些獨特的優(yōu)點，該技術(shù)已被廣泛用于體內(nèi)和體外的基因調(diào)控(Sun等Pharmacol.Rev.52(3)325-347；US patNo 6,617,438；US pat No 6,326,174)。
因此，本發(fā)明提供了可以抑制與肌萎縮或肌生長相關(guān)基因表達的脫氧核酶。這種脫氧核酶的結(jié)構(gòu)包括(1)催化功能基團，其核苷酸序列為GGCTAGCTACAACGA。(2)位于催化功能基團5′端的結(jié)合序列；(3)位于催化基團3′端的結(jié)合序列。脫氧核酶通過二個結(jié)合序列，特異性地與肌生長抑制素或其受體基因表達的RNA結(jié)合，由催化基團在嘌呤與嘧啶結(jié)合點誘導對靶RNA的切割。
B.核酸的化學修飾本發(fā)明所提供的寡核苷酸可以用化學的方式進行修飾。所述修飾是在分子水平上對天然核酸分子結(jié)構(gòu)進行一處或多處化學修飾。
包括以下化學修飾1)對堿基、糖基、核苷酸之間的磷酸酯鍵的修飾，及增加一些取代基，例如，二胺(diamine)、膽固醇或其它親脂性基團。
2)末端保護在分子的末端加入保護基團，以防止分子的降解。這種保護可以是5′端，也可以是3′端，或是兩端均被保護。
3)質(zhì)子化當該分子溶于中性水時，會引起pH值的降解。質(zhì)子化可通過將分子在酸溶液中處理后完成。通過這一過程，寡核苷酸所帶有的質(zhì)子受體被質(zhì)子結(jié)合，所述的質(zhì)子受體存在于取代的或未取代的磷酸基團或存在于中心基團和末端保護基團上。許多核酸的主干結(jié)構(gòu)在低pH下(例如pH1-3)均不穩(wěn)定。本發(fā)明通過引入某些修飾，可使核酸在pH1～pH2的條件下，仍具有滿意的穩(wěn)定性，這些修飾包括2′-鹵化物；2′-O-烷基，3′-O-烷基；2′-O-烷基-n(O-烷基)等。由于抗酸性的增加，使這些寡核苷酸更容易被制成藥物組合物。
本發(fā)明還提供了抗核酸內(nèi)解酶降解的核酸分子。這種抗酶特性可以通過多種化學修飾而獲得，包括2′-O-甲基磷酸二酯鍵，2′-O-甲烷，2′-O-甲烷-n(O-甲烷)，2′-氟，雜合連接鍵，其它主干結(jié)構(gòu)的修飾。另外，這些修飾還包括對堿基的修飾，例如，甲基化堿基、羥甲基化堿基等。
本發(fā)明還提供了抗核酸外解酶降解的核酸分子。寡核苷酸可以通過對其5′端和3′端修飾而獲得這種抗酶特性。這些末端修飾包括反向連接堿基，雙脫氧核苷酸，甲磷酸基，烷基，芳基，cordycepin，cytosine arabanoside，2′-甲氧基，乙氧基核苷酸，phosphorothioate連接鍵，3′-O-甲基堿基，熒光素，肽鍵連接，二氮苯基，膽固醇，生物素，acridine，rhodamine psoralen，glyceryl，丁醇基，丁基，己醇基和3′-O-烷基。優(yōu)選的丁醇基結(jié)構(gòu)為OH-CH2CH2CH2CH2-。
修飾性核苷酸還包括對糖基的修飾，例如在2′位3′位取代的核糖核酸或脫氧核糖核酸。核糖基和單核苷酸之間的連接鍵稱為核酸的主干結(jié)構(gòu)。對主干結(jié)構(gòu)的修飾包括連接鍵以及其它可以增強穩(wěn)定性和親和性的修飾，例如，對糖結(jié)構(gòu)的修飾。具體的例子有，在堿基相對于天然右旋異構(gòu)體糖為反向時，可使用左旋(L-)異構(gòu)體脫氧核糖；或?qū)⑻腔?′-羥基團、2′-鹵素元素、2′-O-烷基、2′-O-烷基-n(O-烷基)取代；或者使用下列連接鍵2′-O-甲基磷酸二酯鍵，2′-O-乙基，2′-O-丙基、丁基，2′-O-烷基-n(烷基)，2′-甲氧乙氧基，2′-氟，2′-脫氧erythropentofuranosyl，3′-O-甲基、異丁基寡核苷酸，2′-O-(CH2CH2)xCH3以及Butyne連接鍵。本發(fā)明的寡核苷酸可具有部分修飾，或全部修飾，或是不同修飾的組合。
本發(fā)明優(yōu)選修飾性寡核苷酸的連接鍵是非手性的(achiral)，可以含至少3～8個連續(xù)的非手性連接鍵，優(yōu)選為7～12個非手性連續(xù)的連接鍵；最為優(yōu)選的是全部的連接鍵為非手性的。在某些情況下，非手性連接鍵和手性連接性可以相間存在，例如，兩個連續(xù)非手性連接鍵后接一個手性連接鍵，再跟二個連續(xù)非手性連接鍵；或三個連續(xù)的非手性鍵接一個手性連接鍵；或四個連續(xù)的非手性連接鍵跟二個手性連接鍵等。非手性連接鍵包括，但不限于，磷酸二酯鍵、硫代磷酸二酯鍵。
磷酸二酯鍵可以是5′至3′，5′至2′或5′至5′或以上的組合方向。這種連接鍵的修飾可以是分子內(nèi)的(單一或重復)，也可以是在RNA或DNA的末端。
本發(fā)明所提供的藥物組合物的功能效應可用本領(lǐng)域熟知的方法進行測定。這些方法包括體內(nèi)和體外的，例如，在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中分析藥物組合物對靶基因表達的影響和對細胞表型的影響；在體內(nèi)模型和臨床試驗中，測定藥物組合物的生物學效應，包括藥效、藥理、藥劑、毒理等。體內(nèi)模型包括建立的疾病動物模型和正常動物。
C 藥物組合物的構(gòu)成本發(fā)明提供的藥物組合物含有為調(diào)節(jié)與肌萎縮或肌生長相關(guān)基因表達的一種以上的寡核苷酸。根據(jù)寡核苷酸的數(shù)量、類型、靶基因等，藥物組合物中寡核苷酸可以有多種不同的組合方式。寡核苷酸的靶基因可從表1和2中選擇。
藥物組合物中可以只含單一寡核苷酸，其靶基因可以是肌生長抑制素或其受體，也可以是非肌生長抑制素基因。
藥物組合物中可以含一種以上的寡核苷酸，寡核苷酸的種類可以達100種以下，優(yōu)選的為2～20種。
藥物組合物中的寡核苷酸可以是一種類型，例如分別選自反義寡核苷酸，或是核酶；或是干擾RNA，或是脫氧核酶。
藥物組合物中也可以包括不同類型的寡核苷酸，例如，反義寡核苷酸與干擾RNA的組合，反義寡核苷酸與脫氧核酶的組合等。
藥物組合物中的寡核苷酸可以是靶向單一基因的，其可以是一種類型的寡核苷酸，例如反義寡核苷酸，靶向一個以上的靶位點，例如5′端非翻譯區(qū)、翻譯起始區(qū)、3′端非翻譯區(qū)、翻譯終止區(qū)等。
藥物組合物中的寡核苷酸也可以靶向多種基因，例如，二種以上的寡核苷酸，靶向肌生長抑制素和其受體基因；二種以上的寡核苷酸，靶向非肌生長抑制素基因；二種以上的寡核苷酸，混合靶向肌生長抑制素和非肌生長抑制素基因。
藥物組合物中寡核苷酸可以靶向人的基因，也可以靶向不同動物基因，例如牛、豬、雞、鼠、馬、狗和魚。
D 藥用，營養(yǎng)添加劑和順勢療法的寡核苷酸組合物本發(fā)明還進一步提供了藥用，營養(yǎng)添加劑和順勢療法的寡核苷酸組合物。
1.藥物組合物本發(fā)明包括藥物組合物含至少一種本發(fā)明所提供的寡核苷酸。在有些藥物組合物中，可以含100種以下不同的寡核苷酸，例如2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，30，40，50，75種。在有些藥物組合物中，寡核苷酸是反義寡核苷酸、核酶、干擾RNA、脫氧核酶，或以上的組合。在有些藥物組合物中，一種或多種寡核苷酸是修飾性寡核苷酸。在有些化合物中，含一種以上的反義寡核苷酸，其可以是部分或全部修飾的藥物組合物。藥物組合物中還含有適合于藥用的賦形劑和其它輔劑。
本發(fā)明的靶向基因可以是單一的，也可以是多種基因的組合。靶向多種基因的藥物組合物，可以對不同的信號傳導途徑進行同時調(diào)控，將比靶向單一基因的方法更為有效。另外，由于使用的多個寡核苷酸中的每個寡核苷酸的量相對比較低，因此會大大降低產(chǎn)生毒性的可能性。本發(fā)明使用的寡核苷酸為修飾性的，因此要比天然寡核苷酸更加穩(wěn)定，且與目前常用的修飾方法相比，例如，硫代磷酸二酯鍵，本發(fā)明的寡核苷酸的毒性更低。
本發(fā)明的藥物組合物可以采用非腸道的，口服或局部的給藥方式。
本發(fā)明的藥物組合物可按本技術(shù)領(lǐng)域熟知的技術(shù)進行制備。藥用載體的選擇可根據(jù)制劑類型和給藥途徑，例如，靜脈注射，口服，局部，噴霧劑，栓劑，非腸道，或骨髓注射等。賦形劑可含幾種藥用載體。對于順勢療法藥物組合物其輔劑可采用一些能增加順勢療效或減輕癥狀的制劑。另外，藥物組合物中所含的穩(wěn)定劑、防腐劑以及其它的成份一般為藥物組合物重量的0.5％～2％。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可確定出適當?shù)慕o藥方式和遞藥系統(tǒng)。
本發(fā)明的藥物組合物可按要求制成不同的劑型，包括液體、片劑、藥丸、粒狀、粉末、軟膏、乳劑、針劑或栓劑。任何藥物可接受的介質(zhì)和輔劑均可使用，例如，水、甘油、油類、乙醇、調(diào)味劑、防腐劑、食物染料等用于液體制劑，淀粉、糖、稀釋劑、顆粒劑、潤滑劑、粘合劑、分散劑等用于制備固體制劑。
注射用制劑為寡核苷酸的水溶液，溶劑為符合藥用標準的水或生理鹽水。注射用液體還可以含適當?shù)囊后w介質(zhì)、懸浮劑以及可以調(diào)節(jié)滲透壓的制劑、防腐劑等。實際制作方法和程序?qū)τ谝粋€本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是熟知的。
局部用藥劑型可以制成乳劑、敷料、凝膠、洗液、軟膏、液體等?？梢约尤氡砻婊钚詣?，以增加藥物的深層穿透。這些表面活性劑包括天然的，也可以是化學合成的，例如異丙十四烷酸鹽。在有些情況下，藥物組合物可采用化妝品用的制劑成分。
噴霧劑型的制備可采用將寡核苷酸溶于或懸浮于噴發(fā)劑或噴發(fā)劑與溶劑中，例如乙醇作為溶劑。在局部用藥劑型和噴霧劑型中，藥物比例(寡核苷酸)一般為總重量的0.001％～40％。
栓劑的制備可以將寡核苷酸與脂質(zhì)介質(zhì)混合而制成，例如theobroma油、可可奶油、甘油、明膠或聚氧乙烯二醇。
寡核苷酸還可以制成脂質(zhì)體，以增加寡核苷酸在體內(nèi)的半衰期。所用脂類包括，但不限于，Cardiolipin，dimyristoyl，dipalmitoyl，dioleoyl phosphatidyl choline，phosphatidyl glycerol，palmitoyloleoyl phosphatidyl choline或phosphatidylglycerol，phosphatidic acid，lysophosphatidic acid，phosphatidyl serine，phosphatidyl inositol，cholesterol。
本發(fā)明的藥物組合物的給藥劑量為每公斤體重0.01～100mg所述寡核苷酸。優(yōu)選的劑量為每公斤0.01mg～10mg。
當口服給藥時，每1～10天可給藥一個劑量單位，或每天給藥，每天1～10個劑量單位，直到治愈，或癥狀得到減輕。在有些情況下，用藥劑量為每天1～4次。在有些情況下，病人按醫(yī)囑每天用藥2～3個劑量單位。
2.營養(yǎng)添加劑本發(fā)明所述的營養(yǎng)添加劑指的是可以補充食物的藥物組合物，除含一種或二種以上本發(fā)明所述寡核苷酸外，還可包括任何可用于人和動物的可食用的物質(zhì)，這些物質(zhì)可增強食物的吸收、濃縮、代謝等。營養(yǎng)添加劑。劑型包括片劑、膠囊、粉劑、膠狀物、液體等類型。
本發(fā)明提供的營養(yǎng)添加劑對患肌萎縮的病人非常有效。也可作為普通人群的營養(yǎng)添加劑。
本發(fā)明所述的營養(yǎng)添加劑還可以加入其它營養(yǎng)添加劑，例如，抗氧化劑、維生素、食用纖維素、礦物質(zhì)等。
營養(yǎng)添加劑還可以含有一些藥用介質(zhì)，例如，乳糖、葡萄糖、果糖、玉米淀粉、土豆淀粉、纖維素等。根據(jù)不同的制劑要求，營養(yǎng)添加劑中還可加入稀釋劑、粘合劑、充填物、改味劑、食用顏料、防腐劑、穩(wěn)定劑、調(diào)節(jié)劑、乳化劑等。
由于人體對寡核苷酸的耐受程度很高，營養(yǎng)添加劑中所含的寡核苷酸量可以很大。每日每公斤體重的攝入量為0.1mg～100mg。
3.順勢療法藥物組合物順勢療法指的是給予病人少量能使健康者產(chǎn)生類似該病癥狀的藥物的療法。本發(fā)明的藥物組合物可用于該療法，其制備方法是本技術(shù)領(lǐng)域熟知的。例如，將1份固體寡核苷酸與9份乳糖混合即可產(chǎn)生1X固體制劑，重復這一過程即可得到2X，3X，4X…..等不同濃度的制劑。用類似的方法，可制備液體制劑，例如，將1份重量的寡核苷酸與10倍體積的液體混合，產(chǎn)生1X液體；重復這一過程可得到低濃度制劑，例如，取1毫升1X液體，與9毫升稀釋劑混合，即可得到2X液體。
本發(fā)明的順勢療法藥物組合物含一種或一種以上寡核苷酸的組合，所含寡核苷酸可以是經(jīng)化學修飾的。在有些情況下，順勢療法藥物組合物可通過安慰劑給藥，即將寡核苷酸制劑滴在或噴在由乳糖制備的安慰劑藥片上，然后口服。
順勢療法制劑還可以包括一些有助于緩解癥狀的介質(zhì)，例如在US pat No.5,603,915中所述的介質(zhì)。其還可加入一種電磁介質(zhì)，如US pat No 5,830,140所述。
表7中列出了常用順勢療法的劑量。
II本發(fā)明的方法本發(fā)明進一步提供了使用本發(fā)明提供的藥物組合物治療疾病的方法。這些方法包括應用該藥物組合物調(diào)節(jié)細胞內(nèi)基因表達的方法，用本藥物組合物治療肌肉萎縮癥的方法，用于對抗療法、營養(yǎng)添加、順勢療法的方法，用于增加食用動物和畜牧動物肌肉生長的方法，以及使用本藥物組合物輔助其它治療的方法。
肌肉萎縮癥指的是，以肌肉萎縮為主要原發(fā)癥狀的疾病，例如，肌營養(yǎng)不良、脊髓損傷、神經(jīng)變性病、肌缺乏、惡質(zhì)病、肌萎縮等，還可以是一些脂肪和肌肉比例異常增高的疾病，例如，二型糖尿病、X綜合癥。
在成人和動物中，骨胳肌的萎縮可以是由于缺乏使用肌肉，老化、饑餓和疾病造成的癥狀，例如，敗血癥、肌營養(yǎng)不良、艾滋病、衰老和癌癥等。肌肉減少的主要特點是，肌細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)減少，無力，疲勞，肌纖維直徑變小。肌細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)的減少是由于合成的降低和分解的加快。
肌萎縮疾病一般均伴隨著一系列基因表達的改變或異常。這一異常表達往往導致機體的病理性變化，可由熟知本領(lǐng)域的臨床醫(yī)生進行確定。例如，對一個糖尿病患者，臨床醫(yī)生可以診斷其體重高于人群平均體重的20％；對一個肌肉消瘦病人，臨床醫(yī)生可以對其測定肌肉力量，并與人群平均值比較，從而確診是否為肌萎縮。
本發(fā)明的靶向基因可以是單一的，也可以是多種基因的組合。靶向多種基因的藥物組合物，可以對不同的信號傳導途徑進行同時調(diào)控，將比靶向單一基因的方法更為有效。另外，由于使用的多個寡核苷酸中的每個寡核苷酸的量相對比較低，因此會大大降低產(chǎn)生毒性的可能性。本發(fā)明使用的寡核苷酸為修飾性的，因此要比天然寡核苷酸更加穩(wěn)定，且與目前常用的修飾方法相比，例如，硫代磷酸二酯鍵，本發(fā)明的寡核苷酸的可能毒性很低。
A 肌萎縮癥狀利用本發(fā)明的藥物組合物可用于治療以下(但不限于)癥狀。
肌營養(yǎng)不良。肌營養(yǎng)不良是一類神經(jīng)肌肉性疾病，包括假肥大性肌營養(yǎng)不良(DMD)，多型性肢帶肌營養(yǎng)不良(LGMD)和先天性肌營養(yǎng)不良(CMD)，這些疾病的癥狀為進行性肌肉損傷和減少，組織炎癥，纖維和脂肪組織取代肌肉組織，導致一系列的并發(fā)癥，甚至死亡。
肌缺乏。肌缺乏是一種與衰老有關(guān)的肌肉重量、力量和功能損失的疾病，一般在75歲以后發(fā)病。致病因素包括無法行動，運動原改變，激素水平降低，蛋白合成水平降低等。除無法行動外，上述因素均與遺傳控制基因表達有關(guān)。因此，應用寡核苷酸調(diào)節(jié)相關(guān)的基因可以延緩或逆轉(zhuǎn)肌肉損失。
惡質(zhì)病。惡質(zhì)病是一種與許多疾病相關(guān)的疾病，例如，癌癥、艾滋病、敗血癥和充血性心衰，該病的主要癥狀特點是骨骼肌和脂肪組織同時大量減少，但不是由于營養(yǎng)不良造成。惡質(zhì)病是三分之一癌癥患者死亡的原因。在致病過程中，細胞因子和腫瘤因子抑制肌肉生長的基因產(chǎn)物導致肌萎縮。有些惡質(zhì)因子可以選擇性地作用于肌漿球蛋白重鏈在肌小管和鼠肌肉里，腫瘤壞死因子α(TNFα)和γ干擾素可以通過一種RNA依賴型的機制，大大降低肌漿球蛋白的合成(Acharyya等J.Clin lnvest.114370-378，2004)。腫瘤病人的進行性衰弱導致他們對化療和放療的毒性更為敏感，許多病人死地于惡質(zhì)病相關(guān)的癥狀，而不是腫瘤本身。因此，本發(fā)明的藥物組合物可逆轉(zhuǎn)由惡質(zhì)病導致的肌萎縮，有希望成為一種有效的治療方法。
糖尿病。糖尿病是一種最常見的代謝性疾病。I型糖尿病多在青少年發(fā)作，表現(xiàn)為胰島β細胞的破壞，一般需要胰島素治療。II型糖尿病多在成年期發(fā)作，占全部糖尿病的80％以上。盡管II型糖尿病可通過改變生活習慣而得到改善，例如，減輕體重和增加肌肉生長等，研究表明調(diào)節(jié)某些相關(guān)基因的表達可以改善某些癥狀(US pat NO 6,656,475)。
上述僅為舉例說明通過調(diào)節(jié)基因表達可以改善與肌萎縮相關(guān)的疾病癥狀。其它的病癥還包括(但不限于)脊髓損傷，神經(jīng)變性疾病，創(chuàng)傷，缺血性肺病(COPD)，厭食癥，艾滋病，由于臥床等造成的肌萎縮以及任何由肌肉損傷、肌肉生長異常造成的疾病。
B.治療用的靶基因用于治療的靶基因已列入表1和表2，但不僅限于表中所列。有關(guān)基因的詳細描述如下。
肌生長抑制素(myostatin)。該基因是調(diào)節(jié)肌肉生長，直接或間接涉及幾乎所有肌萎縮病的主要基因。作為一種分泌型生長因子，它可以在人和動物的肌肉內(nèi)細胞負性調(diào)節(jié)肌肉的生長。它屬于轉(zhuǎn)化生長因子中的一類，表達于發(fā)育型和成熟的肌肉。在缺乏該基因表達的小鼠中，肌肉增加達25～30％(Mcpherron等，Nature，38783-90，1997；Whittemore等，Biochem.Biophys.Res.Commun.300965-971，2003；Grobet等，Genesis，35227-238，2003)。
肌生長抑制素在血液中循環(huán)，患肌萎縮的病人血清中的肌生長抑制素均出現(xiàn)增高。因此，該基因已被認為是一種特異的藥靶，調(diào)節(jié)該基因表達可用作治療與肌萎縮相關(guān)疾病的有效方法。
最近報道表明，用肌生長抑制素抗體可以顯著的在mdx小鼠中改善肌萎縮癥狀。在受治療的小鼠中，不僅正常肌細胞數(shù)有所增加，肌肉的力量也大大增強。盡管這一療效的機制并非完全清楚，但很顯然，其與調(diào)節(jié)/降低肌生長抑制素水平有關(guān)。因此，肌生長抑制素的阻斷劑是一種很有希望的治療肌萎縮的手段。
在肌缺乏癥中，血清中高水平肌生長抑制素被認為是一種與衰老有關(guān)肌缺乏的生物標記。抑制該基因的表達可以是改善和治療預防肌缺乏癥的手段。
肌生長抑制素受體肌生長抑制素的信號傳導類似于Activin和TGF-β。它可以有效地結(jié)合II型受體ActRllB與I型受體ALK或ALK5形成雜合復合體，導致對Smad產(chǎn)物的磷酸化，從而控制基因表達和介導肌生長抑制素的效應。Smads是一類信號傳導分子，可將有關(guān)信號從細胞表面?zhèn)魅爰毎藘?nèi)，通過與DNA和轉(zhuǎn)錄因子的作用以調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。
轉(zhuǎn)錄因子肌原性轉(zhuǎn)錄因子MyoD是一種調(diào)節(jié)肌生長抑制素功能的調(diào)節(jié)因子。在肌肉細胞內(nèi)表達的一系列轉(zhuǎn)錄因子包括MyoD，myogenin，myf-5和MRF-4/herculin/myf-6。當將以上任一因子引入非生肌細胞內(nèi)，該細胞可分化為肌細胞。特別是MyoD，其可引導肌肉的細胞生成，抑制增殖，激活分化，誘導收縮表型。
Dystrophin基因Dystrophin基因已被證明在不同的肌營養(yǎng)不良癥中起著主導作用，例如，假肥大性肌營養(yǎng)不良(Duchenne muscular dystrophy，DMD)，Becker肌營養(yǎng)不良等。在這些肌營養(yǎng)不良癥中dystrophin基因均有不同的突變。利用寡核苷酸，例如反義寡核苷酸，調(diào)節(jié)這些突變基因的表達，或?qū)ν蛔冞M行校正，可以達到對肌營養(yǎng)不良的治療。
惡質(zhì)病相關(guān)基因惡質(zhì)病涉及了許多不同的途徑和調(diào)節(jié)因子，例如，腫瘤壞死因子(TNF)。注射TNF給小鼠產(chǎn)生惡質(zhì)病模型。Activins和肌生長抑制素在幾種類型的癌癥和感染中表達均增高。以上這些基因均可作為治療惡質(zhì)病的藥靶。最近，一種新的蛋白，稱作癌惡質(zhì)因子，被證明與惡質(zhì)病相關(guān)，也可以作為一個新的藥靶。
糖尿病相關(guān)基因正常的肌肉功能能夠保持體內(nèi)糖的平衡。調(diào)節(jié)肌生長抑制素的表達而增強肌肉的生長可以起到控制糖尿病的功能。Activin-follistatin系統(tǒng)涉及胰腺的發(fā)育，從而影響糖的代謝。最近發(fā)現(xiàn)的一些分泌肽和BMP-9均可調(diào)節(jié)糖的生成與代謝。因此，除了脂生成細胞因子(例如leptin和adiponectin)外，多個TGF-β基因族的成員(包括肌生長抑制素，activin BMP-9)均參與體內(nèi)的糖平衡和糖尿病。
綜上所述，本發(fā)明提供的方法是利用本發(fā)明的藥物在細胞內(nèi)調(diào)節(jié)一種或多個基因的表達，這些基因均與肌萎縮癥有關(guān)，代表性基因列于表1和表2。
在有些情況下，可將細胞，組織或器官在體外分離出來，然后對其用本發(fā)明的藥物處理，然后將處理的細胞，組織或器官輸送回體內(nèi)。
本發(fā)明中所指的療效是治愈，緩解和預防所對應的癥狀。例如，用本發(fā)明的藥物組合物治療肌萎縮(肌營養(yǎng)不良、肌缺乏、脊髓損傷、神經(jīng)變性疾病、厭食癥、惡質(zhì)病等)，其有療效指的是增加肌肉體積和重量，增強肌肉力量等。對于預防性效果，本發(fā)明的藥物組合物可用于有潛在患肌萎縮可能的人，如長期臥床病人，或患有易引起肌萎縮病的病人，或尚未被診斷為惡質(zhì)病的腫瘤患者。因此，本發(fā)明的治療方法包括對動物和人的任何治療，包括以下內(nèi)容(1)防止尚未診斷出，但有可能出現(xiàn)的癥狀；(2)抑制癥狀發(fā)展；(3)減輕或逆轉(zhuǎn)癥狀；(4)保持體內(nèi)平衡。
用于人和動物的寡核苷酸藥物組合物的劑量取決于所治療的癥狀、給藥途徑、受治個體的生理狀況以及治療是營養(yǎng)性的或是抗病性的，或是順勢療法的。產(chǎn)生營養(yǎng)性療效的劑量指的是一種無毒性，且大于能保持理想生理狀況最小量的寡核苷酸劑量。產(chǎn)生抗病性療效的劑量指的是一種無毒性，且大于能產(chǎn)生所希望的生理效應的最小量的寡核苷酸劑量。產(chǎn)生順勢療效的劑量指的是一種無毒和能產(chǎn)生所希望的生理效應的寡核苷酸的最低劑量。
在表6中舉例列舉了單一或組合靶基因，用以制備不同寡核苷酸，以醫(yī)治不同疾病。表中不同基因的組合中，每個基因之間用“/”分開，例如A/B/C，表示寡核苷酸靶基因A，B，C的組合。
本發(fā)明的藥物組合物還可用于治療一些動物，例如，鳥類、魚類和哺乳類動物(特別是雞、豬、羊、狗、馬、貓等)，在藥物組合物中寡核苷酸對應的靶基因序列為種屬特異的。
在進一步的應用中，本發(fā)明提供的方法可用于調(diào)節(jié)食用動物或競技用動物體內(nèi)的肌生長抑制素的表達，從而增強肌肉的生長。使用方法和劑量類似對疾病的治療。在有些情況下，所用劑量，給藥途徑和療程依所用于的動物種類和希望達到的效果有所調(diào)整。
表1 代表性人靶基因

表2 代表性動物靶基因


表3 靶向人基因的反義寡核苷酸序列




表4 靶向動物基因的反義寡核苷酸序列




表5 針對人肌生長抑制素的代表性反義寡核苷酸


*反義寡核苷酸的設(shè)計是基于人肌生長抑制素基因(myostatin)(AF104922).
表6 舉例說明用于治療肌肉萎縮的寡核苷酸藥物組合物

表7順勢療法使用的RNA/DNA劑量

具體實施例方式以下實施例的列出是為了詳細說明本發(fā)明，并不對發(fā)明的內(nèi)容加以限制，如表3，4，5中所列的反義寡核苷酸序列為代表性的分子，任何其它可以產(chǎn)生對肌萎縮相關(guān)病癥產(chǎn)生療效的反義寡核苷酸，均可用于本發(fā)明的藥物組合物中。
實施例1 細胞水平對肌生長抑制素(Myostatin)的抑制1.實驗目的本實驗是為了在小鼠肌肉細胞系中篩選有活性的RNA寡核苷酸。檢測的指標是通過蛋白印跡法觀察RNA寡核苷酸對肌生長抑制素表達的影響。
2.實驗材料1)細胞C2C12細胞系來源于小鼠肌肉細胞，培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)液中，每100毫升DMEM完全培養(yǎng)液中加入15ml胎牛血清，100單位青霉素，100微克鏈霉素。培養(yǎng)條件為37℃，5％CO2。細胞的分化培養(yǎng)采用2％的馬血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37℃，5％CO2。
2)RNA寡核苷酸七種靶向肌生長抑制素基因不同區(qū)域RNA寡核苷酸，每個分子均帶有3′端丁烷保護基。用于細胞轉(zhuǎn)染效率實驗的RNA寡核苷酸在5′端帶有熒光集團FITC標記。
3.實驗步驟1)轉(zhuǎn)染細胞這一過程是將RNA寡核苷酸通過脂質(zhì)體道入細胞。
2)分析細胞轉(zhuǎn)染效率利用流式細胞儀分析轉(zhuǎn)染的效率。
3)基因表達水平的檢測利用蛋白印跡法分析RNA寡核苷酸對靶基因表達的影響。
4.實驗結(jié)果1)FACS(fluorescence activating cell sorting)定量分析細胞轉(zhuǎn)染效率轉(zhuǎn)染前一天細胞傳代3×105于6孔板中，轉(zhuǎn)染按下述過程進行a)于A-管中混合250μl opti-MEM和1μl寡核苷酸(終濃度2μM)，室溫5分鐘；b)于B-管中混合250μl opti-MEM和4μl Lipofectamine-2000，室溫5分鐘；c)將A、B管中的溶液混合，室溫20-30分鐘。
d)將傳代的細胞用PBS洗兩遍，將混好的溶液加到細胞表面，輕輕混勻。
e)37℃放置4-6小時后，換完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)數(shù)小時后進行有關(guān)檢測。
用FITC標記的RNA-oligo轉(zhuǎn)染C2C12細胞(2M)24小時后，倒掉培養(yǎng)液，PBS沖洗細胞兩遍，胰酶消化收集細胞于離心管中，吸管反復吹打分散細胞，離心沉淀細胞，PBS重懸，再離心沉淀，反復洗兩遍，除去游離的FITC-RNA寡核苷酸，400目鋼網(wǎng)過濾使細胞呈單細胞懸液，流式細胞儀分析轉(zhuǎn)染的效率。
以未轉(zhuǎn)染的細胞為空白對照，發(fā)熒光的細胞占總細胞的比例代表轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示，在本實驗條件下，RNA寡核苷酸在C2C12細胞中的轉(zhuǎn)染效率為45-50％。
2)蛋白印跡法(Western blotting)檢測RNA寡核苷酸對酸對肌生長抑制素基因表達的抑制細胞轉(zhuǎn)染如上所述。用七種RNA寡核苷酸分別轉(zhuǎn)染的C2C12細胞經(jīng)用細胞裂解液(50mM Tris-HCl，1mM EDTA，2％SDS，5mM DTT，10mM PMSF)裂解。30s超聲粉碎，沸水浴變性10min，13,000g離心去除細胞碎片，上清液中蛋白濃度用BCA assay reagent(Pierce Chemical Co，Rockford，IL)測定。100μg蛋白在經(jīng)12％濃縮膠，分離膠SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5％脫脂奶粉封閉非特異性結(jié)合位點，然后膜與相應一抗體4℃孵育12h，洗滌；二抗室溫孵育2h，洗滌，加入化學發(fā)光底物(Supersignal WestDura Extended Duration Substrate，PIERCE)，暗室X光片曝光、顯影、定影顯示條帶，看家蛋白Beta-actin條帶作為內(nèi)對照。肌生長抑制素一抗體的濃度為2μg/ml，Beta-actin的抗體濃度1∶500，0.2μg/ml。
結(jié)果顯示，實驗所用的七種RNA反義寡核苷酸均可以特異性地抑制肌生長抑制素myostatin基因的表達，而對細胞對照蛋白(β-actin)的表達無影響。這一結(jié)果表明，本發(fā)明所提供的反義RNA寡核苷酸可有效地進入細胞，與靶基因(肌生長抑制素myostatin)的mRNA結(jié)合，并使其降解，最終導致其蛋白表達的降低。在實驗所用的七種RNA反義寡核苷酸中，分子A，B，C的特異性抑制效果最大(AATg Tag CgT CCg AgA gAC；BTgC ATC ATT TTA AAA ATC AgC；CACC TAA TgC AAA gCT CAT)。實驗所用寡核甘酸均為2′-O-甲基修飾和帶有3′端丁氧基保護。
實施例2 單一和組合型RNA寡核苷酸對小鼠肌肉生長的抑制比較1.實驗目的研究RNA寡核苷酸在單一或組合使用條件下體內(nèi)對肌肉生長的影響。
2.實驗材料三種RNA寡核苷酸分別靶向肌肉生長抑制素基因的5′端非翻譯區(qū)(A)；翻譯起始區(qū)(B)；翻譯終止區(qū)(C)。每種RNA寡核苷酸按1mg/ml濃度溶于生理鹽水。將每種RNA寡核苷酸按等體積混合制成組合型RNA寡核苷酸。
3.實驗步驟實驗分五組進行，每組含六只6-8周雌性小鼠。實驗采用每三天一次尾靜脈注射，注射量為100μl(5mg/kg體重)。實驗完成后剝離腿部肌肉稱重。
4.實驗結(jié)果實驗分組為A，RNA寡核苷酸A(ATg Tag CgT CCg AgA gAC)；B，RNA寡核苷酸B(TgC ATC ATT TTA AAA ATC AgC)；C，RNA寡核苷酸C(ACC TAA TgC AAA gCT CAT)；D，RNA寡核苷酸A+B+C；E，生理鹽水對照。
肌生長抑制素可抑制肌肉的生長，抑制該基因的表達將導致促進肌肉生長。本實驗用不同RNA寡核苷酸組合靜脈注入小鼠體內(nèi)，對小鼠肌肉生長的影響見下表。肌肉生長促進率(％)為(處理組-生理鹽水組)/生理鹽水組。
表8 單一和組合肌生長抑制素RNA寡核苷酸促進小鼠肌肉生長的比較.

5.實驗結(jié)論從上表可見，合并使用RNA寡核苷酸，相對于單獨使用，能夠更有效地抑制肌生長抑制素基因的表達，從而促進小鼠肌肉的生長。
實施例3 RNA寡核苷酸組合物對小鼠肌肉生長的影響1.實驗目的利用三種篩選出的RNA寡核苷酸A，B，C進一步探討合并使用三種寡核苷酸對小鼠肌肉生長以及在肌肉組織中對及肌生長素基因表達的影響。
2.實驗材料1)實驗動物共24只小鼠，6-8周齡雌鼠。
2)寡核苷酸將每一個寡核苷酸溶解。三種RNA寡核苷酸(分別靶向靶向myostatin的5′端非翻譯區(qū)、翻譯起始區(qū)、翻譯終止區(qū))等體積混合，注射量為5mg/kg，每只鼠100μl；四種DNA寡核苷酸(用作對照)等體積混合，注射量為5mg/kg，每只鼠100μl；3.實驗方法和步驟實驗分為A、B、C三組，每組8只鼠。其中A組實驗組，注射上述三種RNA寡核苷酸的組合物；B組寡核苷酸對照組，注射四種DNA寡核苷酸對照組合物；C組處理對照組，注射生理鹽水。
具體實驗步驟如下1)小鼠24只(6-8周)，于動物房中穩(wěn)定一周2)第8天，稱重后，尾靜脈注射每只小鼠100μl寡核苷酸或生理鹽水3)第9天，腹腔注射同等量4)第10天，腹腔注射同第9天5)重復靜脈-腹腔-腹腔注射循環(huán)八次6)第34天，稱重每只小鼠后迅速處死，取腓腸肌和四頭肌，稱重。取小塊組織固定以待組織學檢測，其余液氮冷卻貯存，蛋白印跡Western Blotting待用。
2.實驗結(jié)果1)肌生長素基因反義RNA寡核苷酸組合物對小鼠肌肉生長的影響實驗結(jié)束時處死小鼠取腓腸肌和四頭肌稱重，對數(shù)據(jù)進行處理，肌肉生長促進率(％)為(處理組-生理鹽水組)/生理鹽水組。結(jié)果見下表表9 RNA寡核苷酸組合對小鼠肌肉生長的促進

從上表可見，注射靶向肌生長素基因反義RNA寡核苷酸組合物的實驗組其腿部肌肉的平均重量顯著高于對照實驗組和DNA寡核苷酸對照組，從而證明了反義RNA寡核苷酸能夠抑制肌生長抑制素基因的表達，而使其肌肉的生長加快。
2)肌生長素基因反義RNA寡核苷酸組合物對小鼠平均體重的影響24只小鼠(雌性)分組是隨機的，其平均體重均呈現(xiàn)輕微的上升趨勢，但組間無顯著差異。這一結(jié)果表明，RNA寡核苷酸的作用是肌肉特異性的。
3)肌生長素基因反義RNA寡核苷酸組合物對肌生長素基因在肌肉組織中表達的影響實驗進一步地提取了組織總蛋白，以檢測肌生長抑制素基因在肌肉組織中的表達情況。肌肉組織在細胞裂解液(50mM Tris-HCl，1mM EDTA，2％SDS，5mM DTT，10mMPMSF)中勻漿，裂解。30s超聲粉碎，沸水浴變性10min，13,000g離心去除細胞碎片，上清液中蛋白濃度用BCA assay reagent(Pierce Chemical Co，Rockford，IL)測定。100μg蛋白在經(jīng)12％濃縮膠，分離膠SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5％脫脂奶粉封閉非特異性結(jié)合位點，然后膜與相應一抗體4℃孵育12h，洗滌；二抗室溫孵育2h，洗滌，加入化學發(fā)光底物(Supersignal West Dura Extended Duration Substrate，PIERCE)，暗室X光片曝光、顯影、定影顯示條帶，看家蛋白Beta-actin條帶作為內(nèi)對照。肌生長抑制素一抗體的濃度為2μg/ml，Beta-actin的抗體濃度1∶1000，0.2μg/ml，二抗1∶10000，0.1μg/ml。
蛋白印跡Western Blotting的檢測結(jié)果表明RNA-寡核苷酸能夠在在小鼠肌肉組織中顯著地抑制肌生長抑制素基因的表達，而對組織細胞內(nèi)對照蛋白無影響，從而證明，RNA寡核苷酸對小鼠肌肉生長的促進是通過抑制肌生長素基因表達產(chǎn)生的。
實施例4 肌生長抑制素RNA寡核苷酸組合通過不同給藥途徑對小鼠肌肉生長的抑制1.實驗目的研究RNA寡核苷酸組合物在不同給藥途徑下的體內(nèi)效果，即對肌肉生長的促進。
2.實驗材料1)動物，共24只小鼠，6-8周齡雌正常小鼠分為A、B、C、D組，每組6只鼠。
2)寡核苷酸將每一個寡核苷酸溶解于生理鹽水中，三種RNA寡核苷酸等體積混合，其分別靶向靶向肌生長抑制素基因myostatin的5′端非翻譯區(qū)；翻譯起始區(qū)；翻譯終止區(qū)，注射劑量為5mg/kg，每只鼠100μg/100μl。
3.實驗步驟和方法實驗分四組進行。實驗全程為四周。
A組為靜脈注射，每三天注射100μl混合寡核苷酸(A+B+C)；B組為靜脈和腹腔交替注射，每天注射100μl混合寡核苷酸(A+B+C)；C為生理鹽水對照，注射方法如B組；D為口服，每天由小鼠口內(nèi)灌入100μl寡核苷酸(A+B+C)實驗結(jié)束時處死小鼠取腓腸肌和四頭肌稱重，對數(shù)據(jù)進行處理，肌肉生長促進率(％)為(處理組-生理鹽水組)/生理鹽水組。
4.實驗結(jié)果表10 RNA寡核苷酸組合不同注射途徑對小鼠肌肉生長的促進

從上表可見，RNA寡核苷酸在不同給藥途徑的條件下，與對照組(生理鹽水)相比，均能夠有效地抑制肌生長抑制素基因的表達，從而促進小鼠肌肉的生長。
權(quán)利要求
1.一種治療肌肉萎縮或增強肌肉生長的寡核苷酸，特征是(1)含有7～75個核苷酸；(2)含有通過非手性5′到3′磷酸核苷間鍵連接的7～75個鄰接的核糖基團；(3)互補于與肌肉萎縮病相關(guān)靶基因的5′端非翻譯區(qū)、翻譯起始區(qū)、3′端非翻譯區(qū)和翻譯終止區(qū)；(4)具有75℃～115℃的熔解溫度(Tm，1毫摩爾濃度)
2.如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于該寡核苷酸由10～26個核苷酸組成，具有40℃～85℃的熔解溫度(Tm，1微微摩爾濃度)。
3.如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于該寡核苷酸包括核糖寡核苷酸和脫氧核糖寡核苷酸。
4.如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于該寡核苷酸是經(jīng)化學修飾的修飾性寡核苷酸。
5.如權(quán)利要求4所述的寡核苷酸，其特征在于所述修飾性寡核苷酸是在糖基2′位上帶有取代基團的，所述取代基團選自氧、甲氧基、丙氧基、甲氧-乙氧基、氟、氯、溴、碘。
6.如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于該寡核苷酸在3′端和/或5′帶有保護基團。
7.如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于該寡核苷酸是3′末端封閉和/或5′末端封閉的。
8.如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于該寡核苷酸是反義寡核苷酸。
9.如權(quán)利要求8所述的寡核苷酸，其特征在于所述反義寡核苷酸包括靶向人基因的反義寡核苷酸、靶向動物基因的反義寡核苷酸和針對人肌生長抑制素的代表性反義寡核苷酸。
10.如權(quán)利要求8所述的寡核苷酸，其特征在于該寡核苷酸的序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO191。
11.如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于該寡核苷酸是干擾RNA(RNAi)、核酶或脫氧核酶。
12.一種治療肌肉萎縮或增強肌肉生長的寡核苷酸組合物，含有權(quán)利要求1-11中任一權(quán)利要求所述的寡核苷酸中的一種或多種。
13.如權(quán)利要求12所述的組合物，其特征在于當使用二種寡核苷酸時，這二種寡核苷酸將各自與相同或不同的肌肉萎縮病相關(guān)基因的一段區(qū)域互補；其中，第一種寡核苷酸與某一組基因中的第一個基因的5′非翻譯區(qū)、翻譯起始位點、3′非翻譯區(qū)或翻譯終止位點的區(qū)域互補，第二種寡核苷酸與同一組或另一組基因中的第二個基因的5′非翻譯區(qū)、翻譯起始位點、3′非翻譯區(qū)或翻譯終止位點的區(qū)域互補。
14.如權(quán)利要求1-11中任一權(quán)利要求所述的寡核苷酸制備治療動物或人肌肉萎縮藥物或營養(yǎng)補劑的用途。
15.如權(quán)利要求1-11中任一權(quán)利要求所述的寡核苷酸制備增強動物或人肌肉生長的藥物或營養(yǎng)補劑的用途。
16.如權(quán)利要求15所述的用途，其中所述的動物包括哺乳動物和非哺乳動物。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療肌肉萎縮的寡核苷酸藥物。所述寡核苷酸含有7～75個核苷酸；含有通過非手性5′到3′磷酸核苷間鍵連接的7～75個鄰接的核糖基團；互補于與肌肉萎縮病相關(guān)靶基因的5′端非翻譯區(qū)、翻譯起始區(qū)、3′端非翻譯區(qū)和翻譯終止區(qū)；具有75℃～115℃的熔解溫度(Tm，1毫摩爾濃度)。所述的寡核苷酸包括核糖寡核苷酸和脫氧核糖寡核苷酸，并可經(jīng)化學修飾。本發(fā)明優(yōu)選的寡核苷酸是反義寡核苷酸，也可以是干擾RNA(RNAi)、核酶和脫氧核酶。本發(fā)明的寡核苷酸可用于制備治療動物或人肌肉萎縮藥物或營養(yǎng)補劑。
文檔編號A61P3/02GK1718194SQ200510077730
公開日2006年1月11日 申請日期2005年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月24日
發(fā)明者羅德瑞克·M·K·戴爾 申請人:奧林格斯技術(shù)有限公司